Ақпарат

Транскрипттегі шаш қыстырғышы (бағаналы ілмек) эукариоттық рибосоманы тоқтата ала ма?

Транскрипттегі шаш қыстырғышы (бағаналы ілмек) эукариоттық рибосоманы тоқтата ала ма?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Олардың РНҚ-ның қайталама құрылымының дәлелі эукариоттық жасуша ішінде трансляцияны тоқтатады ма?


Транскрипттегі шаш қыстырғышы (бағаналы ілмек) эукариоттық рибосоманы тоқтата ала ма?

Бұл болуы мүмкін сияқты. C9orf72 аудармасы мысалдардың бірі болып табылады. Бұл генде GGGGCC қайталануы мРНҚ-ның 5' UTR-де (бірінші ATG-ден жоғары) болады. Қайталанулар ALS сияқты нейродегенеративті бұзылыстың ішкі жиындарында кеңейеді. Қайталанулар діңгек ілмек құрылымын құра алады және кеңейтілген қайталанулардың өзек ілмектері тұрақтырақ болады.

Кеңейтілген қайталануы бар mRNA-лар GGGCC қайталануынан әртүрлі кадрлардан GGG-GCC, GGG-CCG және GGC-CGG кодондары болып табылатын поли-ГлиАла, поли-ГлиПро және поли-ГлиАрг пептидтерін шығаратын сияқты.

Бұл аударма ATGсіз қайталаудың бір жерінде немесе жоғарыда басталатынын білдіреді. Мұны түсіндіру үшін рибосомалар GGGGCC кеңейтілген қайталанулары арқылы өзек ілмегі тығыз құрылымына байланысты тоқтап қалады, қателесіп тРНҚ алып, трансляцияны бастайды деген болжам бар. Ол «Қайталаумен байланысты емес ATG аудармасы» деп аталады.

Мыналарға сілтеме жасағыңыз келуі мүмкін: Қайталаумен байланысты AUG емес аударма және оның нейродегенеративті ауруға әсері. https://sites.tufts.edu/als/the-answer/c9orf72/ RAN аудармасы және фрейм ауыстыру адамның нейродегенеративті бұзылыстарының қарапайым қайталануындағы аудармалық қиындықтар ретінде


Түйіндеме

Соңғы онжылдықта бактериялық 70S рибосомасының көптеген рентгендік кристаллографиялық үлгілерінің пайда болуына қарамастан, эукариоттық 80S рибосомасының дәл атомдық моделі әлі де қол жетімді емес. Эукариоттық рибосомаларда эукариоттық жасушалардағы экстрарибосомалық функцияларға қатысатын бактериялық рибосомаларға қарағанда рибосомалық ақуыздар мен рибосомалық РНҚ көбірек болады. Крио-ЭМ РНҚ және ақуыз гомологиясын модельдеумен біріктіру арқылы біз құрылымдық гомологты анықтауға болатын барлық рибосомалық РНҚ кеңейту сегменттерімен және барлық рибосомалық ақуыздармен толық ашытқы 80S рибосомасының атомдық үлгісін алдық. 80S рибосомалық ақуыздардың мутациясы немесе жойылуы рибосоманың жетілуін тоқтатып, адамның бірнеше ауруларына әкелуі мүмкін. Біз мутациялары адамдардағы Diamond-Blackfan анемиясымен байланысты эукариоттарға ғана тән осындай ақуыздың бірін локализацияладық, rpS19e. Сонымен қатар, біз рибосоманың динамикалық сабақ негізі арасындағы эукариоттық ұзарту факторы 2-мен маңызды өзара әрекеттесуді сипаттаймыз.

Ағымдағы мекен-жайы: Фармакология департаменті, Кейс Вестерн Резерв университеті, Кливленд, OH 44106-4965, АҚШ

Ағымдағы мекенжай: Құрылымдық биология бойынша ғылыми-зерттеу серіктестігі, Ратгерс, Нью-Джерси мемлекеттік университеті, Химия және химиялық биология департаменті, Пискатауэй, NJ 08854-8087, АҚШ

Ағымдағы мекен-жайы: Құрылымдық және молекулалық биология институты, Кристаллография мектебі, Лондон Биркбек колледжі, Лондон WC1E 7HX, Ұлыбритания


Аннотация

Тоқтау кодоны 80S рибосомалық А орнында болғанда, мРНҚ арнасын алып жатқан алты нуклеотид (+4-тен +9) төмен болады. Біз осы төменгі нуклеотидтердің сүтқоректілердің жасушаларындағы трансляцияның аяқталуының сәттілігіне немесе үш аялдама кодонындағы сәтсіздікке әсерін зерттедік. Тоқтату кодондарының (UAA>UAG>>UGA) ішкі сенімділігінде күтілетін иерархия байқалды, бұл ретте +4 және +8 позициясындағы нуклеотидтер арқылы жүргізілетін терминацияны оқуға жоғары ықпалды әсерлер болды. Күрделі әсер +5 және +6 позицияларындағы нуклеотидтерден байқалды. Ең әлсіз аяқтау контексттеріне декодтау шығару факторының (eRF1) концентрациясының жоғарылауы немесе төмендеуі көбірек әсер етті, бұл eRF1 осы сигналдармен байланысу жылдамдығын шектейтінін көрсетеді. Терминация тиімділігі туыстық супрессор тРНҚ-ларымен айтарлықтай төмендегенде, төменгі нуклеотидтердің байқалған әсері сақталды. Эукариот геномдарындағы, әсіресе, Saccharomyces cerevisiae және Drosophila melanogaster. Біз тоқтату тиімділігіне тікелей босату факторы арқылы тоқтату сигналын сұрау ғана емес, сонымен қатар кіру арнасындағы мРНҚ нуклеотидтерімен төменгі рибосомалық әрекеттесу де әсер ететінін ұсынамыз.


3. Нәтижелер

3.1 5′UTR РНҚ құрылымдарымен өрнек күшін өзгерту

Соңғы жұмыс S. cerevisiae мРНҚ-ның 5′UTR ішіндегі шаш қыстырғыш құрылымдары трансляцияны тежеу ​​арқылы экспрессияны төмендететінін көрсетті (22). Алдымен бұл тұжырымды тексеру үшін біз галактозаны индукциялайтын GAL1 промоторынан жасыл флуоресцентті протеинді (GFP) кодтайтын мРНҚ 5′UTR-ге шаш түйреуіш құрылымдарының кітапханасын енгізу үшін бір ыдысты клондау әдістерін қолдандық. Дегенерацияланған олигонуклеотидті праймерлермен ПТР күшейту стратегиясын, содан кейін модульдік YTK жүйесімен клондау арқылы біз 1-суретте жинақталған және S1 қосымша суретінде егжей-тегжейлі берілген GFP бастапқы кодонынан 15 негізге дейінгі аралықта орналасқан шаш қыстырғыш кітапханасын енгіздік. Шаш қыстырғышты кодтау ретін жобалау үшін біз ViennaRNA құралдар жиынтығынан RNAfold қолдандық, себебі ол RNAfolding алгоритмдерін жергілікті компьютерде іске қосуға мүмкіндік береді және термодинамикалық параметрлерді 30°C температурада жұмыс істеу үшін реттеуге болады (14, 40). Бастапқы сынақ ретінде екі жұп дегенерацияланған олигонуклеотид праймерлері uORF түзілуін болдырмау үшін мерзімінен бұрын AUG бастау кодондарының енгізілмейтінін қамтамасыз ететін дизайн стратегиясын қолдана отырып, екі балама қайталама құрылым кітапханасын құруға арналған. Праймерлер бірге Қозақ аймағының дәл жоғары жағында орналасқан 27 негізді жұптың күшті шаш қыстырғыш мотивіне бүктелу үшін RNAfold болжаған дәйектіліктің 60 негізін енгізуді кодтайды (1А сурет).

Nby9qm4hx2K4bea6SHCWIvi-VRKZ5OOWkC26-791OdDdr6I8t52VVNpK6oFk5BLnwTEBTIOSQYlwAvYpNG" />

HL1 және HL2 5′UTR шаш қыстырғыш кітапханасын құруға шолу. (А) Дегенерацияланған нуклеотидтер шаш қыстырғыштың құрылымына әртүрлі позицияларда енгізіледі. (Б) Барлық ықтимал тізбектердің MFE RNAfold арқылы есептеледі және гистограммада бейнеленеді. Содан кейін бұл мәндер нәтиже кітапханасының өрнек профилін болжау үшін пайдаланылады. Қажет болған жағдайда, дегенерацияланған нуклеотидтердің құрамы мен орналасуы экспрессия деңгейлерінің қажетті таралуын алу үшін реттеледі. (C) Дизайн талаптарға сай болғанда, қажетті азғындықтарды қамтитын праймерлерге тапсырыс беріледі. Плазмидалар кітапханасы ішек таяқшасы трансформация ПТР және YTK пішімінде жүзеге асырылған келесі Golden Gate негізіндегі құрастыру қадамы арқылы жасалады. кітапханасы E. coli трансформанттар жиналып, плазмидалар ашытқы трансформациясына дайындалады. (D) Трансформаторлық ашытқы колониялары ағынды цитометрияның көмегімен біріктіріліп, талданады. Құрамында қызыл флуоресценция көрсетпейтін клондар дұрыс құрастыру үшін сапаны бақылауда жойылады. Шаш түйреуіштер кітапханасының әртүрлілігі жасыл флуоресценцияның магнитуданың үш тәртібіне таралуынан көрінеді. Анықтама үшін бастапқы құрылымның таралуы ашық жасыл түспен көрсетілген және қосалқы осьпен нормаланған. Қалыптастыру алдындағы салыстыру S2 қосымша суретінде көрсетілген.

Nby9qm4hx2K4bea6SHCWIvi-VRKZ5OOWkC26-791OdDdr6I8t52VVNpK6oFk5BLnwTEBTIOSQYlwAvYpNG" />

HL1 және HL2 5′UTR шаш қыстырғыш кітапханасын құруға шолу. (А) Дегенерацияланған нуклеотидтер шаш қыстырғыштың құрылымына әртүрлі позицияларда енгізіледі. (Б) Барлық ықтимал тізбектердің MFE RNAfold арқылы есептеледі және гистограммада бейнеленеді. Содан кейін бұл мәндер нәтиже кітапханасының өрнек профилін болжау үшін пайдаланылады. Қажет болған жағдайда, экспрессия деңгейлерінің қажетті таралуын жасау үшін дегенерацияланған нуклеотидтердің құрамы мен орналасуы реттеледі. (C) Дизайн талаптарға сай болғанда, қажетті азғындықтарды қамтитын праймерлерге тапсырыс беріледі. Плазмидалар кітапханасы ішек таяқшасы трансформация ПТР және YTK пішімінде жүзеге асырылған келесі Golden Gate негізіндегі құрастыру қадамы арқылы жасалады. кітапханасы E. coli трансформанттар жиналып, плазмидалар ашытқы трансформациясына дайындалады. (D) Трансформаторлық ашытқы колониялары ағынды цитометрияның көмегімен біріктіріліп, талданады. Құрылымдық қызыл флуоресценция көрсетпейтін клондар дұрыс құрастыру үшін сапа бақылауында жойылады. Шаш түйреуіштер кітапханасының әртүрлілігі жасыл флуоресценцияның магнитуданың үш тәртібіне таралуынан көрінеді. Анықтама үшін бастапқы құрылымның таралуы ашық жасыл түспен көрсетілген және қосалқы осьпен нормаланған. Қалыптастыру алдындағы салыстыру S2 қосымша суретінде көрсетілген.

Дегенерацияланған нуклеотидтер праймерлердің ішінде 10 позицияға жобаланған, осылайша клондау нәтижесінде пайда болған әртүрлі құрылымдар шаш қыстырғышының ішіндегі негіздердегі вариацияға ие болады, сондықтан алынған РНҚ қайталама құрылымы үшін күштілік ауқымы. RNAfold көмегімен екі шаш қыстырғыш кітапханасының әрқайсысы үшін бүктелудің болжамды ең аз бос энергиясының таралуын енгізілген азғындау негіздерінің барлық ықтимал комбинациялары үшін бүктеу күшін есептеу арқылы анықтауға болады (1В-сурет). Әрқайсысының 10 азғын негізі бар екі бастапқы кітапхана −32,2 ккал/моль және −28,8 ккал/моль орташа MFE қатпарлануымен болжанған қайталама құрылым беріктіктерінің қалыпты таралуын беруге арналған (тиісінше HL1 және HL2 кітапханалары, Қосымша кестені қараңыз). реттілік үшін S9).

Плазмидтік кітапхана құрылысы кезінде барлық колониялар әр кітапханаға біріктіріліп, кейін түрлендірілді S. cerevisiae және әр кітапхананың барлық ашытқы колониялары біріктірілді. Біріктірілген кітапханалар ген экспрессиясын индукциялау үшін галактозалық ортада өсірілді және әрбір ұяшықтағы жасыл флуоресценция ағындық цитометрия арқылы әрбір кітапхананың 10 000 ұяшығы үшін өлшенді (1С сурет). HL1 және HL2 кітапханалары үшін қалыпқа келтірілген жасыл флуоресценция популяция бойынша үш шамадан жоғары өзгеретіні байқалды (1D сурет), бұл шаш қыстырғыш модульдері бар эквивалентті құрылыммен салыстырғанда ұяшықтардағы GFP экспрессиясын айтарлықтай өзгерткенін көрсетеді. шаш қыстырғыш модулі жоқ (Қосымша сурет S2). Екі жағдайдағы флуоресценция гистограммаларының пішіні мен шыңы да ерекшеленеді, болжанған қайталама құрылымы (HL1) күштірек кітапхана пайдаланылған кезде GFP экспрессиясының аз мөлшерін көрсететін көбірек ұяшықтар.

3.2 Өрнек деңгейлерін болжамды бүктеу энергияларына сәйкестендіру

Біз бұдан әрі кодталған 5′UTR қайталама құрылымдарының болжамды MFE және нәтижесінде пайда болатын байланыстарды анықтауға тырыстық. in vivo GFP өрнек деңгейлері S. cerevisiae. Біз кітапханаларымыздан кездейсоқ 31 жеке колонияларды таңдадық, олардың 5′UTR аймақтарының ретін анықтадық және индукция кезінде бір ұяшыққа GFP экспрессиясын сипаттау үшін ағын цитометриясын қолдандық. Біз 5′UTR реттілігін енгізу арқылы әрбір изоляттағы шаш қыстырғыш құрылымдары үшін MFE болжау үшін RNAfold қолдандық. Содан кейін біз болжанған MFE және әрбір оқшауланған колония үшін болжанған UTR қатпарлану энергиясы мен GFP өрнегі арасындағы анық байланысты ашатын нормаланған GFP өрнегінің арасындағы байланысты сыздық (2А сурет). −22 ккал/моль жоғары MFE бар әлсіз құрылымдар экспрессияның өлшенетін төмендеуін бермейді, бірақ MFE мәндері одан әрі төмендеген сайын GFP экспрессиясының күрт төмендеуі байқалады. гендік экспрессия. Төмендеу транскрипцияның төмендеуіне емес, аударманың төмендеуіне байланысты екенін растау үшін біз qPCR әдісін әртүрлі 5′UTR шаш қыстырғыш тізбектері енгізілгеніне қарамастан, әрбір ұяшықтағы транскрипт деңгейлеріміздің өзгеріссіз қалатынын тексеру үшін қолдандық (қосымша S3 сурет).

5′UTR шаш қыстырғыш күші мен ақуыз экспрессиясы арасындағы корреляция. Күшті шаш қыстырғыштары болжамды түрде төмен өрнекті тудыратыны көрсетілген. (А) Шаш түйреуіштің жиналу энергиясы мен қалыпты жасыл флуоресценция арасындағы тасымалдау функциясын анықтау. Флуоресценция 31 оқшауланған HL1 және HL2 кітапхана мүшелері үшін өлшенді және қалыпқа келтірілген флуоресценцияны алу үшін ата-аналық штаммның медианалық автофлуоресценциясына бөлінді. Оқшаулағыштар 5′UTR реттілігін алу үшін реттелген, олар сәйкес шаш қыстырғыштың жиналу энергиясын есептеу үшін пайдаланылды. Диаграмма қалыпты жасыл флуоресценцияға қарсы сызылған және логистикалық өсу қисығымен бекітілген әрбір изоляцияның 5′UTR бүктеу энергиясын көрсетеді. Тізбектер мен алынған мәндер S5 қосымша кестесінде келтірілген. Қате жолақтары әрқайсысы 10 000 оқиғадан тұратын үш өлшемнің медианасының стандартты ауытқуын көрсетеді. (Б) Болжамды бүктелу энергиясы мен нормаланған флуоресценция арасындағы логистикалық сәйкестікті сипаттайтын теңдеу. (C) РНҚ шаш қыстырғыш кітапханасын құрайтын транскрипция бірлігінің диаграммасы. Қызғылт аймақ дистрофиялық нуклеотидтерді көрсететін қызыл шарлары бар шаш қыстырғышын құрайды. (D) 5′UTR құрылымы кітапханаларының болжамды күші мен осы кітапханалардың өлшенген гендік экспрессиялық үлестірімдері арасындағы корреляция. Барлық панельдер нормаланған жиілік үлестірімдерін (гистограммалар) көрсетеді. Барлығы алты кітапхана (HL1-6) көрсетілген, олардың орташа бүктелу MFE ккал/мольмен берілген. Панельдердің жоғарғы қатарында әртүрлі кітапханалардың 5′UTR-леріндегі MFE таралу гистограммасы көрсетілген. Бұл панельдер үшін көлденең осьтер сызықтық шкала бойынша -50 ккал/мольден 0 ккал/мольге дейін ауытқиды. Ортаңғы жол оларды болжанған нормаланған өрнек деңгейлерінің гистограммасына A панелінде орнатылған теңдеу арқылы түрлендіреді. Үшінші жол ағын цитометриясы арқылы өлшенген қалыпты флуоресцентті репортер өрнек деңгейлерінің эксперименталды түрде алынған таралуын көрсетеді. Төменгі екі қатарда көлденең ось логарифмдік шкала бойынша сол жақтағы 1-ден оң жақтағы 1000-ға дейінгі диапазондағы қалыпты жасыл флуоресценцияға (бірліксіз шама) сәйкес келеді.

5′UTR шаш қыстырғыш күші мен ақуыз экспрессиясы арасындағы корреляция. Күшті шаш қыстырғыштары болжамды түрде төмен өрнекті тудыратыны көрсетілген. (А) Шаш түйреуіштің жиналу энергиясы мен қалыпты жасыл флуоресценция арасындағы тасымалдау функциясын анықтау. Флуоресценция 31 оқшауланған HL1 және HL2 кітапхана мүшелері үшін өлшенді және қалыпқа келтірілген флуоресценцияны алу үшін ата-аналық штаммның медианалық автофлуоресценциясына бөлінді. Оқшаулағыштар 5′UTR реттілігін алу үшін реттелген, олар сәйкес шаш қыстырғыштың жиналу энергиясын есептеу үшін пайдаланылды. Диаграмма нормаланған жасыл флуоресценцияға қарсы сызылған және логистикалық өсу қисығымен бекітілген әрбір изоляцияның 5′UTR бүктеу энергиясын көрсетеді. Тізбектер мен алынған мәндер S5 қосымша кестесінде келтірілген. Қате жолақтары әрқайсысы 10 000 оқиғадан тұратын үш өлшемнің медианасының стандартты ауытқуын көрсетеді. (Б) Болжамды бүктеу энергиясы мен нормаланған флуоресценция арасындағы логистикалық сәйкестікті сипаттайтын теңдеу. (C) РНҚ шаш қыстырғыш кітапханасын құрайтын транскрипция бірлігінің диаграммасы. Қызғылт аймақ дистрофиялық нуклеотидтерді көрсететін қызыл шарлары бар шаш қыстырғышын құрайды. (D) 5′UTR құрылымы кітапханаларының болжамды күші мен осы кітапханалардың өлшенген ген экспрессиясының таралулары арасындағы корреляция. Барлық панельдер нормаланған жиілік үлестірімдерін (гистограммалар) көрсетеді. Барлығы алты кітапхана (HL1-6) көрсетілген, олардың орташа бүктелу MFE ккал/мольмен берілген. Панельдердің жоғарғы қатарында әртүрлі кітапханалардың 5′UTR-леріндегі MFE таралу гистограммасы көрсетілген. Бұл панельдер үшін көлденең осьтер сызықтық шкала бойынша -50 ккал/мольден 0 ккал/мольге дейін ауытқиды. Ортаңғы жол оларды болжанған нормаланған өрнек деңгейлерінің гистограммасына A панелінде орнатылған теңдеу арқылы түрлендіреді. Үшінші жол ағын цитометриясы арқылы өлшенген қалыпты флуоресцентті репортер өрнек деңгейлерінің эксперименталды түрде алынған таралуын көрсетеді. Төменгі екі қатарда көлденең ось логарифмдік шкала бойынша сол жақтағы 1-ден оң жақтағы 1000-ға дейінгі аралықтағы қалыпты жасыл флуоресценцияға (бірліксіз шама) сәйкес келеді.

2А-суреттегі тренд сигмоидальді қисық сызығын көрсететіндіктен, 5′UTR тізбегінің бүктелуінің есептелген MFE және максималды шығысынан ген экспрессиясын (қалыпты флуоресценция ретінде) болжау теңдеуін беру үшін логистикалық өсу теңдеуін өзгертуді таңдадық. промоутер (Pmax) ген экспрессиясының құрылымында қолданылады (2В сурет). Бұл бекітілген қисық деректерді мұқият бақылайтынымен, барлық деректер нүктелері 95% сенімділік аралығына түспейді және ең төтенше жағдайларда болжанған өрнек мәндері байқалған мәнмен салыстырғанда 3 есе артық немесе төмен бағаланады. Бұл біздің қисық сызықты сәйкестендіру тәсілі барлық мінез-құлықтарды толық қамтымайтынын көрсетеді, бірақ оның болжау күші әлі де бар көптеген құралдармен жақсы салыстырылады. RBS Calculator v1.0 бірнеше биофизикалық процестерді есепке алу үшін алынған үлгіні пайдаланғанымен болжанған мәндерден 10 есеге дейін ауытқулар берді (8). Сол сияқты, yUTR калькуляторындағы сызықтық сәйкестіктер (18) осы жерде көрсетілгендей деректерге жақын емес сияқты. 5′UTR вариациясын шаш қыстырғышының күшін басқаратын бірнеше негізгі нуклеотидтерге ғана шектейтіндігіміз осындай қарапайым тәсілдің жақсы нәтиже беретін себебі болуы мүмкін.

Қисық қисық теңдеуінің болжамдық күшін тексеру үшін біз келесі төрт қосымша кітапхананы (HL3-6) жасап, HL1 және HL2-мен салыстырғанда олардың үлестірімінде әртүрлі орташа құрылым күштеріне ие болу үшін әзірлендік (2С сурет). Әрбір кітапхананың барлық мүшелері үшін болжамды өрнек деңгейінің үлестірімі GAL1 промоутерін пайдалану үшін орнатылған теңдеу арқылы есептелген MFE-ден анықталды. Pmax. Содан кейін болжамды үлестірімдер гистограммалар ретінде сызылды және әрбір ашытқы кітапханасы үшін GFP шығысының ағындық цитометриялық үлестірімдерімен салыстырылды. Бұл модель болжамдары мен эксперименттік деректер арасында жақсы сапалық келісімді көрсетті (2D сурет). Барлық жағдайларда болжау гистограммалары таралу (өрнек деңгейлерінің диапазоны) және шыңның позициясы (орташа өрнек) бойынша өлшенген нормаланған GFP өрнегіне сәйкес келді. Популяциядағы шағын және үлкен жасушалардың ішкі шу тудыруына байланысты болжамдармен салыстырғанда ағын цитометрия деректерінде кейбір шыңның кеңеюі байқалады.

Содан кейін осы кітапханалардағы жеке мүшелердің күткендей жұмыс істейтінін тексеру үшін біз осы кітапханалардың бірінен (HL3) оқшауланған, реттелген және жеке сипатталған құрылымдарды алдық және олардың реттілігі негізінде болжанған MFE мәндеріне қарсы олардың байқалған GFP өрнегін сыздық (3A сурет). Біз GFP нөлдік мутациясына жатқызатын бір шектен тыс мәннен басқа, кірістірілген шаш қыстырғышының ретін өзгерту арқылы ген экспрессиясын болжамды реттеу мүмкіндігін тексеретін болжау мен өлшеу мәндері арасындағы тамаша келісім көрінеді.

Шаш қыстырғыш кітапханалары әртүрлі генетикалық контексттерде болжамдылықты сақтайды. Үш генетикалық контекстке енгізілген үш шаш қыстырғыш кітапханасынан алынған оқшаулаулар жеке реттіліктердің болжамдылығы әртүрлі контексттерде сақталатынын көрсетеді. Әрбір генетикалық контекст үшін біз ДНҚ тізбегінің мультфильмін (масштабта емес, жоғарғы қатар), қалыпқа келтірілген флуоресценцияның болжанған және өлшенген таралуын (ортаңғы қатар) және болжанғанға қарсы сызылған оқшауланған колониялардың нормаланған флуоресценция сызбаларын көрсетеміз. 5′UTR аймағының қатпарлануының бос энергиясы, сондай-ақ бастапқы промотордың (төменгі қатар) максималды флуоресценциясына негізделген әртүрлі қатпарлану энергияларындағы болжамды флуоресценция. (А) GAL1 туынды промоутері және yEGFP контекстіндегі HL3 кітапханасының изоляциялары. HL3 кітапханасында орташа MFE 25,8 ккал/моль бүктеледі, сондықтан MFE −35 ккал/мольден төмен изоляттар сирек кездеседі. (Б) GAL1 туынды промоутері және mRuby2 RFP контекстіндегі HL1 кітапханасының изоляциялары. HL1 кітапханасының орташа MFE мәні -32,2 ккал/моль. (C) PGK1 промоутері және yEGFP контекстіндегі HC1 кітапханасының изоляциялары. HC1 кітапханасының орташа MFE мәні -28,9 ккал/моль. Тізбектер мен алынған флуоресценция мәндері сәйкесінше (A), (B) және (C) үшін S6 – S8 қосымша кестелерінде берілген.

Шаш қыстырғыш кітапханалары әртүрлі генетикалық контексттерде болжамдылықты сақтайды. Үш генетикалық контекстке енгізілген үш шаш қыстырғыш кітапханасынан алынған оқшаулаулар жеке реттіліктердің болжамдылығы әртүрлі контексттерде сақталатынын көрсетеді. Әрбір генетикалық контекст үшін біз ДНҚ тізбегінің мультфильмін (масштабта емес, жоғарғы қатар), қалыпқа келтірілген флуоресценцияның болжанған және өлшенген таралуын (ортаңғы қатар) және болжанғанға қарсы сызылған оқшауланған колониялардың нормаланған флуоресценция сызбаларын көрсетеміз. 5′UTR аймағының қатпарлануының бос энергиясы, сондай-ақ бастапқы промотордың (төменгі қатар) максималды флуоресценциясына негізделген әртүрлі қатпарлану энергияларындағы болжамды флуоресценция. (А) GAL1 туынды промоутері және yEGFP контекстіндегі HL3 кітапханасының изоляциялары. HL3 кітапханасында 25,8 ккал/моль қатпарлы орташа MFE бар, сондықтан MFE −35 ккал/мольден төмен изоляттар сирек кездеседі. (Б) GAL1 туынды промоутері және mRuby2 RFP контекстіндегі HL1 кітапханасының изоляциялары. HL1 кітапханасының орташа MFE мәні -32,2 ккал/моль. (C) PGK1 промоутері және yEGFP контекстіндегі HC1 кітапханасының изоляциялары. HC1 кітапханасының орташа MFE мәні -28,9 ккал/моль. Тізбектер мен алынған флуоресценция мәндері сәйкесінше (A), (B) және (C) үшін S6 – S8 қосымша кестелерінде берілген.

3.3 5′UTR шаш қыстырғыштары модульдік бөліктер ретінде

Жасалған шаш қыстырғыштарын басқа конструкцияларға ауыстыруға болатындығын көрсету үшін біз келесі құрылымдардағы ORF тізбегін басқа ақуыздың бір кодтау өрнегімен ауыстырдық. Қазір қызыл флуоресцентті ақуызды (RFP) білдіретін осы кітапханалардың нұсқаларын жасау үшін yEGFP ORF-ді HL4, HL2 және HL1 кітапханалары үшін mRuby2 ORF-мен ауыстырдық. mRuby ORF-де yEGFP ORF-ге маңызды нуклеотидтер тізбегі гомологиясы жоқ, бұл 5′UTR контекстінің басқа төменгі ағындағы РНҚ тізбегі болуы арқылы өзгеретінін білдіреді. Осы жаңа кітапханалардағы RFP өрнегінің ағынды цитометриялық талдауы болжамды өрнек үлестіріміне сәйкес келеді (Қосымша S4 a суреті). Сонымен қатар, HL1-RFP кітапханасы үшін кездейсоқ таңдалған изогендік құрылымдар талданған кезде, біз жеке конструкциялар үшін болжау мен өлшеу мәндері арасындағы жақсы келісімді көрдік (3B сурет).

Содан кейін біз GFP-кодтау құрылымдарымыздың жоғары жағындағы промоторлар ретін өзгерту арқылы модульді әрі қарай бағаладық. Біз алдымен әртүрлі промоторлармен шығыстардың кең таралуын қамтамасыз ету үшін орташа MFE -28,9 ккал/моль болатын етіп таңдалған жаңа азғындалған шаш қыстырғыш кітапханасын (HC1) кодтайтын 5′UTR құрастырдық. Содан кейін бұл GFP өрнек кассетасына құрастырылды және әрқайсысы белгілі мәнді алу үшін экспрессиялық күші алдын ала анықталған әртүрлі конститутивті промоторы бар бес кітапхана жасау үшін пайдаланылды. Pmax. HC1 негізіндегі кітапханалар үшін өрнектердің таралуы беске бекітілген теңдеуді пайдалана отырып болжалды. Pmax құндылықтар. Бұл болжамды үлестіруді барлық бес кітапхана үшін ағынды цитометриялық талдаумен салыстырған кезде, әсіресе күшті промоторлар үшін жақсы сапалы сәйкестік қайтадан байқалды (Қосымша S4 b суреті). Мұның жеке деңгейде шындық екенін тағы да растау үшін изогендік құрылымдар реттелген және қайта талданған және олар болжанған және өлшенген өрнек деңгейлері арасындағы тамаша келісімді көрсетті (3C сурет). Бұл мүмкін болатын промоутерлердің шағын ғана үлгісі болғанымен, нәтиже 5′UTR шаш қыстырғыш тәсілі жоғары промоторларға қатысты модульдік екенін білдіреді, бұл тәсілді көптеген промоутерлердің өрнектерін өзгерту үшін қолдануға болатынын білдіреді. S. cerevisiae. Дегенмен, әлсіз промоторлар күшті 5′UTR құрылымына әсіресе сезімтал болып көрінетінін атап өту маңызды, сондықтан орташа бүктелу күші әлсіз кітапханалармен жұптастыру үшін ең қолайлы болады.

3.4 5′UTR шаш қыстырғыштарымен реттелетін өрнекті болжамды баптау

Мұнда әзірленген қайталама құрылымды mRNA 5′UTR ішінде орналастыру әдісі ген экспрессиясын модуляциялау үшін жаңа модульдік құралды ұсынады. жылы S. cerevisiae, геннің экспрессия күшін өзгертудің ең жиі қолданылатын әдісі промоторды ауыстыру болып табылады, алайда генді реттеу қажет болғанда (мысалы, индукцияланатын экспрессия үшін) промоторды баптау қиынға соғады, өйткені промотордағы мутацияланатын негіздер көбінесе транскрипция күшін өзгертеді. транскрипция факторларының промоторды байланыстыратын және реттейтін тиімділігін өзгертеді. 5′UTR шаш қыстырғыштары бұл мәселенің шешімін ұсынады, себебі өрнек шығысының дәл бапталуы реттеу кодталған жерден алыс негіздерді өзгерту арқылы қол жеткізіледі.

Мұны көрсету үшін біз өз көзқарасымызды мақсатты мутагенезді, іріктеуді және сипаттауды қолдана отырып, бұрын жасаған балама реттелетін промоторлар кітапханасымен тікелей салыстырдық (41). Екі жағдайда да GAL1 промоторының синтетикалық реттелетін нұсқасы пайдаланылады, мұнда Lac ингибиторы (LacI) промотор өзегінде орналасқан байланыстыру орнына байланысу арқылы GFP өрнекті басады. Бұл промотордың сыртқы реттелуі LacI репрессорын блоктайтын IPTG индукторы арқылы жүзеге асырылады және осылайша толық промотор экспрессиясына әкеледі.

Екі кітапхана үшін де IPTG қолданылған кезде максималды нәтижелердің қалаған диапазоны байқалады, бірақ репрессияның тиімділігі промоторлар кітапханасы үшін айтарлықтай өзгереді, әсіресе бірнеше промоторлар ағып кетеді (4А сурет). Керісінше, 5′UTR шаш қыстырғыш кітапханасының барлық мүшелері репрессияға әсер етпеген және индукцияланған шығыс сәйкестік болжамдарымен қалаған өрнек сипаттамаларын көрсетеді (4В сурет). Сонымен қатар, 45 мүшеден тұратын бұл кітапхананың генерациясы бір аптадан аз уақыт ішінде орындалды, 48-ден тек үш колония өрнектің болмауына байланысты жойылуы керек. Керісінше, бұрын қолданылған промоторлық мутагенез әдісі 2-3 аптаны және 21 мүшелік дәрежелі кітапхананы оқшаулау үшін 300-ден астам колонияларды скринингті қажет етті (41).

Реттелетін өрнектер кітапханасын құру әдістерін салыстыру. GAL1 негізіндегі реттелетін промоторларда промоторды басу үшін Lac Repressor (LacI) арқылы байланыстырылуы мүмкін синтетикалық Lac операторының учаскесі бар. IPTG кейіннен ДНҚ-дан LacI босату үшін қосылуы мүмкін, оның репрессивті әсерін кері қайтарады және yEGFP экспрессиясын индукциялайды. (А) Мақсатты кездейсоқ мутагенезді қолданатын нәтижелер мен әдіс. Бұл тәсілде негізгі промотордағы таңдалған аймақтар (сұр блоктар) толығымен рандомизацияланған. 350 үміткер пулынан 20 ең жақсы орындалатын хит (L1–L20) және мутацияланбаған нұсқасы (LX) таңдалады. Қате жолақтары үш биологиялық қайталаудың орташа стандартты қатесін білдіреді. (Б) Осы жұмыста әзірленген 5′UTR шаш қыстырғыштарын қолданудың нәтижелері мен әдісі. Құрамында бұзылған нуклеотидтер бар шаш қыстырғыш кітапхана тізбегі (HG1) транскрипцияның басталу орнынан кейін және бастапқы кодонның алдына тікелей орналастырылады. Алынған клондардан 45 алдын ала скринингтік қадамсыз тікелей таңдалады және сипатталады. Қате жолақтары үш биологиялық қайталанудың медианасының стандартты ауытқуын білдіреді.

Реттелетін өрнектер кітапханасын құру әдістерін салыстыру. GAL1 негізіндегі реттелетін промоторларда промоторды басу үшін Lac Repressor (LacI) арқылы байланыстырылуы мүмкін синтетикалық Lac операторының учаскесі бар. IPTG кейіннен ДНҚ-дан LacI босату үшін қосылуы мүмкін, оның репрессивті әсерін кері қайтарады және yEGFP экспрессиясын индукциялайды. (А) Мақсатты кездейсоқ мутагенезді қолданатын нәтижелер мен әдіс. Бұл тәсілде негізгі промотордағы таңдалған аймақтар (сұр блоктар) толығымен рандомизацияланған. 350 үміткер пулынан 20 ең жақсы орындалатын хит (L1–L20) және мутацияланбаған нұсқасы (LX) таңдалады. Қате жолақтары үш биологиялық қайталаудың орташа стандартты қатесін білдіреді. (Б) Осы жұмыста әзірленген 5′UTR шаш қыстырғыштарын қолданудың нәтижелері мен әдісі. Құрамында дегенерацияланған нуклеотидтері бар шаш қыстырғыш кітапхана тізбегі (HG1) транскрипцияның басталу орнынан кейін және бастапқы кодонның алдына тікелей орналастырылады. Алынған клондардан 45 алдын ала скринингтік қадамсыз тікелей таңдалады және сипатталады. Қате жолақтары үш биологиялық қайталанудың медианасының стандартты ауытқуын білдіреді.


Филиалдар

Марк Грайл Biochimie et Biophysique Moléculaire және Cellulaire институтында (IBBMC), National de la Recherche Scientifique орталығында (CNRS), UMR8619, Bat 430, Université Paris Sud, F-91405 Orsay Cedex, Франция және де Biochimie-де. , CNRS, UMR 7654, Ecole Polytechnique, F-91128 Palaiseau Cedex, Франция.

Бертран Серафин Equipe Labelisée La Ligue, Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire and Cellulaire (IGBMC), Ilkirch F-67400, Франция, CNRS, UMR7104, Illkirch F-67404, Франция, F64, Inserm, U9, -67400, Франция және Университетте Страсбург, Страсбург F-67000, Франция.


4. Болашақ перспективалар

Стохастикалық реакциялардың асинхронды сипатына байланысты егжей-тегжейлі молекулалық механизмдерді әдеттегі көлемді эксперименттерден шығару жиі қиын. Соған қарамастан, соңғы уақыттағы биофизикалық құралдардың дамуы, әсіресе бір молекулалы әдістер, псевдокноталардың механикалық және функционалдық қасиеттері [31, 32, 41, 44], рибосомалық геликазаның әрекеті [46, 78] және механизмдер туралы көп нәрсені түсіндірді. тұтастай аударма машиналарының [52, 76, 79, 80]. Шынында да, крио-ЭМ, рентгендік кристаллография, сондай-ақ молекулалық динамикалық модельдеу/модельдеу деректерін біріктіру smFRET нәтижелерімен жақсы келісетін рибосомалық L1 сабағы мен тРНҚ арасындағы өзара әрекеттесу туралы болжамдар мен түсініктер берді [80]. 𢄡 PRF механизмдерін зерттеуге ұқсас біріктірілген әдістемелерді қолдану арқылы нені үйренуге болатынын сұрағыңыз келеді.

Құрылымдық, есептеу және бір молекулалық тәсілдер бірін-бірі толықтырады. Есептік модельдеу және модельдеу молекулалардың динамикалық табиғатын ашады және сыртқы әсер ететін күштер болған кезде белок деформациясының физикаға негізделген әдістерін ұсынады [69, 73, 81, 82]. Есептеулер рибосоманы ең аз конформациялық өзгерістерді тудыратын және оптикалық пинцет кезінде мРНҚ-дан диссоциациялануын тудыратын учаскелерде таңбалау арқылы бір молекулалы экспериментте биотин/дигоксигениннің таңбалануын мүмкін ете алады. Оның механикалық сипаттамалары бұлшықет жасушаларында молекулалық күш сенсоры ретінде қызмет ететін титинкиназа жағдайындағы сияқты физиологиялық тұрғыдан маңызды болуы мүмкін [81�]. Екінші жағынан, бір молекулалық күш пен флуоресцентті спектроскопиялар белоктар [84�], РНҚ [87] және кешендер [41, 88] үшін қатпарлану-ашу, сондай-ақ созылу сияқты нақты уақыттағы құрылымдық ауысуларды зерттейді. Бұл деректерді кейінірек физика модельдері мен молекулалық модельдеулерді тексеру және/немесе нақтылау үшін пайдалануға болады.

Трансляциялық аппаратты, сондай-ақ 𢄡 PRF механизмдерін түсіну вирусқа қарсы терапия үшін тартымды мақсаттарды ұсынды. Эукариоттық 80S рибосомасына бағытталған және 𢄡 PRF [89, 90] өзгертетін препараттарды жасау мүмкін болса да, жанама әсерлер фрейм ауыстыруды пайдаланатын потенциалды жасушалық гендерге байланысты түсініксіз, бірақ әлі табылған жоқ [91’ x0201393]. Developing drugs that specifically interact with viral 𢄡 PRF-stimulating structures could be a good intervention strategy. Indeed, small ligands have been identified to alter viral 𢄡 PRF efficiencies by binding to the 𢄡 PRF-promoting stem-loop in HIV-1 and the pseudoknot in severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) [6, 21, 27]. As described above, single-molecule force spectroscopy can provide the unfolding forces of various RNA structures, which correlate with 𢄡 PRF efficiencies much better than thermodynamic stabilities. Studies with various mutant 𢄡 PRF-promoting structures may facilitate drug discovery by identifying the essential residues and bondings responsible for their mechanical stabilities as well as interactions with the ribosome. Accordingly, combining the new biophysical tools sheds light on how future antiviral agents can be developed to work against the ubiquitous 𢄡 PRF mechanisms among viruses.


Мазмұны

Simplified schematics of the mechanisms of prokaryotic transcriptional termination. In Rho-independent termination, a terminating hairpin forms on the nascent mRNA interacting with the NusA protein to stimulate release of the transcript from the RNA polymerase complex (top). In Rho-dependent termination, the Rho protein binds at the upstream rut site, translocates down the mRNA, and interacts with the RNA polymerase complex to stimulate release of the transcript.

Two classes of transcription terminators, Rho-dependent and Rho-independent, have been identified throughout prokaryotic genomes. These widely distributed sequences are responsible for triggering the end of transcription upon normal completion of gene or operon transcription, mediating early termination of transcripts as a means of regulation such as that observed in transcriptional attenuation, and to ensure the termination of runaway transcriptional complexes that manage to escape earlier terminators by chance, which prevents unnecessary energy expenditure for the cell.

Rho-dependent terminators

Rho-dependent transcription terminators require a large protein called a Rho factor which exhibits RNA helicase activity to disrupt the mRNA-DNA-RNA polymerase transcriptional complex. Rho-dependent terminators are found in bacteria and phages. The Rho-dependent terminator occurs downstream of translational stop codons and consists of an unstructured, cytosine-rich sequence on the mRNA known as a Rho utilization site (rut) for which a consensus sequence has not been identified, and a downstream transcription stop point (tsp). The rut serves as a mRNA loading site and as an activator for Rho activation enables Rho to efficiently hydrolyze ATP and translocate down the mRNA while it maintains contact with the rut site. Rho is able to catch up with the RNA polymerase because it is being stalled at the downstream tsp сайттар. Multiple different sequences can function as a tsp site. [1] Contact between Rho and the RNA polymerase complex stimulates dissociation of the transcriptional complex through a mechanism involving allosteric effects of Rho on RNA polymerase. [2] [3]

Rho-independent terminators

Intrinsic transcription terminators or Rho-independent terminators require the formation of a self-annealing hairpin structure on the elongating transcript, which results in the disruption of the mRNA-DNA-RNA polymerase ternary complex. The terminator sequence in DNA contains a 20 basepair GC-rich region of dyad symmetry followed by a short poly-A tract or "A stretch" which is transcribed to form the terminating hairpin and a 7𔃇 nucleotide "U tract" respectively. The mechanism of termination is hypothesized to occur through a combination of direct promotion of dissociation through allosteric effects of hairpin binding interactions with the RNA polymerase and "competitive kinetics". The hairpin formation causes RNA polymerase stalling and destabilization, leading to a greater likelihood that dissociation of the complex will occur at that location due to increased time spent paused at that site and reduced stability of the complex. [4] [5] Additionally, the elongation protein factor NusA interacts with the RNA polymerase and the hairpin structure to stimulate transcriptional termination. [6]


TRANSCRIPTION

The synthesis of messenger RNA from DNA is called transcription. The genetic information in DNA is not translated directly into proteins. These information are first transcribed into mRNA. Many enzymes are involved in the process of transcription. These enzymes perform following functions:

  • They unwind a region of a DNA molecule
  • They initiate and end mRNA synthesis.
  • They also modify the mRNA after the completion of transcription.

Only one or a few genes are exposed during transcription. Only one of the two DNA strands is transcribed. Eukaryotes have three enzymes involved in transcription of different RNAs. Бұлар:

(а) RNA Polymerase I is located in the nucleolus and transcribes ribosomal RNA (rRNA).

(б) RNA Polymerase II is localized to the nucleus. It transcribes messenger RNA (mRNA) and most small nuclear RNAs

(c) RNA Polymerase III is localized to the nucleus. It transcribes transfer RNA (tRNA) and other small RNAs (including the small 5S rRNA).

There are following steps of transcription: I. Initiation

Following steps are involved in initiation of transcription:

(a) The site of DNA where DNA polymerase attaches is called

промоутер. Promoter is normally composed of 50 nucleotides. It is present at the start of gene. The promoter for polymerase II contains a TATA box. The TATA box binding protein (TBP) recognizes TATA boxes and attached the RNA polymerase on promoter.

(б) Бұл кезеңде ДНҚ қос тізбекті (“тұйық”). This RNA Polymerase/wound-DNA structure is called closed complex.

(c) The DNA is unwound and becomes single-stranded (“open”) near initiation site. This RNA •Polymerase/unwound-DNA structure is called the open complex.

(d) The RNA polymerase transcribes the DNA, but produces about 10 abortive nucleotides (transcripts). These are unable to leave the RNA polymerase because the exit channel is blocked by the

(e) The a-factor of RNA polymerase dissociates from the holoenzyme and elongation starts.

RNA polymerase starts joining complementary ribose nucleotides to the 3′ end of the DNA strand. The same complementary bases paired in DNA. But in RNA, the base uracil replaces the base’ thymine. Thus uracil complement to adenine.

Newly RNA transcripts uses adenosine-5’riphosphate (ATP), guanosine-5 1 -triphosphate (CUP) (purine nucleoside triphosphates). Uridine-5′-triphosphate (UTP) and cytidine-5 . -triphosphate (CTP) (pyrimidine nucleoside triphosphates).

2. Termination

Transcription continues. Finally, RNA polymerase reaches the termination sequences. Thus transcription stops. Екі тоқтату механизмі белгілі:

(a) Rho-independent termination: It involves the terminator sequences within the RNA that signal the RNA polymerase to

stop. The terminator sequence is usually a palindromic sequence. It forms a stem-loop hairpin structure. It dissociates the RNA polymeras from the DNA template. One such common termination palindromic sequence ‘GCCGCCAG’. The RNA polymerase fails to proceed beyond this point. Therefore, the nascent DNA-RNA hybrid dissociates.

(b) Rho-dependent termination: In this case termination factor called p factor(rho factor) stop RNA synthesis at specific sites. This protein binds and runs along the mRNA towards the RNA polymerase. When p-factor reaches the RNA polymerase, it dissociates RNA polymerase from the DNA, terminating transcription.

The newly transcribed mRNA is called the primary transcript. It is modified before leaving the nucleus. Some base sequences in newly transcribed mRNA do not code for proteins. RNA splicing cut out these noncoding regions. Thus-the mRNA coding region can he read continuously at the ribosome.

(а)In Prokaryotes: The newly synthesized mRNA is directly

released into the cytoplasm in bacteria. It is converted into polypeptide chain in cytoplasm.

(б) In eukaryotes: The mRNA in eukaryotes has to travel from inside the nucleus to ribosomes outside in the cytoplasm. Therefore, eukaryotic mRNA is modified in several ways. These modifications help it in its journey. A cap and a tail are added. Thus the molecule remains stable during long journey to ribosome. The caps and tails save the mRNA from the action of variety of nucleases and phosphatases enzymes.


7 The structure of the degradosome

The catalytic center for endonucleolytic activity in RNase E is exclusively located in the N-terminal half of the protein (see Figs. 4 and 6) [ 40, 41, 79]. In a study directed at understanding the domain structure of RNase E, Vanzo et al. [62] analyzed the role RNase E plays in the assembly of the E. coli degradosome. The C-terminal half of RNase E contains distinct binding sites for the three degradosome components DEAD-box-helicase RhlB, enolase, and PNPase. Contact apparently is made on a one to one basis between RNase E and the ligand, while there is no direct interaction between the three. In particular, no interaction between PNPase α subunit and enolase was observed, making further questionable the fact that originally enolase was named β subunit of PNPase [61]. Vanzo et al. also showed direct evidence for oligomerization of RNase E, which was already proposed by Mackie [32]. The RhlB helicase is highly activated when in contact with the binding domain of RNase E. RNase E, apart from its own catalytic abilities, with its C-terminus is the assembly platform for the degradosome. A truncated C-terminal half of E. coli RNase E can bind the degradosome components PNPase, RhlB, and enolase [80].

The prokaryotic degradosome. This scheme presents a model for the structural organization of the degradosome acting on 3′-ends. The various pools for phosphate in this micro-environment are орто-phosphate Pмен, poly-phosphate (Pмен)n, mononucleotide diphosphates NDP, and ATP. The inhibitory or stimulatory influence of these pools on mRNA degradation is indicated by + or −. NDPs inhibit PNPase, poly-phosphate probably inhibits the helicase. The model reflects the current ideas about the interaction of known degradosome components. PPK, poly-phosphate kinase PNPase, polynucleotide kinase.

The prokaryotic degradosome. This scheme presents a model for the structural organization of the degradosome acting on 3′-ends. The various pools for phosphate in this micro-environment are орто-phosphate Pмен, poly-phosphate (Pмен)n, mononucleotide diphosphates NDP, and ATP. The inhibitory or stimulatory influence of these pools on mRNA degradation is indicated by + or −. NDPs inhibit PNPase, poly-phosphate probably inhibits the helicase. The model reflects the current ideas about the interaction of known degradosome components. PPK, poly-phosphate kinase PNPase, polynucleotide kinase.

Our lab has recently purified the degradosome from R. capsulatus (Fuhrmann, Rauhut and Klug, unpublished results). An RNase E of the apparent ‘180’-kDa type, RhlB helicase, enolase, and PNPase are present in the complex and, most interestingly, a second DEAD-box RNA helicase of 65 kDa. This complex would therefore be able to operate in a similar mode as that proposed for E. coli.

It is now time to look at the currently known RNases E to see whether all of them are fit to act as degradosome assemblers. A recent compilation of RNases E compares the enzymes from E. coli, Haemophilus influenzae, Synechocystis, Porphyria chloroplasts, and Туберкулез микобактериясы [80]. The enzymes from Синекоцистис және Porphyria chloroplast only have a reported length of approximately 50% of the E. coli және H. influenzae белоктар. The reported parts are clearly homologous with the N-terminus of the latter two. The E. coli, H. influenzae, және M. туберкулез enzymes share the same length. The former two have highly homologous N-termini, their C-termini being highly divergent. M. туберкулез shows limited homology over the full length. The just published sequence of the Rickettsia prowazekii genome revealed the presence of an only 683 amino acid long RNase E. Only the N-terminal two thirds show the usual high sequence homology (with a 90-amino acid insert in the ultimate N-terminus). If the situation of dramatically shortened C-termini alone should already give cause to doubt a general presence of an RNase E-mediated degradosome, then the more so when we consider the fact that almost all of the completely sequenced bacterial genomes lack a detectable RNase E like protein. Evolution not only found different solutions for the C-terminus of RNase E, but also for the entire activity exemplified by RNase E. The 13.3-kDa protein ARD-1 from human cells is a functional analogue of E. coli RNase E, shares structural features, and can rescue rne-deficient E. coli strains [ 81, 82].

It is interesting, though, to look at degradosome-like complexes which have been described in cellular organelles like chloroplasts and mitochondria, both of bacterial origin. A chloroplast high molecular mass complex with PNPase and an RNase E-like enzyme was described [ 83, 84]. The RNase E-like activity has a molecular mass of 67 kDa and is recognized by E. coli anti-RNase E antibodies. In yeast mitochondria the mtEXO complex contains three major proteins with 3′→5′ exonuclease activity and is involved in mtRNA degradation [85]. The complex shows NTP requirement for nuclease activity and NTPase activity, both indicative of the presence of a helicase. One component was recently identified as DExH-box RNA helicase [86]. The yeast nucleus contains a different type of high molecular mass complex, the exosome [87]. This complex of 300–400 kDa harbors five 3′→5′ exonucleases, mostly homologues of E. coli 3′→5′ exonucleases, but no helicases. All nucleases are vital parts needed for precursor rRNA processing. Interacting with ATP-dependent RNA helicases like the yeast Dob1p and Ski2p, the exosome probably has an important role in the mRNA turnover of all eukaryotes [ 88–90]. Сондай-ақ E. coli degradosome was shown recently to be involved in rRNA degradation in E. coli [91].


Free ribosomes and bound ribosomes are interchangeable. The cell ca change the numbers depending on its metabolic needs. The ribosomes read and translate cod.

In the process of translation, mRNA, tRNA, and the ribosome all work together to create the protein. The ribosomes hold the mRNA and allows the tRNA to come .

Translation may occur in either the cytoplasm or the rough endoplasmic reticulum. Two molecular factors that play a key role in translation are transfer RNAs.

The enzyme RNA polymerase synthesis mRNA following the rules of compatible base pairing. For instance, DNA sequence A, T, G, C, G indicates the complementary.

The amino acid sequence was detached and compared. All parts were detached and returned to bag. Results In this lab, a DNA model was constructed and then the.

Having one or two strands makes a huge differences, because RNA has only one single strand, its quilt smaller than DNA, making RNA fit through the nucleus do.

A part of RNA that is produced by an enzyme binds to the end of the beginning strand. RNA (primer) is the starting point for DNA synthesis. RNA primase is us.

Transcription in prokaryotes requires the formation of the holoenzyme RNA polymerase (holoRNAP), which consists of a core enzyme and a σ subunit. The core en.

Retro transposons first transcribe themselves in RNA and then RNA is copied to DNA again by reverse transcriptase which is generally encoded by mobile elemen.

This discontinuous synthesis of DNA causes short segments of DNA called Okazaki fragments to be formed. As DNA polymerase continues to synthesis DNA, Topoiso.


Бейнені қараңыз: Шаш қыстырғыш заколка (Желтоқсан 2022).