Ақпарат

Шектеу Сыртқы мембрананың өткізгіштігі мен шегі

Шектеу Сыртқы мембрананың өткізгіштігі мен шегі


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Осы оқулыққа сәйкес:

Мысалы, бактерияға қарсы заттарға өте төзімді P aeruginosa, сыртқы қабықшасы E coli-ге қарағанда 100 есе аз өткізеді.[27-бет]

содан кейін сол бетте:

Түрлі түрлердің пориндері E coli және S typhimurium-да 600-ге жуық молекулалық салмақтан P aeruginosa-да 3000-нан астамға дейін өзгеретін әртүрлі алып тастау шектеріне ие.

P. aeruginosa қалай өткізгіштігі E. coli-ге қарағанда төмен болуы мүмкін, егер оның шығару шегі E.coli-ден үлкен болса?


Менің әрекетім:

Бұл дереккөз осылай деп мәлімдейді

OprF P. aeruginosa сыртқы мембранасын 500 Да алып тастау шегімен қамтамасыз етеді.

Бұл (500 Да.) E. coli 600 Да. қарағанда жақын, сондықтан ол қалай өте төзімді?


Бактериялық конвертті итеру

4.2.4 Сыртқы мембраналық көпіршіктер және бактериялық елестер

Сыртқы мембраналық көпіршіктер (OMVs) және бактериялық елестер (BGs) - ата-аналық жасушаның беткі белоктары бар грам-теріс конверттің жасушасыз туындылары [77-79]. OMVs диаметрі 50-250 нм болатын сыртқы мембранадан алынған екі ламеллярлы везикулалардан тұрады, олар үнемі өсіп келе жатқан грам-теріс бактериялармен өңделеді [77]. OMV-де тиімді беттік дисплейге жолаушы ақуыздарын біріктіру арқылы қол жеткізілді E. coli везикуляция кезінде осы құрылымдарда шоғырланған токсин ClyA [80]. OMVs вакцинаны жеткізу құралдары ретінде ерекше пайдалылыққа ие, себебі олар ұзақ сақтау кезінде тұрақты [81] және күшті иммуногенді (бұл көпіршіктер ОМ көптеген иммуностимуляциялайтын компоненттерінің арқасында сақталады), бірақ бүлінбеген жасушалар сияқты экологиялық қауіпсіздікке қауіп төндірмейді. өйткені олар тарай алмайды (4.1 қорапты қараңыз) [82–84] .

BGs, керісінше, бактериофагтан алынған лизис генінің гетерологиялық экспрессиясы арқылы түзілетін толық грамтеріс бактериялық қабықтар. Е (4.2-сурет). Экспрессиядан кейін E протеині N-терминусы арқылы IM-ге енеді, ал C-терминал домені IM арқылы ауысады (4.2A сурет) және OM-ге интеграцияланады (4.2B суреті), екі мембрананың бірігуін индукциялайды. Е ақуызының олигомерленуі «лизис туннельінің» пайда болуына әкеледі (4.2C сурет), ол арқылы цитоплазма жасушадан тыс шығарылады. Дегенмен, литикалық оқиғаның бақыланатын сипатына және IM және OM арасындағы тиімді тығыздауға байланысты жасуша қабықшасының морфологиясы мен периплазмалық мазмұны сақталады [78]. Көбінесе бөтен протеиндерді BG-ге бекіту жолаушыларды OmpA сыртқы мембрана ақуызымен біріктіру арқылы жүзеге асырылады. Ақырында, OMV сияқты, BGs күшті иммуностимуляциялық қасиеттеріне және репликацияға қабілетсіздігіне байланысты вакцинаны жеткізу үшін тамаша көлік болып табылады [85,86].

4.2-сурет. Протеин E-индукцияланған лизистің және BG генерациясының схемалық көрінісі. (A) Е протеинінің N-терминал аймағы IM-ге енеді, ал С-терминусы периплазмаға ауысады. (B) С-терминусы содан кейін IM-мен біріктіруді индукциялау үшін OM-ге біріктіріледі. (C) Ақыры Е протеині лизис туннелін түзу үшін олигомеризацияланады.

Дереккөз: Лангеман және т.б. [78] .


Шектеу Сыртқы мембрананың өткізгіштігі мен шегі - Биология

БАКТЕРИОЛОГИЯ ЖУРНАЛЫ, тамыз 1992 ж. 5196-5203

0021-9193/92/165196-08$02.00/0 Авторлық құқық © 1992, Американдық микробиология қоғамы

Pseudomonas aeruginosa сыртқы мембрана өткізгіштігіндегі Porin OprF-тің алып тастау шегі мен рөлін қайта бағалау, бұзылмаған жасушаларды пайдалану ФРАНСИС БЕЛЛИДО, НАНСИ Л. МАРТИН, РИЧАРД ДЖ. СИЕНЕЛЬ ЖӘНЕ РОБЕРТ Э. В. ХАНОК**

Микробиология бөлімі, Британдық Колумбия университеті, 300-6174 Университет бульвары, Ванкувер, Бнитиш Колумбиясы, Канада V6T 1Z3 25 наурыз 1992 ж./Қабылданды 9 маусым 1992 ж.

Үлгілік мембрананы қалпына келтіру әдістерін пайдаланған бұрынғы зерттеулер Pseudomonas aeruginosa сыртқы мембранасының жоққа шығарылу шегіне және OprF сыртқы мембранадағы негізгі арна түзетін ақуыз болып табылмайтындығына қатысты әртүрлі қорытындыларға келді. Бұл зерттеуде тек екі цитоплазмалық ферментті, а-галактозидаза мен сахароза гидролазасын және ішкі мембрана рафинозды өткізгіштігін кодтайтын 6,2 кб/п Sall фрагменті pFB71 плазмидасын жасау үшін pNM185 векторының m-толуат-индукцияланатын тол промоторының артында клондалған. P. aeruginosa штаммдары pFB71 бар, индуктормен өсіргенде, кірістіру арқылы кодталған екі ферментті де өндірді және мелибиоза дисахаридінде және трисахарид рафинозасында өсу қабілетіне ие болды. Өсу қарқыны сахаридтің концентрациясы мен мөлшеріне байланысты болды және изогенді OprF жетіспейтін Q кірістіру туындысының H636(pFB71) мелибиозы мен рафинозасындағы өсуін өлшеу арқылы зерттелген OprF болмауына байланысты үш-бес есе төмендеді. ). Жоғары концентрацияларда ди-, три- және тетрасахаридтер P. aeruginosa-ны плазмолиздеу үшін сыртқы мембрана арқылы өте алады, бұл жарықтың шашырауымен өлшенеді және электронды микроскопиямен расталады. Жарық шашырау өзгерістерінің бастапқы жылдамдығы кинетикасы қолданылатын сахаридтің мөлшеріне байланысты болды. Сонымен қатар, H636 штаммы үшін сыртқы мембрана арқылы рафиноза мен стахиозды сіңіруге байланысты жарықтың шашырауының өзгеру жылдамдығы оның OprF-жеткілікті H103 негізгі тегімен салыстырғанда бес есе немесе одан да төмен болды. Бұл деректер OprF P. aeruginosa дисахаридтерінен үлкен қосылыстар үшін ең басым порно екенін көрсететін модельдік мембраналық зерттеулерге сәйкес келеді және осы порин мен сыртқы мембрана үшін алып тастау шегі тетрасахарид өлшемінен үлкен екенін болжайды. Сонымен қатар, бұл деректер моносахаридтерді сіңіруде басым функциясы бар және үлкенірек сахаридтерді сіңіруде азырақ функциясы бар басқа пориндердің болуын растады.

Pseudomonas aeruginosa сияқты грамтеріс бактериялардың сыртқы мембраналары гидрофильді қосылыстар үшін өлшемді алып тастау шегін анықтайтын су толтырылған арналармен тесілген өткізгіштік кедергілері болып табылады (9, 22). Бұл арналар пориндер деп аталатын трансмембраналық ақуыздар класынан түзіледі (9, 22). P. aeruginosa-ның F порин протеині (кейіннен OprF деп өзгертілді) оқшауланып, липосомаларға қайта құрылды және диаметрі 2 нм-ге дейінгі декстрандарды өткізетін арналарды қалыптастыру үшін тепе-теңдік талдауларында (өткізу жылдамдығы ескерілмеді) көрсетілді. (11). Керісінше, ішек таяқшасы мен Salmonella typhimurium бірдей жағдайларда тетрасахаридтерді (диаметрі, 1,17 нм) алып тастайтын пориндер бар екені анықталды (11, 16). P. aeruginosa porin OprF деректері бастапқыда бұл бактерияның E. coli және S. typhimuium (11) салыстырғанда антибиотиктерге ішкі төзімділігі жоғары екенін көрсететін деректерге, сондай-ақ P. aeruginosa бар екенін көрсететін кейінгі деректерге қайшы болып көрінді. сыртқы мембрананың төмен өткізгіштігі (2, 17, 37). OprF P. aeruginosa-да мол протеин болғандықтан, үлкен арналарды алып тастау шегіне қарамастан, OprF антибиотиктер сияқты субстраттарды сіңіруде нашар жұмыс істейді деп ұсынылды (5, 11). Бұл ұсынысқа сәйкес нәтижелер қара липидті қос қабатты (5) және липосома ісінуі (19, 38) үлгілі мембраналық зерттеулермен қамтамасыз етілді. OprF арналарының нашар жұмыс істеуін түсіндіру үшін екі бөлек гипотеза ұсынылды. Бұл жеке OprF молекулалары бар молекулалық гетерогенділік болды *

үлкен арналарға (99% жиілік) (32) және OprF арналарының ерекше геометриясына (19) ие. 1986 жылдан бастап Накаэ және әріптестер P. aeruginosa сыртқы мембранасы біркелкі дисахаридтердің жұтылуын болдырмайды (8, 33-36), OprF порин емес (8, 36) және нақты P. aeruginosa пориндері C, D және E деп аталатын үш ақуыз болып табылады (36). Осы тұжырымдарға келу үшін пайдаланылған әдістемелер липосомалардың ісіну әдістерін де (8, 35, 36) және плазмолиз эксперименттерін (25, 26) қамтиды. Бұл зерттеулердің әрқайсысы қате әдіснама негізінде арнайы сынға алынғанымен (18, 19, 27), бір әдіс, яғни екі түрлі топтың қолындағы липосомалардың ісінуі осындай әртүрлі зерттеулерге әкелуі мүмкін екендігі алаңдатады. нәтижелер (36, 38). Сонымен қатар, химиялық (8, 17) немесе молекулалық-генетикалық (30) құралдармен түзілген OprF жетіспейтін штамдар антибиотикке сезімталдықта не өзгеріссіз, не аздаған өзгерістерге ие болды, сондықтан OprF P. aeruginosa негізгі порин ақуызы болып табылады деген қорытындыны растай алмады. . Екінші жағынан, антибиотиктерге сезімталдықтың бұл өзгерісінің болмауы жасуша өткізгіштігінің, пішінінің және өсу сипаттамаларындағы OprF рөлінен туындайтын елеулі өзгерістерге байланысты болды.

сыртқы мембрана және жасуша құрылымы (8, 31). Сондықтан, біз модельдік мембраналық зерттеулерден туындаған ықтимал артефактілерді жою үшін in vivo эксперименттік протоколдарды пайдалану арқылы бұл мәселені қайта қарауды шештік. Алынған нәтижелер P. aeruginosa сыртқы мембранасы рафиноза (трисахарид) немесе

стахиоз (тетрасахарид) және одан әрі OprF деп болжайды

Корреспондент автор. 5196

бұл сахаридтерді қабылдауға қатысатын негізгі, бірақ міндетті түрде жалғыз арна емес. МАТЕРИАЛДАР МЕН ӘДІСТЕР Бактерия штаммдары, плазмидалар және өсу жағдайлары. P. aeruginosa PAO1 ауксотрофты штамы H103 (30) құрамында OprF бар жабайы типті штамм ретінде пайдаланылды. P. aeruginosa H636 fl фрагменті-мутацияланған oprF генімен генді ауыстыру арқылы жасалған H103 штаммының oprF::fQ туындысы болды (30). E. coli DH5a F' [F' end41 hsdRl7 (rK- mK+) supE44 thi-1 recAl gyrA96 reAl X- +80dlacZAM15 A(lacZYA argF) U169] (30) бастапқы клондау үшін пайдаланылды, ал E. coli (30) ), құрамында хромосомаға біріктірілген мутацияланған RP1 плазмидасы E. coli-ден P. aeruginosa-ға дейін плазмидалардың екі аталық жұптасу үшін пайдаланылды. E. coli DS25-91 (lacY melB metB rpsL raf?) (3) құрамында рафинозаны пайдалану, 130 кб/п плазмид pRSD2-1 конститутивтік мутациясы бар R. Schmitt (Lehrstuhl fuir Genetik, Universitat Regensburg, Regensburg, Германия) алынды. ). pRSD2-1 (rafR [RafC] Tra+ InI) 6,2 кб SalI фрагменті толық реттелген (GenBank қосылу нөмірі, M27273) және тек үш құрылымдық генді кодтайтыны көрсетілген, rafA (оагалактозидаза), rafB (ішкі мембраналық рафинозды пермеза) , және rafD (сахароза гидролаза) және кесілген ген, raf (репрессор ген) (3). Бұл фрагмент pRSD2-1-ден кесіліп, pFB71 жасау үшін m-толуат- немесе бензоатпен реттелетін pNM185 экспрессия векторының (Kmr Smr pmTOL mob' tra +) (15) SalI алаңына енгізілді. pNM185 плазмидасында бірегей SalT сайтын жасау үшін EcoRI-SalI адаптерін осы плазмидтің бірегей EcoRI сайтына енгізу керек болды. pFB71 плазмиді E. coli SM10 түрлендіру үшін қолданылды, плазмидаға тән антибиотиктерге төзімділік маркерлерін таңдау және рафинозада өсу, содан кейін (3, 7) және векторларда кодталған моб функциясын пайдаланып, конъюгация арқылы H103 және H636 штаммдарына ауыстырылды. SM10 хромосомасына енгізілген tra гендер (28). Штамдар 2% (масса/көлем) Bacto агарымен (30) қажет болғанда қатайтылатын 150 мМ NaCl бар Luria сорпа ортасында (0,8% Bacto Tryptone, 0,5% ашытқы сығындысы) жүйелі түрде өсірілді. Арнайы көміртегі көздерінде өсуді қамтитын тәжірибелер үшін E. coli штаммдары AB минималды ортада (6), ал P. aeruginosa штаммдары BM2 минималды ортада өсірілді (2). Өсу эксперименттері үшін көміртегі көзі ретінде глюконат (P. aeruginosa) немесе глицерин (E. coli) бар минималды ортада орташа экспоненциалды фазаға дейін өсірілген бактериялар 50-ден 1-і құрамында сахаридтердің белгіленген деңгейлері бар алдын ала жылытылған балғын ортаға субкультураланды және өсірілді. 37°С-та шайқау. Үлгілер (әрқайсысы 1 мл) A6 үшін тұрақты аралықпен алынды. өлшемдер. Өсуді Km өлшеу үшін (яғни өсудің максималды жылдамдығының жартысын беретін көміртегі көзінің концентрациясы) корреляция коэффициенті r-ден асатын сызықтарды беру үшін бастапқы өсу қарқынының кері көрсеткіштері сахарид концентрацияларының кері көрсеткіштеріне қарсы сызылған. 0,92 (бұл деректер 20 және 37 және одан төмен сілтемелерде айтылғандай, бұл оқиға өсу жылдамдығын шектейтін болса ғана сыртқы мембрананың өткізгіштігін көрсететінін атап өту керек). Өсу Km мәндері ордината осіндегі кесіндіден (-л/Км) есептелді. Рафиноза мен мелибиоза (>99,5% таза) Sigma Chemical Co. (Сент-Луис, Мо.) компаниясынан алынды. Кішігірім сахаридтердің айтарлықтай ластануының болмауы P. aeruginosa және E. coli штаммдарының құрамында плазмида болмаса, осы сахаридтердің жоғары деңгейінде өсе алмауымен анықталды.

pFB71. Жарық шашырау тәжірибелері. BM2 ортада өсірілген жасушалар

PSEUDOMONAS AERUGINOSA PORIN

құрамында 10 мМ глюконат бар 3000 х г центрифугалау арқылы жиналды және құрамында 5 мМ MgCl2 және 300 моМ қант концентрациясы бар 10 мМ MOPS (морфолинпропансульфон қышқылы) буферінде (рН 6,5) ақырын қайта суспензияланды. Жарық шашырауын өлшеу 1 мл ұяшықтарды шығару және қозу толқын ұзындығы 600 нм және саңылау ені 2 нм орнатылған Perkin-Elmer 650-1OS спектрофлюориметрінің кюветка ұстағышына салу арқылы орындалды. Жарықтың ерікті бірліктерде шашырауы 60 минутқа дейін үздіксіз жазылды. Электрондық микроскопия. Жасушалар 300 мосМ глюкозада, мелибиозада, рафинозада немесе стахиозда 10 мМ KCN бар және онсыз 30 минут бойы инкубацияланды, содан кейін 2,5% соңғы концентрацияға глутаральдегид қосылды. Бақылау эксперименттері KCN плазмолиз жылдамдығына әсер етпейтінін анықтады, бұл жарық шашырау тәжірибелері көрсеткендей. 3 сағаттан кейін жасушалар жуылды және 1% осмий тетроксидінде 2 сағат бойы бекітілді, этанол сериясында (25, 50, 80, 95 және 100%) сусыздандырылды, содан кейін Аралдитке ендірілді. Жіңішке кесінділер Reichert Ultramicrotome OM U4 Ultracut көмегімен кесіліп, көміртегімен қапталған мыс торларында жиналып, уранилацетат пен қорғасын цитратымен боялған. Барлық үлгілер 60 кВ жұмыс істейтін Zeiss EM 10C трансмиссиялық электронды микроскоппен зерттелді. Ферменттік талдаулар. Сахароза гидролаза және a-галактозидаза белсенділігінің деңгейлері индукторы бар немесе индукторсыз (тиісінше E. coli және P. aeruginosa үшін 0,1 және 5 мМ м-толуат) сәйкес минималды ортада (1-кесте) экспоненциалды түрде өскен жасушаларда анықталды. Шикі сығындылар 35% салыстырмалы шығыс деңгейінде Фишер дыбыстық дисмембраторының шағын зондымен (300-модель) 0°C температурада 30 секунд ішінде ұяшықтарды үш рет ультрадыбыспен өңдеу арқылы дайындалды. Сахароза гидролаза және а-галактозидаза белсенділігі басқа жерде сипатталғандай өлшенді (24, 25). НӘТИЖЕЛЕР МЕН ТАЛҚЫУ Рафинозадағы өсу. Вудрафф пен Хэнкок (30, 31) бұрын H636::Q штаммындағы OprF жоғалуынан туындайтын P. aeruginosa сыртқы мембранасының негізгі құрылымдық ақаулары антибиотиктерге сезімталдықтағы OprF рөліне қатысты түпкілікті қорытындыларды жоққа шығарды деп ұсынды. Бірнеше антибиотиктер, соның ішінде 13-лактамдар, пориндік жолдың (30) жоғалуын ішінара өтей алатын пориндік емес жолдарды (10) пайдалану арқылы сыртқы мембрана арқылы өте алады деп ұсынылған. Алайда, біз гидрофильді олигосахаридтер поринді емес жолдарды қолдану арқылы сыртқы мембранадан өте алмайды деп ойладық. Осылайша, егер OprF шынымен P. aeruginosa негізгі порині болса, оның жоғалуы сахаридтердің өсуінің Km өзгеруіне әкелуі керек. Өкінішке орай, P. aeruginosa моносахаридтен үлкен кез келген сахаридтерде өсе алмайды, бұл Йонейама және т.б. ұсынғандай, сыртқы мембрана үшін моносахаридтерді шығару шегін көрсетуі мүмкін. (33, 34) немесе қолайлы ферменттердің жетіспеушілігін көрсетуі мүмкін. Сондықтан біз E. coli плазмиді pRSD2-1-ден P. aeruginosa-ға рафинозаны пайдалану оперонын клондау арқылы тиісті метаболикалық мүмкіндіктерді қамтамасыз етуге тырыстық. Клондалған 6,2 кб SalI фрагменті толық реттелген және екі цитоплазмалық фермент, cx-галактозидаза және сахароза гидролаза және бір интегралды ішкі мембраналық пермеаза гендеріне қосымша rafR-кодталған репрессордың бір бөлігін ғана қамтиды (7). Бастапқыда фрагмент pFB15 плазмидасындағы так промоторының артындағы pVDtac (6) өрнек векторына клондалған. Төменде сипатталғанға ұқсас нәтижелер алынғанымен (4-сілтемеде қысқаша қарастырылғандай), тактиканың нашар көрінісі

КЕСТЕ 1. E. coli DH5a(pFB71) және P. aeruginosa H103(pFB71) және H636(pFB71) сахароза гидролаза және а-галактозидаза белсенділігі (, ақуыздың ,умоль п-нитрофенол бөлінген) мин/мм

Сахароза гидролазасының белсенділігі

(1 тмоль глюкоза/мин/мг ақуыз)

Бақыланатын мелибиозды рафиноза

1.6 ± 0,4 3,5 ± 0,4 4,9 ± 0,1 5,1 ± 0,9 2,6 ± 0,5 4,1 ± 0,6 9,3 ± 0,8 8,9 ± 0,2 3,3 ± 0,3 4,5 ± 0,4 8,8 ± 0,6 9,5 ± 0,8 г E. таяқшасы DH5a (pFB71) мәдениеттер 0,1 мм м- қамтылған индуктор ретінде толуат. P. aeruginosa H103(pFB71) және H636(pFB71) дақылдарында 5 мМ м-толуат бар

индуктор ретінде, өйткені 0,1 мМ м-толуат кез келген ферменттің анықталатын деңгейлерін индукциялай алмады. E. coli DH5a(pFB71) үшін 5 мМ м-толуат улы болды. Пайдаланылған көміртегі көздерінің концентрациясы 50 мМ глюконат, глицерин және мелибиоза немесе 100 мМ рафиноза болды. I 3rC температурасында бір миллиграмм ақуызға минутына бөлінетін глюкозаның микромолдары ретінде көрсетілген үш тәуелсіз талдаудың ± стандартты ауытқуларын білдіреді. Сығындыларда жасушадан алынған глюкозаның барлығы пайдаланылғандықтан, плазмидасыз немесе индукцияланбаған дақылдардағы фондық концентрациялар (берілген сандардың шамамен 30-40%-ы) алынып тасталды. C 37°C температурада бір миллиграмм ақуызға минутына бөлінетін p-нитрофенолдың микромолдары ретінде көрсетілген үш нақты белсенділік талдауының орташа ± стандартты ауытқуы. d a-Галактозидаза белсенділігі глюконатта өскеннен кейін өлшенді, өйткені бұл өсу эксперименттерінде пайдаланылатын бақылау көміртегі көзі болды. Дегенмен, глюконат сахароза гидролаза талдауларына кедергі келтірді, сондықтан бұл глицерин (E. coli) немесе сукцинатта (P. aeruginosa) өскеннен кейін жасалды.

P. aeruginosa-дағы промотор минималды ортада (14) қанттың өте баяу өсуіне және ұзақ (10-нан 24 сағатқа дейін) кідіріс уақытына әкелді. Сондықтан, жоғарыда сипатталған 6,2 кб SalI фрагментін pNM185 плазмидасындағы m-толуат-индукцияланатын тол промоторының артында қайта клондадық. Алынған pFB71 плазмидасы E. катушкасының DHSa-ға индукциялық жағдайларда (1-кесте) және рафинозада өсуге (2-кесте) а-галактозидаза мен сахароза гидролазасын экспрессиялауға мүмкіндік берді. pFB71 плазмидін P. aeruginosa H103 ішіне тасымалдағаннан кейін, бұл штамм сукцинатта немесе 5 мМ м-толуат қосылған глюконатта өсірілгенде сахароза гидролазасының да, от-галактозидазаның да маңызды деңгейлері индукцияланды (1-кесте). Толуаттың төменгі деңгейлері (яғни, 0,1 мМ) осы плазмиденкодталған ферменттерді индукциялай алмады. Құрамында плазмиді бар H103 штамы мелибиоза және рафиноза дисахаридтерінде өсу қабілетіне ие болды (1-сурет), ал плазмидасы жоқ H103 штамы (1-сурет) немесе pNM185 векторы бар H103 штамы (деректер көрсетілмеген) жоқ. Керісінше, pFB71 плазмиді глюконаттың өсуіне әсер етпеді (1-сурет). Осы бақылауларға сәйкес, индуктор ретінде 5 мМ m-толуаттың қатысуымен рафиноза немесе мелибиозада өсетін H103(pFB71) штамы сахароза гидролазасының да, а-галактозидазаның да жоғары деңгейлерін түзді (1-кесте). H103(pFB71) мелибиоза мен рафинозада өсу қабілетін алу ди- және трисахаридтердің екеуі де сыртқы мембрана арқылы өтетінін білдіреді, өйткені pFB71 кірістіруінде тек ішкі мембрана өткізгіштігі мен екі цитоплазмалық фермент бар. Осы интерпретацияға сәйкес, біз жасуша супематантында қандай да бір фермент белсенділігін анықтай алмадық. Сонымен қатар, сахаридтердің (50 мМ) тіркелген концентрацияларында H103 (pFB71) штаммы 2-КЕСТЕ. E. coli және P. aeruginosa штаммдарының көзі үшін әртүрлі көміртегі көздерінде өсу Km.

Глюконат Мелибиозды Рафиноза

трисахаридті рафинозаға қарағанда дисахарид мелибиозында жылдамырақ өсті (1-сурет), нәтижесінде сыртқы мембранадағы пориндік арналардың өлшемдеріне қатысты осы сахаридтердің өлшемдері ішінара түсіндірілді. Қант тасымалдауындағы OprF рөлін тексеру үшін pFB71 плазмиді H636 штаммына, OprF тапшылығы бар, H103 штаммының Qt инсерциялық мутанты енгізілді. Индуктор ретінде 5 мМ m-толуаттың қатысуымен өсірілген H636(pFB71) сахароза гидролазасы мен а-галактозидазаның H103(pFB71) штаммынан айырмашылығы жоқ деңгейлерін көрсетті (1-кесте). H636(pFB71) штаммы глюконат концентрациясының 50 еселік диапазонында минималды глюконат ортада H103(pFB71) штаммымен бірдей жылдамдықпен өсті (3-суретті қараңыз). Бұл сыртқы мембрана арқылы глюконат өтуінде OprF-тен басқа пориндер басым болатынын көрсетті. Керісінше, H636 (pFB71) рафинозада (2 және 3-сурет) және мелибиозада (3-сурет) H103 (pFB71) қарағанда баяу өсті. Өсу жылдамдығын шектейтін концентрацияларда OprFdeficient мутантының өсу қарқыны оның құрамында OprF бар аталық штаммының өсу қарқыны тек 20%-дан (рафиноза үшін) 33%-ға дейін (мелибиоза үшін) құрады және

Өсу км. 20-анықтамада анықталған, 3-суретте көрсетілген нәтижелерден алынған 50% максималды өсу жылдамдығына әкелетін көміртегі көзінің концентрациясы. b P. aenrginosa уытты әсерінен рафинозаның >200 концентрациясының өсуіне байланысты. mM, бұл жағдайда тек үш деректер нүктесі қол жетімді болатын Км өсуін дәл анықтау мүмкін болмады (Cурет 3).

Уақыт (сағат) CUR. 1. P. aeruginosa H103 өсімі (тұтас сызықтар) немесе pFB71 рафинозаны кәдеге жарату плазмиді (үзік сызықтар) жоқ. Өсу субстраттары (50 мМ) глюконат (шеңберлер), мелибиоза (үшбұрыштар) және рафиноза (шаршы) болды.

PSEUDOMONAS AERUGINOSA PORIN

0,1 R_Q) 0 20 40 60 80 100 120 140

Уақыт (сағат) CUR. 2. H103(pFB71) штаммының (тұтас сызық) және оның oprF::fl мутанты H636(pFB71) (үзік сызық) 100 мМ рафинозадағы өсуі.

бұл айырмашылықтар статистикалық маңызды болды (P 3MB Өлшемдері 0 Жүктеулер 0 Көрулер


ASJC Scopus пәндік салалары

  • APA
  • Автор
  • BIBTEX
  • Гарвард
  • Стандартты
  • RIS
  • Ванкувер

In: Бактериология журналы, том. 136, N 1, 12.01.1978 ж. 381-390.

Зерттеу нәтижесі: Журналға қосқан үлесі › Мақала › рецензия

T1 - грамтеріс бактериялардың сыртқы мембраналары. XIX. Pseudomonas aeruginosa PAO1-ден оқшаулау және қалпына келтіруде және өткізгіштік кедергісін анықтауда қолдану

N2 - P. aeruginosa PAO1 сыртқы және ішкі мембраналарын этилендиаминтетрасірке қышқылы қосылмаған жағдайда бөлу әдісі ойлап табылды. Бұл әдіс натрий додецилсульфаты-полиакриламидті гель электрофорезінде бірдей белок үлгісін көрсететін екі сыртқы мембраналық фракцияны береді, бірақ фосфолипидтердің салыстырмалы құрамында айтарлықтай ерекшеленеді. Осы сыртқы мембраналық фракциялардың бірі және ішкі мембраналық фракция типтік ішкі және сыртқы мембрана маркерлерінің мазмұны бойынша бағаланғандай, 4% -дан аз айқас ластанған. Сыртқы мембранада көрінетін молекулалық салмағы 37 000, 35 000, 21 000 және 17 000 болатын төрт негізгі белок жолағы бар. Липополисахаридтерден және фосфолипидтерден қалпына келтірілген везикулалар везикулалар түзілу кезінде көпіршіктердің құрамына кіретін барлық сахаридтерді өткізбейтін болды. Көпіршіктерде сыртқы мембрана ақуыздары болған кезде, олар тек 9000 молекулалық салмағынан асатын сахаридтерді толығымен сақтап қалды, бұл P. aeruginosa сыртқы мембранасының сахаридтерге қатысты шектеу шегі алынған көрсеткіштен (500-ден 600 дальтонға дейін) айтарлықтай үлкен екенін көрсетеді. кейбір ішек бактериялары. Гидрофильді заттар үшін жоғарырақ шектеу шегі бар сыртқы мембрананың артықшылықтары мен ықтимал кемшіліктері талқыланады.

AB - P. aeruginosa PAO1 сыртқы және ішкі мембраналарын этилендиаминтетрасірке қышқылы қосылмаған жағдайда бөлу әдісі ойлап табылды. Әдіс натрий додецилсульфаты-полиакриламидті гель электрофорезінде бірдей белок үлгісін көрсететін екі сыртқы мембраналық фракцияны береді, бірақ фосфолипидтердің салыстырмалы мазмұны бойынша айтарлықтай ерекшеленеді. Осы сыртқы мембраналық фракциялардың бірі және ішкі мембраналық фракция типтік ішкі және сыртқы мембрана маркерлерінің мазмұны бойынша бағаланғандай, 4% -дан аз айқас ластанған. Сыртқы мембранада көрінетін молекулалық салмағы 37 000, 35 000, 21 000 және 17 000 болатын төрт негізгі белок жолағы бар. Липополисахаридтерден және фосфолипидтерден қалпына келтірілген везикулалар везикулалар түзілу кезінде көпіршіктердің құрамына кіретін барлық сахаридтерді өткізбейтін болды. Көпіршіктерде сыртқы мембрана ақуыздары болған кезде, олар тек 9000 молекулалық салмағынан асатын сахаридтерді толығымен сақтап қалды, бұл P. aeruginosa сыртқы мембранасының сахаридтерге қатысты шектеу шегі алынған көрсеткіштен (500-ден 600 дальтонға дейін) айтарлықтай үлкен екенін көрсетеді. кейбір ішек бактериялары. Гидрофильді заттар үшін жоғарырақ шектеу шегі бар сыртқы мембрананың артықшылықтары мен ықтимал кемшіліктері талқыланады.


Талқылау

CymA құрылымының ең қызықты бөлігі - арна люменіне және сыртына жылжи алатын жылжымалы элементті құрайтын N терминалы. Біздің деректеріміз оның субстратты байланыстыруға жарамды екенін көрсететінін ескере отырып, N терминалының рөлі қандай (6-сурет)? Арнаны тарылту арқылы N-терминалдың ~ 15 қалдықтары ОМ өткізгіштігін сақтайды, ол басқа жағдайда бұзылуы мүмкін. Бөшкенің тиімді диаметрін азайту үшін ішке қарай бүктелетін жасушадан тыс ілмектерден тұратын тарылту элементтері OmpF (S1-сурет) (1) сияқты 16 немесе одан да көп β-жіптерден тұратын OM арналарында кездеседі. Бұл ілмектер өте тұрақты болады, өйткені олар баррельдің ішкі беттерімен немесе басқа ілмектермен көптеген өзара әрекеттеседі. CymA жағдайында салыстырмалы түрде қысқа сегмент (N терминал) периплазмалық жағынан арнаға еніп, бөшке қабырғасымен әрекеттеседі. Осы өзара әрекеттесудің энергетикасы туралы түсінік алу үшін біз метадинамиканың көмегімен жабайы типтегі CymA-да N терминалының орташа күшін есептеудің бір өлшемді потенциалын орындадық (14). Нәтиже кристалдағы N ұшының орны бос энергия минимумына сәйкес келетінін көрсетеді (S8-сурет). Сонымен қатар, N терминалының периплазмалық кеңістікке қозғалысы бірнеше энергетикалық кедергілерден өтуді талап етеді. Осылайша, ашық арнаны генерациялау үшін N терминалының бөшкемен өзара әрекеттесуін бұзу керек. Бөшке қабырғасымен N-терминал қалдықтарының шектеулі саны ғана әрекеттесетінін ескерсек (3-сурет).Б), біз CD субстратының кіру орнынан төмен қарай жылжуы каналды ашу үшін қозғаушы күшті қамтамасыз ете алатынын ұсынамыз, мүмкін Arg5 маңызды қалдығымен әрекеттесетін арна қабырғасының қышқылдық қалдықтарын тарту арқылы (Cурет 8). Сондықтан CymA-ны лигандты OM диффузиялық арна деп санауға болады. Болашақ эксперименттер және толығырақ молекулярлық динамикалық модельдеу CD-дискілер арқылы N терминалының орын ауыстыру механизмі және басқа молекулалардың арнаны аша алатындығы туралы түсінік алу үшін қажет болады.

CymA бойынша циклодекстрин тасымалдаудың схемалық моделі. (мен) CymA (қызыл қызыл) N ұшы баррель люменінің ішінде орналасқан. N ұшындағы Arg5 (+) арна қабырғасындағы глутамин қышқылы қалдықтарының (−) карбоксилат топтарымен әрекеттеседі. (ii) Кіру орнында субстратты басып алғаннан кейін, CD молекуласы арнаға жақындығын төмендету үшін айналады және одан әрі таралады. N ұшы бөшкеден N ұшының бөшке қабырғасымен өзара әрекеттесуінің бұзылуы арқылы шығарылады. (iii) N ұшын шығарғаннан кейін CD молекуласы периплазмалық кеңістікке диффузияланады.

PLUMED 2 (30) жүйесінде жүзеге асырылған жақсы температуралы метадинамика (14) көмегімен анықталған арна осі бойындағы N терминалының бір өлшемді бос энергия профильдері (PMF). Реакция координатының қашықтығы N ұшы (C) арасындағы COM (масса центрі) айырмасы ретінде анықталады.α қалдық атомдары 1–13) және бөшке (Cα қалдық атомдары 26–324) арна осі бойымен. Ең төменгі энергетикалық күйге сәйкес келетін N терминалының кристалданған күйін қоса алғанда, ақуыздың үш репрезентативті суреті көрсетілген.

OM өлшемдерін алып тастау шегінен үлкенірек молекулалардың өтуіне мүмкіндік беретін OM диффузиялық арналары бұрын анықталған. Алайда, барлық жағдайларда субстраттардың арна арқылы сызықты түрде өтуіне мүмкіндік беретін құрылымдар бар, мысалы, мальтолигосахаридтер арқылы өту. E. coli Тоқты (11). Біздің зерттеуіміз қазір CD сияқты көлемді молекулалардың OM диффузиялық арналары арқылы жасушаларға тиімді енетінін көрсетеді. Осыдан кейін жасушалар PMF-ден алынған энергияны неге TonB-тәуелді тасымалдаушылар арқылы үлкен субстраттарды алу үшін жұмсайды деген сұрақ туындайды. CymA көрсеткендей, субстрат өлшемі белсенді тасымалдауды қажет ететін шешуші фактор емес. Керісінше, субстратты өте тығыз байланыстыру қажеттілігі болуы мүмкін, себебі ол тапшы және/немесе құнды. Сыртқы энергия кірісі субстратты босату үшін қажетті үлкен конформациялық өзгерістерді жасау үшін қажет. TBDT жағдайында субстратты босату периплазмалық кеңістікке өтпелі арнаның пайда болуымен байланысты. Керісінше, CymA жылжымалы N-терминалының тарылу домені кіріс субстратпен ығыстырылуы мүмкін, бұл жасушалардың OM өткізгіштік кедергісін бұзбай үлкен көлемді субстраттарды қабылдауының талғампаз әдісін қамтамасыз етеді.


Қорытындылар

Қорытындылай келе, сыртқы мембрана саңылауларының қара және ақ суреті - бактериялардан митохондриялар мен хлоропластарға дейін - әдетте ашық селективті емес диффузиялық саңылаулар түспен толтырылуы керек: сыртқы мембраналар метаболизмді дөрекі бақылау мүмкіндігін сақтайды. арнайы реттелетін арна түзетін белоктардың болуымен. Дегенмен in vitro кернеу өзгерістерінің әсері бойынша эксперименттер иондық арналарды зерттеуде пайдалы, мұндай қалпына келтірілген жүйелер ұяшықта іс жүзінде не болатынын тым жеңілдетеді. Дегенмен, in vivo еріген заттар, метаболиттер және протеинді факторлар арнаның өтуіне жауап беретін сияқты - қақпаның байланыс түймесін басу арқылы еріген заттарды жылжыту немесе ұстап тұру. Сыртқы мембраналар арқылы тасымалдаудың жұмыс моделі 1-суретте көрсетілген.


Әдістері

Жасуша мәдениеті

Бұлшық ет сүт безінің қатерлі жасушалары (4 T1) 37 °C 5% CO2, 10% к/т ұрықтың сиыр сарысуы, 100 U/мл пенициллин және 100 мкг/мл стрептомицин қосылған Roswell Park Memorial Institute (RPMI) орталарында өсірілді. (ThermoFisher). Жасушалар 180 x г центрифугалау арқылы 0,5 мл/10 см 2 трипсинмен жиналды, фосфат буферінің тұзымен (PBS) жуылды және өндірушінің нұсқауларына сәйкес NucleoCounter® NC-100™ (chemometect, Копенгаген) арқылы саналды. Жасушалар 40 мл 4% буферленген формалинде 24 сағат бойы бөлме температурасында (RT) бекітілді.

Бактериялардың өсу жағдайлары

Escherichia. coli P16Lux плазмидін [39] тасымалдайтын K12 MG1655 аэробты түрде 37 °C температурада OD деңгейіне дейін өсірілді.600 Luria-Bertani (LB) ортасындағы 0,8 300 мкг/мл эритромицинмен толықтырылған және 3000 хг центрифугалау арқылы жиналған, 4 °C температурада 10 минут, 4% буферленген формалинде 24 сағат бойы 2X концентрациясына дейін тоқтатылған. RT.

Бекітілген бактерия жасушаларын санау

Бактерия жасушаларының суспензиялары бактерияларды санау жинағының (Invitrogen) нұсқауларына сәйкес есептелді. In brief, after fixation, a 10% aliquot was taken from this suspension and serially diluted (100X) with filtered sterilised 0.15 M NaCl solution to obtain a cell density of approximately 1 × 10 6 cells in 989 μl of NaCl. Bacterial cells were stained with 1 μl of Syto® BC and 10 μl (1X 10 6 ) of counting beads were added to the suspension. Cells were counted in an LSR II Flow Cytometer (BD Biosciences, NJ, USA). The acquisition trigger was set to side scatter and set to 800.

Membrane permeabilisation assay

After fixation, 8 × 10 7 4 T1 cells were harvested at 180 x g for 10 min, washed once with 20 ml of Tris Buffer Saline (TBS) (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.6), and suspended to a final density of 2.5 × 10 6 cells per ml in TBS. Similarly, 5 × 10 9 E. coli cells, were harvested at 300 x g for 10 min, washed once with 20 ml of TBS and suspended to a final density of 2.5 × 10 7 cell per ml in TBS. 500 μl of the cell suspensions were aliquoted into 1.5 ml tubes and treated with a permeabilisation agent. Permeabilisation agents tested were: Triton X-100 (0.1% v/v), Tween-20 (0.2% v/v), Saponin (from Quillaia bark) (0.1% w/v) (S4521), Digitonin (D141) (0.5% w/v). All were acquired from Sigma-Aldrich. Concentrations used were derived from several protocols [6].

The cells were permeabilised for 25 min, at 25 °C, shaking at 500 rpm. Permeabilised cells were washed once with TBS (centrifugation speeds as above) and blocked on ice with TBS + 1% w/v Bovine Serum Albumin (BSA) for 30 min. Blocked cells were exposed to 0.75 μg of Cyanine-5 (Cy5) or Phycoerythrin (PE) labelled Streptavidin (SAv-Cy5, MW = 60 KDa or SAv-PE, MW = 360 KDa) (Biolegend, CA, USA) for 30 min at 25 °C, shaking at 280 rpm. Cells were washed with 1 ml of 0.15 M NaCl solution and resuspended in 350 μl of the same solution for analysis. Bacterial cells were also labelled with 1 μl of Syto® BC (Invitrogen) for 5 min and analysed by flow cytometry in a BD LSRII. 4 T1 cells were identified and gated based on their Forward/Side scatter and E. coli cells were detected using the 488–1 (Fluorescein isothiocyanate - FITC), 525/50 filter for Syto® BC and gated using the side scatter. Cy5 positive cells were detected with the red 670/14 filter. PE positive cells were detected with the yellow/green 780/60 filter. For each experimental replicate, 3 × 10,000 events were recorded for 4 T1 cells and 3 × 100,000 for bacteria.

DNase screening

A screen to identify the DNase with the highest DNA depleting activity in a reaction buffer containing Qb-Saponin was performed. DNases tested were as follows: Recombinant DNase I [1-2 U, 1 μl] (Sigma-Aldrich), Turbo DNase [2 U, 1 μl] (Thermo-Fisher), Molysis DNase [2 μl] (Molzyme GmbH & Co, Bremen, Germany), RQ1 DNase [20 U, 20 μl] (Promega), Benzonase [75 U, 0.3 μl] (Sigma-Aldrich). 5 × 10 6 4 T1 cells, FF for 48 h were treated with 0.2% w/v Qb-Saponin and the DNases tested. Reactions were set in reaction buffers provided or suggested by the supplier for 20 min at 37 °C. The reaction was stopped by either: the addition of Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) for Benzonase, the supplied reaction Stop Buffer, or by incubating at 75 °C (DNAse I). Cells were then subject to DNA purification with the QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN). DNA yield was measured with Qubit™ dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen). All reactions were performed in triplicate. A no-DNAse control was included. This was incubated under the same conditions with buffer supplied for DNAse I, but without the nuclease.

Quillaja bark Saponin titration

Different w/v concentrations (0.1, 0.25, 0.5, 1%) were tested in 1 × 10 6 E. coli cells that were fixed, washed, permeabilised, blocked and imaged as described for membrane permeabilisation assay.

DNA depletion assay

Cells were fixed, washed and permeabilised as described for the membrane permeabilisation assay. 2.5 × 10 5 4 T1 or 2.5 × 10 6 E. coli cells were permeabilised, blocked with 500 μl of 1% w/v BSA in TBS+ MgCl2 (20 mM Tris-HCL, 20 mM NaCl, 2 mM MgCl2, pH 8) for 30 min on ice. Blocked cells were treated with 1.5 μl (≥ 375 units) of Benzonase nuclease (Sigma-Aldrich) for 30 min at 37 °C, shaking at 360 rpm. Treatment was stopped by the addition of 100 mM EDTA. The cells were washed once with TBS and suspended in 0.15 M NaCl, where they were stained with 10 μM CytoPhase Violet (Biolegend) for 1 h at RT, shaking at 200 rpm in the dark. Bacterial cells were labelled with 100 μM of BacLight red (Invitrogen) for 15 min at RT, shaking at 200 rpm and analysed by flow cytometry. 4 T1 cells were identified and gated based on their Forward/Side scatter and E. coli cells were detected using the 561 laser (Yellow/Green) 660/20 filter for BacLight red and gated using the side scatter. CytoPhase+ cells were detected with the 355 (UV) laser and 450/50 filter.

Confirmation of host depletion (HD) strategy

The efficacy of the combined treatment was verified by qPCR in DNA purified from a mixed cell suspension, consisting of 1 × 10 7 E. coli cells and 1 × 10 4 4 T1 cells. Cells were incubated for 30 min at 37 °C, shaking at 360 rpm in TBS or the optimised HD buffer (0.2%w/v Qb-saponin, in TBS + MgCl2 (20 mM Tris-HCL, 20 mM NaCl, 2 mM MgCl2), pH 8) with or without 500 U of Benzonase. The treated cells were then processed for DNA purification following instructions of the QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (QIAGEN) and the purified DNA analysed by qPCR.

Quantitative PCR (qPCR)

Reactions were prepared using LUNA Universal qPCR master mix (NEB, USA) and 0.25 μM of each primer (Table 1). The thermal profile included an initial denaturation of 1 min at 95 °C, followed by 40 cycles of denaturation at 95 °C × 10 s, annealing for 15 s at the temperature specified by NEB’s annealing temperature (Ta) calculator for Hot Start Taq, followed by 20–40 s of extension at 68 °C. For each assay, a 5-point standard curve was made from log10 dilutions of gene blocks corresponding to species-specific genetic regions (Table 1), using an initial concentration of 10 7 copies. Primers and gene-blocks were acquired from IDT (Coralville, USA). Efficiency between 95 and 105% and R-square values > 0.995 were deemed as acceptable. All samples were run in triplicate.

Statistical analyses

Flow cytometry data was exported and analysed in FlowJo (BD, UK) and raw data exported to R. All statistical testing and visualisation were performed in the R environment (v3.6.3). Tests of normality were performed using the Shapiro-Wilk test. Tests of means were performed using paired samples T-Tests and Wilcoxon Signed Rank Tests as appropriate. The false discovery rate was controlled using the Bonferroni procedure. Data visualisation was performed using GGplot2 package (v3.2.1).


Structural basis for maintenance of bacterial outer membrane lipid asymmetry

The Gram-negative bacterial outer membrane (OM) is a unique bilayer that forms an efficient permeation barrier to protect the cell from noxious compounds 1 , 2 . The defining characteristic of the OM is lipid asymmetry, with phospholipids comprising the inner leaflet and lipopolysaccharides comprising the outer leaflet 1,2,3 . This asymmetry is maintained by the Mla pathway, a six-component system that is widespread in Gram-negative bacteria and is thought to mediate retrograde transport of misplaced phospholipids from the outer leaflet of the OM to the cytoplasmic membrane 4 . The OM lipoprotein MlaA performs the first step in this process via an unknown mechanism that does not require external energy input. Here we show, using X-ray crystallography, molecular dynamics simulations and in vitro and in vivo functional assays, that MlaA is a monomeric α-helical OM protein that functions as a phospholipid translocation channel, forming a

20-Å-thick doughnut embedded in the inner leaflet of the OM with a central, amphipathic pore. This architecture prevents access of inner leaflet phospholipids to the pore, but allows outer leaflet phospholipids to bind to a pronounced ridge surrounding the channel, followed by diffusion towards the periplasmic space. Enterobacterial MlaA proteins form stable complexes with OmpF/C 5,6 , but the porins do not appear to play an active role in phospholipid transport. MlaA represents a lipid transport protein that selectively removes outer leaflet phospholipids to help maintain the essential barrier function of the bacterial OM.

Three systems are known to maintain OM lipid asymmetry: the OM phospholipase A2 PldA 7 , the lipopolysaccharide (LPS) palmitoyl transferase PagP 8 and the Mla (maintenance of outer membrane lipid asymmetry) system. Only the Mla system maintains asymmetry directly via phospholipid extraction, while PldA and PagP both generate lysophospholipids in the outer leaflet that still require removal. The Mla system is conserved in Gram-negative bacteria and plant chloroplasts 9,10 , consisting of the inner membrane (IM) ABC transporter MlaBDEF, the periplasmic protein MlaC and the OM lipoprotein MlaA 4,6,11 . Phenotypes from defects in the Mla system are mild under laboratory conditions and require small-molecule OM stressors such as SDS/EDTA or antibiotics 4,5,6,11 . However, MlaA has been identified as a virulence factor in various bacteria 12,13,14,15 . In addition, the Mla system was recently shown to regulate outer membrane vesicle formation 16 . The deleterious effects of Mla knockouts probably result from phospholipid accumulation in the OM outer leaflet, forming bilayer patches that are portals for entry of lipophilic small molecules 17 . So far, structural information on Mla components is available only for MlaC and MlaD 5 . MlaC probably accepts a phospholipid from MlaA and shuttles it to the ABC transporter for ATP-dependent plasma membrane insertion 5 . MlaA is the most enigmatic Mla component, particularly since its identity as a periplasmically exposed lipoprotein appears hard to reconcile with its proposed activity on outer leaflet phospholipids.


Specific callose enzymes modulate plasmodesmal callose levels

Key genes that regulate callose levels specifically at plasmodesmata include members of the A. thaliana β-1,3-glucanase, AtBG_ppap (Levy et al., 2007) and PdBGs, as well as the A. thaliana callose synthase (CalS) family, encoded by CalS10/GSL8/CHORUS, CalS3/GSL12, CalS1/GSL6 немесе CalS8/GSL4. құрамындағы мутациялар PdBG1 немесе PdBG2 genes increase callose accumulation and perturb normal lateral root formation (Benitez-Alfonso et al., 2013). жылы cals10 mutants, callose deposition at the cell plate is abolished, causing seedling lethality and pleiotropic phenotypes that range from defects in cell division and guard cell patterning, to alterations in phototropic response and plasmodesmal permeability (Guseman et al., 2010 Han et al., 2014). Gain-of-function mutations in CalS3 increase callose levels and alter root development (Vatén et al., 2011). Мутациялар CalS1 abolish the hyperaccumulation of callose induced by salicylic acid or pathogenic bacterial infection, while those in CalS8 eliminate the callose deposition induced by mechanical wounding or reactive oxygen species. Бұдан басқа, cals8 mutants show an increase in basal plasmodesmal permeability compared to that found in wild-type plants (Cui and Lee, 2016). These data, together with the observations on additional proteins that are found at plasmodesmata (see below, Box 2 and poster), suggest that a network of callose-regulating factors control the permeability of plasmodesmal channels.

Receptor-like protein kinases that are important for controlling growth and developmental processes are partially associated with plasmodesmata (see poster). For example, the receptor-like kinase STRUBBELIG (SUB) and C2-domain-containing receptor-like protein QUIRKY (QKY) interact at plasmodesmata, which is thought to promote movement of unidentified intercellular factors needed for tissue morphogenesis (Vaddepalli et al., 2014). Similarly, the receptor kinases ARABIDOPSIS CRINKLY 4 (ACR4) and CLAVATA 1 (CLV1) interact at plasmodesmata in the root meristem to restrict root meristematic activity to only a few designated cells (Stahl et al., 2013).

A number of transcription factors move from cell to cell through plasmodesmata, including those that play important roles in cell type specification (see poster). KNOTTED 1 (KN1) moves from inner shoot apical meristem (SAM) tissue layers into overlying layers to establish meristematic cell identity and maintain the stemness of this tissue (Kim et al., 2002). LEAFY moves from the outermost SAM layer into inner layers to control the differentiation of vegetative cells into floral meristem cells (Sessions et al., 2000). WUSCHEL (WUS) moves from the SAM-organizing center into the central zone, where it maintains stem cell fate and number (Yadav et al., 2011). CAPRICE (CPC) is expressed in all non-hair root epidermal cells, but moves into the cells that will become root hairs to promote their differentiation (Kurata et al., 2005). SHORT ROOT (SHR) moves from root stele into neighboring endodermal cells to promote differentiation of the ground tissues (Nakajima et al., 2001). Signaling molecules that move through plasmodesmata also include those involved in defense signal propagation (see poster). For example, the lipid transfer protein AZELAIC ACID INDUCED 1 (AZI1) not only interacts with the plasmodesmal regulators PDLP5 and PDLP1, but also triggers systemic acquired resistance (SAR) in response to pathogen exposure. This in turn leads to symplasmic transport of the SAR signaling molecules azelaic acid (AzA) and glycerol-3-phosphate (G3P) (Lim et al., 2016). Another lipid transfer protein, DEFECTIVE IN INDUCED RESISTANCE 1 (DIR1), has been found to move symplasmically into systemic tissue (Champigny et al., 2013). Taken together, these factors exemplify the variety of cellular signaling events that employ plasmodesmal communication.


Transport Across the Membrane

Мембрана арқылы қозғалатын барлық заттар энергияның қажет немесе қажет еместігіне қарай жіктелген екі жалпы әдістің бірімен әрекет етеді. Passive (non-energy requiring) transport is the movement of substances across the membrane without the expenditure of cellular energy. During this type of transport, materials move by simple diffusion or by facilitated diffusion through the membrane, down their concentration gradient. Су мембрана арқылы осмос деп аталатын диффузиялық процесте өтеді. Osmosis is the diffusion of water through a semi-permeable membrane down its concentration gradient. It occurs when there is an imbalance of solutes outside of a cell versus inside the cell. The solution that has the higher concentration of solutes is said to be hypertonic and the solution that has the lower concentration of solutes is said to be hypotonic. Water molecules will diffuse out of the hypotonic solution and into the hypertonic solution (unless acted upon by hydrostatic forces).

(PageIndex<1>) суреті: Осмос: Osmosis is the diffusion of water through a semipermeable membrane down its concentration gradient. Егер мембрана еріген зат үшін болмаса да, суды өткізетін болса, су төменгі концентрацияға (және осылайша еріген зат концентрациясы жоғары жаққа) диффузиялау арқылы өз концентрациясын теңестіреді. Сол жақтағы стаканда мембрананың оң жағындағы ерітінді гипертониялық.

In contrast to passive transport, active (energy-requiring) transport is the movement of substances across the membrane using energy from adenosine triphosphate (ATP). The energy is expended to assist material movement across the membrane in a direction against their concentration gradient. Белсенді тасымалдау ақуыз сорғыларының көмегімен немесе везикулаларды қолдану арқылы жүзеге асуы мүмкін. Another form of this type of transport is endocytosis, where a cell envelopes extracellular materials using its cell membrane. The opposite process is known as exocytosis. This is where a cell exports material using vesicular transport.


Бейнені қараңыз: Диффузия (Ақпан 2023).