Ақпарат

A3. Димеризация және көп байланыстыру орындары - Биология

A3. Димеризация және көп байланыстыру орындары - Биология


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Алдыңғы мысалдарда төмендегі теңдеуде сипатталғандай, M макромолекуласының L лигандты бір жерде байланыстыру жағдайын қарастырдық:

[M + L ightleftharpoons ML ]

қайда

[K_d = dfrac{[M][L]}{[ML]}. label{1}]

Біз байланыстыру қисықтары ((ML) қарсы (L) немесе (Y) қарсы (L) болатынын көрдік. гиперболалық, жартылай максималды байланыстыру кезінде (K_d = L) бар.

Бұл тепе-теңдіктің ерекше, бірақ кең таралған мысалы, төменде көрсетілгендей, макромолекула өзін-өзі димер түзу үшін байланыстырғанда пайда болады:

[ M + M ightleftharpoons M^2 = D ]

мұндағы (D) - димер, және қайда

[K_d = dfrac{[M][M]}{[D]} = dfrac{[M]^2}{[D]} label{11} ]

Бір қарағанда, ([D]) қарсы ([M]) графигі гиперболалық болады, (K_d) қайтадан ([M]) жартылай максималды мәнге тең болады деп күтуге болады. димер концентрациясы. Бұл дұрыс болып шықты, бірақ қарапайым туынды ретті, өйткені алдыңғы туындыда (M_o) бекітілген және (L_o) өзгерген деп есептелген. Димер түзілу жағдайында бұрынғы туынды өрнекте (M) және (L) екеуін де үстірт көрсететін (M_o) екеуі де өзгереді.

Тағы да (M_o) үшін массалық баланс өрнегі жазылуы мүмкін:

[[M_o] = [M] + 2[D] белгі{12}]

мұнда 2 коэффициенті қажет, өйткені олардың әрбір димерінде 2 М.

Жалпы алғанда, тримерлердің (Три), тетрамерлердің (Тетра) және басқа да олигомерлердің пайда болуы үшін,

[ [M_o] = [M] + 2[D] + 3[Три] + 4[Тетра] + : .... label{13} ]

ef{12} теңдеуін қайта реттеу және (M) үшін шешу береді

[[M] = [M_o] -2[D] белгі{14}]

ef{14} теңдеуін (K_d) өрнекке ( ef{1} теңдеуі) ауыстыру

[K_d = dfrac{(M_o-2D)(M_o-2D)}{D} ]

мұнда квадрат түрге қайта орналастыруға болады:

[4D2 - (4M_o+K_d)D + (M_o)^2 = 0 белгі{15} ]

ол (y = ax^2+bx+c) түрінде болады. Квадрат теңдеуді шешу кез келген берілген ([M_o] кезінде ([D]) береді. Мән (Y), ұқсас бөлшек қанықтығы, есептеуге болады, мұнда (Y) - 0-1 аралығында өзгеруі мүмкін жалпы мүмкін (D) бөлігі.

[Y = dfrac{2[D]}{[M_o]} label{16}]

Димерлену диссоциациясының тұрақтысы (K_d = 25, mu M) болатын (Y) vs (M_o) графигі төменде көрсетілген.

1-сурет: макромолекуланың димеризациясы үшін қанығуды байланыстыру қисығы

Жалпы (M) концентрациясында (M_o = K_d) болатын жартылай максималды димер түзілуімен қисық гиперболалық болып көрінетінін ескеріңіз. Сонымен қатар, 40x (K_d) болатын (M_o = 1000 ,mu M) кезінде де жалпы мүмкін болатын (D) 90% ғана түзілетінін ескеріңіз ((Y = 0,90) )). Қарапайым үшін

[M + L <=> ML]

тепе-теңдік, егер (L_o) = 40x (K_d) және (M_o ll L_o), онда

[ Y = dfrac{L}{K_d+L} = dfrac{L}{(L/40)+L} = 0,976 ]

Ақуыз мономерінің агрегаттық күйі оның биологиялық белсенділігімен тығыз байланысты. Димерлерді түзе алатын белоктар үшін кейбіреулері мономерлік күйде белсенді, ал басқалары димер ретінде белсенді. Рентген құрылымын талдау үшін ақуыз кристалданған жағдайда табылған жоғары концентрациялар белоктарды димерлі күйге түсіруі мүмкін, бұл белсенді ақуыз димер деген жалған қорытындыға әкелуі мүмкін. ([M_o]) және (K_d) нақты физиологиялық концентрациясын анықтау зерттеушілерге биологиялық белсенділікпен байланысты болуы мүмкін (Y) мәні туралы білім береді. Мысалы, интерлейкин 8, белгілі бір иммундық жасушаларды байланыстыратын хемокин рентгендік және ЯМР құрылымдық анықтауда димер ретінде, бірақ физиологиялық концентрацияларда мономер ретінде болады. Демек, димер емес, мономер өзінің рецепторларын иммундық жасушалармен байланыстырады. Вирустық протеазалар (герпес вирустық протеаза, АИВ протеаза) димерлі түрде белсенді, олардың белсенді учаскесі димер интерфейсінде түзіледі.

Тағы бір ерекше жағдай: L әр түрлі Kds бар 2 сайтқа байланыстыру

Kds салыстырмалы өлшемдері оған қалай әсер ететінін көру үшін интерактивті графикті қараңыз.

Wolfram Mathematica CDF ойнатқышы - L сайтын 2 сайтқа байланыстыру (тегін плагин қажет)


FZD7 ортологтары бойынша салыстырмалы интегромика: сүтқоректілердің FZD7 ортологтарының 5'-промотор аймағындағы PU.1, SP1, CCAAT-box және TCF/LEF/SOX транскрипция факторлары үшін сақталған байланыстыру орындары

Канондық WNT сигналдары MYC, CCND1, FGF20, JAG1, WISP1 және DKK1 гендерін жоғары реттеу үшін Frizzled (FZD) отбасы рецепторы және LRP5/LRP6 коорецепторы арқылы түрленеді, ал канондық емес WNT сигналдары FZD отбасы рецепторы және PTK7R2 арқылы түрленеді. RHOA/RHOU/RAC/CDC42, JNK, PKC, NFAT және NLK сигналдық каскадтарын белсендіру үшін /RYK ко-рецепторы. Қалыпты асқазан-ішек жолында көрсетілген FZD7 өңеш қатерлі ісігінде, асқазан қатерлі ісігінде, колоректальды обырда және гепатоцеллюлярлық карциномада жоғары реттеледі. Мұнда шимпанзе FZD7 және сиыр Fzd7 гендер биоинформатика (Техинт) және адам интеллектісі (Humint) көмегімен анықталып, сипатталды. Шимпанзе FZD7 және сиыр Fzd7 гендері сәйкесінше NW_001232110.1 және AC173037.2 геномдық тізбектерінде анықталды. Шимпанзе FZD7 және сиыр Fzd7 адам FZD7-мен 100% және 97,2% жалпы амин қышқылы сәйкестігін көрсетті. Адамның FZD7 және адамның FzE3 арасында алмастырылған тоғыз амин қышқылы қалдықтарының барлығы шимпанзе, сиыр, тышқан және егеуқұйрық FZD7 ортологтарындағы адамның FZD7 қалдықтарымен бірдей болды. Бірнеше клондау артефактілері және/немесе реттілік қателері бар FzE3 пайдаланатын функционалдық талдаулар жарамсыз. FZD7 ортологтары жасушадан тыс Frizzled домені, 5-ші трансмембраналық домен айналасындағы лейцин сыдырма мотиві және цитоплазмалық DVL және PDZ байланыстыратын мотивтері бар жеті трансмембраналық ақуыздар болды. FZD7 ортологтарының Ser550 және Ser556 болжамды aPKC фосфорлану орындары болды. FZD7 арқылы сигнал берудің реттеуші механизмдері ретінде димеризация және Ser550/556 фосфорлануы болжанған. Адамның FZD7 генінің транскрипциялық бастапқы орны NM_003507.1 RefSeq 5'-соңынан жоғары 735 б.б. болды. Асқазан-ішек қатерлі ісігінен, гепатоцеллюлярлық обырдан және ұйқы безінің қатерлі ісігінен басқа, адамның FZD7 mRNA-лары бластоцисттерде, дифференциацияланбаған эмбриональды дің (ES) жасушаларында, ES-ден алынған эндодермальды прогениторларда, ES-туындысынан алынған нейрондық прогениторларда, ES-ден алынған нейрондық прогениторларда, ұрықтың шырышты қабықшасы эпителиінде, ұрықтың шырышты қабығының эпителиінде экспрессияланды. бауырды қалпына келтіреді және көп склероз. Салыстырмалы геномикалық талдаулар PU.1, SP1/Krüppel тәрізді, CCAAT-бокс және TCF/LEF/SOX транскрипция факторларын байланыстыру орындары сүтқоректілердің FZD7 ортологтарының 5'-промоторлық аймақтарында сақталғанын көрсетті.


Антибиотиктерді байланыстыру TipA мультирезистенттік транскрипциялық реттегішінің аутоингибициясын босатады.

Бактерияларға төзімділік стратегияларын зерттеу бактериялық антибиотиктерге төзімділіктің бүкіл әлемде таралуына қарсы шара ретінде жаңа микробқа қарсы препараттарды жасауға көмектесуі мүмкін. Осындай стратегиялардың бірі әртүрлі антибиотиктерге қарсы ең аз автореттелген көп дәрілік төзімділік (MDR) жүйелерін құрайтын TipA транскрипция факторларының класын қамтиды. Дегенмен, бізде антибиотиктердің байланысуы осы процеске кедергі келтіруі мүмкін дизайн молекулаларына транскрипциялық белсендіруді қалай тудыратыны туралы ақпарат жеткіліксіз. Көбірек білу үшін біз Caulobacter crescentus-тен SkgA кристалдық құрылымын TipA протеинінің өкілі ретінде анықтадық. Біз күтпеген кеңістіктік бағдарды және антибиотикті байланыстыратын TipAS эффекторлық доменінің апо күйінде орналасуын анықтадық. Байланысқан антибиотикті мықтап жабу үшін антибиотикті байланыстыратын саңылаудың қақпағын қалыптастыруға канондық жауап беретін TipAS доменінің α6-α7 аймағы димерлік интерфейске қатысатынын және ДНҚ-байланыстырушы доменмен өзара әрекеттесу арқылы тұрақтанғанын байқадық. апо мемлекеті. Одан әрі құрылымдық және биохимиялық талдаулар байланысылмаған TipAS доменінің промотор ДНҚ байланысуына стерильді түрде кедергі жасайтынын, бірақ оның α6-α7 аймағының ауыстырып-қосқышы арқылы осы аутоингибирлеуді босату үшін антибиотикпен байланысу кезінде керемет конформациялық ығысуға ұшырайтынын көрсетті. Осылайша, MDR гендерінің промоторлары, соның ішінде tipA және РНҚ полимеразалары антибиотиктерге тиімді төзімділікті қамтамасыз ететін транскрипцияға қол жетімді болады. TipA протеиндерін белсендірудің молекулярлық механизмі туралы бұл түсініктер TipA ақуыздары, сондай-ақ бактериялық MDR жүйелері туралы түсінігімізді жақсартады және бактериялық төзімділікті блоктау үшін маңызды анықтамалар бере алады.

Түйін сөздер: ДНҚ-байланыстырушы ақуыз TipA белсендіру механизмі антибиотиктерге төзімділік аутоингибирлеу кристалдық құрылым Дәрілік төзімділік көп дәріге төзімділік (MDR) құрылымы биология транскрипция промоутері транскрипцияны реттеу транскрипция реттеушісі.

Copyright © 2020 © 2020 Jiang et al. Elsevier Inc. басып шығарған. Барлық құқықтар қорғалған.

Мүдделер қақтығысы туралы мәлімдеме

Мүдделер қақтығысы — Авторлар осы мақаланың мазмұнына ешқандай мүдделер қақтығысы жоқ деп мәлімдемейді.

Авторлар осы мақаланың мазмұнына ешқандай мүдделер қақтығысы жоқ деп мәлімдейді


Биохимия - байланыстырушы ақуыздар

Ол лиганд пен ақуыздың байланысу тиімділігін сипаттайды.

Kd мәні неғұрлым аз болса, соғұрлым күштірек болады, себебі Kd = P L/PL, Kd соғұрлым үлкенірек байланыстыру әлсіз болады.

Жасушалық жауап - бұл Т-лимфоциттерді қолдануды қамтитын иммундық жауаптың бір түрі, онда олар антигеннен құтыла алады.

Бұл жерлер эпитоптар деп аталады.

Айнымалы домен антиденедегі эпитопты тану үшін қолданылады.

Оның жоғары авидтілігі бар, яғни бір байланыстыру оқиғасы антиген арасындағы басқа байланысу оқиғасына әкелуі мүмкін.

Мысалы, эпитопты тану және байланыстыру үшін бір сайты бар Fab аймағының берілген жақындығы бар.

2 байланысу орны бар IgG-де оның байланысуы 100 есе көп.

Өйткені антидене ісік жасушасы үшін тиімді болмауы мүмкін, бірақ біз оның ісікке тікелей және тек ісік жасушасына түсетінін білеміз.

Бос гемде Fe2+ оттегін байланыстыра алады, бірақ ол сонымен қатар Fe 3+ түрленеді (О2 байланыстыра алмайды), сондықтан біз гемді бір нәрсемен байланыстыруымыз керек.

4 пиррол сақинасының азоттары Fe2+ құра алатын 6 мүмкін координациялық байланыстың 4-ін құрайды.

Проксимальды гистидин
Темірмен байланыс түзуге қатысады, ол гемді / темірді оттегімен байланыстыруға көмектесетін белгілі бір жолмен орналастыруға мүмкіндік береді.

Ол оттегінің төмен концентрациясында (яғни бұлшықеттердегі оттегінің концентрациясында) оттегін шығаруға қабілетті болуы керек.

Миоглобин тіпті төмен концентрацияларда (яғни бұлшықеттерде) оттегін тиімді байланыстыруы керек.

Ол оттегінің концентрациясы өте төмен болған кезде ғана (яғни, оттегінің концентраты айтарлықтай төмен тінде қажет болғанда және тереңде болғанда) шығарады.

Себебі оттегінің төмен концентрінде оттегі молекуласының айтарлықтай байланысуы болмайды, бірақ оттегінің өте жоғары концентрациясында айтарлықтай байланысуы болады.


Анықтамалар

Жером V, Мюллер Р. Ісік жасушаларына ген экспрессиясын бағыттау үшін тінге тән, жасушалық циклмен реттелетін химерикалық транскрипция факторлары Hum Gene Ther 1998 9: 2653–2659

Busch SJ, Sassone-Corsi P. Димерлер, лейцин сыдырмалары және ДНҚ-байланыстырушы домендер Трендтер Genet 1990 6: 36–40

Нойберг М, Адамкевич Дж, Хантер Дж.Б., Мюллер Р. Jun лейцин сыдырмасы бар Fos протеині AP1 байланыстыратын орынмен байланысатын гомодимерді құрайды. Табиғат 1989 341: 243–245

Кузаридтер Т, Зифф Е. Fos, jun және GCN4 лейцин сыдырмалары димеризация ерекшелігін белгілейді және осылайша ДНҚ байланысуын бақылайды. Табиғат 1989 340: 568–571

Шмидт-Дёрр Т т.б. LexA репрессорының және Jun лейцин сыдырмасының ДНҚ байланыстыру аймағынан тұратын гибридті ақуыздың құрылысы, тазартылуы және сипаттамасы: айналмалы дихроизм мен мутагенезді зерттеу Биохимия 1991 30: 9657–9664

Кузаридтер Т, Зифф Е. Фос-джун әрекеттесуіндегі лейцин найзағайының рөлі Табиғат 1988 336: 646–651

О'Ши Е.К., Рутковский Р, Стаффорд WFD, Ким П.С. Fos және jun оқшауланған лейцин сыдырмалары арқылы артықшылықты гетеродимерді қалыптастыру Ғылым 1989 245: 646–648

Шуерман М т.б. Фос протеиніндегі лейциннің қайталанатын мотиві Jun/AP-1 көмегімен күрделі түзілуге ​​делдал болады және трансформация үшін қажет. Ұяшық 1989 56: 507–516

Oas TG т.б. Ядролық магниттік-резонанстық спектроскопия арқылы анықталған лейцин сыдырмасының екіншілік құрылымы Биохимия 1990 29: 2891–2894

Шуерман М, Хантер Дж.Б., Хенниг Г, Мюллер Р. Фос және Джун лейциндік қайталануларындағы лейцинді емес қалдықтар тұрақтылыққа ықпал етеді және димеризацияның ерекшелігін анықтайды. Нуклеин қышқылдары Res 1991 19: 739–746

О'Ши Е.К., Рутковский Р, Ким П.С. Фос-Джун онкопротеин гетеродимеріндегі ерекшелік механизмі Ұяшық 1992 68: 699–708

Гловер Дж.Н., Харрисон SC. ДНҚ-мен байланысқан c-Fos-c-Jun гетеродимерлі bZIP транскрипция факторының кристалдық құрылымы Табиғат 1995 373: 257–261

Triezenberg SJ, Kingsbury RC, McKnight SL. VP16 функционалды диссекциясы, қарапайым герпес вирусының трансактиваторы геннің ертерек экспрессиясы Genes Dev 1988 2: 718–729

Часман Д.И., Корнберг РД. GAL4 протеині: тазарту, GAL80 ақуызымен байланыс және сақталған домен құрылымы Мол жасушалық биол 1990 10: 2916–2923

Dang CV т.б. Жасуша ішілік лейцин сыдырмасының өзара әрекеттесуі c-Myc гетеро-олигомеризациясын көрсетеді. Мол жасушалық биол 1991 11: 954–962

Дэвидсон Дж.Н т.б. Пиримидин биосинтезіндегі алғашқы үш ферменттің эволюциялық тарихы Биоэсселер 1993 15: 157–164

Гонтеро Б т.б. Шпинат хлоропластарынан көп ферментті кешеннің құрылымдық және функционалдық қасиеттері. 2. Агрегацияланған күйдегі ферменттердің кинетикалық қасиеттерін модуляциялау Eur J Biochem 1993 217: 1075–1082

Вальчак Х т.б. Ісік некрозының факторымен байланысты апоптозды индукциялайтын лигандтың ісік өлтіру белсенділігі in vivo Табиғат мед 1999 5: 157–163

Калдерон Д, Робертс БЛ, Ричардсон В.Д., Смит А.Е. Ядроның орнын анықтауға қабілетті қысқа аминқышқылдарының тізбегі Ұяшық 1984 39: 499–509

Ransone LJ, Verma IM. Ядролық прото-онкогендер fos және jun Annu Rev Cell Biol 1990 6: 539–557

Бұршақ М.А т.б. Қуық карциномасының жасушалық цитоуыттылығы: семинарды бағалау Рак рес 1975 35: 2902–2913

Аусубель I, Фредерик М. Молекулалық биологиядағы ағымдағы хаттамалар Джон Уайли және ұлдары: Нью-Йорк 1991 ж

Корнил I, Man S, Fernandez B, Kerbel RS. Жалаңаш тышқандардағы тері астындағы имплантациядан кейін адамның қатерлі меланомасының ісіктігі, меланогенезі және метастаздарының жоғарылауы J Natl Cancer Inst 1989 81: 938–944

Coll JL т.б. Өкпенің қатерлі ісігіндегі bax және p53 жалаңаш ген трансферінің ісікке қарсы белсенділігі: in vitro және in vivo талдау Hum Gene Ther 1998 9: 2063–2074


Белсенді HER2/HER3 рецепторлық кешенінің құрылымдары бір лигандтың байланысуы арқылы индукцияланған димеризация интерфейсіндегі динамикасын көрсетеді.

Адамның эпидермиялық өсу факторының рецепторы 2 (HER2) және HER3 өсу факторы нейрогулин-1β (NRG1β) 1-3 байланыстыру кезінде күшті про-онкогенді гетерокомплексті құрайды. HER2 және HER3 өзара әрекеттесу механизмі кешеннің кез келген құрылымдары болмаған кезде белгісіз болып қалады. Біз толық ұзындықтағы HER2/HER3 димерінің жанында NRG1β-байланысты бөліп алдық және HER2/HER3 димеризация интерфейсінде күтпеген динамикаларды ашатын жасушадан тыс домен модулінің 2,9Å крио-электрондық микроскопиясын (крио-ЭМ) қайта құруды алдық. Біз NRG1β-байланысқан HER3 димеризациясының тізбегі шешілмейтінін көрсетеміз, себебі apo HER2 мономері HER3 димеризация иін байланыстыру қалтасын орнату үшін қажетті лиганд-индукциялық конформациялық өзгеріске ұшырамайды. HER2, S310F онкогенді жасушадан тыс домен мутантының екінші құрылымында біз димеризация интерфейсін тұрақтандыратын HER3 димеризация қолымен компенсаторлық өзара әрекеттесуді байқаймыз. Біз HER2/HER3 және HER2-S310F/HER3 екеуі де HER2-бағытталған терапевтік антидене, трастузумабпен байланысу қабілетін сақтайтынын көрсетеміз, бірақ мутанттық кешен пертузумабпен байланыспайды. Біздің HER2-S310F/HER3/NRG1β/trastuzumab фрагменті антигенді байланыстыру (Fab) кешенінің 3,5Å құрылымы рецептор димерінің трастузумабты орналастыру үшін конформациялық өзгеріске ұшырайтынын көрсетеді. Осылайша, онкогендік мутациялар сияқты, терапевтика HER2/HER3 гетеродимерінің ішкі динамикасын пайдаланады. Жалғыз лигандталған HER2/HER3 гетеродимерінің бірегей ерекшеліктері димеризация интерфейсі арқылы лигандтардың орналасуын аллостериялық сезінуді атап көрсетеді және HER2 жасушадан тыс домендерінің канондық белсенді димер интерфейсі арқылы неге гомо-ассоциацияланбағанын түсіндіреді.


Трансмембраналық доменнің димеризация мотивтеріндегі нүктелік мутациялар EphA2 рецепторының тирозинкиназасының белсенді немесе белсенді емес күйін тұрақтандырады.

EphA2 рецепторының тирозинкиназасы көптеген адам тіндерінде жасуша адгезиясын және бағыттауды реттеуде орталық рөл атқарады. EphA2 активтенуі жасушадан тыс және цитоплазмалық домендердің қатысуымен болатын плазмалық мембранада дұрыс димеризация/олигомеризациядан кейін жүреді. Біздің зерттеуіміз балама глицин арқылы емес, L(535)X3G(539)X2A(542)X3V(546)X2L(549) гептад қайталанатын мотив арқылы димеризацияланған липидті бицеллаға енгізілген EphA2 оқшауланған трансмембраналық домені (TMD) анықталды. сыдырма мотиві A(536)X3G(540)X3G(544) (көптеген ақуыздардағы TMD димеризациясына тән). Толық ұзындықтағы EphA2 үшін TMD өзара әрекеттесулерінің маңыздылығын бағалау үшін біз гептад қайталанатын мотивтегі (HR нұсқасы: G539I, A542I, G553I) немесе глицин сыдырма мотивіндегі (GZ нұсқасы: G540I, G544FP) және экспрессиялық Y544I-дегі негізгі қалдықтарды ауыстырдық. HEK293T жасушаларында EphA2 (WT, HR және GZ нұсқалары) белгіленді. Конфокальды микроскопия жасушаларда барлық EphA2-YFP нұсқаларының ұқсас таралуын анықтады. EphA2-YFP нұсқаларының экспрессиясы және олардың киназалық белсенділігі (Тир(588) және/немесе Тир(594) фосфорлануы) және эфрин-A3 байланысуы бір жасуша негізінде ағындық цитометриямен талданды. Кез келген EphA2 нұсқасын белсендіру тіпті жасушалардағы EphA2 мазмұны жеткілікті жоғары болған кезде де эфринді ынталандырусыз жүреді. Эфрин-A3 байланысуы мутантты нұсқаларда әсер етпейді. TMD мутациялары EphA2 белсенділігіне айтарлықтай әсер етеді. Лигандқа тәуелді және лигандқа тәуелсіз белсенділік WT нұсқасымен салыстырғанда HR нұсқасы үшін күшейтілген және GZ нұсқасы үшін төмендетілген. Бұл нәтижелер EphA2 сигналының трансдукциясының негізінде жатқан механизм ретінде тиісінше белсенді емес және белсенді рецепторлық күйлерге сәйкес келетін гептад қайталануы және глицин сыдырма мотивтері арасында TMD димеризациясының ауысуын ұсынуға мүмкіндік береді.

Түйін сөздер: Баламалы димеризация жасушасының беткі рецепторы Eph рецепторының ағынының цитометриясы мембраналық ақуыздар ақуыздық домендер рецепторлық тирозин киназасы трансмембраналық домен.

© 2014 Американдық биохимия және молекулалық биология қоғамы, Inc.


ТАЛҚАЛАУ

Бұл зерттеу А-ның гомодимеризациясы нәтижесінде пайда болатын бірлескен әрекеттесулерді зерттеу үшін жылдам алмасу перфузиялық жүйесімен бірге конфокальды микроскопияны пайдаланды.1-ARs немесе A3-Тірі жасушалардың бетіндегі AR. А-дан айырмашылығы1-AR, бәсекелес лигандтар арасындағы жоғары кооперативтік әрекеттесулер А-да байқалды3-АР. Бұл әсерлер А-ның бірлескен экспрессиясында айтарлықтай төмендеуі мүмкін3Лиганды байланыстырмайтын A бар -AR GFP3(N250A)-AR YFP, бәсекелес лигандтар арасындағы ынтымақтастық A арасындағы өзара әрекеттесу нәтижесінде пайда болады деп болжайды.3-Жасуша бетіндегі AR. Кинетикалық деректер кейіннен тірі жасушалардағы гомодимерлі GPCR кезінде бәсекелес лигандтар арасындағы өзара әрекеттесулерді сандық анықтауға мүмкіндік беру үшін конститутивтік димеризацияның динамикалық математикалық моделіне сәйкес болды.

Классикалық GPCR фармакологиясында лигандтар екі жүйеге тәуелсіз қасиетпен, жақындықпен және ішкі тиімділікпен анықталады. Дегенмен, соңғы зерттеулер осы теориялық негізге сәйкес келмейтін GPCR лигандтарын байланыстыру және сигнал беру профильдерін анықтады. Аллостериялық лигандтардың және функционалды селективті ортостериялық лигандтардың ашылуы зондқа тәуелділік құбылысын және осылайша, есірткіге үміткерлерді скрининг кезінде қолданылатын трасерлік лиганд пен функционалдық талдауларды мұқият қарастыру талабын енгізді (6). GPCR димерлерінде немесе жоғары ретті олигомерлерде лигандтарды байланыстыру және жасушаішілік сигнализация оқиғаларын сипаттау кезінде қосымша күрделілік қабаттары енгізіледі. GPCR арасындағы гомомерлі және гетеромерлі әрекеттесу зондқа, рецепторлардың тығыздығына және тінге тәуелді болуы мүмкін. Дегенмен, GPCR-GPCR өзара әрекеттесулерінің бұл жүйеге тәуелді қасиеттері, сонымен қатар, функционалды және/немесе кеңістік-уақытша селективтілігі жоғары GPCR жасушаішілік сигнализациясын модуляциялайтын дәрілік үміткерлерді әзірлеу үшін әлеуетті жаңа терапиялық жолдарды көрсетуі мүмкін (12).

Бүгінгі күні тірі жасушалардағы GPCR димеризациясын зерттейтін зерттеулердің көпшілігінде резонанстық энергияны тасымалдау (RET) немесе BiFC сияқты әдістер қолданылған. Аденозиндік рецепторлар тобында YFP фрагменттері арасындағы BiFC екі А1-AR және А3-AR гомомерлік комплекстер құра алады (2-сурет және реф. 38 ). GPCR арасындағы BiFC және RET тірі жасушалардағы рецепторлардың жақындығын анықтауда өте күшті болуы мүмкін болса да, бұл әдістер жалғыз пайдаланған кезде GPCR-GPCR өзара әрекеттесулерінің фармакологиялық немесе физиологиялық салдарын анықтай алмайды. GPCR димеризациясы лигандтарды байланыстыруға және/немесе функцияға әсер ету үшін бірлескен өзара әрекеттесулер болуы керек, алайда тірі жасушаларда бұл құбылысты бірнеше зерттеулер зерттеді (11, 12). Зондқа тәуелді кооперативтік факторлардың сандық көрсеткіштері димерленудің лиганд-GPCR өзара әрекеттесуіне әсерін түсіну үшін механикалық негізді қамтамасыз ете алады және осылайша димер интерфейсі арқылы әрекеттесетін лигандтар үшін құрылым-белсенділік қатынастарын дамытады.

Екінші лигандтың жоқтығы мен бар болуы кезіндегі трассер лигандының диссоциациялану кинетикасын зерттеу екі топографиялық бір-бірінен ерекшеленетін байланыс орындары арасындағы бірлескен әрекеттесулерді анықтаудың сезімтал әдісі болып табылады. Осы зерттеуде пайдаланылған флуоресцентті аденозин туындысы ABA-X-BY630 бұрын жақсы сипатталған (33, 39). Екеуінде де CHO-A1 және CHO-A3 жасушалар, ABA-X-BY630 концентрацияға тәуелді түрде кальций мобилизациясын және ERK1/2 фосфорлануын ынталандыру қабілетін сақтап қалды. Наномольдік диапазондағы ABA-X-BY630 концентрацияларының ассоциациясы мен диссоциациялануының арнайы байланысу кинетикасы сәйкесінше моноэкпоненциалды байланыс пен ыдырауды бақылайды. Бұл нәтижелер бірге эндогендік аденозинге ұқсас ABA-X-BY630 классикалық ортостериялық агонист ретінде әрекет ететінін көрсетеді.1-АР және А3-АР. Селективті емес аденозин рецепторларының антагонисті XAC және селективті емес аденозин рецепторларының агонистері NECA және аденозин ABA-X-BY630 диссоциациясына әртүрлі әсер етті.1-АР және А3-АР. A3-AR-да селективті емес лигандтардың әрқайсысы ABA-X-BY630 диссоциациясында >9 есе күшеюіне делдал болды (5А-сурет). Керісінше, А1-AR, лигандтардың әрқайсысы шағын,

1,5 есе, ABA-X-BY630 диссоциациясының жоғарылауы (5В-сурет). А нүктесінде ABA-X-BY630 диссоциациясына бәсекелес лигандтардың әсері3-AR шексіз сұйылту немесе A жағдайында ABA-X-BY630 қайта байланыстыруын көрсете алмайды3-Жасуша бетінен AR секвестрленуі. Бұл антагонисттің қаныққан концентрациясы болған кезде ABA-X-BY630 бірлестігі мен ABA-X-BY630 диссоциациясының комбинациясы қарапайым массалық әсер ету ережелеріне сәйкес келмейтіндігіне байланысты, яғни байқалған ассоциация жылдамдығына қарағанда баяу. диссоциациялану жылдамдығы. Сонымен қатар, А арасындағы айтарлықтай айырмашылық1-АР және А3-AR рецепторға тән болуы керек, өйткені флуоресценттік лиганд, бәсекелес лигандтар және жасуша фоны тұрақты болып қалады. Бір қызығы, бірлескен әрекеттесу рецепторлардың жоғары тығыздығының салдары болуы екіталай, өйткені рецепторлардың экспрессиясы

А-мен салыстырғанда A1-CHO жасушаларында 4 есе көп3-CHO жасушалары.

А3ABA-X-BY630 және NECA арасындағы AR рецепторын лигандтарды байланыстырмайтын мутантты А болуы арқылы концентрацияға тәуелді түрде тежеуге болады.3-Жасуша бетіндегі AR. Бұл тәжірибелер А-ның котрансфекциясын қамтыды3-AR GFP және А3(N250A)-AR YFP CHO жасушаларына. Конфокальды кескіндерді спектрлік араластыру бір уақытта қозғалған GFP және YFP ​​нәтижесінде пайда болатын флуоресценцияны бөлудің сенімді әдісі болды. Көру өрісінде GFP/YFP флуоресценция қарқындылығының қатынасы ұяшықтан ұяшыққа айтарлықтай өзгерді. Осылайша, кооперативтік өзара әрекеттесулердің бір ұяшықты талдауы жалғыз айнымалысы А қатынасы болатын жасушалар үшін анықталды.3AR GFP A дейін3(N250A)AR YFP . А үлесін ұлғайту3(N250A)-AR YFP жасуша бетінде, бұл A ұлғаюымен байланысты болуы мүмкін3-AR GFP /A3(N250A)-AR YFP димерлері ABA-X-BY630 және NECA арасындағы ынтымақтастықтың үдемелі төмендеуіне делдал болды. Мономерлі рецепторлар ішіндегі аллостериялық әрекеттесулерге байланыстырмайтын мутантты рецепторлардың болуы әсер етпеуі керек. кооперацияның төмендеуі байқалған кезде А3(N250A)-AR YFP А-ның болуын болжайды3-AR YFP /А3(N250A)-AR YFP димерлері және лигандтарды байланыстырмайтын протомердің лигандтарды байланыстыратын протомерге әсері жоқ. Бұл нәтижелер CHO-A-дағы ұсынысты қолдайды3 жасушаларда байқалған аллостериялық өзара әрекеттесулер А арқылы өтеді3-AR гомомерлі кешен.

Агонистер мен антагонистердің ABA-X-BY630 диссоциациясының жоғарылауына қатысты ұқсас әсерлері.3-AR гомомерлік және гетеромерлі өзара әрекеттесулерді сипаттайтын бірқатар алдыңғы зерттеулерге сәйкес келеді және димерлік GPCR интерфейсі арқылы бірлескен әрекеттесу міндетті түрде рецепторларды белсендіруді қажет етпейтінін болжайды (11, 12). Жақында жүргізілген допамин Д2 рецептор, GPCR-GPCR өзара әрекеттесулерінің төменгі ағындық сигналдық салдарын зерттей отырып, агонист-агонист пен агонист-кері агонисттің D-мен байланысуы арасындағы қарама-қарсы кооперативтік әрекеттесулерді байқады.2 рецепторлы гомодимер (42). Допаминнен айырмашылығы D2 рецепторлардың гомдимерлері, аденозин А кооперациясы3 рецепторлардың гомодимерлері лигандтардың тиімділігімен корреляцияланбайды. Дегенмен, GPCR гомомерлері мен гетеромерлерінің күрделі аллостериялық табиғатын ескере отырып, аллостериялық әрекеттесулердің зерттелген рецепторға, зондқа және тінге байланысты өзгеруі таңқаларлық емес.

Аллостериялық әрекеттесулерді сандық бағалау үшін механикалық құрылым қажет. GPCR фармакологиясындағы математикалық модельдеудің жалпы мақсаты - параметрлердің ең аз санын пайдалана отырып, аллостериялық әрекеттесулерді барабар сипаттай алатын модельді әзірлеу. Конститутивтік гетеродимерлердегі лигандтардың ұқсастығының аллостериялық модуляциясын сипаттайтын қарапайым модель үштік кешенді модель болып табылады. Конститутивті гомодимеризация жағдайында бір лигандтың 2 молекуласымен гомодимерді бір уақытта орналастыру үшін үштік комплекс моделін кеңейту керек. Бұл модельде байланыс бос және сингулярлы орналасқан гомодимер үшін лигандтың жақындығына байланысты. 2 құрылымдық әр түрлі лигандтардың байланысуын сипаттау кезінде конститутивтік GPCR гомодимеризациясының қарапайым моделі кеңейтілді, қазір 2 жақындық константасы және 3 кооперативтік фактор арқылы сипатталады. Конститутивтік GPCR гомодимеризациясының кинетикалық нұсқасы осы зерттеулерде бәсекелес лигандтар арасындағы өзара әрекеттесулерді сандық анықтау үшін алынған.3-AR гомодимерлері. Бұл модельдің ішінде А3-AR конститутивті гомодимерлер ретінде бар, GPCR димер ретінде туып, жұмыс істейді және өледі деген алдыңғы зерттеулерге сәйкес келеді (43, 44). Рецепторларды гомодимеризациялау моделі байланыстырушы параметрлер мен лиганд концентрацияларының функциялары ретінде, сондай-ақ динамикалық жүйелер үшін уақыт бойынша байланысқан фракциялар үшін аналитикалық шешімдерді береді. Демек, лиганд жылдамдығының тұрақтысы мен кооперативтік бағаларды алу үшін салыстырмалы түрде арзан есептеу параметрлерін бағалау тәртібін қолдануға болады. Бір мезгілде байланысқан гомодимерлі А арасындағы әрекеттесу3-AR сайттары әдетте теріс кооперативті болып табылды. Кинетикалық деректерді талдау GPCR-GPCR өзара әрекеттесулерін зерттеуге арналған жоғары мазмұнды тәсілді білдіреді. Сонымен қатар, GPCR фармакологиясының кинетикалық талдауы организмде сирек тепе-теңдікте болатын эндогендік лигандтарды байланыстыру оқиғаларын түсінуге физиологиялық тұрғыдан маңыздырақ көзқарасты білдіруі мүмкін.

Бұл зерттеулердегі күтпеген байқау селективті емес лигандтардың A-дан ABA-X-BY630 диссоциациялану кинетикасына қарама-қарсы әсері болып табылады.1-А-мен салыстырғанда AR3-АР. А3-AR басқа AR мүшелерімен салыстырғанда тез десенсибилизацияланады (45). Аденозиннің 2 молекуласында А-мен байланысқан диссоциацияның жоғарылауы3-AR гомодимері патофизиологиялық жоғары концентрацияларда эндогендік аденозиннің тұру уақытын азайту үшін қосымша физиологиялық механизмді көрсетуі мүмкін. Дәрілік заттардың табылуына қатысты А3Ісік жасушаларының әртүрлі типтеріндегі -AR экспрессиясы жасушалардың пролиферациясында және миграциясында рөл атқаратыны ұсынылған. Осылайша, егер А3-AR гомомеризациясы – рецепторлардың тығыздығына және/немесе тінге тәуелді, А-ны ажырататын лигандтар.3-AR мономерлер мен гомомерлер қатерлі ісік ауруын емдеуде ісік жасушаларын іріктеп бағыттаудың жаңа терапиялық стратегиясын ұсынуы мүмкін (46).

А3-AR қабыну аурулары мен қатерлі ісіктерді қоса алғанда, бірқатар жағдайлар үшін әлеуетті жаңа емдік мақсат болып табылады (46, 47). Бұл зерттеу жергілікті А3-ARs. Осы зерттеуде қолданылатын кинетикалық және математикалық тәсіл аллостериялық және/немесе ортостериялық лигандтар арасындағы бірлескен әрекеттесулерді анықтау және түсіндірудің қуатты әдісі болып табылады. Бұл тәсілдің қосымша артықшылығы оның физиологиялық контексте эндогенді экспрессияланған GPCR арасындағы өзара әрекеттесулерді оңай зерттеуге болатындығы болып табылады.