Ақпарат

9.11А: Өсімдік ДНҚ вирустары – Биология

9.11А: Өсімдік ДНҚ вирустары – Биология


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ДНҚ вирустары өсімдіктерде салыстырмалы түрде сирек кездеседі, бірақ бүкіл әлем бойынша егіннің айтарлықтай зақымдалуына жауапты.

үйрену мақсаттары

  • ssDNA және dsDNA өсімдік вирустарын ажыратыңыз

Негізгі нүктелер

  • ДНҚ вирустары өсімдіктерде РНҚ аналогтарымен салыстырғанда салыстырмалы түрде сирек кездеседі.
  • Көптеген вирустар сияқты, бір тізбекті ДНҚ вирустарының көпшілігінің геномдары кішкентай, тек бірнеше белоктарды кодтайды, сондықтан репликация үшін иесі жасуша факторларына тәуелді.
  • Қос тізбекті ДНҚ вирустары өсімдіктердің тек төменгі түрлерін, мысалы, балдырларды зақымдайды. Бұл вирустар геномдары 160-дан 560 кб-қа дейінгі 600-ге дейін белокты кодтайтын гендері бар үлкен dsDNA вирустары болып табылады, бұл оларды жоғары сатыдағы өсімдіктерді жұқтыратын вирустардан айтарлықтай ерекшеленеді.
  • Өсімдік вирустары әдетте жәндіктер сияқты векторлар арқылы таралады, бірақ ұрпақтан ұрпаққа да берілуі мүмкін.

Негізгі шарттар

  • Балтимордың классификация жүйесі: Дэвид Балтимор әзірлеген Балтимор классификациясы вирустарды геном түріне (ДНҚ, РНҚ, бір тізбекті (ss), қос тізбекті (ds) және т.б.) байланысты отбасыларға топтастыратын вирустарды жіктеу жүйесі болып табылады. олардың қайталану әдісі.
  • плазмодеммалар: Plasmodesmata (сингулярлы: plasmodesma) - өсімдік жасушалары мен кейбір балдыр жасушаларының жасуша қабырғаларын кесіп өтетін, олардың арасындағы тасымалдау мен байланысты қамтамасыз ететін микроскопиялық арналар.
  • капсид: Вирустың сыртқы белок қабығы.

ДНҚ вирусы – генетикалық материалы ретінде ДНҚ бар вирус және ДНҚ-ға тәуелді ДНҚ полимераза арқылы репликацияланады. ДНҚ вирустары вирустарға арналған Балтимор жіктеу жүйесінің I тобына (қос тізбекті ДНҚ; dsDNA) немесе II тобына (бір тізбекті ДНҚ; ssDNA) жатады. Бір тізбекті ДНҚ әдетте жұқтырған жасушаларда екі тізбекті болып кеңейеді.

ДНҚ вирустары өсімдіктерде салыстырмалы түрде сирек кездеседі. Өсімдік вирустарының 17 пайызы ssDNA, ал dsDNA вирустары эукариоттық балдырлар сияқты төменгі сатыдағы өсімдіктерді ғана зақымдайды. dsDNA өсімдік вирустарының сиректігі басқа таксономиялық патшалықтармен салыстырғанда ерекше; жануарлар вирустарының төрттен бірі және бактериялық вирустардың төрттен үш бөлігі dsDNA болып табылады.

Өсімдік вирустары әртүрлі әдістермен беріледі және әдетте қорғаныс кедергілерін бұзуды талап етеді. Вирустар жараланған өсімдіктің сау өсімдікке тиюі арқылы шырынның тікелей тасымалдануы арқылы таралуы мүмкін, бұл көбінесе ауылшаруашылық әрекеттерінен туындайды, мысалы, құралдар немесе қолдар зақымдануы. Көбінесе вирустар жәндіктер, нематодтар немесе қарапайымдар сияқты векторлық делдалдар арқылы таралады, олар вирустарды жұқтырған өсімдіктермен қоректенеді, содан кейін вирусты сау өсімдіктерге таратады.

Вирустың ұрпақтан ұрпаққа берілуі өсімдік вирустарының шамамен 20% кездеседі. Вирустар тұқым арқылы тараған кезде тұқым генеративті жасушаларда жұқтырылады және вирус жыныс жасушаларында немесе кейде тұқым қабығында сақталады. Өсімдік вирустарының тұқым арқылы берілу механизмдері туралы аз мәлімет бар, дегенмен қоршаған орта маңызды рөл атқаратыны белгілі.

Бір тізбекті ДНҚ вирустары

The Geminiviridae және Нановирустар өсімдіктерді жұқтыратын белгілі ssDNA вирустарының екі тұқымдасы. Geminiviridae бір тізбекті ДНҚ вирустарының ең үлкен белгілі отбасы болып табылады. Оның құрамында өсімдік вирустарының кең ауқымы бар, соның ішінде бұршақтың алтын мозаикалық вирусы, қызылшаның бұйра үсті вирусы, жүгері жолақтары вирусы және қызанақ псевдобұйра үстіңгі вирусы, олар бірге бүкіл әлем бойынша егіннің айтарлықтай зақымдалуына жауап береді. Геном не 2500-3100 нуклеотидтер арасындағы бір құрамдас болуы мүмкін, немесе кейбір бегомовирустар жағдайында әрқайсысы 2600-ден 2800 нуклеотидке дейінгі екі бірдей өлшемді компонент болуы мүмкін. Олардың жетіспейтін шыңында қосылған екі толық емес T=1 икосаэдры бар ұзартылған, геминат капсидтері бар. Капсидтердің мөлшері диаметрі 18-20 нм, ұзындығы шамамен 30 нм. Бегомовирустар екі түрлі бөлшектерге бөлінген екі компонентті геномға ие, олардың екеуі де әдетте қолайлы хост жасушасында жаңа инфекцияны бастау үшін бірге берілуі керек. Көптеген вирустар сияқты, геминивирус геномдары тек бірнеше белоктарды кодтайды, сондықтан репликация үшін жасуша факторларына тәуелді. Geminiviruses репликациясы M13 және көптеген плазмидалар сияқты бактериофагтарда көрінетін айналмалы шеңбер механизмі арқылы жұқтырған өсімдік жасушасының ядросында жүреді. Алынған ssDNA ядродағы өнгіш бөлшектерге оралады. Бұл бөлшектер кейіннен ядродан шығып, вириондар ретінде қоршаған жасушаларға берілуі мүмкін бе немесе ssDNA жасушадан жасушаға плазмодесмата арқылы тасымалдана ма, белгісіз. Бұл вирустар векторлық жәндіктердің тесетін ауыз мүшелері арқылы дифференциацияланған өсімдік жасушаларына еніп, бастапқыда жұқтырады: дегенмен, бұл жасушаларда ДНҚ репликациясына қажетті негізгі ферменттер жоқ, бұл вирустың репликациясын қиындатады. Бұл блокты жеңу үшін геминивирустар өсімдік жасушаларын тыныш күйден жасушалық циклге қайта кіруге итермелей алады, осылайша вирустық репликация пайда болуы мүмкін.

The Нановирустар өсімдіктерді зақымдайтын бір тізбекті ДНҚ вирустарының тұқымдасы. Олардың атауы гректің «нано» (ергежейлі) сөзінен шыққан, себебі олардың кішкентай геномы және жұқтырған өсімдіктерге өсуді тоқтататын әсері бар.

Бұл отбасының вириондары капсидті және қабықсыз. Капсид диаметрі 18-20 нм болатын икосаэдрлі. Геном ұзындығы әрбір ~1 кб бір тізбекті дөңгелек ДНҚ-ның 6-дан 11-ге дейінгі сегменттерінен тұрады, сегменттердің нақты саны тұқымға байланысты өзгереді. Сегменттердің әрқайсысы бір ақуызды кодтайды. Әрбір сегменттің кодталмаған аймағында оның шыңында сақталған 9-нуклеотидті тізбегі бар болжамды діңгек ілмек құрылымы бар. Әрбір мүшеде ~33 кДа репликация ақуыздарын кодтайтын 4 сегментке дейін бар. Басқа сегменттер өлшемі 10-20 кДа өнімдерді кодтайды және ~19 кДа қабық ақуызын және ретинобластома байланыстыру мотиві бар ақуызды қамтиды.

Екі тізбекті ДНҚ вирустары

Өсімдіктердің қос тізбекті ДНҚ вирустары сирек кездеседі және тек төменгі сатыдағы өсімдіктерді, мысалы, балдырларды зақымдайды. Бұл вирустар (отбасы Phycodnaviridae) геномдары 160-дан 560 кб-қа дейінгі 600-ге дейін белокты кодтайтын гендері бар үлкен dsDNA вирустары, бұл оларды жоғары сатыдағы өсімдіктерді жұқтыратын вирустардан айтарлықтай ерекшеленеді. Олар бүкіл әлемде сулы ортада кездеседі және әдетте қызыл және қоңыр толқындар деп аталатын массивті балдырлардың гүлденуін тоқтату сияқты балдырлар қауымдастығын реттеуде динамикалық рөл атқарады, негізінен құжатталмаған.


Вирустар – жасушаның сыртында көбейе алмайтын кішкентай, тірі емес паразиттер. Вирус генетикалық ақпараттан тұрады -- ДНҚ немесе РНҚ -- белокпен қапталған. Вирус өзінің генетикалық ақпаратын қабылдаушы жасушаға енгізеді, содан кейін жасуша механизмін басқарады. Бұл процесс вирусқа ДНҚ немесе РНҚ көшірмелерін жасауға және қабылдаушы жасушаның ішінде вирустық ақуыздарды жасауға мүмкіндік береді. Вирус бір ұяшықта өзінің бірнеше көшірмесін тез жасай алады, жаңа хост жасушаларын жұқтыру үшін осы көшірмелерді босатады және одан да көп көшірмелер жасайды. Осылайша, вирус хост ішінде өте тез көбейе алады.

Аты айтып тұрғандай, ДНҚ вирустары өздерінің генетикалық материалы ретінде ДНҚ-ны пайдаланады. ДНҚ вирустарының кейбір жалпы мысалдары парвовирус, папилломавирус және герпесвирус болып табылады. ДНҚ вирустары адамдарға да, жануарларға да әсер етуі мүмкін және жағымсыз белгілерді тудырудан денсаулыққа өте ауыр қауіп төндіруге дейін болуы мүмкін.

ДНҚ-вирустар қабылдаушы жасушаға енеді, әдетте вирустың мембранасы жасуша мембранасымен біріктірілген кезде. Вирустың мазмұны жасушаға енеді, ядроға барады және ДНҚ репликациясы мен РНҚ-ға транскрипциясы үшін жасушаның биохимиялық механизмін қабылдайды. РНҚ вирустық ДНҚ-ны жабу үшін вирусқа қажет ақуыздардың түзілуін бақылайды. Вирустық ДНҚ-ның бұл жабыны капсид ретінде белгілі. Капсидтер жасуша сыйымдылығына жеткенше және ашылғанға дейін жасуша ішінде жиналады, жаңадан пайда болған вирустарды жаңа хост жасушаларын жұқтыру үшін шығарады.


Өсімдік вирустары және олардың классификациясы

3 Өсімдік вирусының квазитүрі

РНҚ және ДНҚ өсімдік вирустарының жұқпалы клондарының сезімтал хосттар арқылы өткен талдаулары квазитүрлердің популяцияларының дамитынын көрсетті (Kim et al., 2005 Ge et al., 2007 Acosta-Leal et al., 2008 Jeske et al., 2010). Дегенмен, халық санына қатысты кейбір шектеулер туралы дәлелдер бар. Мысалы, Acosta-Leal және т.б. (2008) BNYVV популяциясы сезімтал өсімдіктерде, құрамында өсімдіктерге қарағанда біртекті екенін көрсетті. Rz1- симптомсыз тамырмен шектелген инфекцияларды тудыратын аллель.

Екі жақты кринивируста (ToCV) RNA1 құрамдас бөлігінің популяциясы (репликациямен байланысты ақуыздарды кодтайды) RNA2 компонентіне (кодтау инкапсидация - жүйелік қозғалыс және жәндіктердің берілуіне қатысты ақуыздар) қарағанда күрделірек (Лозано және т.б., 2009). ). Бұл көпкомпонентті вирустарда функция әртүрлі геномдық сегменттердің генетикалық құрылымында үлкен айырмашылықтар тудыруы мүмкін екенін көрсетеді. Roossinck (2011) коэволюциядағы іріктеу қысымының неғұрлым қатаң болуына байланысты патогендік вирустарға қарағанда мутуалистік вирустардың квазитүрлердің популяциясы тар деген болжам жасады.


Бұл жәндіктің геномында өсімдік ДНҚ-сы бар

Ақ шыбын деп аталатын тли тәрізді кішкентай жәндіктің геномында өсімдік ДНҚ-сы бар және ол генді өсімдіктен жәндікке тасымалдаудың алғашқы белгілі жағдайларының бірі болып табылады, деп хабарлайды Хайди Ледфорд. Табиғат.

Өткен аптада журналда жарияланған жаңа зерттеуге сәйкес, бұл ген де икемді емес, өйткені ол жәндіктерге табиғи токсиндермен толтырылған өсімдіктермен қоректенуге мүмкіндік береді. Ұяшық. Генетикалық материалдың бұл тағдырлы тасымалдануы кем дегенде 35 миллион жыл бұрын болды және ақ шыбындарды ауылшаруашылық зиянкестеріне айналдыратын генетикалық құралдар жиынтығының бөлігі болып көрінеді, деп хабарлайды Джонатан Ламберт. Ғылым жаңалықтары.

“Он немесе 20 жыл бұрын ешкім генді тасымалдаудың мұндай түрі мүмкін деп ойлаған емес”,” Рой Кирш, Макс Планк химиялық экология институтының химиялық экологы, зерттеуге қатыспаған’ Ғылым жаңалықтары. “Өсімдіктен жәндікке көшу үшін ген еңсеруі керек көптеген кедергілер бар, бірақ бұл зерттеу оның болғанын және геннің ақ шыбындарға пайдасын беретінін анық көрсетеді.”

Ақ шыбынның геномына өсімдік ДНҚ-сын қалай енгізгені әлі белгісіз, бірақ генді тасымалдау оқиғасы вирустармен байланысты болуы мүмкін, деп хабарлайды Донна Лу. Жаңа ғалым. Бұл сценарийде ақ шыбындардан өсімдіктерге немесе керісінше өтетін вирус кейбір өсімдік ДНҚ-сын алады. Содан кейін, вирус ақ шыбынға жұқтырған кезде, өсімдік ДНҚ-сы таралып, ақырында қатенің геномына қосылды.

“[Кейбір] вирустар негізінен өз геномын иелерінің жасушаларына енгізеді, дейді Швейцариядағы Нойхâтел университетінің энтомологы және зерттеудің бірлескен авторы Тед Турлингс. Жаңа ғалым.

“Бұл өте сирек кездесетін оқиға, бірақ миллиондаған жылдар бойы өзара әрекеттесетін миллиардтаған жәндіктер мен өсімдіктер туралы айтқанда, бұл мүмкін болады,” Турлингс. Ғылым жаңалықтары. Генді тасымалдаудың бұл түрі іс жүзінде зиянкестердің өсімдіктердің қорғанысымен күресу қабілетін алуының маңызды механизмі болуы мүмкін, - деп қосады Турлингс.

Табылған биологияның қызықты бөлігін ашумен қатар, болашақ дақылдарды шырын соратын ақ шыбындардан қорғауға көмектесуі мүмкін. Табиғат. Алдын ала эксперименттер ұрланған өсімдік генін өшіру жәндіктерді өсімдік токсиндеріне сезімтал етеді деп болжайды.

“Бұл біз таразыларды өсімдіктің пайдасына айналдыруға болатын механизмді ашады”,” Чикаго университетінің зерттеуге қатыспаған эволюциялық экологы Эндрю Глосс. Табиғат. “Бұл эволюцияны зерттеу егінді қорғау сияқты қолданбаларға арналған жаңа тәсілдер туралы хабарлаудың тамаша мысалы.”.


ДНҚ вирустары

Вирустар негізінде жіктелуі мүмкін белоктар вирустық генетикалық материалдың ішінде кодталған немесе геном . Дезоксирибонуклеин қышқылы (ДНҚ) геномдары бар вирустар ДНҚ вирустары деп аталады. Барлық вирустар сияқты, ДНҚ вирустары да жұқтыратын жасушалармен салыстырғанда кішкентай, сондықтан міндетті жасушаішілік паразиттер (тек жасуша ішінде көбейе алатын паразиттер). Тиісті жасушада ДНҚ вирустары вирустық ДНҚ геномында қамтылған гендерді пайдаланып, вирусты репликациялау үшін жасушаны бағдарламалай алады.

Вирустың жасушадан тыс түрі вирион деп аталады. ДНҚ вирусы үшін вирион капсид деп аталатын құрамында ақуызы бар қабықпен қорғалған ДНҚ гендерінің жиынтығынан тұрады. Пальто көбінесе құрылымында заңдылық пен симметриямен сипатталады және жасушалармен байланысуға және оларды басып алуға қабілетті. Кейбір ДНҚ вирустары жағдайында капсид жасушалық мембраналардан түзілетін мембранамен қоршалуы мүмкін. Сезімтал жасушаның инвазиясы кезінде вирустық геномды жасушаға шығару үшін вирион бөлшектеледі, сол кезде вирустық ДНҚ ішіндегі гендер транскрипцияланып, вирустық хабаршы рибонуклеин қышқылын (мРНҚ) түзеді.

Вирустық мРНҚ ақуызға айналады. Бұл ерте белоктар қалыпты жасушалық функцияларды өзгертуге жауап береді, бұл кейбір жағдайларда жұқтырған жасушаға иммундық жүйеден аулақ болуға мүмкіндік береді. Бұл ерте белоктар вирустық гендердің кеш синтезін ілгерілету және жасушаны өндіруге дайындау үшін де маңызды. ұрпақ вирус. Вирусты репликациялау және қоршау үшін маңызды белоктарды қамтитын кеш гендік синтезден кейін ұрпақ вириондарын жұқтырған жасуша басқа жасушаларды басып алу үшін шығарады, осылайша процесс қайталануы мүмкін.

Адамдарда ауруды жұқтыратын және тудыруы мүмкін алты түрлі ДНҚ вирусының отбасы бар. Оларды әрі қарай «кішкентай» ДНҚ геномдары немесе «үлкен» ДНҚ геномдары барларға бөлуге болады. Кішкентай ДНҚ геномдары бар ДНҚ вирустарының геномдық өлшемдері 10-нан аз килобазалық жұптар , ал үлкен геномы бар ДНҚ вирустары 30 килобазалық жұптан асады. Кішкентай ДНҚ вирустарында әдетте вирус геномында кодталған оннан аз ген бар, ал үлкен ДНҚ вирустарында елу геннен жүзден астам генге дейін кез келген жерде болуы мүмкін. Кішкентай ДНҚ геномдары бар вирустарға адам папилломавирусы (HPV) жатады. HPV терінің эпителий жасушаларын зақымдайды. Ол қолдар мен аяқтардағы жалпы сүйелдерді тудырады және кейбір жағдайларда әйелдерде жатыр мойны обырының дамуы үшін маңызды. В гепатиті - бауырды зақымдайтын, гепатитті тудыратын және бауыр ісігімен байланысты тағы бір кішкентай ДНҚ вирусы. Аденовирус, герпесвирус және поксвирус - бұл адамға жұқтыратын үлкен ДНҚ вирустарының мысалдары. Аденовирустар, олардың көптеген түрлері бар гастроэнтерит және адамдардағы тыныс алу жолдарының аурулары.

Герпесвирустар - өте алуан түрлі вирустар тобы. Адамды жұқтыратын және жасырын инфекцияны белгілейтін барлығы сегіз герпесвирус бар. Герпес

Адамдарды жұқтыратын басқа герпес вирустарына мононуклеозды тудыратын және адамның әртүрлі қатерлі ісіктерінде маңызды болып табылатын Эпштейн-Барр вирусы және балаларда желшешек пен ересектерде бөртпе тудыратын варикелла-зостер вирусы жатады. Адамдарды жұқтыруы мүмкін соңғы үлкен ДНҚ вирусы - шешек. 1970-ші жылдардағы шешек вакцинациясы мен жойылуына дейін шешек адам популяцияларында айтарлықтай сырқаттанушылық туғызды, олардың кез келген жерінде 1-ден 25 пайызға дейін өліммен аяқталды.


9.11А: Өсімдік ДНҚ вирустары – Биология

Өсімдік РНҚ вирусындағы гендердің ең аз саны екі болуы мүмкін: қабық ақуызы және РНҚ репликаза гені (РНҚ фагтары сияқты). Дәлелдер әдетте 3-5 ген өнімін көрсетеді.

Өсімдіктің оң тізбекті РНҚ вирустары жиі бөлінген геномдарға ие болады (үлестірмедегі 14-4 суретті қараңыз). Сонымен қатар, вирус геномдары бөлек инкапсулирленген. Инфекцияға қажетті екі немесе үш түрлі нуклеин қышқылы компоненттерінен тұратын вирустық геномдар екі жақты, үш жақты немесе көп жақты вирустар деп аталады. Геномдық РНҚ-ның бір түрінен артық. Оқулықтағы 271-273 беттерді қараңыз.

Көп жақты вирустар эволюциялық кемшілікте болуы мүмкін. Жоңышқа мозаикалық вирусының инфекциялық сұйылту қисығы (инфекция үшін B, M, Tb бөлшектерін қажет етеді) темекі некрозының вирусына (бір бөлшек) қарағанда тікірек. Геномның бөлінуі вирустың берілуіне немесе инфекциясына кедергі келтіруі мүмкін.

Спутниктік ВИРУСТАР ЖӘНЕ РНҚ

1962 жылы Касинис алғашқы спутниктік вирустарды сипаттады. Бұл вирустар серологиялық тұрғыдан олардың көмекшілерімен байланысы жоқ және екі геномның тізбегі бойынша ұқсастықтары шамалы. Спутниктік вирустар оның репликациясына тәуелді екінші, тәуелсіз репликацияланатын вирустың болуына байланысты.

Спутниктік РНҚ-ның өзіндік қабық ақуызы жоқ және басқа вирустық РНҚ көмегімен инкапсулирленген.

  • Өсімдіктердің бір-біріне жанасуы арқылы шырын арқылы, тамыр егу арқылы және қолмен өңдеу арқылы механикалық берілу.
  • Вегетативті көбею және егу.
  • Тұқым, тозаң, кенелер, нематодтар, қоңыздар, саңырауқұлақтар (зооспоралар мен мицелийлер тасымалдайды) және жәндіктер (тли, жапырақтылар, қабыршақты жәндіктер, трипс, шегірткелер, қоңыздар, ақ шыбындар). Мысалы, қияр мозаикалық вирусы және тли арқылы қозғалатын арпа сары ергежейлі вирусы.

Өсімдік вирустарын жарық микроскоп арқылы тікелей бақылау арқылы көзбен көру мүмкін болмағандықтан, вирусологтар олардың бар-жоғын анықтаудың және диагноз қоюдың келесі әдістеріне жүгінуі керек.

1. Өсімдік шырыны арқылы ауруды өсімдікті ысқылау, егу, қопсыту немесе жәндіктер арқылы беру мүмкіндігі.

2. Индекстеу - индикаторлық өсімдіктер - белгілі бір вирусқа сезімтал және әсер еткенде белгілі бір жолмен әрекет етеді.

3. ЭМ көмегімен визуалды тексеру.

4. Симптомдардың басқа көздерден (мысалы, гербицидтер, қоректік заттардың жетіспеушілігі) болмауы мүмкіндігін жою арқылы.

    Жанама (вирус + Ab вирусы + фермент конъюгацияланған Ab) және тікелей (қос антидене сэндвич техникасы) (Ab вирус + вирус + ферментпен конъюгацияланған Ab).
      1. Шұңқырға вирус немесе Ab вирусы қосылып, олар қабырғаларға жабысып қалады.
      2. Шұңқырға антидене немесе вирус қосылды және олар өз аналогына қосылады (яғни, антиденеге антиген).
      3. Фермент конъюгаты бар екінші антидене бірінші антидене/вирус кешеніне қосылады.
      4. Субстрат ферментпен катализденеді және бұл түс өзгеруіне әкеледі.
    • Сүт көптеген вирустарды инактивациялайды - құралдарды/қолды жуу үшін сүтті пайдаланыңыз. "Сүт өсімдік ағзасына жақсы әсер етеді!" Сабын мен су да жақсы әсер етеді!
    • Ауру өсімдіктерді жою, ықтимал вирус тасымалдаушыларын (ең алдымен арамшөптер мен жәндіктерді) жою және жою.
    • ауруға төзімді сорттар.
    • ауру немесе вируссыз тұқым, тамыр немесе түйнектер.
    • кросс-қорғаныс (вирустың азырақ вирулентті штаммымен егу өсімдікті кейінірек оған әсер еткенде неғұрлым вирулентті штаммнан қорғайды).
    • жылу (кейбір вирустар хостты өлтірмейтін температурада өледі). Мысалы, ұйықтап жатқан көбею мүшелерін ыстық суға (35 С) бірнеше минут немесе сағатқа батыру немесе өсімдіктерді жылыжайда 35-40 С температурада бірнеше күн, апта немесе ай бойы өсіру вирусты инактивациялауы мүмкін.
    • Темекі мозаикалық вирусының (TMV) бүкіл әлем бойынша таралуы негізінен темекі мен қызанақты жұқтырады, бірақ 350-ден астам түрі сезімтал.
    • Темекі жапырақтары дақтанып, ашық және қою жасыл аймақтары бұрмаланып, ыдырайды немесе көпіршіктенеді, әсіресе жаңа өскен жерлер.
    • өсімдіктердің өсуінің тежелуі. қызанақта жапырақтардың дақтары пайда болады және жапырақтары ұзын және үшкір болады.
    • TMV - ұзындығы 300 нм және диаметрі 15-18 нм болатын таяқша тәрізді бөлшек. Оның ssRNA және ақуыз қабығы бар.
    • инактивациялау қиын, өлі, кептірілген ұлпаларда 5 жыл және тірі өсімдік ұлпаларында көп айлар бойы өмір сүре алады.
    • вируленттілігі ауырдан жеңіл белгілерге дейін өзгеретін көптеген штаммдар. вирус өсімдіктен өсімдікке егіншілер, ластанған құрал-жабдықтар және шайнайтын жәндіктер алған жарақаттар арқылы таралады.
    • вирус өлі өсімдік тіндері мен қалдықтарында, ластанған жабдықта, ластанған топырақта, жылыжай ыдыстарында, төсек-орындарда, құрал-саймандарда, сондай-ақ жылқы тәрізді арамшөптерді қоса алғанда, тірі үй иелерінде қыстайды. Solanum carolinense, және басқа да дақылдар (қызанақ, бұрыш және баклажан).
    • вируссыз тұқымды қолданыңыз (қышқылмен немесе ағартқышпен өңделген қызанақ тұқымы)
    • жұқтырмаған топыраққа трансплантациялау
    • бромметилмен фумигациялау немесе қыздыру.
    • тұқым алаңдарында немесе жылыжайларда темекі шайнауға немесе темекі шегуге болмайды.
    • вирустың таралуын болдырмау үшін қолды сабынмен және сумен немесе сүтпен жуыңыз.
    • өсімдіктерді сүтпен (тұтас немесе майсыздандырылған) бүрку азайтуға көмектесетін сияқты
    • инфекциялар. ие емес дақылдармен ауыспалы егіс (жүгері, күріш, басқа дәнді дақылдар).
    • төзімді сорттар

    TMV вирусының бөлшектерінің тұрақтылығы оның анықталған, біртектілікке дейін тазартылған, содан кейін биохимиялық және биологиялық сипатталған бірінші вирус болғандығын көрсетеді.

    Кішкене қабық ақуызының суббірліктері (капсомерлер) спираль тәрізді ақуыз қабығын немесе капсидті қалыптастыру үшін біріктіріледі (46 және 47 беттердегі 2.10 және 2.11-суреттерді қараңыз). Вирус бөлшектерінде ені 4 нм болатын осьтік арна бар және вирустық РНҚ қоршаған ақуыз спиральындағы ойықтың ішінде жатыр. Нуклеин қышқылының өзегі осьтік арнада емес, ішкі арна мен өзекшенің сыртқы беті арасында шамамен жарты жолда өтеді. Жалпы бөлшек таяқша тәрізді, тар және қатты. Спиральдың қадамы 2,3 нм және әр айналымда 16 1/3 қабық ақуыз молекулалары бар. Толық ұзындықтағы вирион 130 бұрандалы бұрылыстан тұрады.

    TMV бөлшектері нуклеазалар мен протеолитикалық ферменттерге төзімді. TMV бөлшектері сілтілі және қышқыл ерітінділерде де ыдырайды. Температура мен рН тым шектен шықпаса денатурация көбінесе қайтымды болады. Денатуранттың жойылуы вирустық ақуыздың табиғи құрылымын қайта құруға және оның изоэлектрлік нүктесіне жақын жерде (рН 4-тен 6-ға дейін) TMV қабықшасының ақуызы TMV вириондарына ұқсайтын таяқша тәрізді бөлшектерді қалыптастыруға мүмкіндік береді.

    Вирус жуғыш заттармен (мысалы, SDS) немесе 6 М мочевинамен немесе фенолмен экстракциялау арқылы бейтарап рН әсеріне ұшырағанда, РНҚ бұзылмаған күйде экстракциялануы мүмкін. Оқшауланған TMV РНҚ жергілікті TMV протеиніне қосылғанда, олар тек ақуызға қарағанда (рН 4-тен төмен және рН 6-дан жоғары тұрақсыз) тұрақтырақ (рН 3-тен 9-ға дейін тұрақты) тұрақты "қайта құрастырылған" вирусын құрайды.

    Ақуыз мен РНҚ тек жалаңаш РНҚ-ға қарағанда жұқпалы болып табылады (инфекцияны тудыру үшін жалаңаш РНҚ-дан 1000 есе көп қажет).

    Вирустық РНҚ темекі мозаикалық ауруының жалғыз детерминанты екендігінің дәлелі Холмс рибграсс мозаикалық вирусынан (RMV) РНҚ-ны TMV ақуыздық суббірліктерімен араластыру арқылы алынды. Қалпына келтірілген вирус жүйелі инфекцияның орнына өсімдіктерде локализацияланған зақымданулар туғызды және жаңа RMV вирусын түзді (RMV РНҚ + құрамында гистидин мен метионин бар ақуыз қабығы - ТМВ-да жоқ). №2 үлестірме материалдағы 50-беттегі 2.13 суретті қараңыз

    Спиральды вирустардың жинақталуы

    33 ақуыз молекуласының агрегаттары қос дискіні құрайды. Бұл вирустық РНҚ-мен біріктіріледі. Нуклеин қышқылының ақуыз агрегатына қосылуы TMV жалпы штамм РНҚ-ның 3' ұшынан 800-ге жуық нуклеотидтердің жиналу орнының (OAS) бастауынан басталады. Вирустық РНҚ-ның 5' ұшына қарай таяқшаның өсуі жылдам, қос дискілердің қосылуын қамтиды, 3' ұшының инкапсидациясы А протеинінің мономерлерін немесе шағын агрегаттарды қосу арқылы баяу жүреді. Оқулықтағы 6.6-суретті немесе №2 үлестірмедегі 50-беттегі 2.14-суретті қараңыз). Котрансляциялық бөлшектеу - ақуыз қабығы 5' ұшында иесі жасушадағы рибосомалармен ығыстырылады.

    1. Белок синтезінің кейбір кезеңінде амин қышқылын беру.
    2. Вирустық РНҚ-ның 3' және 5' терминалдық аймақтары арасындағы базалық жұптасуды бұзу арқылы трансляцияны жеңілдету
    3. Теріс тізбекті синтезді бастау үшін вирустық репликазаны тану орны ретінде әрекет етеді
    4. Түпнұсқа РНҚ әлемінен алынған молекулярлық қазба, онда тРНҚ тәрізді құрылымдар репликация үшін РНҚ-ны белгіледі және үшінші 3' ұшынан нуклеотидтердің бақыланбайтын жоғалуын болдырмайды.

    TMV геномында бес ашық оқу шеңбері немесе ORF табылған. Субгеномдық mRNAs және трансляциялық оқу - ген экспрессиясын реттеу үшін TMV қолданатын екі стратегия.
    Өсімдіктердің оң әсер ететін РНҚ вирустары жеке гендердің экспрессиясын жеңілдету және/немесе реттеу үшін бірнеше басқа механизмдерді әзірледі. Гендердің экспрессиясын реттеудің 5 стратегиясы.

    • Банан, бұршақ, балдыркөк, крестгүлділер, қияр, гладиолус, лалагүлдер, қауындар петуниялары, шпинат, асқабақ, қызанақ және зиннияларды қоса алғанда, кең хост шырқады.
    • Симптомдары темекі мозаикасына ұқсайды және екі ауруды ажырату қиын
    • Қияр мозаикалық вирусы (CMV) көп қырлы вирус болып табылады - бөлшектердің диаметрі 30 нм. үйкеліс және тли арқылы механикалық жолмен беріледі. көптеген арамшөптер мен мәдени өсімдіктерде қыстайды.
    • қиярдың, мускустың, шпинаттың және темекінің төзімді сорттары.
    • арамшөптерді жою және афицидтермен бүрку арқылы тли популяциясын азайту.
    • қияр мен егу көзі (яғни, күнбағыс қатары) арасына тосқауыл қою.
    • өсімдіктермен жұмыс істегенде қолды сүтпен жуу.
    • жолдар арасындағы алюминий жолақтар тлиге қарсы әрекет ететін ультракүлгін сәулені көрсетеді.
    • Арпа Сары ергежейлі ауруы арпа, сұлы, қара бидай және бидайды зақымдайды.
    • сұлы мен арпада 50 % 30 % жоғары шығын.
    • жапырақтардың сарғаюы және ергежейлі болуы, өсімдіктердің өсуі, тамыр жүйесінің төмендеуі, астық өнімділігінің төмендеуі. жапырақтар қызыл немесе қола түске айналуы мүмкін = "red жапырақ"
    • BYDV – диаметрі 25 нм болатын көп қырлы вирус.
    • механикалық жолмен берілмейді.
    • тұқым емес.
    • өсімдік қалдықтарында немесе топырақта қыстан өтпейді.
    • тек тірі өсімдік ұлпасында (өсімдік немесе жабайы шөптер) және тли денелерінде (әртүрлі түрлер қатысады, соның ішінде сұлы-құс шие тли және ағылшын дәнді тли) тіршілік етеді. Симптомдар тлиді тамақтандыру арқылы инфекциядан кейін 3-6 аптадан кейін пайда болады.
    • үлкен шөпті жерлерге ұсақ дәндерді отырғызудан аулақ болыңыз - вирус көзі ретінде әрекет етіңіз.
    • инсектицидтер соншалықты пайдалы емес.
    • қалыпты себу кезеңінің соңына таман сұлы немесе арпа отырғызбаңыз.
    • Субвирустық қоздырғыштардың ішінде тек вироидтар мен приондар приондық бөлшекті дербес қайталайды, геномдық нуклеин қышқылы жетіспейді.
    • Спутниктік вирустар мен спутниктік РНҚ-да кәдімгі нуклеин қышқылы геномдары бар, бірақ олардың репликациясы көмекші вирустың болуына байланысты.
    • Спутниктік вирустар мен РНҚ көмекші вирустарымен маңызды реттілік гомологиясын көрсетпейді.

    Спутниктік вирустар алғаш рет өсімдіктерде байқалды. Олардың репликациясы репликацияны қамтамасыз ететін көмекші вирустың болуына байланысты, бірақ көмекші вирус репликациясы үшін спутниктік вирус қажет емес. Спутниктік вирустардың геномдары мен көмекші вирустарының геномдары арасында жүйелі ұқсастық аз немесе мүлдем жоқ. Спутниктік вирустар әдетте өздерінің капсид протеинін шығарады.

    Мысал: Темекі некрозының спутниктік вирусының көмекші вирусы (STNV - 18 нм бөлшек), темекі некрозының вирусы (TNV - кішкентай 30 нм икосаэдрлік вирус). STNV құрамында 22 кДа қабық ақуызын синтездеуге арналған моноцистронды мРНҚ бар. Спутниктік вирустар әдетте көмекші вирустарға қарағанда кішірек екенін ескеріңіз.

    STNV - оның көмекшісінің міндетті паразиті, оның репликациясына ол енетін жасушаларда TNV болуына байланысты.

    Бұл тәуелділіктің ерекшелігі (1) TNV-ден басқа өсімдік вирустарының көмекші ретінде әрекет ете алмауымен және (2) белгілі бір TNV штаммдарының STNV әртүрлі штаммдарының репликациясын қолдау қабілетінің вариациясымен суреттелген. STNV болуы TNV репликациясын айтарлықтай басады.

    Қияр мозаикалық вирусы (1972 жылы Франциядағы қызанақ өсімдіктері арасындағы өлімге әкелетін некротикалық аурудың эпифитоты). Бұл қызанақ өсімдіктерінің инфекцияларымен байланысты белгілердің ауырлығы мен атипикалық сипатына байланысты ерекше болды (алдыңғы мәтіндегі қияр мозаикасының сипаттамасын қараңыз). Бұл ауруға қызанақтардың реакциясының жоғарылауы темекіде немесе қызанақта өсірілген вирустың таралуы үшін пайдаланылатын хостпен байланысты болды, күшейтілген некротикалық жауап берді, ал асқабақ иелерінде көбейгендері некроздық реакцияны азайтты. Некрозды қызанақ өсімдіктерінің РНҚ экстракциясы күтілетін үш геномдық және бір субгеномдық РНҚ-ға қосымша шағын РНҚ түрінің ауыспалы мөлшерінің болуын анықтады. Бұл 5-ші РНҚ түрі CARNA 5 (яғни, CMV-ассоциирленген РНҚ 5 немесе CMV satRNA), спутниктік РНҚ деп белгіленді.

    CARNA 5 CMV бар болса, қызанақ өсімдіктерінде аурудың белгілері күшейеді, ал табаско бұрышында CARNA 5 болуы CMV тудыратын ауру белгілерін әлсіретеді. Басқа факторлар, соның ішінде спутниктік РНҚ-дағы реттілік өзгерістері, басқа көмекші вирус штаммдарын пайдалану және қоршаған орта жағдайындағы өзгерістер көмекші вирус тудырған белгілерді айтарлықтай күшейтеді немесе басады.

    Спутниктік РНҚ геномдық құрылымы

    Спутниктік РНҚ өсімдіктердің бес түрлі вирус тобының мүшелерімен байланысқан. TCV (шалқанның қыртысы вирусы) С РНҚ-сын қоспағанда, спутниктік РНҚ-лар өздерінің тиісті көмекші вирустарының геномдарында шектеулі реттілік гомологиясын ғана көрсетеді. Спутниктік РНҚ екі өлшем класынан көрінеді - үлкен, олардың көлемі бойынша спутниктік вирустардың геномдарына ұқсас және әлдеқайда кішірек.
    ВИРОЙДТАР

    Вироидтар жұқпалы аурудың ең кішкентай белгілі қоздырғыштары болып табылады - кішкентай (246-375) нуклеотидтер), жоғары құрылымды, ақуыз капсиді де, анықталатын хабаршы РНҚ белсенділігі де жоқ бір тізбекті РНҚ молекулалары.

    1. Вироидтар бар in vivo капсидаланбаған, төмен молекулалық РНҚ ретінде
    2. Инфекцияланған тіндерде вирус тәрізді бөлшектер болмайды
    3. Инфекция үшін төмен молекулалық РНҚ-ның бір ғана түрі қажет
    4. Вироидтер ешқандай ақуызды кодтамайды
    5. Кішкентай мөлшеріне қарамастан, вироидтар сезімтал жасушаларда автономды түрде репликацияланады және көмекші вирус қажет емес.
    6. Бір тізбекті вироидтық РНҚ-лар рибонуклеазалар арқылы ас қорытуға төзімді және жоғары термиялық тұрақтылыққа ие (оңай денатурацияланбайды).
    • Трансформация – өсімдікке қандай да бір механизм арқылы жаңа генді енгізу (яғни, Агробактерия-делдалдық генді тасымалдау, бомбалау, электропорация, өсімдік вирусы арқылы генді тасымалдау).
    1. Жаңа гендердің қосылуы (жаңа ген өнімін экспрессиялау үшін).
    2. Геннің немесе ген өнімінің басылуы (өсімдікте - мысалы, жемістердің қартаюын болдырмау үшін этилен газын өндіруге қарсы немесе ықтимал өсімдік вирусына қарсы - мысалы, TMV).
    • майларды, крахмалдарды және пластмассаларды синтездей алады
    • тағамды өңдеуге және басқа мақсаттарға арналған ферменттерді синтездей алады
    • көбірек қоректік тағамдар (мысалы, ақуыз мөлшері жоғары өсімдіктер және маңызды аминқышқылдарының кең профилі - метионинге бай бұршақ немесе лизинге бай жүгері)
    • өсу үшін азотты бекіте алады
    • қатуға төзімді
    • зиянкестерге төзімді
    • гербицидке төзімді
    • ауруға төзімді.
    • Трансформацияланған өсімдік өнімдеріне аллергия.
    • Мәдени өсімдіктердің жабайы туыстарына жаңа гендердің кездейсоқ қозғалысы.
    • Тұтынушының генетикалық түрлендірілген өсімдік өнімдерін, әсіресе азық-түлік өнімдерін пайдалануға төзімділігі.
    • Этикалық және моральдық ойлар. (мысалы, улы болып табылатын трансгенді марихуана өсімдіктерін шығару, жеке пайда үшін генетикалық ресурстарды пайдалану).

    1. Агробактерия- гендердің делдалдық тасымалдануы

    1. Ti гендері шектеу ферменттерінің көмегімен жойылады
    2. Антибиотиктерге төзімділіктің мақсатты гені/гені енгізілген
    3. A. tumefaciens ішіне қайта енгізілген модификацияланған Ti плазмиді
    4. Бактериялар қалаған хостты жұқтыруға мүмкіндік берді (әдетте иесінің тіндік мәдениеті)
    5. Бактериялар ДНҚ-ны иесіне енгізеді
    6. Антибиотиктер (а) бактерияны жою үшін және (b) трансформацияланбаған жасушаларды таңдау үшін өсіп келе жатқан каллусқа қосылады.
    7. Тін мәдениетіндегі каллус бүкіл өсімдікті қалпына келтіру үшін қолданылады
    • ДНҚ-мен қапталған бөлшектер микропроектті зеңбірек (мылтық ұнтағы заряды) арқылы өсімдік тініне түсірілді.
    • Electrical-acceleration of DNA-coated particles.
    • Final Product: Population of transformed/untransformed cells. Transformed cells are selected and through tissue culture work a new plant is generated.
    • Protoplasts (cell wall removed with enzymes) or partially-digested apical meristems using enzymes.
    • Sudden electrical discharge opens up membrane and DNA is allowed to enter.
    • Final Product: Population of transformed/untransformed cells. Transformed cells are selected and through tissue culture work a new plant is generated.
    • Tobacco could be infected and the product harvested from altered plants.
    • Geneware' and Pharming'.
    • The coat protein genes of brome mosaic and tobacco mosaic viruses were replaced by bacterial chloramphenicol acetyltransferase. Such viruses are unable to systemically invade the host plant, and have only limited potential as expression vectors. In the case of TMV, this problem is solved by adding the foreign gene to the viral genome rather than substituting for one of the normal viral genes. Trial runs indicate that expression levels achieved are much lower than those of TMV coat protein. Insertion of such genes at different locations in the viral genome or a satellite-like virus associated with helper viruses may increase these yields.

    Mycoviruses are probably widespread in fungi in nature, despite the fact that relatively few have been isolated and characterized, and still fewer have been experimentally transmitted to test fungi and demonstrated to be infectious. A survey of 50 isolates of Rhizoctonia solani from the field, 49 were found to have RNA resembling that of mycoviruses.

    Typical mycovirus particles are isometric in shape and have a diameter between 25-48 nanometers. Some mycoviruses are rod-shaped or have some other form. This nucleic acid core usually consists of dsRNA and infrequently contains dsDNA. Some mycoviruses appear to be multipartite. Strains of Penicillium chrysogenum, from which the antibiotic penicillin is commercially produced appears to be infected by a mycovirus. Mycoviruses appear to be transmitted by means of cytoplasm and through spores. Mycoviruses appear to be retained in the cytoplasm of a fungal strain indefinitely.

    Many mycoviruses do not cause symptoms in their hosts, despite the fact that cells may harbor large numbers of virus particles. Viral infection in the edible mushroom Agaricus brunnescens causes a degeneration of the mycelium and development of malformed basidiocarps, resulting in a reduction of yield.


    Summary – DNA vs RNA Viruses

    DNA viruses and RNA viruses are the two main categories of viruses. As their names imply, DNA viruses contain DNA as their genetic material while RNA viruses contain RNA as their genetic material. Thus, this is one of the key differences between DNA and RNA viruses. Generally, DNA genomes are larger than RNA genomes. Furthermore, most DNA viruses contain double-stranded DNA while most RNA viruses contain single-stranded RNA. DNA viruses show accurate replications while RNA viruses show error-prone replication. Apart from that, DNA viruses are stable and show a lower mutation rate while RNA viruses are unstable and show a higher rate of mutation. This is the summary of the differences between DNA and RNA viruses.

    Reference:

    1. “DNA Viruses.” NeuroImage, Academic Press, Available here.
    2. “RNA Virus.” Wikipedia, Wikimedia Foundation, 20 Feb. 2019, Available here.


    Advantages and costs

    Evidence shows that, regardless the specific situations that permitted the appearance of multipartite viruses, this adaptive strategy yields highly successful plant viruses. A main open question is which are the specific advantages conferred by multipartitism. In that sense, how is multipartitism different from genome segmentation? How is the apparent problem of loss of genomic information in the plant-to-plant transmission solved? The question of the actual advantages of multipartitism in relation to other strategies has received relatively little attention in the virological literature though. However, new and seemingly puzzling experimental results have awoken interest in the problem of the very existence of multipartitism and its adaptive intricacies. 12,14,16 First, the recently described Jingmenviruses infect mosquitoes, cattle, and non-human primates, 27 thus broadening the range of hosts of multipartite viruses. This observation suggests that the initial restriction of multipartitism to plant viruses might be a result of a skewed and incomplete sampling. 13 Second, it has been repeatedly observed that, after an infection cycle, the abundances of different segments of the multipartite genome might vary in orders of magnitude, 14,22,46 with relative frequencies that seem to be host-specific. 14,79 The latter observation implies that ensuring maintenance of the genetic information requires a much higher MOI, which will be controlled by the least abundant segment.

    There are several possible advantages of multipartition that were put forward early in the literature. One of the most prominent suggestions is the possibility to increase variability through segment shuffling, thus generating hybrid viruses with characteristics from different strains. 80 Possible applications to genetic engineering were soon suggested. 81 Advantages in the relationship between parasite and host were also entertained, either related to the replicative machinery of the host 80 or to the possibility to regulate the relative abundance of genome segments in time and space, 82 thus controlling cellular resources and host resistance. At the beginning of the 1980 decade only three families (seven genera) of multipartite viruses were known, and all had ssRNA genomes of positive polarity. Multipartitism was implicitly linked to this feature of the virus invoking an increased efficiency in the control of translation. 83 Exceptions to the observations that led to the advantages just discussed caused soon the dismissal of several hypotheses. The work by Pressing and Reanney 84 represented an inflexion point in the topic. They argued against increased genetic flexibility, more efficient packaging or more efficient control of translation. Inspired by at the time recent theory that identified high mutation rates as a powerful restriction to the faithful transmission of genetic information in molecular quasispecies, 85 they devised for the first time a quantitative model of the advantage of bipartition, which would be due to increased copying fidelity of shorter segments.

    Pressing and Reanney’s model did not explore how a bipartite form would perform when in competition to its non-segmented analog. In a subsequent model, 86 conditions for the dominance of the bipartite form considering the MOI and the mutation rate were derived. Also a faster replication rate 87 was suggested as a putative advantage of shorter genomes, among others. 88 Those models and the conceptual framework where they were derived originated an interesting controversy in relation to the levels of selection that may affect multipartite viruses (summarized in 89,90 ). As of today, experimental evidence of the several possible advantages discussed in the literature is meagre, and the little one that exists does not seem to favor any of the classical hypotheses. The transition to bipartition observed in FMDV 50 permitted to quantify the advantage of the bipartite form in competition with the non-segmented wild type. Neither a more accurate maintenance of the genetic information nor a faster replication of shorter genomes were detected. Instead, it turned out that viral particles of the bipartite form were more stable, presumably due to a lower pressure exerted on the capsid by shorter RNA segments, allowing for a longer lifetime between infection events. 51

    In any of the scenarios explored, be they qualitative or quantitative, a sufficiently high MOI in transmission was seen as a requirement for persistence. Bona fide advantages of multipartition should compare this strategy with segmentation, and demonstrate that a similar advantage is not to be found in segmented viruses (which enjoy the advantages of shorter genomes without the cost of larger MOI 12 ). The precise cost of MOI to maintain a multipartite genome has been analytically worked out 91 in the scenario of a stochastic deme model. 92 It has been shown that, under independent propagation of the genome parts, a precise relationship between the gain in average lifetime between infection events due to shorter genomes and the MOI of the propagation exists. 91 If MOI is not high enough or the gain in stability is too small, the multipartite form will be unable to displace the wild type in competition otherwise non-segmented and multipartite forms coexist. Analogous relationships are obtained if the advantage relies on the elimination of deleterious mutations or on the replication rate. In any case, the model treats each segment on an equal footing, so it predicts that they will all be equally abundant. This scenario sets a precise limit to the number of segments that can arise under a mechanism of genome segmentation. 91 For example, a tetrapartite form in competition with its cognate non-segmented counterpart would be fixed only for MOIs above 100–200, well above known typical MOI. 93 The observation that different segments appear in different amounts puts much more stringent limits on the minimal MOI if they propagate independently. It has been suggested that variable frequency of the segments could however represent a genuine advantage of multipartition by granting additional regulation of gene expression by differences on copy number of the genes. 12,79 Though the problem of ensuring an MOI able to prevent the dispersion of genetic information remains, empirical knowledge of how multipartite viruses propagate between hosts is very limited. Most plant viruses use vectors to propagate through a broad variety of different interactions. 94 Despite some evidence suggesting that the number of viral particles transmitted through vectors is too small to fulfill the strict requirements of some multipartite viruses, 95,96 forms of propagation different from independently drawing the different segments cannot be discarded. 97,98 High MOI could be facilitated through the formation of complexes containing several heterogeneous particles, through plague-like dynamics of vector populations, or even through movement of the genome parts within the plant tissue—such that the simultaneous presence of all segments in a precise cell before the infection cycle starts would not be required. 99


    Аннотация

    Negative-stranded/ambisense RNA viruses (NSVs) include not only dangerous pathogens of medical importance but also serious plant pathogens of agronomic importance. Tomato spotted wilt virus (TSWV) is one of the most important plant NSVs, infecting more than 1,000 plant species, and poses major threats to global food security. The segmented negative-stranded/ambisense RNA genomes of TSWV, however, have been a major obstacle to molecular genetic manipulation. In this study, we report the complete recovery of infectious TSWV entirely from complementary DNA (cDNA) clones. First, a replication- and transcription-competent minigenome replication system was established based on 35S-driven constructs of the S(−)-genomic (g) or S(+)-antigenomic (ag) RNA template, flanked by the 5′ hammerhead and 3′ ribozyme sequence of hepatitis delta virus, a nucleocapsid (N) protein gene and codon-optimized viral RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) gene. Next, a movement-competent minigenome replication system was developed based on M(−)-gRNA, which was able to complement cell-to-cell and systemic movement of reconstituted ribonucleoprotein complexes (RNPs) of S RNA replicon. Finally, infectious TSWV and derivatives carrying eGFP reporters were rescued өсімдіктерде via simultaneous expression of full-length cDNA constructs coding for S(+)-agRNA, M(−)-gRNA, and L(+)-agRNA in which the glycoprotein gene sequence of M(−)-gRNA was optimized. Viral rescue occurred with the addition of various RNAi suppressors including P19, HcPro, and γb, but TSWV NSs interfered with the rescue of genomic RNA. This reverse genetics system for TSWV now allows detailed molecular genetic analysis of all aspects of viral infection cycle and pathogenicity.

    Negative-stranded/ambisense RNA viruses (NSVs) include well-known members of medical importance such as Ebola virus (EBOV), rabies virus (RV), influenza A virus (FLUAV), and Rift Valley fever virus (RVFV) (1, 2), which can cause considerable morbidity and mortality in humans and burden national health care budgets. NSVs also include serious plant pathogens of agricultural importance, such as Tospoviruses, Tenuiviruses, and Rhabdoviruses, that cause severe diseases on agronomic crops and pose major threats to global food security (3 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ –13).

    NSVs can be classified into nonsegmented and segmented viruses. Nonsegmented NSVs (Мононегавирустар) contain single genomic RNA segments, whereas Arenaviruses, Bunyaviruses, and Orthomyxoviruses contain 2, 3, and 6 to 8 segmented RNAs, respectively. Tospoviruses have 3 segments (tripartite) and rank among the most devastating plant viruses worldwide (14, 15). They are classified in the family Tospoviridae within the order Bunyavidales (16). Tomato spotted wilt virus (TSWV) is the type member of the only genus Orthotospovirus in the family Tospoviridae (14, 16). TSWV has very broad host range, infecting more than 1,000 plant species over 80 families (17), and is transmitted by thrips in a persistent, propagative manner (6, 9, 18, 19). Crop losses due to this virus have been estimated at more than $1 billion annually (7, 17).

    TSWV consists of spherical, enveloped virus particles (80 to 120 nm) that contain a tripartite genome consisting of large- (L), medium- (M), and small-sized (S) RNA segments (14). The L RNA segment is negative sense and encodes a single large RNA-dependent RNA polymerase (RdRp, ∼330 kDa) that is required for viral RNA replication and mRNA transcription (20, 21). Both M and S RNA segments are encoded as ambisense. The genomic (g) RNA (designated [−]) of the M segment encodes a nonstructural protein (NSm), and the antigenomic (ag) RNA (designated [+]) of the M segment encodes a precursor to the glycoproteins (GP Gn and Gc, with n and c referring to the amino- and carboxyl-terminal ends of the precursor, respectively). The NSm plays pivotal roles in cell-to-cell and long-distance movement of TSWV (22 ⇓ ⇓ ⇓ –26). The glycoproteins are required for particle maturation and are present as spikes on the surface of the virus envelope membrane (27, 28). They also play a major role as determinants for thrips vector transmission (29). The gRNA of the S segment encodes a nonstructural protein (NSs), and the agRNA of the S segment codes for a nucleocapsid protein (N). The NSs protein functions as an RNA silencing suppressor to defend against the plant innate immunity system (30 ⇓ –32) and triggers a defense response and concomitant programmed cell death mediated by the dominant resistance gene Tsw бастап Capsicum chinense (33 ⇓ –35). The N protein participates in the formation of ribonucleoprotein complexes (RNPs) (36 ⇓ –38) and is required for viral intracellular movement (39, 40).

    As a virus intensively studied for almost a century (7, 41), TSWV has served as an important model for studying the molecular biology of Tospovirus and other plant NSVs with segmented genomes (6 ⇓ –8, 14). However, its negative-stranded/ambisense tripartite RNA genomes have posed a major obstacle to genetic manipulation of the virus. The initiation of an infection cycle with this virus requires at least the RNP, the minimal infectious unit that consists of viral RNA encapsidated by the N protein and associated with a few copies of the viral RNA-dependent RNA polymerase (6, 14). TSWV RNPs can be mechanically transferred from infected to healthy plants however, transmission by thrips requires RNPs to be enveloped and spiked with the glycoproteins (29).

    The first animal-infecting and related counterpart of TSWV with a segmented RNA genome to be rescued entirely from complementary DNA (cDNA) was Bunyamwera virus in 1996 (42). Following this study, soon other segmented NSVs were rescued from plasmid DNA. The influenza A virus, containing a genome of 8 RNA segments, was recovered in 1999 (43), while the first arenavirus, with a bipartite RNA genome, was recovered in 2006 (44). The rescue of the first nonsegmented plant NSV from the Мононегавирустар, i.e., the sonchus yellow net virus (SYNV), was not reported until recently (11, 45). More recently, a TSWV S RNA-based minireplicon in yeast was reported (46), but no transcriptional activity was observed in contrast to replication.

    Despite the success of the reverse genetics (RG) systems in different animal-infecting NSVs, the өсімдіктерде reconstitution of infectious RNPs for plant-infecting viruses with a segmented RNA genome is particularly difficult. All DNA constructs need to be delivered into the same plant cell, and, for TSWV, the RdRp is exceptionally large (∼330 kDa) compared to the RdRp of most other related bunyaviruses (∼240 to 260 kDa) and to the typical open reading frames (ORFs) from the plant genome. Expression of such a large protein gene would be very inefficient, and mRNA transcripts from RNA polymerase II transcription of 35S promoter-constructs in the nucleus may also face splicing of cryptic splicing sites. Moreover, achieving the proper ratios of all 3 genome segments in plant cells is not easy or consistent via Агробактерия-mediated delivery of several constructs, and thus affects the outcome of individual experiments. All these obstacles have severely constrained the construction of a reverse genetics system for TSWV in plants.

    In this study, we report the complete recovery of infectious TSWV entirely from cDNA clones in plants. The establishment of this reverse genetics system presents the start of a new research era for TSWV and provides a powerful platform to study the basic principles of viral infection cycle and pathogenicity.


    Vector construction

    Construction of Cas13 orthologues for өсімдіктерде өрнек

    Nine different Cas13 variants were constructed for activity screening in plants and were cloned in binary vectors for өсімдіктерде expression. The DNA sequences of the LshCas13a variants were plant codon optimized and subsequently cloned into binary vectors, as described previously [33]. Similarly, plant codon-optimized versions of BzCas13b variants with fusions of the 3xHA tag at the N terminus were designed and synthesized (Blue Heron Biotech), either with or without the NLS-encoding sequence at the C terminus, and were flanked by attL1 and attL2 sites to facilitate Gateway cloning into binary vectors (Additional file 1: Sequence S1, S2). Subsequently, BzCas13b-NLS and BzCas13b (no NLS) were subcloned into pK2GW7 binary vectors using LR Gateway recombination cloning to generate pK2GW7-BzCas13b, in which expression is controlled by the constitutive 35S cauliflower mosaic virus promoter (Additional file 1: Map S1). For the other Cas13 orthologues, including LwaCas13a-NLS/NES, PspCas13b-NES, CasRx-NLS, and dCasRx-NLS, the DNA sequences were amplified from plasmids provided by Addgene (Addgene plasmid numbers 91902/105815, 103862, 109049, and 109050, respectively) using primers that add a CACC sequence to the 5′ end of the amplified sequence to facilitate subsequent directional cloning into pENTR/D-TOPO vectors (Invitrogen) (Additional file 1: Table S2). Subsequently, Cas13 sequences were transferred from the pENTR/D-TOPO entry vectors into pK2GW7 binary vectors using Gateway recombination reactions. To generate the CasRx-NES version, the CasRx ORF sequence was amplified from the CasRx-NLS vector (plasmid number 109049) using primers that remove NLS sequences from the N and C termini of CasRx-NLS ORF, leading to the removal of the HA tag and GFP-encoding sequences, and BsaI sites were added at both ends of the isolated ORF (Additional file 1: Table S2). To add nuclear export sequences (NES), DNA sequences encoding NES and NES-1xHA tags were purchased as single-stranded DNA (ssDNA) oligonucleotides from Sigma with overhangs complementary to the overhangs generated from digestion of the BsaI sites at the two ends of the isolated CasRx ORF sequence (Additional file 1: Table S2). Phosphorylated and annealed double-stranded DNA (dsDNA) oligonucleotides were ligated into the BsaI-digested DNA sequence of the CasRx ORF to produce the 5′-NES-CasRx-NES-HA-3′ sequence. Subsequently, the ligation product of 5′-NES-CasRx-NES-HA-3′ was PCR amplified and subcloned into the pENTR/D-TOPO vector, followed by transfer into the pK2GW7 binary vector using LR Gateway recombination cloning. All the Cas13 variant sequences were confirmed in pK2GW7 binary vectors with Sanger sequencing.

    Generation of the TRBO-BFP construct

    To generate the TRBO infectious clone expressing BFP, the EBFP-encoding sequence was amplified from the LeGO-EBFP2 vector (Addgene plasmid number 85213) with primers that add AseI and NotI restriction sites to the 5′ and 3′ ends of the amplified BFP sequence, respectively (Additional file 1: Table S2). The GFP-encoding sequence was removed from the pJL-TRBO-G clone (Addgene plasmid number 80083) by digestion with AseI and NotI and replaced by the ligation of the AseI- and NotI-digested PCR product of BFP into the digested vector.

    Construction of crRNA expression constructs

    To construct the crRNA expression clones, the orthologue’s corresponding direct repeat with the targeting or non-targeting (NS) sequences was purchased from Sigma as ssDNA oligonucleotides (all crRNA sequences used in this study are listed in Additional file 1: Table S1). The phosphorylated and annealed dsDNA fragments of crRNAs were ligated into the TRV RNA2 genome under the pPEBV promoter using XbaI and either XhoI or BamHI restriction sites.

    Өсімдік материалы

    Two- to 3-week-old wild-type Никотиана бентамиана plants grown under long-day conditions (16 h light, 8 h dark at 25 °C) were used for all transient experiments. To generate transgenic Никотиана бентамиана plants overexpressing different Cas13 orthologues, Agrobacterium tumefaciens GV310 strains harboring the selected constructs were transformed into Н.бентамиана leaf discs following previous published protocols [56]. Generated plants (T1) were screened for the expression of the Cas13 protein by immunoblotting using an anti-HA antibody, and seeds harvested from the Cas13-positive plants were screened on kanamycin-containing MS (Murashige and Skoog) media. Surviving seedlings were used for virus-targeting experiments.

    Agroinfiltration of Н.бентамиана жапырақтары

    The different constructs (including all pK2GW7-Cas13 constructs, the TRV RNA1 genome, the engineered TRV RNA2 genomes harboring crRNA sequences under the pPEBV promoter, and the different infectious clones of the RNA viruses, including TRBO-GFP, TRBO-BFP, PVX-GFP, or TuMV-GFP) were individually electroporated into A. tumefaciens strain GV3101. Single colonies grown overnight in selective medium were centrifuged and suspended in infiltration medium (10 mM MES [pH 5.7], 10 mM MgCl2, and 200 μM acetosyringone) and incubated at ambient temperature for 2 h. For infiltration into leaves of Н.бентамиана plants, cultures were mixed at a final OD600 of 0.5 for pK2GW7-Cas13, 0.1 for RNA1 and RNA2-crRNAs, 0.05 for TuMV-GFP and PVX-GFP, and 0.005 for TRBO-GFP and TRBO-BFP, relative to the suspended culture grown overnight. Healthy and fully developed leaves were selected for experiments, and agroinfiltration was done with a 1-ml needleless syringe.

    Fluorescent protein intensity assays and quantitative fluorescence intensity analysis of images

    For GFP and/or BFP expression in transient studies, infiltrated leaves were cut and then photographed after 3 days under a handheld UV light in the dark. For the systemic TuMV-expressed GFP in wild-type and transgenic plants, the whole plants were photographed after 6 to 7 days post-infiltration (dpi). For the quantitative measurements of the GFP signal intensity in images, the mean pixel values of the TRBO-GFP gene expression images were analyzed with ImageJ software to estimate GFP expression across samples. For each sample (each target of Cas13 variants), three biological replicates, represented as three different infiltrated leaves from three different plants, were analyzed. For each leaf, the GFP signal intensities were obtained as the corrected total cell fluorescence (CTCF) following this formula: CTCF = integrated density − (area of selected cell × mean fluorescence of background readings). The CTCF values of all three biological replicates for each sample were then averaged, and the normalized average of each target was compared to the normalized average CTCF value of the NS target. All values were limited to max = 100.

    Immunoblot analysis

    Total proteins were extracted from 100 mg of sample using extraction buffer (100 mM Tris-Cl, pH 8, 150 mM NaCl, 0.6% IGEPAL, 1 mM EDTA, and 3 mM DTT) with protease inhibitors (PMSF, leupeptin, aprotinin, pepstatin, antipain, chymostatin, Na2VO3, NaF, MG132, and MG115). Proteins were separated on a 10% polyacrylamide gel. Immunoblot analysis was conducted using mouse α-GFP antibody (1:3000, Invitrogen) for virus-expressed GFP and rat α-HA (1:1000) antibody for detection of Cas13 proteins. The antigens were detected by chemiluminescence using an ECL-detecting reagent (Thermo Scientific). The quantitative graphs summarizing the average of three independent biological replicates were produced by calculating the densiometric data generated by the relative quantification of protein bands from immunoblot membranes using ImageJ software. The average data of three independent immunoblot replicates were calculated as previously described [57]. Results were presented as fold change relative to the NS and/or virus-only control samples.

    RNA extraction and RT-qPCR for analysis of viral RNA genomes

    Total RNA was extracted from infiltrated leaves (in transient assays) or systemic leaves (in Cas13 overexpression lines) using Direct-zol RNA Miniprep Kits (Zymo Research) following the manufacturer’s instructions. Viral RNA was quantified with one-step RT-qPCR using the iTaq Universal SYBR Green One-Step Kit (Bio-Rad). All RT-qPCR reactions were performed in 10 μl reactions with three technical replicates in either 384-well or 96-well format and read out using a StepOnePlus™ Real-Time PCR System (Applied Biosystem) for the 96-well plates or the CFX384 Touch™ Real-Time PCR detection system (Bio Rad) for the 384-well plates. Expression levels were calculated by subtracting the housekeeping reference gene (tobacco PP2A [58]) cycle threshold (Cт) values from target Cт values to normalize for total input, resulting in ΔCт деңгейлері. Relative transcript abundance was computed as 2 −ΔΔCt [59]. All samples were performed as three biological replicates.