Ақпарат

9.9: Ақуыздың бөлінуі – Биология

9.9: Ақуыздың бөлінуі – Биология


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

9.9: ақуыздың бөлінуі

ПРОТЕИН | Тамақ өнімдерін өңдеуге қатысатын өзара әрекеттесулер мен реакциялар

Амин қышқылдарының ыдырауы

Модельдік жүйелерді зерттеу белок-липидті қоспалардағы су мөлшері азайған кезде белок желілерінің түзілуінен гөрі белоктардың бөлінуі және бүйірлік тізбектердің ыдырауы қолайлы реакциялар екенін көрсетті. Тотыққан липидтің қатысуымен ақуыздағы аминқышқылдарының жоғалу дәрежесінің мысалдары 3-кестеде келтірілген. Бұл жоғалтудың ақуыздың табиғатына және реакция жағдайларына күшті тәуелділігі айқын. Таза амин қышқылдары мен тотықтырғыш липидтердің үлгілік жүйелерінде алынған ыдырау өнімдері 4-кестеде келтірілген.

3-кесте. Асқын тотыққан липидтерге ұшыраған ақуыздардағы аминқышқылдарының жоғалуы

Реакция жүйесі Реакция шарттарыАмин қышқылдары жоғалады а (% жоғалту)
ПротеинЛипидУақытТемпература (°C)
КазеинЛинол қышқылының этил эфирі24 сағ55 бLys(10), Thr(10), Val(10), Ala(9), Tyr(8), Phe(8), Ser(8), Arg(8), Asp(8) c,d
КазеинЛинол қышқылының этил эфирі4 күн60 eLys(50), Met(47), Ile(30), Phe(30), Arg(29), Asp(29), Gly(29), His(28), Thr(27), Ala(27), Тир(27) c,d
Сопақша буминЛинол қышқылының этил эфирі24 сағ55 бMet(17), Ser(10), Lys(9), Ала(8), Леу(8) c,d
Сопақша буминЛинол қышқылының этил эфирі4 күн60 eLys(50), Met(42), Leu(22), His(21), Val(21) c,d
РибонуклеазаЛинол қышқылы40 мин37 бMet(99), Tyr(62), His(54), Lys(51), Cys(40) в
ТрипсинЛинол қышқылы40 мин37 бMet(83), оның(12) в
ЛизоцимЛинол қышқылы8 күн37 бTrp(56), His(42), Lys(17), Met(14), Arg(9)

Gardner HW деректері (1979) Липидті гидропероксидтің ақуыздармен және аминқышқылдарымен реактивтілігі: шолу. Ауыл шаруашылығы және тамақ химиясы журналы 27: 220–229 және ондағы сілтемелер.

a Ең тұрақты аминқышқылдары ғана тізімделген. b Су жүйесі. c Trp талданбаған. d Cys талданбаған. e 80% салыстырмалы ылғалдылық.

4-кесте. Асқын тотықтырғыш липидтердің әсерінен аминқышқылдарынан түзілген өнімдер

Реакция жүйесіАмин қышқылдарынан түзілетін қосылыстар
Амин қышқылыЛипид
ГистидинМетиллинолеат3-(имидазол-4-ил)сүт қышқылы, 3-(имидазол-4-ил)сірке қышқылы гистамин, валин, аспарагин қышқылы, этиламин
ЦистеинЭтил арахидонатЦистин, күкіртті сутегі, аланин
Линол қышқылыЦистин, цистеин қышқылы, цистин дисульфоксиді
МетионинМетиллинолеатМетионин сульфоксиді
ЛизинМетиллинолеатДиаминопентан, аспарагин қышқылы, глицин, аланин, α-аминодипин қышқылы, пипеколин қышқылы, 1,10-диамино-1,10-дикарбоксидекан

Gardner HW (1979) нұсқасынан өзгертілген липидті гидропероксидтің ақуыздармен және аминқышқылдарымен реактивтілігі: шолу. Ауыл шаруашылығы және тамақ химиясы журналы 27: 220–229.


НӘТИЖЕЛЕР

OMA1 және YME1L OPA1 синтезінің белсенділігін дифференциалды түрде модуляциялайды

Ал адам OPA1 сегіз түрлі мРНҚ қосылу нұсқалары бар (Қосымша S1A сурет), тінтуір тіндері тек төрт – 1, 5, 7 және 8 изоформаларын көрсетеді (Акепати) т.б., 2008) (1А-сурет). 1 және 7 изоформаларының әрқайсысы сәйкесінше l-OPA1 қоспасын және s-OPA1 бір немесе екі нұсқасын шығарады. Қысқа изоформалар митохондриялық ішкі мембрана протеазалары OMA1 (S1 орнында) және YME1L (S2 учаскесінде) арқылы ұзын изоформаның протеолитикалық бөлінуімен түзіледі. Керісінше, 5 және 8 изоформаларының протеолитикалық өңдеуі аяқталады және тек қысқа изоформаларға әкеледі (Ән. т.б., 2007).

1-СУРЕТ: OMA1 және YME1L OPA1 синтезінің белсенділігін дифференциалды түрде реттейді. (A) Ақуыз жолақтарының шығу тегін көрсететін тінтуірдің OPA1 ақуыз изоформаларының схемасы аe. MEF 1, 5, 7 және 8 изоформаларын көрсетеді. 1 және 7 изоформалары жолақтарды құрайтын ұзын пішіндерді береді. а және б және жолақтарды құрайтын қысқа формалар вe. 5 және 8 изоформалары жолақтармен сәйкес келетін қысқа пішіндерді шығарады вe, бірақ қарапайымдылық үшін жолақтар вe 1 және 7 изоформаларынан шыққанына қарай таңбаланады. MPP (митохондриялық өңдеу пептидазасы), S1 (OMA1 бойынша) және S2 (YME1L бойынша) бөліну орындары көрсеткілермен көрсетілген. Қызғылт сары сызық пен көрсеткілер жолақтарды көрсетеді в және г ұзын изоформадан алынған 7/а, ал қызғылт сызық пен көрсеткі сол жолақты көрсетеді e ұзын изоформадан алынған 1/б. (B) OPA1 жолақтарын Вест-блот талдауы Ома1 және Yme1l мутант МЭФ. Бес OPA1 жолағы (аe) жабайы типті МЭФ-де айқын көрінеді. Ома1-null MEF жетіспейді в және e Yme1l-null MEF жетіспейді г және Oma1/Yme1l-null MEF-де барлық қысқа пішіндер жоқ, вe. Жүктеуді бақылау ретінде тубулин қолданылды. (C) WT-дегі митохондриялық морфологияның (mito-DsRed) репрезентативті кескіндері және әртүрлі ортадағы протеаза-нөлдік MEFs. GLY: жоғары глюкоза ортасы OXI: ОКФОС-индукциялаушы орта CHX: 10 мкм циклогексимиді бар жоғары глюкоза ортасы. Кірістірулер үлкейтілген көріністі көрсетеді. Масштаб жолағы, 5 мкм. (D) C жасушаларының митохондриялық морфологиясының сандық көрсеткіші. Әрбір тәжірибеде 100 ұяшық бағаланды. Қате жолақтары үш тәуелсіз эксперименттен алынған SD көрсетеді. (E) WT және WT арасындағы әртүрлі орталарда in vivo митохондриялық синтез жылдамдығын салыстыру Oma1/Yme1l-нөлдік MEFs. Біріктіру белсенділігі уақыт функциясы ретінде PA-GFP қарқындылығының төмендеуімен өлшенді. Қате жолақтары кем дегенде алты тәуелсіз өлшемнен алынған SD-ді білдіреді.

Тінтуірдің эмбриондық фибробласттарында (MEFs) төрт мРНҚ изоформасының бұл тобы жасуша лизаттары SDS–PAGE (белгіленген) арқылы шешілгенде бес ақуыз жолағын береді. аe 1, А және В-суретте). Топтар а және б тиісінше 7 изоформасынан және 1 изоформасынан туындайтын ұзын пішіндер (1А-сурет). Топтар в және г сәйкесінше OMA1 және YME1L арқылы жасалған 7 изоформасының S1- және S2-бөліну өнімдері. Топ e — 1 изоформасының қысқа, S1-жарылған түрі. 5 және 8 изоформалары жолақтарға үлес қосатын қысқа ғана изоформаларды жасайды. вe (Өлең т.б., 2007). OPA1 жолақтарының бірдей жиынтығы басқа зерттеулерде байқалды, дегенмен салыстырмалы қарқындылық мәдениет жағдайларындағы айырмашылықтарға байланысты өзгеруі мүмкін (Ананд т.б., 2014).

Жолақтардың тәуелділіктері вe OMA1 немесе YME1L протеазаларындағы лизаттардағы OPA1 жолағы үлгісімен расталды. Ома1-нөл немесе Yme1L-нөлдік ұяшықтар (1В-сурет). Протеаза мутантты жасушаларында байқалған OPA1 жолақ үлгілері қосымша S1B суретінде кестеленген. сәйкестіктері Ома1-нөл және Yme1L-нөлдік жасушалар тиісті протеазаларға қарсы Western Blotting арқылы расталды (қосымша S1C сурет). Атап айтқанда, екеуінде де пайда болатын ұзағырақ топ бар Yme1l-нөл және Yme1l/Oma1- нөлдік жасушалар, мүмкін, YME1L-тәуелді қысқа изоформаның түзілуінің бұзылуына байланысты (яғни, изоформа 8).

Осы протеазалардың OPA1 фузогендік функциясын реттеудегі рөлін түсіну үшін біз қарастырдық Oma1/Yme1l қос нокаут MEFs, құрамында OPA1-нің тек ұзын формалары бар (Ананд т.б., 2014). Стандартты жоғары глюкоза қоректік ортада бұл жасушалар жабайы типті (WT) жасушалармен салыстырғанда митохондриялық фрагментацияның жоғарылауын көрсетеді (1, C және D-сурет). Көптеген Oma1/Yme1l мутантты жасушалар соған қарамастан қысқа түтікшелі митохондрияларды көрсетеді (1D-сурет), сондықтан митохондриялық фрагментация дәрежесі бұрынғыға қарағанда айтарлықтай азырақ. Mfn1/Mfn2-нөл немесе Opa1-нөлдік ұяшықтар (Шен т.б., 2005, 2007). Ома1-null MEFs қалыпты митохондриялық морфология профильдерін көрсетеді, және Yme1l-нөлдік MEFs жоғары фрагменттелген митохондрияларды көрсетеді (1D-сурет). Жалпы тенденциялар – бұл митохондриялар Oma1/Yme1l мутант жасушалар WT жасушаларына қарағанда көбірек фрагменттелген, бірақ олармен салыстырғанда азырақ Yme1l мутантты жасушалар – алдыңғы зерттеуге сәйкес келеді (Ананд т.б., 2014). OPA1 диапазонының үлгілері әртүрлі медиа жағдайларында ұқсас (қосымша S1D суреті).

Біз бұл мутантты жасушалардың митохондриялық синтез деңгейін жоғарылататын мәдениет жағдайларына қалай жауап беретінін сынадық. Өсірілген МЭФ митохондриялық синтез белсенділігін арттырады және тотығу фосфорлануын (OXPHOS) индукциялайтын ортада өсіргенде митохондрияның ұзаруын көрсетеді. Бұл жауап YME1L белсенділігіне байланысты екені көрсетілген (Мишра т.б., 2014). Осы идеяға сәйкес, біз OXPHOS-индукциялаушы ортадан туындаған митохондриялық ұзарудың жойылғанын таптық. Yme1l-нөл және Oma1/Yme1l-нөлдік MEFs (сурет 1, C және D). Фотоактивтендіруші (PA) – жасыл флуоресцентті ақуызды (GFP) біріктіру талдауында өлшенгендей, базальды жағдайларда митохондриялық синтез айтарлықтай төмендеді. Oma1/Yme1-нөлдік MEFs WT жасушаларындағымен салыстырғанда және OXPHOS-индукциялаушы ортаға жауап ретінде жоғарылаған жоқ (1E-сурет). Керісінше, осы зерттеуде сыналған барлық генотиптердің жасушалары стресстен туындаған митохондриялық гиперфузияны тудыратын циклогексимидті (CHX) емдеуге жауап ретінде сенімді митохондриялық ұзаруды көрсетеді (Tondera). т.б., 2009) (1-сурет, C–E). Гиперфузия CHX қосылғаннан кейін тез индукцияланады (1Е сурет). CHX өңдеу WT және екеуінде де PA-GFP сигналының сұйылтуын жақсартты Oma1/Yme1l- нөлдік ұяшықтар. WT жасушалары соңғысына қарағанда едәуір жоғары синтез жылдамдығын көрсетті, бұл Oma1/Yme1l-күшті синтездік қоздырғыш болған жағдайда да нөлдік жасушалар. Біріктірсек, біздің бақылауларымыз алдыңғы тұжырыммен келіседі Ома1/Yme1l-тек l-OPA1 бар нөлдік жасушалар митохондриялық синтез белсенділігін сақтайды (Ананд). т.б., 2014). Дегенмен, синтез белсенділігінің деңгейі WT жасушаларымен салыстырғанда айтарлықтай төмен. OMA1 және YME1L протеазалары OPA1 функциясын дифференциалды түрде реттейді. Стресс-индукцияланған гиперфузия протеазалардың екеуіне де тәуелді емес, l-OPA1 осы стресс жағдайында синтезге делдалдық ету үшін жеткілікті деген есеппен сәйкес келеді (Тондера т.б., 2009). Керісінше, OXPHOS-индукцияланған митохондрияның ұзаруы бұрын айтылғандай, YME1L белсенділігіне байланысты (Мишра т.б., 2014).

The Opa1 S2 сайты in vivo OXPHOS-индукцияланған синтезге делдалдық жасау үшін қажет

OPA1-тің YME1L-тәуелді бөлінуінің функцияларын түсіндіру үшін біз MEF-де CRISPR-Cas9-делдалдық геннің мақсаттылығын пайдаландық. Opa1 S2 бөліну орнын кодтайтын 5b экзонындағы геномдық локус (2-сурет, А және В). Біз 5b экзонында жойылуларды жасаймыз деп үміттендік Opa1 оқу кадры, нәтижесінде S2 бар функционалды OPA1 изоформаларының түзілуін болдырмайтын төменгі ағындағы мерзімінен бұрын тоқтату кодоны пайда болады. Бұл сценарийде мутантты жасушаларда тек ұзын изоформа 1 (жолақ б) және сәйкес S1 бөліну өнімі (жолақ e). Топтар а, в, және г олар жоқ болады, өйткені олар 5b экзонынан – құрамында транскрипттерден пайда болады (2В-сурет).

2-СУРЕТ: кодталған S2 сайты Opa1 экзон 5b in vivo OXPHOS-индукцияланған синтез үшін қажет. (A) S2 және CRISPR-Cas9 gRNA нысанасының орналасуын көрсететін 5b экзонының схемасы. 1 және 2 клондарда бар жоюлар көрсетілген. (B) Экзон 5b бар изоформалар жойылғаннан кейін OPA1 изоформа құрамының схемасы Қызыл Xs мутантты жасушаларда жоқ деп күтілетін изоформаларды көрсетеді. (C) Western Blot талдауы ∆эксон 5b MEF клондары. 1 және 2 клондары жолақтардың күтілетін жоғалуын көрсететін оң клондар а, в, және г. Соңғы жолақ теріс клон болып табылады. Жүктеуді бақылау ретінде тубулин қолданылды. (D) WT және екі митохондриялық морфологияның сандық көрсеткіші ∆эксон 5b көрсетілген медиадағы клондар. Әрбір тәжірибе үшін жүз ұяшық саналды. Қате жолақтары үш тәуелсіз эксперименттен алынған SD көрсетеді.

MEF-дегі экзон 5b нысанасына қарсы Cas9 және gRNA (бағыттаушы РНҚ) өтпелі экспрессиясынан кейін біз жолақтары жоқ бірнеше колонияларды анықтадық. а, в, және г (2С-сурет). Клонға тән әсерлерден қорғау үшін біз үш немесе одан да көп қолдандық ∆эксон 5b біздің барлық эксперименттеріміздегі клондар және екі түрлі клоннан алынған нәтижелер суреттерде көрсетілген. ДНҚ секвенциясы 1-клонның гомозиготалы екі нуклеотидті делециясы бар екенін және 2-клонның әрқайсысында кадрдың ауысуын тудыратын екі ұзағырақ делециясы бар екенін көрсетті (2А-сурет).

The ∆эксон 5b жасушалар қалыпты глюкозасы бар ортада өсіргенде қалыпты митохондриялық профильдерді көрсетті. Сонымен қатар, олар CHX стимуляциясы кезінде митохондрияларды күрт ұзартып, стресстен туындаған қалыпты гиперфузия реакциясын көрсетті (2D-сурет және S2A қосымша суреті). Алайда OXPHOS-индукциялайтын ортада мутантты жасушалар бақылау ортасындағы өсумен салыстырғанда митохондриялардың ешқандай ұзаруын көрсетпеді, бұл OXPHOS-индукцияланған гиперфузия үшін Opa1-нің S2-бөлінуі қажет екенін көрсетеді. OXPHOS-индукциялаушы орта митохондрияның ұзаруына ықпал етпесе де ∆эксон 5b жасушалар, біз физиологиялық салдарын анықтаған жоқпыз. OXPHOS-индукциялаушы орта осы жасушаларда оттегі тұтынуының жоғарылауын тудырды (Қосымша сурет S2B), бұл тыныс алу функциясының артуы митохондриялық ұзаруға тәуелді емес екенін көрсетеді. Сонымен қатар, WT жасушалары және ∆эксон 5b жасушалар OXPHOS-индукциялаушы ортаға ауысқаннан кейін жасушалардың ұқсас өсуін көрсетті (Қосымша S2C суреті). MEF-тен басқа, біз екеуін шығардық ∆эксон 5b тінтуір сызықтары. Мутантты тіндердің батыстық талдауы аброгациясын көрсетті Opa1 экзон 5b – құрамында белок жолақтары (қосымша сурет S2D). OPA1 изоформаларындағы осы биохимиялық өзгеріске қарамастан, мутантты тышқандар айқын физиологиялық дисфункцияны көрсетпеді және кем дегенде 1 жаста қалыпты салмақ жинады (Қосымша S2E суреті).

WT және жаңа OPA1 бөліну учаскесін анықтау ∆эксон 5b жасушалар

Осы зерттеу барысында біз осы OPA1 ақуыз изоформаларын зерттеу үшін жоғары ажыратымдылықтағы гель жүйесіне ауыстық. Осы жаңа жүйемен бұрын топ деп белгіленген нәрсе г WT жасушаларында біз белгілейтін дублет жолақтарын шешуге болады г және г′ (3A-сурет). Қайта талдау жасағанда біз мұны түсіндік ∆эксон 5b жасушалар екі қысқа Opa1 жолағын шығарады, г' және e. YME1L-тәуелді S2 сайтының жойылуымен, ∆эксон 5b ұяшықтар OPA1-нің OMA1-делдалдық өңдеуін ғана көрсетеді деп күтілуде. жылы ∆эксон 5b/Oma1-нөлдік ұяшықтар, жолақ e жоқ бірақ г′ жолағы қалады, бұл оның OMA1-ге тәуелсіз екенін көрсетеді (3A-сурет).

СУРЕТ 3: WT және жаңа OPA1 бөлінуін анықтау ∆эксон 5b жасушалар. (A) WT-ның жоғарырақ ажыратымдылықтағы батыстық талдауы, ∆эксон 5b, және ∆эксон 5b/Ома1-нөлдік MEFs. астында орналасқан қосымша жолақты ескеріңіз г WT MEFs. Бұл топ (деп аталады г′) айқынырақ көрінеді ∆эксон 5b және ∆эксон 5b/Ома1-нөлдік клондар. Жүктеуді басқару ретінде HSP60 пайдаланылды. (B) Жолаққа тәуелділік г' қосулы Yme1l. Көрсетілген shRNA-ны білдіретін жасушалар Western blotting әдісімен талданды. Панельдердің екі жинағы бір гельде орындалды. Жүктеуді басқару ретінде HSP60 пайдаланылды. (C) ПТР талдауы Opa1 транскрипттері ∆эксон 5b жасушалар. Алдыңғы праймер 3-экзонда, ал кері праймер 7-экзонда орналасқан (қосымша S3C сурет). 1 және 5 изоформаларына сәйкес жолақтар секвенирлеу арқылы расталды. (D) 1 және 5 толық ұзындықтағы OPA1 изоформаларының схемасы. (E) 5 изоформасымен жасалған қысқа пішіннің вестерн-блот талдауы. Жүктеуді бақылау ретінде HSP60 пайдаланылды. (F) 5 изоформа жолағына тәуелділігі г′ YME1L бойынша. FLAG белгісі бар адамның OPA1 (изоформасы 1 немесе 5) көрсетілген генотиптің жасушаларында экспрессияланды және FLAG-ға қарсы Western Blotting арқылы талданды. Жүктеуді басқару ретінде HSP60 пайдаланылды.

YME1L OPA1 посттрансляциялық өңдеуге қатысатын басқа белгілі мембрана аралық протеаза болғандықтан, біз оның жолақты өндіру үшін маңызды екенін тексеру үшін қысқа шаш қыстырғыш РНҚ (shRNA) қолдандық. г'. Бұзылу тиімділігі Yme1l және Ома1 shRNAs Western blotting арқылы расталды (қосымша сурет S3, A және B). WT жасушаларында YME1L құлауы жолақтардың жоғалуына әкелді г және г′, ал OMA1-нің құлауы жолақтардың жоғалып кетуіне себеп болды в және e (3B-сурет). тәуелділігі гYME1L бойынша, бірақ OMA1 емес, екеуінде де расталды Δэксон 5b/Oma1-нөлдік ұяшықтар және Δэксон 5b ұяшықтар (3В-сурет).

Жаңа қысқа OPA1 жолағының көзін анықтау г′, біз кДНҚ-ның ПТР талдауын қолдандық Δэксон 5b негізгі қалғанын анықтау үшін жасушалар Opa1 мРНҚ транскрипттері. Жеке мРНҚ транскрипттерін ажырату үшін 4, 4b және 5b балама сплайсинг экзондарын қамтитын праймерлерді пайдалана отырып (Қосымша S3C суреті), біз мутантты жасушалардың 1 изоформасымен мРНҚ қосылысының 1 және 5 нұсқаларын (ПТР талдауымен және секвенирлеумен расталған) экспрессиялағанын анықтадық. аздап молырақ (3-сурет, С және D). 7 және 8 изоформаларының болмауы таңқаларлық емес, өйткені оларда экзон 5b бар. Оның орнына 5 изоформасында баламалы экзон 4b (3D-сурет) бар және басқа да 4b экзоны бар изоформалар сияқты, қысқа изоформаға конститутивті түрде бөлінгені бұрын көрсетілген (Ән). т.б., 2007). 5 изоформасының конститутивтік бөлінуі S1 орнында болады деп болжанған, бұл изоформадағы жалғыз белгілі бөліну учаскесі (Ән т.б., 2007). Дегенмен, біз бұл болжам дұрыс емес пе деп ойладық, өйткені S1-де 5 изоформасының бөлінуі жолаққа әкеледі. e, жоқ г'. 5 изоформасының жолақ жасай алатынын тексеру үшін г', біз 5-ші изоформаны өрнектедік Opa1- нөлдік ұяшықтар. 5 изоформасы айқын айырмашылығы бар қысқа изоформаны құрады e және бірге көшіп келді г' топтары бар ∆эксон 5b және ∆exon5b/Oma1-нөлдік ұяшықтар (3E-сурет). Бұл бақылау 5 изоформасы жолақтың ықтимал көзі екенін көрсетеді г'. Оның бөліну орны N-терминалынан S1-ге дейін, бұл аздап үлкенірек өлшемімен көрсетілген г' салыстырғанда e.

5 изоформасының бөлінуіне жауапты протеазаны анықтау және одан әрі YME1L-тәуелді жолақты растау үшін г' шынында да 5 изоформасынан туындайды, біз OMA1 немесе YME1L жоқ мутантты MEF-лердегі C-терминал FLAG-тегтелген адам изоформаларының 5 және 1 әрекетін салыстырдық. S1-де OMA1 арқылы бөлінуді көрсететін алдыңғы зерттеулерге сәйкес, 1-FLAG изоформасы OMA1-ге тәуелді қысқа изоформаны жасайды (3F-сурет). YME1L болмаған кезде, бұл қысқа изоформаның көп мөлшері OMA1 белсенділігінің жоғарылауына байланысты шығарылады (Wai т.б., 2015). Күтілгендей, 5-FLAG изоформасы басқару MEF-де толығымен өңделеді. OMA1 болмауы ыдырау үлгісіне әсер етпейді, бұл изоформа 5 қысқа пішінінің өндірісі OMA1-ге тәуелсіз екенін көрсетеді (3F-сурет). жою Yme1l бұл қысқа пішіннің өндірісін толығымен жояды және 1 изоформасынан түзілген қысқа изоформамен сәйкес келетін төменгі жолаққа әкеледі (3F-сурет). Сонымен қатар, бұрын болмаған ұзын пішіннің аз мөлшері қалыптасады. Бұл нәтижелер қалыпты жағдайда 5 изоформасының S1 ағынының жоғары жағындағы учаскеде, YME1L-тәуелді түрде жолақ шығару үшін аяқталуға дейін өңделетінін көрсетеді. г'. YME1L болмаған кезде, төменгі ағындағы S1 учаскесінде бөліну белсендіріледі. OMA1 және YME1L екеуі де болмаған кезде 5 изоформасынан ұзын пішін ғана жасалады (3F-сурет, соңғы жолақ). Нәтижелер бірге OPA1 изоформасы 5 протеазаны өңдеуге өте сезімтал екенін көрсетеді, әдетте YME1L арқылы. YME1L болмаған жағдайда OMA1 5 изоформасын S1-жарылған OPA1-ге өңдейді. 5 изоформасының бөлінуі үшін қосымша протеазалар жеткіліксіз, бұл екеуі де болған кезде ұзын изоформа 5 түзілуімен көрсетілген. Yme1l және Ома1 жоқ.

4b экзонындағы лейцинге бай, YME1L-тәуелді бөліну аймағын анықтау

Біздің нәтижелеріміз 5 изоформасында S1 ағынының жоғары жағында жаңа YME1L-тәуелді бөліну учаскесі бар екенін көрсетеді. Жаңа бөліну орнын (біз оны S3 деп белгілейміз) анықтау үшін біз бөліну экзон 4b-ге тәуелді ме, жоқ па деп сұрадық, экзон 5-тен жоғары бірінші экзон. г' WT бойынша, Δэксон 5b, және Δэксон 5b/Oma1-нөлдік ұяшықтар (4А-сурет, жолақ г' жұлдызшалармен белгіленген). Бұл тәуелділік бөліну орны 4b экзонында болуы мүмкін екенін көрсетеді. Бұл идеяны тексеру үшін біз 4b экзонында әртүрлі қысқа делецияларды қамтитын изоформа 5 мутанттарының (Мут 1-9) әрекетін талдадық (4В-сурет). 4b экзонының 5′ жартысында делецияларды қамтитын 1, 2 және 3 мутанттар изоформа 5 бөлінуін өңдеуде ақау көрсетпейді, бұл 4b экзонының бірінші жартысында бөліну орны жоқ екенін көрсетеді (4С-сурет). 4, 5 және 6 мутациялары ұзын пішіннің аз мөлшерін тудырады, әдетте ол болмайды. Сонымен қатар, бұл мутанттар топтың көрнекті өндірісін көрсетеді e. 7 және 8 мутанттар да ұзын пішін мен жолақтың болуын көрсетеді e. Сонымен қатар, бұл мутанттар жолақтың үстінде жағынды қалыптастыратын жаңа ыдырау өнімдерін көрсетеді e (4С-сурет). 4b және 5 экзондары арасындағы көпірші аминқышқылдарын жойған 9 мутация жолақ жасайды e және 5 изоформасының ұзақ формасын тудырмай-ақ жаңа бөліну өнімдерін шығарады. Бұл нәтижелер S3 ыдырауы 4b экзонының 3′ жартысындағы мутацияларға, әсіресе қатарынан бес лейциннің созылуына әсер ететін мутацияларға (7 және 8 мутанттар) сезімтал екенін көрсетеді. (5 изоформасындағы амин қышқылдары 199–203). Бір қызығы, мутациялардың ең көрнекті әсері жолақты жоюдан гөрі ұзын пішінді және жаңа ыдырату өнімдерінің пайда болуы болып табылады. г′.

4-СУРЕТ: 4b экзонындағы YME1L-тәуелді OPA1 S3 бөліну аймағын анықтау. (A) Жолаққа тәуелділік г' 4b экзонында. shRNA қарсы Opa1 экзон 4b көрсетілген генотиптің жасушаларында экспрессияланды. Жұлдызшаларды бөлектеу жолағы г'. Жүктеуді басқару ретінде HSP60 пайдаланылды. (B) схемасы Opa1 экзон 4b мутанттары. Жоғарғы жағында экзон 4b (қызыл) және экзон 5 (көк) арқылы кодталған полипептидтік тізбектер көрсетілген. Қызыл көрсеткі 5-экзондағы белгілі S1 бөліну орнын көрсетеді жасыл көрсеткілер осы зерттеуде табылған жаңа S3 учаскелерін көрсетеді. 4b экзонында жойылған аминқышқылдарымен бірге изоформа 5 мутанттары тізімделген. (C) OPA1 өңдеуге экзон 4b мутанттарының әсері. Адам 5 изоформасының FLAG белгісі бар экзон 4b мутанттары экспрессияланды Opa1-нөлдік MEF жасушалары және Western blot әдісімен талданады. Басқару элементтері ретінде FLAG тегтері бар WT изоформалары 1 және 5 пайдаланылды. Жүктеуді басқару ретінде HSP60 пайдаланылды. (D) OMA1 және YME1L изоформа 5 мутанттарында OPA1 өңдеуге әсері. WT адам Iso 5 және оның 2, 6 және 7 мутанттары көрсетілген Ома1- және Yme1l- нөлдік MEF және FLAG тегтері бар OPA1 жолақ үлгілері Western blot арқылы талданды. Жүктеуді басқару ретінде HSP60 пайдаланылды. (E) диапазонның тандемдік масс-спектрометриясы арқылы 4b экзонындағы ықтимал S3 бөліну орындарын анықтау г'. Топ г′ FLAG-белгінің өрнегі арқылы жасалды Opa1 293T жасушаларындағы 5 изоформасы, анти-FLAG иммунопреципитациясымен тазартылған, SDS–PAGE арқылы шешілген, трипсинмен қорытылған және тандемдік масс-спектрометрияға ұшыраған. Сол жақта Схема салыстырмалы қарқындылығына сәйкес боялған үш жыртылған N-терминалды пептидтерді көрсетеді. Дұрыс, үш пептидтің қарқындылығының графигі. (F) пента-лейцин мутанттарының жолақ генерациясына әсері г'. Көрсетілгендей, аланиндер 4b экзонымен кодталған С-терминалдың пента-лейцин созылуындағы 1, 2 немесе 3 лейцинді ауыстыру үшін пайдаланылды. 5 изоформасының FLAG-белгіленген мутанттары көрсетілген Opa1-нөлдік жасушалар және Western blot әдісімен талданады. Жүктеуді басқару ретінде HSP60 пайдаланылды. (G) OPA1 изоформа профилінің схемасы ∆эксон 5b MEFs. Жасыл көрсеткі анықталған жаңа S3 сайтын білдіреді.

Мутанттардың бөлінуіне жауапты протеазаларды анықтау үшін біз протеаза мутанты MEF-де FLAG-белгіленген мутанттарды көрсеттік (4D-сурет). 6 және 7 мутанттарда ең кішкентай бөліну өнімі жоғалып кетті Ома1-нөлдік ұяшықтар, оның OMA1-ге тәуелді екенін көрсетеді. 7-мутантта YME1-ге тәуелді үлкенірек қысқа формалар бар. OMA1 де, YME1L де болмаған кезде ешқандай бөліну байқалмады, бұл бұл екі протеаза изоформа 5 өңдеу үшін маңызды екенін көрсетеді.

Бөліну орнын дәлірек анықтау үшін жолақтың N-терминал тізбегін анықтау үшін тандемдік масс-спектрометрияны қолдандық. г′, 293T жасушаларында FLAG-белгіленген адам 5 изоформасының шамадан тыс экспрессиясы нәтижесінде пайда болады. Топ г′ FLAG тегіне қарсы иммунопреципитация арқылы жиналды, SDS–PAGE ішінде шешілді және биохимиялық талдау үшін оқшауланды. Пептидтер трипсинді ыдырату арқылы түзілді және наноспрей ионизациясының тандемдік масс-спектрометриясымен (LC-MS) біріктірілген сұйық хроматография арқылы анықталды. Анықталған пептидтердің тек үшеуінде трипттік емес N-терминдері болды. Екі басымдысында N-терминдері 4b экзонында орналасқан, екіншіден соңғы лейцинге дейін және пенталейцин созылуындағы соңғы лейциннен басталады (4E сурет). Соңғы пептид ең жоғары қарқындылыққа ие болды, бұл оның басым S3 ыдырау өнімін білдіреді. Бұл идеяны сынау үшін біз пента-лейцин созылуындағы соңғы 1-3 лейцин аланинмен алмастырылған изоформа 5 мутанттарын (10-13 мутанттар) құрастырдық. Біз бір лейцинді ауыстырудың (12 және 13 мутанттар) жолаққа аз әсер еткенін анықтадық. г′ өндіру, бірақ үлкенірек бөліну өнімдерінің шағын деңгейі байқалуы мүмкін (4F-сурет). Соңғы екі лейциннің екеуі де ауыстырылған кезде (мутант 11), аберрантты бөлінудің айтарлықтай деңгейі болды және ұзын изоформа пайда болды. Бұл екі әсер де соңғы үш лейцин ауыстырылған кезде жоғарылады (мутант 10). Біріктірілген LC-MS және мутациялық талдау S3 бөліну орны 4b экзонының соңында кодталған пента-лейциндік созылу шегінде жатқанын дәлелдейді. Өнімнің иондық спектрлері бөліну ең алдымен соңғы лейцинге дейін N-терминалында болатынын көрсеткенімен, мутациялық фенотиптер бөліну пента-лейцин созылуына өте жақын басқа жерлерде де болуы мүмкін екенін көрсетеді (4С-сурет, 9-13 жолдар). Мутациялардың ешқайсысы жолақ өндірісін толығымен жоймайды г′, бұл торап мутацияланған кезде бөліну әлі де S3-ке өте жақын болуы мүмкін екенін болжайды. Сондай-ақ 5 изоформасының протеолитикалық өңдеуге өте бейім екені анық – S3 учаскесі мутацияға ұшыраған кезде бөліну S1-де немесе N-терминалынан S3-ке дейінгі криптикалық учаскелерде белсендіріледі, бұл 5 изоформасының ыдыраған нұсқаларының пайда болуына әкеледі. Біздің талдауымыз көрсеткендей, ∆эксон5b жасушалар екі доминантты ұстайды Opa1 мРНҚ транскрипттері, 1 және 5 изоформалары. Бұл жеңілдетілген транскрипт профилі бір l-OPA1 (1-изоформадан) және екі s-OPA1 (1/S1 және 5/S3 изоформалары) береді (4G-сурет).

5 изоформасының S3-жарылған қысқа түрі митохондриялық түтікшені реттейді

Адамдарда да, тышқандарда да жартысы Opa1 сплайс формаларында экзон 4b бар және тек қысқа изоформалар алу үшін конститутивті түрде ыдырайды (Ән т.б., 2007). Бұл неге Opa1 бірнеше мРНҚ сплайс формаларын кодтайтыны туралы мәселені көтереді, олардың жалғыз мақсаты қысқа изоформаларды жасау болып табылады. Бұл мәселені шешу үшін 5 изоформасын қолдандық. Бұрынғы зерттеулерге сәйкес (Ән т.б., 2007), изоформа 5-де көрсетілген кезде митохондриялық ұзару белсенділігі жоқ дерлік. Opa1-ішкі мембрана бірігуінің толық жоғалуына байланысты жоғары фрагменттелген митохондриялары бар нөлдік MEFs (5А суреті және S5A және S4A қосымша суреттері). S3 өңдеуін бұзатын изоформа 5 мутациялары, алайда, олардың митохондрияларды ұзарту қабілетімен көрсетілгендей, айтарлықтай митохондриялық синтез белсенділігін көрсетеді (5А-сурет және S5A және S4, A және B қосымша суреттері). Бұл мутанттар қысқа пішіндермен қатар ұзын пішінді де шығаратындықтан, бұл нәтижелер OPA1 ұзын және қысқа изоформаларының қоспасы митохондриялық синтез белсенділігі үшін маңызды деген модельге сәйкес келеді (Ән т.б., 2007). Сонымен қатар, бұл нәтижелерді митохондриялық синтез белсенділігін индукциялайтын ұзын изоформаның өндірісі деп ұсыну арқылы түсіндіруге болады.

5-СУРЕТ: 5 изоформасының S3-жарылған қысқа түрі митохондриялық морфологияны реттейді. (A) 5-изоформды мутанттар арқылы митохондриялардың ұзаруы. Изоформ 5 мутанттары экспрессияланды Opa1-нөлдік жасушалар және митохондриялық морфологиялар сандық түрде анықталды. Қате жолақтары алты тәуелсіз эксперименттен алынған SD көрсетеді. (B) жолақтың таусылуы г' shRNA арқылы 4b экзонына және реэкспрессиясына қарсы г′ изоформа бойынша 5. 5 изоформасының эктопиялық экспрессиясы shRNA әсерін жеңу және өндіру үшін жеткілікті г'. OPA1 изоформалары OPA1-ге қарсы Western blotting әдісімен талданды. Жүктеуді басқару ретінде HSP 60 пайдаланылды. (C) 4b shRNA экзонының митохондриялық морфологияға әсері. Қате жолақтары үш тәуелсіз эксперименттен алынған SD көрсетеді. (D) Бицистрондық OPA1 экспрессиясын талдау. Opa1-1 изоформаны немесе изоформа 1 плюс 5 изоформасын экспрессиялайтын нөлдік жасушалар OPA1-ге қарсы Western blotting әдісімен талданды. ∆эксон 5b салыстыру үшін ұяшықтар көрсетілген. Жүктеуді басқару ретінде HSP60 пайдаланылды. (E) Жолақ әсері гМитохондриялық морфология туралы. Митохондриялық морфологияның сандық көрсеткіштері Opa1-нөлдік MEFs 1 изоформасын YFP немесе 1 изоформасын 5 изоформасымен өрнектейтін. Қате жолақтары үш тәуелсіз эксперименттен алынған SD көрсетеді. П фрагменттелген, қысқа құбырлы, ұзын құбырлы және өзара байланысты мәндері сәйкесінше 4,8 × 10 –4, 0,04, 0,001 және 9,9 × 10 –7 болды. П мәндер Студент арқылы есептелді т сынақ. (F) Қалыпты және S3 бұзылған жағдайларда OPA1 изоформаларын көрсететін модель. S3 бұзылған кезде (төменгі панель, қорап), s-OPA1 өндірісін сақтай отырып, S1 және құпия учаскелердегі бөлінулер белсендіріледі. ОМ: сыртқы мембрана, IM: ішкі мембрана.

Осы екі модельді ажырату үшін біз 5 изоформасының қысқа түрінің физиологиялық қызметін одан әрі зерттедік. Біз shRNA-ны 4b экзонын құлату үшін қолдандық. Δэксон 5b және Δэксон 5b/Oma1- жеңілдетілген портфолиосы бар нөлдік ұяшықтар Opa1 мРНҚ сплайсы қалыптасады. Күтілгендей, 4b экзонының құлауы жолақтың қысқаруына әкелді г′ екі ұяшық сызығында (4A және 5B суреттері). Ішінде Δэксон 5b MEFs, 4b экзонының құлауы күрт митохондриялық фрагментацияға әкеледі (5С-сурет және S5B қосымша суреті). Сол сияқты, в Δэксон 5b/Oma1-нөлдік жасушалар, 4b экзонының бұзылуы митохондриялық фрагментацияға әкеледі (5С-сурет және S5B қосымша суреті). Тығыздау нәтижесі мақсаттан тыс әсерлерге байланысты емес екенін тексеру үшін біз 4b экзонының нокдаундарында 5 изоформасын қайта экспрессияладық (5В-сурет) және екі жасуша желісінде де митохондриялық морфологияның ұзаруын байқадық (5C суреті және S5B қосымша суреті).

OPA1 қысқа формасы митохондриялық синтезді реттеу үшін ұзын пішінмен жұмыс істей алады деген идеяны әрі қарай сынау үшін біз екі түрлі OPA1 сплайс пішінін бірге экспрессиялау үшін экспрессия жүйесін әзірледік. Opa1-нөлдік MEFs. 5 изоформасымен бірге 1 изоформасын немесе YFP ​​басқаруымен бірге 1 изоформасын жасау үшін бицистрондық өрнек векторын құрастырдық. Western blot осы ұяшықтардағы күтілетін OPA1 жолақ үлгісін растады (5D-сурет). Жалғыз изоформа 1 өрнекпен ұзын жолақ б және қысқа жолақ e өндірілді. 1 және 5 изоформаларының бицистрондық экспрессиясы кезінде қосымша қысқа форма (г′ изоформасынан 5) қосылды. Бұл қос өрнекте байқалған жолақтарды қайталады Δэксон 5b жасушалар (5D-сурет) және ұзағырақ митохондриялық профильдер пайда болды. Бір ғана изоформ 1 экспрессиясымен салыстырғанда (5E суреті және S5C қосымша суреті) салыстырғанда едәуір көп жасушалардың құрамында өзара байланысқан митохондриялар болды және азырақ жасушаларда фрагменттелген митохондриялар болды. Бұл нәтижелер S3-жарылған s-OPA1 митохондриялық синтезді ынталандыру үшін l-OPA1-мен жұмыс істей алатынын көрсетеді. Бұл синергияның s-OPA1-де GTP гидролизінің белсенділігін қажет ететінін анықтау үшін біз бицистрондық жүйені құрамында дисфункционалды GTPase домені (iso 5-G300E) бар 5 изоформасымен жабайы типті изоформа 1 экспрессиялау үшін пайдаландық. Opa1-нөлдік MEFs. Протеин жолағы үлгісі Iso 1-IRES-Iso 5-G300E экспрессиясы бар жасушаларда Iso 1-IRES-Iso 5 экспрессиясы бар жасушалармен салыстырғанда ұқсас болды (қосымша S5D сурет). Мутацияланған 5 изоформасы митохондриялық синтезді жабайы типтегі 1 изоформасымен үйлестіруде тиімсіз болды, бұл синтез функциясын сақтау үшін s-OPA1-де GTPase белсенділігі қажет екенін көрсетті (қосымша S5, C және E суреті).


НӘТИЖЕЛЕР

Пептидті субстраттарға арналған тазартылған ADAM 10 ерекшелігі.

α-секретазаның ыдырау аймағын қамтитын пептидті субстрат ретінде біз октадекапептидтік амид тізбегін, қалдық 11� Aβ (Aβ N ұшына қатысты нөмірлеу) (12) таңдадық. Оның C ұшы APP бірінші жасушадан тыс қалдығына сәйкес келеді. Aβ(11�) ADAM 10-мен 30 минуттық инкубациялаудан кейін HPLC талдауы екі фрагменттің пайда болуымен бастапқы пептидтің 28% бөлінуін көрсетті (кесте ​ (1-кесте). 1). Электроспрей ионизациясының масс-спектрометриясы арқылы талдау оларды N-терминалды гексапептид (мішілік ионы м/z 777,5) және С-терминалдың додекапептид амиді (мәт. м/z 2082.8) негізгі октадекапептид амидінің. Осылайша, ADAM 10 протеолитикалық жолмен Lys-16 және Leu-17 арасында β1-секретаза белсенділігі бар фермент үшін күтілгендей бөлінеді. 6 сағаттық инкубациядан кейін Leu-17 және Val-18-ден кейін пайда болған аздаған бөлінумен негізінен осы учаскеде 69' A'2(11'x0201328) бөлінді (Cурет 'x200B (Cурет 1 1). А және Кесте ​ Кесте 1). 1).

1-кесте

Ақуыздардың бөліну аймағын қамтитын пептидтерге арналған ірі қара бүйрегінен тазартылған ADAM 10 ерекшелігі

ПротеинЖүйелі% ірі қара ADAM 10 арқылы бөлінуі
30 мин6 сағ
ҚОЛДАНБАEVHHQK ↓ LVFFАEDVGSNK-NH22869
ҚОЛДАНБА (A692G)EVHHQK ↓ LVFFГEDVGSNK-NH21454
ИЛ-6 рецепторларыANATSLPVQ ↓ DSSSV-NH200
Ангиотензин түрлендіретін ферментTPNSAR ↓ SEGPLPDSGR-NH200
Pro-TNF-αPLAQA ↓ VRSSSRTPSD-NH249100

Cleavage of peptides by ADAM 10 after 30 min or 6 hr was determined by HPLC analysis. ↓, proteolytic cleavage site. 

Cleavage of peptides spanning the α-secretase cleavage site of APP by ADAM 10. (А) Peptide substrates were incubated in cleavage buffer in the absence (Сол) or in the presence of ADAM 10 (Дұрыс) for 6 hr at 37ଌ, followed by HPLC analysis. The asterisks indicate the peptide substrates and the numbers indicate the products generated as follows: 1, EVHHQK-OH 2, LVFFAEDVGSNK-NH2 3, LVFFGEDVGSNK-NH2. (Б) CD spectra of APP peptides. Measurements were carried out in the presence of 0.5% SDS.

Next we examined whether the extent of cleavage depends on the conformation of the substrate as has been described for the cleavage of APP by α-secretase (3). For this purpose, Ala-21 in Aβ(11�) was replaced by Gly. This position corresponds to a naturally occurring Ala → Gly mutation at position 692 of APP770 (31), which was identified in patients with cerebral hemorrhages due to amyloid angiopathy. In vivo studies with APP770 (A692G) showed that this mutation C-terminal to the α-secretase cleavage site led to relatively more Aβ compared with p3 by partial inhibition of α-secretase (32) and to an increased alternative cleavage of the Aβ domain, probably caused by aberrant substrate recognition of α-secretase (33).

CD measurements for the octadecapeptide amide Aβ(11�) in 0.5% SDS showed a spectrum characteristic for α-helical conformation, whereas a random coil conformation was observed for the peptide with the Ala → Gly mutation in position 21 of Aβ(11�) (Fig. ​ (Fig.1 1 Б). The latter peptide was cleaved by ADAM 10 less efficiently than the wild-type peptide: after 30 min, only 14% of the peptide was cleaved between Lys-16 and Leu-17 compared with 28% of Aβ(11�) (Table ​ (Table1). 1 ). ADAM 10 did not cleave peptide substrates containing a cleavage site for ectodomain shedding of angiotensin-converting enzyme (34) or IL-6 receptor (35), but it cleaved a peptide substrate derived from pro-TNF-α, as reported (36, 37).

Several metalloproteinase inhibitors were examined for their ability to inhibit cleavage of Aβ(11�) by purified ADAM 10. The hydroxamic acid-based inhibitor BB-3103 (38) at 100 μM completely inhibited the cleaving activity. ADAM 10 was also completely inhibited by 1 mM DTT, which suggests the existence of thiol or disulfide bonds important for α-secretase activity, and by 1 mM of the chelating agent 1,10-phenanthrolin.

Processing and Localization of ADAM 10 in HEK Cells.

To study the effect of ADAM 10 on APP cleavage in a cellular system, we used HEK cells. The ADAM 10 cDNA was cloned from a bovine kidney cDNA library, tagged at its 3′ end with a DNA sequence coding for the HA antigen, and cloned into the expression vector pcDNA3. After transfection of HEK cells and HEK cells stably expressing APP695 (HEK APP695) (29) with ADAM 10, clones were analyzed for expression and processing of the metalloprotease. For this purpose, cell lysates were immunoprecipitated with anti-HA antibody (16B12) and analyzed by SDS/PAGE and Western blot. Immunostaining revealed two immunoreactive species with apparent molecular masses of 90 kDa and 64 kDa (Fig. ​ (Fig.2 2 А, lanes 2 and 5). The 64-kDa form is derived from the 90-kDa form by removal of the prodomain (194 aa), probably by a furin-like pro-protein convertase, which cleaves ADAMs at the sequence motif RXKR in a late Golgi compartment (39). The calculated molecular mass of the protein core of ADAM 10 after cleavage of the prodomain is 61 kDa. To investigate whether the difference between apparent and calculated molecular masses is caused by glycosylation on the putative N-glycosylation sites of ADAM 10 (24), the glycoproteins of the cell clone with the highest expression level of ADAM 10 (HEK ADAM 10) were treated with Н-glycosidase F. This treatment resulted in a reduction of the molecular masses to the expected values of about 86 kDa for the precursor protein and about 61 kDa for the protein core of ADAM 10 lacking the prodomain (Fig. ​ (Fig.2 2 А, lane 3).

Expression and deglycosylation of ADAM 10 protease (А). After transfection of HEK and HEK APP695 cells with ADAM 10 cDNA, cell lysates were immunoprecipitated with anti-HA antibody, subjected to deglycosylation with Н-glycosidase F (PNGase F) (lane 3), or directly analyzed by 4�% NuPAGE gel system and Western blot. (Б) HEK and HEK ADAM 10 cells were surface-biotinylated. After immunoprecipitation with anti-HA antibody (16B12) and elution of the immune complexes, four-fifths of the eluate were incubated with immobilized streptavidin (lanes a), and the remaining one-fifth was directly applied to a 10% SDS/PAGE gel (lanes b) and then blotted onto PVDF membranes.

The localization of ADAM 10 in transfected HEK cells was investigated by cell surface biotinylation and confocal microscopy. For biotinylation, cells were cooled to 4ଌ and incubated for 30 min with sulfo-Н-hydroxysuccinimidobiotin, a membrane-impermeant biotinylation reagent. Immunoprecipitation was performed with the anti-HA mAb. Four-fifths of collected immunoprecipitates were incubated with immobilized streptavidin to recover protease molecules localized on the plasma membrane. Fig. ​ Fig.2 2 Б shows the appearance of both the processed �-kDa form of ADAM 10, as well as its 90-kDa precursor at the cell surface (lanes a). One-fifth of the immunoprecipitate that was not incubated with streptavidin predominantly showed the nonprocessed 90-kDa form and only a faint band of proteolytically activated ADAM 10 (lanes b). These results demonstrate that the proteolytically activated form of ADAM 10 is localized mainly on the cell surface, where it is able to cleave APP. The majority of ADAM 10 was found intracellularly as proenzyme. Analysis of the localization of ADAM 10 by confocal microscopy of permeabilized HEK ADAM 10 cells showed that its staining pattern largely overlapped with that of the Golgi marker 58K (Fig. ​ (Fig.3). 3 ).

Colocalization of ADAM 10 and of a Golgi marker in HEK cells. Stably expressed ADAM 10 and the Golgi network were simultaneously immunostained. (Сол) Anti-Golgi 58K protein. (Дұрыс) Anti-HA-epitope staining. The high degree of overlap of both immunoreactivities in the perinuclear region reveals a strong colocalization of ADAM 10 and the trans-Golgi marker. The scale bar is in μm.

Effect of ADAM 10 on α Secretase Cleavage of APP in HEK Cells.

The α-secretase activity in HEK ADAM 10 cells was compared with the activity found in untransfected HEK cells. The release of APPs into the medium from cells was monitored with two site-specific antibodies, 1736 and 6E10, both of which recognize the N-terminal sequence of Aβ and thus only detect APPsα, and not APPsβ. Immunoblot experiments and immunoprecipitation after metabolic labeling with 35 S were performed to determine α-secretase activity (Figs. ​ (Figs.4 4 and ​ and5). 5 ). Quantitative analysis of immunoblot experiments with mAb 6E10 showed that HEK cells stably expressing a high level of ADAM 10 release approximately four times more APPsα into the medium compared with untransfected HEK cells (Fig. ​ (Fig.4, 4 , lanes 1 and 4). Increased α-secretase activity was also observed in the HEK APP695 cell clone stably expressing ADAM 10. The relative increase of APPs751α derived from endogenous APP and of APPs695α was only 2-fold (Fig. ​ (Fig.4 4 А, lanes 7 and 8), because of the lower expression level of ADAM 10 (Fig. ​ (Fig.2, 2 , lane 5) and the higher substrate to enzyme ratio.

Secretion of APPsα from HEK and HEK ADAM 10 cells. (А) Cells were incubated in the presence of indicated compound. After 4 hr, the medium was collected, and proteins were precipitated and subjected to immunoblot analysis with antibody 6E10 followed by a 35 S-labeled anti-mouse IgG antibody. (Б) Quantitative analysis of secreted APPsα. The radioactive bands corresponding to APPsα were quantified with the Bio-Imaging analyzer model BAS-1800. The results are expressed as percentage of secreted APPsα in control HEK cells and are the averages ±SD of at least three experiments.

Effect of ADAM 10 on the production of APPsα and on the 10-kDa C-terminal fragment. (А) Cells were metabolically labeled with l -[ 35 S]methionine and [ 35 Sלysteine (200 㯌i/ml) for 5 hr. Cell media were immunoprecipitated with antibody 1736 and analyzed by SDS/PAGE in 10% gels. (Б) Cell lysates were immunoprecipitated with antibody C7. The samples were separated by 10�% Tris/Tricine gel (Novex) and analyzed as described. (C) Quantitative analysis of holo-APP and p10. The values of p10 were normalized to the levels of holo-APP. The results are the averages ±SD of four experiments. Statistical significance between control cells and HEK ADAM 10 cells was determined by Student’s unpaired т test (∗, П < 0.005).

Hydroxamic acid-based zinc metalloprotease inhibitors have recently been shown to inhibit the ectodomain shedding of several membrane proteins including the α-secretase cleavage of APP. No effect on the release of APPsβ has been found (40). We therefore investigated the effect of the hydroxamic acid-based inhibitor BB-3103 on HEK cells and on HEK cells overexpressing ADAM 10. BB-3103 inhibited the release of APPsα in HEK cells by about 40% (Fig. ​ (Fig.4, 4 , lanes 1 and 3) and in HEK ADAM 10 cells by about 70% (Fig. ​ (Fig.4, 4 , lanes 4 and 6).

The stimulation of protein kinase C by phorbol esters strongly enhances the release of APPsα and inhibits the secretion of Aβ (41, 42). To examine the effect of protein kinase C stimulation on ADAM 10 activity, HEK and HEK ADAM 10 cells were treated with 1 μM phorbol 12-myristrate 13-acetate (PMA). Immunoblot experiments showed that PMA increased APPsα release from HEK cells about 6.0-fold (Fig. ​ (Fig.4, 4 , lanes 1 and 2). The augmented α-secretase activity from HEK ADAM 10 cells was further increased 2.5-fold (Fig. ​ (Fig.4, 4 , lanes 4 and 5).

Similar results were observed in immunoprecipitation experiments with antibody 1736, thus the expression of ADAM 10 in HEK cells significantly increased APPsα secretion into the medium (Fig. ​ (Fig.5 5 А). To determine whether ADAM 10 expression also increases the level of p10, cell lysates from HEK and HEK ADAM 10 cells after metabolic labeling were immunoprecipitated with antibody C7 recognizing the C-terminal part of APP. As shown in Fig. ​ Fig.5 5 Б және C, the expression of full-length APP (holo-APP) is not changed, whereas the signal for p10 is significantly stronger in HEK ADAM 10 cells than in control cells, further indicating that ADAM 10 has α-secretase activity.

Effect of a Dominant Negative ADAM 10 Mutant on α Secretase Activity.

To determine whether the human homologue of ADAM 10 is expressed in HEK cells and, therefore, might be responsible for the endogenous α-secretase activity, we performed reverse transcriptase–PCR analysis using total RNA obtained from these cells and oligonucleotides specific for ADAM 10. As shown in Fig. ​ Fig.6 6 А, HEK cells express detectable amounts of mRNA encoding for human ADAM 10, which shows 97% identity of amino acids with bovine ADAM 10. In a control experiment, bovine ADAM 10 mRNA was detected in total RNA of MDBK cells known to express ADAM 10 (24).

Inhibition effect of a dominant negative ADAM 10 protease form (DN). (А) Endogenous expression of ADAM 10 in HEK and MDBK cells detected by reverse transcriptase–PCR. In each case a 541-bp DNA fragment could be amplified. As control, RNA from HEK cells was treated with RNase A before reverse transcription (St, DNA molecular weight marker). (Б) Quantitative analysis of secreted APPsα after immunoblot analysis. The results are expressed as percentage of secreted APPsα in control HEK cells and are the averages ±SD of at least three experiments. Statistical significance between control cells and HEK˽N cells treated or untreated with PMA was determined by Student’s unpaired т test (∗, П < 0.005 ∗∗, П < 0,001).

To inhibit the endogenous α-secretase activity in HEK cells, the point mutation E384A was introduced into the zinc binding site of the bovine ADAM 10 protease. A mutant KUZ protein with a mutation at the same site acted as a dominant negative form in D. melanogaster (21). HEK cells stably expressing the mutant ADAM 10 E384A (HEK˽N) showed a substantially decreased secretion of APPs. The inhibitory effect was most apparent in PMA-treated cells: only about 25% of enzymatic activity was observed (Fig. ​ (Fig.6 6 Б). Thus, this point mutation resulted in a dominant negative form of the protease and significantly decreased constitutive and stimulated α-secretase activity.


Талқылау

Mechanistic and structural implications

We have successfully demonstrated that controllable cleavages of recombinant proteins can be achieved using the engineered Ssp DnaB S1 split-intein. One part of the split-intein is embedded in the precursor protein, and the complementary part of the split-intein is added транс when needed to activate the desired cleavage reaction. In the C-cleavage design, the 144-aa IC sequence in the precursor protein could not undergo C-cleavage on its own, which demonstrates for the first time that the 11-aa IН sequence from the N-terminus of the intein is required for C-cleavage (through Asn cyclization) at the C-terminus of the intein. ИН sequence is not known to participate directly in catalyzing Asn cyclization therefore, its effect is more likely structural. In the intein crystal structure, IН is located together with the C-terminal part (including the Asn residue) of the intein in a catalytic pocket 20 therefore, the deletion of IН might have left a structural void in the catalytic pocket and thus affected cyclization of Asn. ИC was activated to undergo C-cleavage when the missing IН was added as a synthetic peptide, indicating that the IН can associate with the IC транс to reconstitute an active intein. ИН peptide lacked an N-extein therefore, the C-cleavage reaction (Asn cyclization) must have occurred without the first two steps (acyl shift and транс-esterification) of the protein splicing mechanism.

In the N-cleavage design, the 11-aa IН sequence was embedded in the precursor protein, and the separately produced IC protein must recognize and associate with the short IН жүйелі транс, in order for N-cleavage to occur. The reconstituted intein (IC plus IН) must have catalyzed an N-S acyl shift at the N-terminus of IН, and the resulting ester bond was hydrolyzed to complete the N-cleavage reaction. DTT increased the rate constant and the efficiency of the N-cleavage reaction by ∼10-fold and more than 4-fold, respectively, which is likely due to DTT promoting thiolysis of the ester bond, which occurs more rapidly than cleavage by hydrolysis.

The success of our N-cleavage design also for the first time reveals an interesting structural flexibility of the IC protein, as the IC protein could functionally assemble with the 11-aa IН sequence even when the IН was sandwiched between two large protein domains. The crystal structure of the Ssp DnaB mini-intein, from which the S1 split-intein was derived, is shaped like a disk or closed-horseshoe, 20 and the 11-aa IН sequence runs almost perpendicularly through the center of the disk-like structure [Fig. 8(A)]. The 11-aa IН sequence forms two small β-strands named β1 and β2. The β2 part of IН interacts with the β3 part of the IC protein to form an antiparallel β-sheet, which may contribute to the association between IН within the precursor protein and the IC protein. The β1 part of IН is buried deeply inside the intein structure and is enclosed by three β-strands (β5, β6, and β10) of the IC protein. It appears spatially impossible for the IН sequence to simply insert or thread itself through the central cavity of the IC protein, because in the precursor proteins tested, the IН sequence was sandwiched between two relatively large globular protein domains (the 42-kDa maltose-binding protein at the N-terminus, and proteins ranging from the 12.5-kDa thioredoxin to the 116-kDa β-galactosidase at the C-terminus). A more likely scenario is that the IC protein is structurally flexible enough to open up like a clamp so that it could saddle onto the IН sequence within the precursor protein, and then close around the IН sequence to form the active intein [Fig. 8(B)]. It is also possible that the IC protein preexists in an open-clamp structure and can change to the closed-disk-like structure only upon association with the IН sequence. The structural flexibility of the intein could be manifested by the two long β-strands (β5 and β10), which together form the backbone of the disk-like structure of the intein.

Structural modeling of IC association with IН for the N-cleavage. (A) Schematic representation of the precursor protein before and after association with the IC protein. Ribbon structures of IН (red) and IC (yellow) are adapted from a crystal structure of the Ssp DnaB mini-intein that was split into the IН және менC parts, with some of the 12 β-strands numbered according to the original crystal structure. 20 The precursor protein consists of the 11-aa IН (β-strands 1 and 2, red) sandwiched between a maltose-binding protein (MBP) and a thioredoxin (Trx). The 42-kDa MBP and the 12.5-kDa Trx are shown as round balls but not drawn to scale relative to the 17-kDa intein (IН plus IC). (B) A hypothetical model for association of IC with IН. In the first step, a transient conformational change of the IC protein loosens its structure into an open-horseshoe shape. In the second step, the IC protein saddles onto IН and closes up to form the disk-like structure of an active intein.

Our ability to precisely control the N-cleavage and the C-cleavage reactions permitted easy analysis of the reaction kinetics. Interestingly, the N-cleavage rate constant of this Ssp DnaB S1 split-intein is significantly lower than the previously reported N-cleavage rate constants of (1.0 ± 0.5) × 10 −3 s −1 for the Ssp DnaE S0 split-intein 21 and 1.9 × 10 −3 s −1 for the Сах VMA S0 split-intein. 22 This may be due to the very different amino acid sequences of these inteins, although the crystal structures of inteins are generally highly conserved. The different rate constants may be more likely due to the different split sites of these inteins, because the Ssp DnaB S1 split-intein is split at the S1 site near the N-terminus of the intein sequence, whereas the Ssp DnaE split-intein and the Сах VMA split-intein are split at the S0 site closer to the middle of the intein sequence. Different split sites have been noted to affect the rate constant of транс-splicing reactions. The Ssp DnaB S0 split-intein and the Ssp DnaB S1 split-intein, which were derived from the same natural intein, showed транс-splicing rate constants of (9.9 ± 0.8) × 10 −4 s −1 and (4.1 ± 0.2) × 10 −5 s −1 , respectively, 19 , 22 which differed by more than an order of magnitude. Unlike the N-cleavage rate constant discussed above, the C-cleavage rate constants of this Ssp DnaB S1 split-intein are quite comparable to the previously reported C-cleavage rate constants of (1.9 ± 0.9) × 10 −4 s −1 for the natural Ssp DnaE split-intein and (1.0–1.7) × 10 −3 s −1 for the synthetic Сах VMA split-intein, 21-23 although these split-inteins have very different amino acid sequences and very different split sites. We found that the C-cleavage rate constant could be increased by ∼10-fold by substituting the Cys1 residue to the less nucleophilic Ser residue. Although the residues at the N-terminal splice junction are not known to directly participate in Asn cyclization, it appears that even small changes in amino acid side chains at the intein N-terminus can substantially affect rearrangement of chemical bonds at the C-terminal splice junction.

Potential uses and advantages of the controllable cleavages

Advantages of intein-based protein cleavage methods, compared to others such as protease-based methods, have been noted previously, 11 and our methods using intein fragments retain many of these advantages. For example, the N-cleavage method may be used to generate an activated thioester at the C-terminus of a target protein so that the target protein can be joined with another protein or peptide having an N-terminal Cys residue, using the EPL method. 8-10 Unlike protease-based methods that cleave on the C-terminal side of specific recognition sequences, our intein-based N-cleavage method cleaves on the N-terminal side of the recognition sequence (IН) and thus allows removal of the affinity purification domain (or tag) placed on the C-terminus of the target protein. The intein-based N- and C-cleavage methods may also be used together on a single target protein to produce precise and tag-free ends at both the N- and the C-termini, or to achieve cyclization of the target protein (ligation of the N- and C-termini) using the EPL approach. We have demonstrated that the C-cleavage method can be used to generate an N-terminal Cys residue on a target protein, which is needed for EPL, although the Ssp DnaB intein is naturally followed by a Ser residue. Another advantage of these intein-based methods, unlike some protease-based methods, is that inteins are believed to pose no risk of nonspecific cleavage at unintended locations.

Compared to existing intein-based methods that use contiguous inteins, our methods using the S1 split-intein completely avoid any spontaneous cleavage during expression and purification of the precursor protein. This is a significant advantage, because spontaneous cleavages often result in lower yields of the purified protein. In previous reports using contiguous inteins, unwanted spontaneous cleavages have been observed in vivo at various levels and could be as high as 90%. 9 In our C-cleavage method, the 11-aa IН peptide may not be overly expensive and laborious to use, due to the small size of the peptide. For example, cleavage of 100 mg of a 50 kDa-precursor protein may require as little as 20 mg of the IН peptide, if the peptide is used at ∼10-fold molar excess over the precursor protein to drive the cleavage reaction. The extra cost of 20 mg IН may easily be compensated by an increase in protein yield due to the prevention of spontaneous cleavage observed with other intein-based methods. This cost-effectiveness may be particularly true when producing high value proteins for research or pharmaceutical uses, when using more expensive producing cells (e.g. mammalian tissue culture), or when spontaneous cleavages are not tolerated. Lastly, the small IН peptide can be stably stored and easily removed from the cleaved proteins through simple dialysis.

The recombinant precursor proteins in this study had either a maltose-binding protein or a chitin-binding domain as the affinity binder for easy purification, but potentially other affinity binders such as the His-tag and the GST-tag may be used. We showed that the C-cleavage can also occur when the precursor protein is bound to chitin beads and incubated with the IН peptide therefore, this C-cleavage method may be used in a single-step purification of recombinant proteins, using a process similar to that of the IMPACT method. 5 In such a process, cell lysate containing the precursor protein is passed through an affinity column, unbound proteins are washed away, the IН peptide is added to the column to activate the C-cleavage, and the protein of interest is released (cleaved) from the column in a pure form. We have shown the feasibility of this purification strategy by preparing two recombinant proteins (thioredoxin and eGFP) in good yields (6 and 3 mg/L of culture). Our demonstration of peptide-triggered C-cleavage with various different target proteins in solution further shows that the purification approach could be a valuable tool for the preparation of recombinant proteins.

Both N- and C-cleavage reactions presented here reached efficiencies of >90% under optimal conditions, which is comparable to or higher than the cleavage efficiencies of previous methods using contiguous inteins. The N-cleavage method in this study also showed a much higher (∼95%) cleavage efficiency compared to the previously reported IMPACT method using contiguous inteins, 5 probably because the shorter IН sequence embedded in the precursor protein less likely causes protein misfolding.


Аннотация

Фон:Developments in ‘soft’ ionisation techniques have revolutionized mass-spectro-metric approaches for the analysis of protein structure. For more than a decade, such techniques have been used, in conjuction with digestion b specific proteases, to produce accurate peptide molecular weight ‘fingerprints’ of proteins. These fingerprints have commonly been used to screen known proteins, in order to detect errors of translation, to characterize post-translational modifications and to assign diulphide bonds. However, the extent to which peptide-mass information can be used alone to identify unknown sample proteins, independent of other analytical methods such as protein sequence analysis, has remained largely unexplored.

Нәтижелер: We report here on the development of the molecular weight search (MOWSE) peptide-mass database at the SERC Daresbury Laboratory. Practical experience has shown that sample proteins can be uniquely identified from a few as three or four experimentally determined peptide masses when these are screened against a fragment database that is derived from over 50 000 proteins. Experimental errors of a few Daltons are tolerated by the scoring algorithms, thus permitting the use of inexpensive time-of-flight mass spectrometers. As with other types of physical data, such as amino-acid composition or linear sequence, peptide masses provide a set of determinants that are sufficiently discriminating to identify or match unknown sample proteins.

Қорытынды: Peptide-mass fingerprints can prove as discriminating as linear peptide sequences, but can be obtained in a fraction of the time using less protein. In many cases, this allows for a rapid identification of a sample protein before committing it to protein sequence analysis. Fragment masses also provide information, at the protein level, that is complementary to the information provided by large-scale DNA sequencing or mapping projects.


МАТЕРИАЛДАР МЕН ТӘСІЛДЕР

Mutant Strains

All of the mutant strains of Chlamydomonas reinhardtii used in this study have been described previously (see Table 2). The oda2 allele used was pf28 (Mitchell and Rosenbaum, 1985). Cells were maintained on minimal medium using standard procedures (Harris, 1989).

Cell Cytoplasmic Extract

Хламидомонадалар cells were grown in 500 ml of liquid M medium (Sager and Granick, 1953) with aeration in continuous light to a density of 10 6 cells/ml, harvested by centrifugation (550 × g for 6 min at 22°C), and resuspended in ice-cold HMDEK (10 mM HEPES, 5 mM MgSO4, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 25 mM potassium chloride, pH 7.4) to a total of 500 μl. The suspension was transferred to a 1.5-ml microfuge tube that contained an equal volume of acid-washed glass beads (1 mm) and vortexed at setting 6.5 on a Genie II vortexer for 1 min. Cell suspensions were then centrifuged using a Beckman L8 centrifuge at 48,000 ×g, at 4°C for 2 h. Supernatants were either used for immunoprecipitation as described below or mixed with 0.25 volume of 4× sample buffer (8% SDS, 40% glycerol, 125 mM Tris-HCl, pH 6.8, with Pyronin Y added as tracking dye) and β-mercaptoethanol, to a final concentration of 0.7 M, and stored at −20°C for SDS-PAGE. Pellets were resuspended in 500 μl HMDEK, mixed with 0.25 volume 4× sample buffer, and stored at −20°C for SDS-PAGE. Protein concentration was determined by the Bradford dye binding method using BSA as a standard (Bradford, 1976).

Axonemal Preparation

Axonemes were isolated by the method of Witman т.б.(1978). Cells were grown in 500 ml of liquid M medium (Sager and Granick, 1953) with aeration in continuous light to a density of 10 6 cells/ml, harvested by centrifugation at 550 ×g for 6 min at 22°C, washed with 10 mM HEPES, pH 7.4, centrifuged again, and resuspended in 10 ml HMDS (10 mM HEPES, pH 7.4, 5 mM MgSO4, 1 mM DTT, and 4% sucrose). Resuspended cells were deflagellated with 400 μl 50 mM dibucaine (CIBA Pharmaceutical, CIBA-GEIGY, Summit, NJ) and diluted with 10 ml ice-cold HMDS containing 2 mM EGTA and 2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, and cell bodies were removed by centrifugation at 4°C for 7 min at 1,550 ×g. The supernatant was collected and recentrifuged as above. Cell-free supernatant was then centrifuged at 31,000 ×g to pellet axonemes, which were resuspended in HMDEK and an equal volume of 2× sample buffer. β-Mercaptoethanol was added to a final concentration of 0.7 M, and samples were stored at −20°C.

SDS-PAGE and Western Blotting

Samples were prepared and run with Tris-glycine-buffer (Laemmli, 1970) in 5% stacking gels and 5, 7, or 12% separating gels (designated in text) prepared from stocks that contained 30% acrylamide and 0.4% bis-acrylamide. Broad Range protein standards (New England Biolabs, Beverly, MA) of 212, 158, 116, 97.2, 66.4, 55.6, and 42.7 kDa were used, and gels were either stained with Coomassie Blue to show total protein or transferred to immobilon membrane (Millipore, Bedford, MA) for Western blotting following the recommendations ofBurnette (1981). Gels were soaked in transfer buffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, 10% methanol) for 10 min and transferred either at 200 mA for 12 h (Figures 2, 3, 4A, and 5) or at 300 mA for 6 h (Figures 4B and 6). Protein standard lanes were separated from sample lanes and stained with amido black. Antibody binding and detection were performed as directed in the POD chemiluminescence kit (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Briefly, transferred blots were blocked with 1% POD blocking solution for 1 h at room temperature, incubated with the primary antibody in 0.5% POD blocking solution for 3 h at room temperature, washed with TBST (50 mM Tris base, 150 mM NaCl, pH 7.5, with 0.1% Tween-20 [vol/vol]) 2 × 10 min, washed with 0.5% POD blocking solution 2 × 10 min, incubated with secondary antibody in 0.5% POD blocking solution for 1 h at room temperature, washed with TBST four times for 10 min, and then incubated with developing solution for 1 min and exposed to Biomax film (Eastman Kodak, Rochester, NY). Antigen quantitation was estimated by comparison with a blot of an antigen dilution series (2, 1, 0.8, 0.6, 0.4, 0.2, 0.1 x WT control) processed in parallel.

Fig. 2. Specificity of antibody B3B. WT andoda11 flagella, run on 5% gels and blotted to PVDF membrane, were probed with C11.6 (left panel), which detected equal levels of HCβ in both samples. A parallel blot probed with antibody B3B (right panel) detected a single band in WT flagella that is missing in flagella of HCα assembly mutant oda11. Antibodies were detected with a peroxidase-linked secondary antibody and chemiluminescent detection.

Antibodies

Anti-HCβ mAb C11.6 was concentrated by ammonium sulfate precipitation from hybridoma culture supernatants and used at a 1:100 dilution. It was generated from the same fusion as C11.13 (Mitchell and Rosenbaum, 1986). Anti-IC70 mAb 1869A ascites was used at 1:2000 dilution. Anti-IC78 mAb 1878A hybridoma culture supernatant was kindly donated by Dr. G. Witman (King т.б., 1985) and was used at a 1:2 dilution. Anti-HCα polyclonal antibody B3B was produced in a rabbit by immunization with a purified bacterial fusion protein. A 1-kilobase (kb) Pmlмен/HpaI fragment of HCα cDNA pBcA6 (Mitchell and Brown, 1997), which encodes amino acids 512–838 of HCα (a region unrelated to other DHC sequence and that contains the HCα EPAA repeat element), was cloned into vector pGEX-4T-2 (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) at a SmaI site and was transformed into DH5αF′ E. coli. Fusion protein expression was induced for 3 h with 0.1 mM isopropyl-β-thiogalactopyranoside at 37°C. Fusion protein was solubilized and purified by the method ofFrangioni and Neel (1993), run on an SDS-PAGE gel, transferred to nitrocellulose, and visualized with Ponceau S. Nitrocellulose strips containing the protein of interest were dissolved in dimethyl sulfoxide, mixed with adjuvant, and used for immunization. Specific antibodies were affinity purified from whole sera using Western blots of the fusion protein (Frangioni and Neel, 1993) and were used at a dilution of 1:50. Anti-HCγ mAb 25–8, kindly donated by Dr. G. Piperno (King and Witman, 1988), was used at a 1:10 dilution. Peroxidase-labeled goat anti-mouse or goat anti-rabbit secondary antibodies (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) were used at a 1:6000 dilution.

Immunoprecipitation

Cell extracts (0.5 ml) were mixed in a 15-ml conical tube with an equal volume of ice-cold immunoprecipitation (IP) buffer (HMDEK, 75 mM NaCl, 0.01% thimersol, 0.5 mM PMSF, 3% BSA, 0.1% Triton X-100, pH 7.5) and preabsorbed with 25 μl of 50/50 (vol/vol) protein A agarose in IP buffer for 30 min on ice. mAb anti-HCβ antibody C11.6 was added to preabsorbed extracts and incubated for 3–4 h at 4°C. A 100-μl volume of 50/50 (vol/vol) protein A agarose (Sigma Chemical, St. Louis, MO) in IP buffer was added, and the tubes were mixed gently for 1 h. Agarose beads were washed three times with IP buffer containing 0.05% Triton X-100. Immune complexes were eluted by addition of 2× sample buffer containing 0.7 M β-mercaptoethanol and incubation for 2 min in boiling water. The quantity of HCβ immunoprecipitated with antibody C11.6 from wild-type andoda mutant cytoplasmic extracts was determined from preliminary Western blots. Subsequent loads of immunoprecipitate samples were adjusted to include equal amounts of HCβ.

Partial Acid Hydrolysis

Western blots of proteins subjected to partial acid hydrolysis were generated by a modification of the method described by Clevelandт.б. (1977). Briefly, cytoplasmic extracts or whole axonemes were run on an SDS-PAGE gel along with molecular weight markers. The gel was stained in 0.1% Coomassie blue, 50% methanol, and 10% acetic acid for 30 min and destained in 5% methanol and 10% acetic acid for 45 min. Bands of ∼70 kDa molecular mass were cut from the gel and soaked 30 min in 0.125 M Tris/HCl, pH 6.8, 0.1% SDS, 1 mM EDTA. Slices were then lyophilized and either stored frozen at −20°C (controls) or incubated with 70% formic acid for 16 h at 37°C, washed with 50% methanol, and lyophilized. Gel slices were then rehydrated with buffer (1% SDS, 10 mM Tris/HCl, pH 8, 0.1% β-mercaptoethanol, and 10% glycerol) for 6 h, pushed into the bottom of an SDS-PAGE well, and overlayed with 10 μl of Tris/HCl buffer containing 20% glycerol for electrophoresis and transfer to PVDF membranes.


9.9 Test Prep for AP Courses

  • Сіз осындасыз:  
  • Үй
  • Қолшатыр
  • Андовердің табиғаты
  • Филлипс академиясының жабайы табиғатына арналған далалық нұсқаулық
  • Брозоа
  • Филлипс академиясының жабайы табиғатына арналған далалық нұсқаулық: Брозоа

Бұл мәтін AP курстарына арналған Openstax биологиясына негізделген, аға авторлар Джулианна Зедалис, Ла Джолладағы епископ мектебі, Калифорния, Джон Эггебрехт, Корнелл университетінің авторлары Яэл Ависар, Род-Айленд колледжі, Юнг Чой, Джорджия технологиялық институты, Жан ДеСаикс , Чапел Хиллдегі Солтүстік Каролина университеті, Владимир Джуруковски, Саффолк округінің қоғамдық колледжі, Конни Рай, Шығыс Миссисипи қоғамдық колледжі, Роберт Уайз, Висконсин университеті, Ошкош

Бұл жұмыс Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 Unported лицензиясы бойынша лицензияланған, қосымша шектеулер жоқ.


Бейнені қараңыз: Химия пәні тақырып Ақуыздар (Ақпан 2023).