Ақпарат

Бактериялардағы дөңгелек ДНҚ-ның артықшылығы неде?

Бактериялардағы дөңгелек ДНҚ-ның артықшылығы неде?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Менің түсінуімше, бактерияларда дөңгелек ДНҚ бар. Эукариоттар сияқты сызықтық жіптерге қарағанда оның қандай артықшылығы бар?

ДНҚ-ның бірнеше сақинасы бар бактериялар бар ма?


Вибрионды тырысқақтарда екі дөңгелек хромосома болатыны белгілі.

Бактериялардың жасушалық бөлінуі эукариотты жасушалардың бөлінуімен салыстырғанда өте қарапайым және тиімді, ішінара олардың хромосомаларының сипатына байланысты. Оларға митоздан өтудің қажеті жоқ - хромосомалардың конденсациясы, сегрегация, шпиндельді талшықтың түзілуі, тіркеме және т.б. бактерия жасушаларының бөлінуіне қатыспайды.

Дөңгелек ДНҚ сонымен қатар Хейфлик шегін айналып өтеді (осылайша «өлмейтін» болуға мүмкіндік береді), бұл жасуша популяциясы тоқтағанға дейін қанша рет бөлінуі мүмкін, мүмкін теломерлердің қысқаруына, хромосомалардың соңындағы тізбектерге байланысты. Дөңгелек ДНҚ -да теломерлер жоқ болғандықтан, ол әрбір репликация циклінде қысқармайды.

Циркулярлы ДНҚ сонымен қатар Hfr делдалдық конъюгациясы сияқты көлденең генді тасымалдауды жеңілдетеді. Есіңізде болсын, конъюгация «айналмалы шеңбер» түріндегі репликацияға ұқсас, бұл, әрине, ДНҚ-ның дөңгелек бөліктерінде ғана мүмкін.


Басқа жауапты сәл кеңейту үшін мен бактериялардың негізгі хромосомасынан басқа басқа (әдетте дөңгелек) ДНҚ сегменттері болуы мүмкін екенін қосар едім. Бұлар плазмидалар деп аталады және автономды түрде репликацияланатын ДНҚ-ның қос тізбекті молекулалары.

Плазмидалар көбінесе организмнің белгілі бір жағдайларда өмір сүруіне мүмкіндік беретін гендерді тасымалдайды, мысалы, олар антибиотикке төзімділікті немесе қоршаған ортада болмауы мүмкін белгілі бір қоректік затты кодтайтын генді және т.б.

Басқа жауапта айтылғандай, плазмидалар деп аталатын процесте бактериялар арасында көлденең тасымалдануы мүмкін бактериялық конъюгация, және бұл донорда F-плазмида деп аталатын белгілі бір плазмиданың болуымен мүмкін болды. F-плазмида, басқалармен қатар, F-pilus протеинін кодтайды пилин, бұл ДНҚ тасымалдауға қажетті пилустың пайда болуына мүмкіндік береді.

Өздерінің қасиеттеріне байланысты плазмидалар зертханада кеңінен қолданылады векторлар, генетикалық материалды жасушаларға нақты «қабілеттер» беру үшін тасымалдау (мысалы, оның экспрессиясына және оның қызметін тексеруге мүмкіндік беру үшін әдетте жасушаларда көрсетілмейтін белгілі бір рецепторды кодтайтын генді енгізуге болады).

Ақырында, плазмидаларды эукариоттарда да табуға болатынын есте ұстаған жөн (мысалы, ашытқыларда).


Джордж Бидл мен Эдвард Татум ашытқыны ашу арқылы әр ген метаболизм жолындағы ферментке сәйкес келеді деген ұғымды алғаш рет сипаттаған. Neurospora crassa мутагендік жағдайларға (Beadle & amp Tatum, 1941). Осы процедуралардан кейін Джошуа Ледерберг бұл зерттеулерді Tatum -мен жалғастырды, онда олар екі мутантты штаммды шығарды ішек таяқшасы. Бұл бактериялар болды ауксотрофтаролардың өсуін қамтамасыз ету үшін қажетті негізгі қоректік заттарды өндіре алмайды. Екі штамм ретінде сипатталды кездесті & минус био және минус Thr + Leu + Thi + (А штамм) және Met + Bio + thr & minus leu & minus thi & minus (В штамм). А штамы кофеактор биотині мен метионин аминқышқылын өндіруде жетіспеушілік кезінде треонин, лейцин және кофактор тиамин аминқышқылдарын жеткілікті түрде синтездей алады, ал керісінше В штаммына сәйкес болды. өсу пайда болды. Ең аз ортаны метионинмен және биотинмен толықтыру А штаммының қалыпты өсуіне мүмкіндік берді. Екі штаммды бір -біріне араластырып, минималды ортаға жапқанда бактериялардың көбеюі байқалды. Екі штамм бір -бірін генетикалық материалмен жыныстық алмасу орын алғандай етіп толықтыра алады (Lederberg & amp Tatum, 1946).

Бактериялар ДНҚ репликациясына қажетті барлық мүмкіндіктермен жабдықталған. Кәдімгі бактерия түрлері ДНҚ-ны тасымалдау және оны биотехнологияда қолдану үшін тарату үшін зертханада қолдануға бейімделген. Бактерия геномының хромосомалық ДНҚ-сынан басқа, бактерияларда хромосомалық ДНҚ деп аталатын экстрахромосомалық ДНҚ бар. плазмидалар. Бұл плазмидалар бактерия хромосомасынан тәуелсіз репликацияланады және жоғары көшірмеде пайда болуы мүмкін. ДНҚ-ның бұл дөңгелек бөліктері зертханаларда ДНҚ-ның нақты бөліктерін тасымалдау үшін өзгертілген, сондықтан оларды зерттеуге немесе ақуыздарға экспрессиялау үшін пайдалануға болады. Плазмидтер табиғи түрде антибиотиктерге төзімділікті қоса алғанда маңызды қасиеттерге ие бола алады. Плазмидалар салыстырмалы түрде кішкентай, өлшемдері 1000 негізден 1 000 000 негізге дейін (1кб-1000кб).

Бактериялық ДНҚ әдетте үлкен мөлшерде болады дөңгелек хромосома (қызыл). Плазмидтер Хромосомадан тыс және автономды репликацияланатын ДНҚ бөліктері (көк).

Деп аталатын процесс арқылы конъюгация, бактериялар плазмидаларды а деп аталатын құрылым арқылы өткізу арқылы генетикалық материалды басқасына бере алады. конъюгация pilus.

Плазмидасы бар донор мен плазмидасы аз реципиент арасындағы конъюгация процесі. Донор донормен цитозоликалық көпір құру үшін конъюгация пилусын жасайды, онда репликацияның дөңгелек әдісі арқылы алушыға плазмида репликацияланады. Содан кейін реципиент донор ретінде әрекет етуге құқылы болады.


Бактериялардың трансформациясы

Трансформация бұл ДНҚ -ны қоршаған ортадан жаңарту арқылы жасушаның генетикалық өзгеруі. Бұл процесс бактериялардың кейбір түрлерінде табиғи түрде болуы мүмкін, бірақ әдетте сирек кездеседі. Зертханада біз бактерияларды ДНҚ -ны қоршаған ортадан («түрленуге») әкелетін жағдайға ұшырата аламыз. Зертханалық жағдайда бактерияларды түрлендірудің бірнеше жолы бар, бірақ ең көп таралғандардың бірі бактериялардың айналасындағы иондардың концентрациясын өзгертуді, содан кейін жасушаларды белгілі бір жолмен қыздыруды қамтиды. Қоршаған ортадан ДНҚ-ны оңай қабылдауға қабілетті бактериялар деп аталады «құзырлы». Жасушаларды сауатты ету олардың жасушалық мембранасын ДНҚ-ға өткізгіштігін арттырады. Жаңа ДНҚ бактерияларға енгеннен кейін оны жасуша РНҚ, содан кейін ақуыз жасау үшін пайдаланады. Бұл ДНҚ -дан алынған жаңа ақуыздар жасушалардың белгілерінің өзгеруіне себеп болады.

Плазмидтер

ДНҚ геномынан басқа (ол дөңгелек) бактерияларда плазмидалар деп аталатын ДНҚ-ның қосымша кіші шеңберлері де болуы мүмкін. A плазмида -бұл бактерия жасушалары көшіре алатын қос жіпшелі ДНҚ-ның шағын, дөңгелек бөлігі. Плазмидтер табиғи түрде бактерияларда кездеседі және оларды ғалымдар бөтен ДНҚ -ны осы жасушаларға енгізу әдісі ретінде кеңінен қолданады, себебі плазмидадағы ДНҚ тізбегін зертханада өзгертуге болады. Плазмида жасушаға енгеннен кейін оны жасушаның ДНҚ репликациясы аппараты көшіреді. Бактерия жасушасы бөлінген кезде әрбір жаңа жасуша плазмиданың көшірмелерін алады. Бір түпнұсқа трансформацияланған бактериялар көзге көрінетін етіп бөлінеді колония миллион немесе одан да көп трансформацияланған бактериялардан тұрады, олардың әрқайсысында плазмиданың көшірмесі болады (3 -сурет).

2 -сурет: Құрамында бактериялық геномдық ДНҚ мен үш плазмидасы бар бактериялардың диаграммасы. Плазмидалар масштабталмайтынын және әдетте бактериялық геномнан әлдеқайда кіші болатынын ескеріңіз. Бактериялар бөлінгенде, еншілес жасушалар геномдық ДНҚ мен жасушада болатын кез келген плазмидалардың көшірмесін алады. Кредит: Spaully CC SA 2.5 Плазмидті репликация

3 -сурет: E. coli қоректік тақтада өседі. Әр нүкте - бір оқшауланған колония (бір ерекше дөңгелек нүкте). Әрбір колония бір түп бактериялық жасушадан өскен 10 немесе 100 мың жасушалардан тұрады. Сурет өзгертілген: Madprime “K12 E coli колониялары тақтадағы қоғамдық доменде.

Трансформацияланған бактерияларды таңдау

Плазмидті ДНҚ көмегімен бактерияларды түрлендіру үшін биотехнологтар екі мәселені шешуі керек. Біріншіден, құрамында плазмидті ДНҚ бар жасушалардың кемшілігі бар, өйткені жасушалық ресурстар (энергия сияқты) плазмиданы репликациялау үшін және плазмиданың ДНҚ -сы кодталған ақуыздарды синтездеу үшін пайдаланылады. Егер плазмидалары бар жасушалар мен плазмидалары жоқ жасушалардың аралас популяциясы қоректік заттардың көптігімен бірге өсірілсе, онда плазмидасыз жасушалар тез өседі, себебі олар қажет емес плазмидаға энергия жұмсамайды (4 -сурет). Сондықтан плазмидалардан құтылу үшін жасушаларда әрқашан үлкен қысым болады. Егер олар плазмидадан құтыла алса, олар қоректік пластинада (немесе қоршаған ортада) тезірек өседі. Алайда, плазмидадан құтылу - бұл біз қаламайтын нәрсе. Плазмидадан құтылу қысымын жеңу үшін біз плазмиданы ұстайтын және сақтайтын жасушаларға артықшылық беруіміз керек.

4-сурет: Плазмидасы бар және онсыз бактериялар LB қоректік пластинасында өсірілгенде (антибиотик жоқ), плазмидасы жоқ бактериялар тезірек өседі, өйткені ол плазмидті репликациялау және плазмида арқылы кодталған ақуыздарды жасау үшін энергияны пайдаланбайды. Фото несие: Лиза Барти, 2020, CCBY.

Екіншіден, біз қандай бактериялар плазмиданы алғанын анықтай білуіміз керек. Әдеттегі трансформация кезінде миллиардтаған бактериялар сауатты болу үшін өңделеді, содан кейін ДНҚ плазмидасына ұшырайды. Әдетте 1000 бактерияның 1 -ден азы плазмиданы алады (5 -сурет). Бізге трансформацияланбаған бактериялардан (бар бар бактериялардың 99%-дан астамы) құтылу жолы керек, осылайша бізде тек плазмидамен өзгерген бактериялар қалады. Трансформацияланбаған бактериялардан арылмасақ, өзгерген бактерияларды көре алмаймыз, өйткені олар жалпы санның соншалықты аз ғана пайызын құрайды.

5 -сурет: Трансформациядағы бірнеше бактериялар (әдетте 1%-дан аз) іс жүзінде плазмиданы қабылдап, түрленеді. Бізге плазмиданы қабылдамаған бактериялардан құтылудың жолы керек, сонда бізде тек өзгерген бактериялар қалады. Фото кредит: Лиза Барти, 2020, CCBY.

Антибиотиктерге төзімділік гендері плазмидті ДНҚ алған бактерияларды таппаған бактериялардың арасынан табуға мүмкіндік береді. Антибиотиктер бактериялардың көбеюіне немесе өлуіне әсер ететін химиялық заттар. Егер плазмиданың құрамында антибиотикке төзімділік гені болса, онда трансформациядан кейін құрамында антибиотик бар қоректік пластинада өсірілген бактериялар оның әсерінен тежелмейді немесе өлмейді. Бұл трансформация кезінде плазмиданы қабылдаған бактерияларды бактерияларды антибиотик бар қоректік табаққа өсірмеген бактериялардан ажыратуға болатынын білдіреді (6 -сурет). Тек плазмидпен өзгерген бактериялар антибиотиктің өлтіру әсерінен аман қалады және пластинада көрінетін колониялар түзу үшін өседі. Колония бір миллионнан астам генетикалық бірдей бактерия жасушаларынан түзілетінін есте сақтаңыз. Бұл дегеніміз, трансформациядан кейін қоректік заттар + антибиотиктер табақшасында өсетін жалғыз колониялар - бұл плазмиданы алған және сақтайтын бактериялар. Қоректік пластинадағы антибиотикті және плазмидадағы антибиотиктерге төзімділік генін пайдалану біздің екі мақсатқа қол жеткізеді: плазмидасы бар жасушаларға артықшылық береді, осылайша плазмид сақталады, сондықтан біз жасушаларымызда жаңа ДНҚ бар екенін білеміз. Антибиотиктерге төзімділік а деп аталады таңдалатын маркер өйткені біз оны қамтитын ұяшықтарды таңдай аламыз.

6-сурет: Антибиотик бар LB қоректік табақшасында плазмидалы және онсыз бактериялар өсірілгенде, плазмидасыз бактериялардың барлығы антибиотикпен өледі. Антибиотик бар бактериялар ғана өсе алады. Фото несие: Лиза Барти, 2020, CCBY. Габриэль Ван Хелсинг, CCSA 3.0, Бас сүйек және сүйектер.

Плазмидасы бар трансформацияланған жасушаларды таңдау үшін антибиотикті қолдану келесідей болады:

Біздің зертхана үшін:

Біз қолданатын плазмиданы pGLO деп атайды (Bio-Rad-де бар). Бұл плазмиданың құрамында бірнеше маңызды бөліктер бар:

  • Ori – бактериялар бөлінген кезде плазмиданы көшіруге мүмкіндік беретін репликацияның бастауы.
  • GFP (жасыл флуоресцентті ақуыз) гені – GFP протеині ультракүлгін сәулесінің қатысуымен жасыл жарқырау береді.
  • bla гені-осы геннен бета-лактамаза ферменті түзіледі. Бұл фермент бактерияларды өлтірмес бұрын қоршаған ортада болған кезде ампициллин сияқты кейбір антибиотиктерді ыдыратады.
  • araC гені - осы ген шығаратын AraC ақуызы ортада арабиноза болған кезде GFP генін қосады.

Бұл плазмиданың көмегімен түрленетін бактериялар екі жаңа қасиетке ие болады: ультракүлгін сәулелену кезінде жасыл флуоресценцияланады және олар антибиотик ампициллинге төзімді болады.

Бактериялардың трансформациясының негізгі кезеңдері:

  • Белсенді өсіп келе жатқан бактерияларды CaCl2 (кальций хлориді) ерітіндісі бар түтікке енгізгіңіз келетін плазмидті ДНҚ-мен араластырыңыз.
  • Бактерияларды жылдам қыздырып, содан кейін салқындату арқылы «жылу соққысы». Бұл процесс плазмиданың бактерияға енуіне әкеледі.
  • Бактерияларды LB қоректік тақтасына (құрамында қоректік заттар бар) салыңыз, сонда олар жаңадан алынған гендерді қалпына келтіріп, білдіруі мүмкін.

Бактерияларды трансформациялау процедурасы жүргізілгеннен кейін құрамында плазмида бар жасушалар бактерияларды LB қоректік пластиналарында өсіру арқылы таңдалады. ампициллин. Ампициллин плазмидамен трансформацияланбаған кез келген жасушаны өлтіреді. Бұл LB қоректік заттары мен ампициллин бар пластинада көрінетін колониялар құру үшін өсе алатын жалғыз бактериялар трансформацияланған жасушалар екенін білдіреді. Бұл жасушалар GFP өте төмен деңгейде шығарады және ультракүлгін сәулемен қараған кезде ақшыл болып көрінеді.

Арабиноза - бұл пластиналарға құйылған кезде қосуға болатын қант түрі. Арабиноза қант болғанымен, бұл тәжірибеде қоректік заттардың көзі ретінде пайдаланылмайды. Трансформацияланған бактериялар құрамында LB қоректік заттар + ампициллин + арабиноза бар табақшаларда өсірілгенде, арабиноза араС ақуызымен (араС генінен өндірілетін) өзара әрекеттеседі. Арабиноза + araC ақуызының өзара әрекеттесуі GFP генінің транскрипциясын ынталандырады. Бұл бактерияларды ультракүлгін сәулелену көзінің астында қараған кезде жарқын жасыл түс береді.

Біздің эксперименттегі үлгілер

Біздің зертханамызда біз бірнеше түрлі пластиналарда өсірілген трансформацияланған (+pGLO) және өзгермеген (-pGLO) бактерияларды салыстырамыз. Міне, есте сақтау қажет негізгі нүктелер:


Қате туралы мифті жою

SMRT тізбектеу мәліметтерінің күші оның ұзақ оқу ұзақтығында да, қателік процесінің кездейсоқ сипатында да болады (2 -сурет). Illumina және басқа технологиялардың Q30-дан Q35-ке дейінгі көрсеткіштерімен салыстырғанда, жеке оқуларда қателердің көбірек болатыны рас: шамамен 11% - 14% немесе Q12 - Q15. Дегенмен, жеткілікті тереңдікте (айталық, 8x немесе одан да көп), SMRT реттілігі геномның статистикалық орташа консенсус перспективасын береді, өйткені дәл сол қатенің кездейсоқ бірнеше рет байқалуы екіталай. Белгілі болғандай, басқа платформалар соңғы реттілік жасалғанға дейін қосымша әдістермен шешілуі керек жүйелі қателерден зардап шегеді [16].

NA12878 тұтас геном деректеріндегі екі платформаның эмпирикалық кірістіру қатесінің жылдамдығының секвенирленген мәтінмәндік бөлінуі. Бұл суретте біз AAAAA-дан басталатын 8 өлшемді барлық контексттерді көрсетеміз. Эмпирикалық енгізу сапасының бағасы (ж-аксис) PHRED масштабында. PacBio RS құралының қателік жылдамдығының жоғарылығына (шамамен Q12) қарамастан, қате реттілік контекстіне тәуелсіз. Басқа платформаларда әр түрлі реттілік контексті үшін қателіктің әр түрлі жылдамдығы белгілі. Мұнда көрсетілген Illumina HiSeq платформасында қате деңгейі төмен (шамамен сегіз тәуелсіз жұмыс бойынша Q45), бірақ AAAAAAAA және AAAAACAG сияқты контексттерде қате көрсеткіштері әр түрлі (Q30 қарсы Q55). Бұл мәтінмәндік қателік коэффициенті үлкен реттілік тереңдігімен оңай анықталмайтын қиғаштықты тудырады. Эмпирикалық кірістіру қателіктері геномды талдау құралдар жиынтығы (GATK) - базалық сапа ұпайларын қайта калибрлеу құралының көмегімен өлшенді.

SMRT қателік профилінің стохастикалық табиғатынан пайда болатын тағы бір тәсіл-бұл циркулярлық консенсус оқуларын қолдану, мұнда бірыңғай молекулалардан жоғары дәлдікпен консенсус тізбегін құру үшін бір негіз бойынша бірнеше бақылау жасалады [17]. Бұл стратегия оқу ұзақтығын дәлдік үшін сатады, ол кейбір жағдайларда тиімді болуы мүмкін (мақсатты қайта секвенирлеу, шағын геномдар), бірақ секвенирлеу деректерінде кейбір артықшылыққа қол жеткізу мүмкін болса, қажет емес (8x ұсынылады). Бұл артықшылықпен дөңгелек консенсус оқуларын таңдаудан гөрі ұзағырақ кірістірулердің жақсартылған салыстыруынан пайда алған жөн, өйткені ұзағырақ оқулар көбірек қайталауларды қамтуы мүмкін және олардың консенсусынан жоғары дәлдікке әлі де қол жеткізіледі.


ДНҚ топоизомеразалары: биохимия және молекулалық биология

Карл Дрлика, Барри Крейсвирт, фармакологиядағы жетістіктерде, 1994 ж

Бекітілген супер -орау деңгейлеріне қызмет көрсету

Бактерия жасушаларынан алынған тұтас дөңгелек ДНҚ -ның байланыстыру тапшылығы бар, яғни ДНҚ -да дуплексті бұрылыстар бірдей ұзындықтағы сызықты немесе сызықты молекулада кездесетінге қарағанда аз болады. Бұл байланыстырушы тапшылық ДНҚ-ның теріс спиральдық кернеуде болуына әкеледі, сондықтан экстракцияланған ДНҚ-да байқалатын байланыстыру тапшылығы жиі «теріс супер орам» деп аталады. Кернеу жасушалардың ішінде де болады, бірақ алынған ДНҚ деңгейінің тек жартысында ғана (анықтама үшін Дрлика, 1992 қараңыз). Белгісіз факторлар байланыстың жетіспеушілігінің қалған бөлігін шектейді және ДНҚ -да жасушаішілік никалардың оны толық жоюына жол бермейді. ДНҚ-ның көптеген әрекеттері супер орамдық деңгейлерге сезімтал болғандықтан (мысалы, Drlica, 1984 Pruss and Drlica, 1989 қараңыз), бұл деңгейлердің қалай орнатылғанын және бұзылатынын түсіну жалпы қызығушылық тудырады.

Төрт топоизомераза анықталды ішек таяқшасы: топоизомераза I (Ванг, 1971), гираза [топоизомераза II (Геллерт) т.б., 1976a )], топоизомераза III (декан т.б., 1983) және топоизомераза IV (Като т.б., 1990). Тек гираза теріс супер катушкаларды енгізеді in vitro. Бұл теріс айналудың негізгі көзі болып көрінеді in vivoөйткені гиразаның ингибиторлары лизогеннің суперинфекциясы кезінде бактериофаг λ ДНҚ -на теріс суперкөмірлердің енуін блоктайды (Gellert) т.б., 1976b). Бұл ингибиторлар, әсіресе кумариндер, сонымен қатар хромосомадан да, плазмидадан да суперкапсулалардың жоғалуына әкеледі (Дрлика мен Снайдер, 1978 Кано) т.б., 1981 Манес т.б., 1983 ). In vitro, гираза, сонымен қатар I және III топоизомеразалар ДНҚ -ны босаңсытады. I топоизомераза ақаулары (өнім жоғарғы А.) супер орамның жоғары деңгейлеріне әкеледі, демек, топоизомераза I әдетте артық супер орамның сақталуын болдырмайды. Жою жоғарғы А. өсуін тежейді E. coli, және бұл компенсаторлық мутацияның қалпына келуіне әкелді. Бұл картаның көпшілігі гираза гендерінде (гирА және gyrB) және супер орамды қалыпты деңгейден төмен азайтыңыз (DiNardo т.б., 1982 Прусс т.б., 1982 Ричардсон т.б., 1984 Раджи т.б., 1985). Бұл мутациялық зерттеулер жасушаның өсуінде суперкопингтің маңыздылығына баса назар аударады және қарқынды өсу суперкопингтің ± 15% диапазонында болатынын анықтайды. III немесе IV топоизомеразаның суперкопингпен күресуге қалыпты түрде қатысатыны туралы дәлелдер аз.

Гираза мен топоизомераза I субстрат ерекшелігі арқылы белгіленген ауқымда шоғырлануды сақтауға бейім. Гираза суперкапталған субстратқа қарағанда босаңсуда белсенді (Сугино мен Коззарелли, 1980) I топоизомеразасы субстрат ретінде өте теріс қапталған ДНҚ -ны жақсы көреді. in vitro, және ол ДНҚ-ны толығымен босаңсытпайды (Wang, 1971). In vivo, топоизомераза I суперколинг қалыпты деңгейден төмендегенде босаңсытатын белсенділіктің негізгі көзі болып табылмайды: Бір зерттеуде бұл фермент ДНҚ босаңсыту үшін гиразаны ынталандыратын гираза ингибиторларымен индукцияланған ДНҚ релаксациясының жылдамдығына анықталмаған әсер еткен жоқ (Прусс) т.б., 1986) басқа зерттеуде мен топоизомеразаны баяу және ішінара релаксацияладым (Bliska and Cozzarelli, 1987).

Топоизомеразалар спиральдың жоғары кернеуін өзгертетін бұрандалы қадамның бұзылуын түзетеді. Мысалы, температураның төмендеуі ДНҚ -дағы дуплексті бұрылыстардың санын көбейтеді, бұл супержерлік кернеуді арттыруы керек. Топоизомеразалар бұл артық шиеленісті босаңсытатын көрінеді, өйткені ДНҚ төмен температурада өсірілген жасушалардан алынған кезде суперкоиллер азырақ болады (Голдштейн және Дрлика, 1984). Басқа мысалда жасушаларды интеркалирлеуші ​​бояғыш хлорохинмен өңдеу ДНҚ-ны босатады, бұл спиральдық кернеуді төмендетуі керек. Содан кейін гираза супер катушкаларды енгізетін сияқты (Esposito and Sinden, 1987). Кейін хлорохиннің шығарылуы керісінше әсер етеді, бұл релаксацияны тудырады.

Топоизомеразалардың түзету әрекетінің басқа мысалдары тізбекті бөлуді қамтитын ДНҚ белсенділігімен байланысты. Кейбір таңқаларлық жағдайлар суперкопингке транскрипциялық әсерді зерттеуден туындады. Ішінде жоғарғыА Мутант транскрипциясы тет pBR322 гені плазмалық ДНҚ-ның аса теріс айналуына әкелді (Прусс және Дрлика, 1986). Бұл гиразаның тежелуі pBR322-де (Lockshon and Morris, 1983) оң супер катушкалар тудыруы мүмкін деген бақылаумен қоса, ДНҚ бойындағы транскрипциялық кешендердің транслокациясы күрделі және оң шиеленістің (немесе теріс релаксацияның) артында теріс спиральдық шиеленісті тудырады деген идеяға әкелді. шиеленіс) алда (Liu and Wang, 1987). Топоизомераза Мен артық теріс шиеленісті түзететін едім, ал гираза релаксацияны түзетеді (немесе позитивті орамдарды енгізу). Осылайша, екі фермент арасындағы тепе-теңдік таза байланыстыру тапшылығының транскрипциясынан туындаған өзгерістерге әкеледі: теріс суперқаптар топоизомераза I болмаған кезде жиналады (Прусс және Дрлика, 1986) және оң суперқаптар гиразаның ингибиторының қатысуымен жиналады (Wu т.б., 1988). Қалыпты жағдайда транскрипция, кем дегенде, орташа мәндерден едәуір ауытқитын жергілікті суперкапингті тудыруы мүмкін, оны түзету үшін топоизомеразалардың қаншалықты тиімді әрекет ететініне байланысты болады. Плазмидалармен жергілікті бұзылулар байқалды in vivo (Рахмоуни мен Уэллс, 1989, 1992).

Техникалық қызмет көрсетудің тағы бір деңгейі гираза мен топоизомеразаны кодтайтын гендердің экспрессиясын қамтиды. Гиразаның кумарин тежегіштері ДНҚ релаксациясын тудырады (Drlica and Snyder, 1978), ал релаксациямен байланысты екеуінің де экспрессиясының жоғарылауы байқалады. gyrA және gyrB (Menzel and Gellert, 1983), сонымен қатар экспрессияның төмендеуі жоғарғыА (Цэ-Динь, 1985). Сондай -ақ, хинолондардың суперкирингті жоғарылататын жағдайлар табылды (Manes т.б., 1983 Прусс т.б., 1986 Франко мен Дрлика, 1989) осы жағдайларда жоғарғыА өрнек жоғарылайды (Tse-Dinh and Beran, 1988). Осылайша, суперкапинг пен топоизомераза гендерінің экспрессиясын гомеостатикалық реттеу бар.


Бактериядағы ДНҚ (диаграммамен)

Бактериялардың ДНҚ, мысалы E. coli - ковалентті жабық дөңгелек молекула. Ол бактериялық хромосоманы құрайды, дегенмен бұл хромосома өсімдіктер мен жануарлардың эукариоттық хромосомаларына қарағанда құрылымы мен ұйымдасу деңгейі жағынан әлдеқайда қарапайым. Сондай -ақ, әрбір бактерия жасушасында әдетте бір ДНҚ молекуласы бар бір хромосома болады.

E.coli-де ДНҚ молекуласы толық созылған кезде ұзындығы 1300 мкм құрайды, құрамында шамамен 4 000 генді кодтайтын шамамен 4 700 x 10 3 негізгі жұптар бар. Бұл ұзын ДНҚ молекуласын шамамен 1 мкм x 3 мкм өлшемді жасушаға салу үшін молекула қатты бүктелген және аса ширатылған болуы керек.

Прокариоттық хромосома - оны нуклеоид деп те атайды - бірнеше белоктар бір -бірімен байланысқан ілмектерден тұрады. Мысалы, E. coli нуклеоидында орталық ақуыз өзегінен таралатын 45 (40-50) ілмектер бар. Әрбір ілмек аса ширатылған (9.8А-сурет). ДНҚ ілмектерінің аса ширатылған күйін DNase-мен өңдеу арқылы жоюға болады, бұл бір тізбекті үзіліс (ник) тудырады.

Жалғыз лақап басқа ілмектердің асып кетуіне әсер етпестен бір ілмектің ашылуына әкеледі (9.8В -сурет). Бұл ds-ДНҚ молекуласы барлық ілмектер арқылы өтетініне қарамастан, әрбір цикл екіншісінен оқшауланғанын көрсетеді. Нуклеоидты ядродағы ақуыздармен байланыс басқа ілмектердің босап шығуына жол бермейді. E. coli хромосомасына барлық оралған ілмектерді алып тастау үшін шамамен 45 ник қажет, осылайша жабық дөңгелек сақина пайда болады.

Дөңгелек ДНҚ молекуласы бос күйде деп айтылады. Бұл күйде стандартты оң жақ ДНҚ-қос спиральда спиральдың бір айналымына шамамен 10 жұп нуклеотидтер болады. Егер енді спиральдың бір толық бұрылысын босату үшін екі жіптің біреуі 360 ° айналдырылып, бұрылса және шеттері жабылса, дөңгелек ДНҚ молекуласы келесі екі жолмен жауап беруі мүмкін-бұл аймақты тудыруы мүмкін. көпіршік деп аталатын жұпталмаған негіздер, немесе керісінше теріс айналған ДНҚ молекуласын теріс айналдыруы мүмкін.

Дөңгелек ДНҚ-ның үш күйі — босаңсыған, көпіршікті және теріс ширатылған — диаграммалық түрде 9.9-суретте көрсетілген:

Ds-ДНҚ-ның теріс суперкопингін топоизомеразалар деп аталатын ферменттер класы шығарады. Жалғыз тізбекті нико ДНҚ тізбегінің фосфодиэстер байланысында үзіліс немесе саңылау тудыратын топоизомераза I арқылы түзіледі. Зақымдалмаған толықтырушы жіп саңылау арқылы өтеді, содан кейін ник қайта жабылады. Топоизомеразалардың басқа класы, топоизомераза II, ДНҚ-гираза деп те аталады.

Бұл ферменттер екі тізбектің де фосфодиэфирлік байланыстарында екі тізбекті үзіліс тудырады. Бұл ферменттер класы ДНҚ репликациясында маңызды рөл атқарады. Фермент екі тізбектегі үзілістерді қоздыра отырып, бұзылмайтын екі тізбекті ДНҚ молекуласын немесе басқа бөлігінен өтуге көмектеседі.

Осылайша, дөңгелек ДНҚ молекуласы репликацияланған кезде, екі еншілес молекула тізбектің екі сақинасы сияқты бір-біріне қосылуы мүмкін. ДНҚ гиразасы екі молекуланы бірінен екі рет кесу арқылы ажырата алады, ал екіншісіне кейін қайта жабылатын саңылау арқылы өтуге мүмкіндік береді.

ДНҚ -гираза ДНҚ -ның қалыпты репликациясында маңызды рөл атқарады. Репликациялық шанышқының ілгерілеуімен ds-ДНҚ спиралінің репликацияланбаған бөлігінде оң суперқабат пайда болады. Кернеуді өтеу үшін ДНҚ гираза никинг арқылы теріс супер орамды енгізеді.


20 -сұрақ: а) Бактерияларда геномдық ДНҚ -дан тыс шағын дөңгелек ДНҚ болады. Ол қалай аталады? Оның бактериялар үшін маңызы бар ма?в) Бактериялар арасында гликокаликс құрамы мен қалыңдығының айырмашылығы қандай?г) Бактериялардағы мезосомалар мен фимбриялардың рөлі қандай?

Бұл кіші ДНҚ плазмидалар деп аталады. . Алғашқы қолданғаннан кейін ондаған жылдар өтсе де, плазмидтер биотехнологияда әлі де маңызды зертханалық құрал болып табылады: ғалымдар бактерияларды оларды ұстауға мәжбүрлей алады. ДНҚ жеткізу үшін қолданылатын іс жүзінде барлық плазмидтерде антибиотиктерге төзімділік гендері бар. . Плазмидасы бар жасушалар ғана аман қалады, өседі және көбейеді.

в) эндотелий гликокаликсінің құрылымы және оның ығысу күшінің жоғарылауына жауап ретінде азот оксиді (NO) арқылы тамырлы бұлшықеттердің релаксациясын белсендіруі3,6

г) Фимбриялар - жасушадан созылатын жіңішке жіп тәрізді қосымшалар, көбінесе ондаған немесе жүздеген. Олар пилин ақуыздарынан тұрады және жасуша оларды беттерге бекіту үшін қолданады. Олар патогендік бактериялар үшін өте маңызды болуы мүмкін, олар оларды тіндерге жабыстыру үшін қолданады.


Импульстік өрісті гельдік электрофорезді қолдану арқылы A. tumefaciens геном талданды, онда бір сызықты хромосома мен бір шеңберлі хромосома анықталды [1]. Сызықтық хромосоманың өлшемі 2100 Кб, ол 3000 Кб шеңберлі хромосомадан кіші [1]. Agrobacterium түрінің екі дөңгелек хромосомасы бар мүшелері бар бруцеллалар түрлерімен 16 -шы рРНҚ реттілік байланысы бар [1].

B. melitensis бұл грам-теріс коккобактер бактерия, оның екі дөңгелек хромосомасы бар [5]. Екі хромосома мөлшері 2117 Кб және 1178 Кб [5]. Бруцелланың екі дөңгелек хромосомасы бар басқа түрлеріне жатады B. suis biovar 1, B. suis biovar 2, B. suis biovar 4, B. abortus және B. ovis [9].


Бактериалды ДНҚ -ның суперқайтауы | Микробиология

ДНҚ молекулалары босаңсыған және өте оралған екі күйде болады. ДНҚ молекуласының босаңсыған күйі - бұл спиральдың бұрылыстарының нақты санын негізгі жұптардың санын есептеу арқылы болжауға болатын жағдай, ал босаңсыған ДНҚ молекулалары кішкене кеңістікте орналасу үшін қатты бұралған кезде күй суперкаперлі деп аталады. .

Ішек таяқшасының мысалында босаңсыған ДНҚ молекуласының суперкаперлі күйге енуінің себебі анықталған. E. coli ДНҚ-сы босаңсыған күйінде ұзындығы 1 мм-ден асады, бұл E. coli жасушасының өзінен шамамен 400 есе ұзын болады. Осыншама көп ДНҚ-ны E. coli жасушасының аз ғана кеңістігіне қалай салуға болады? Табиғат бұл мәселені ДНҚ молекуласына ‘жоғары тәртіпті’ құрылымды енгізу арқылы шешті.

Бұл құрылымда екі тізбекті спиральді ДНҚ супер орам деп аталатын процесті қолдана отырып, одан әрі жоғары бұралған және E. coli жасушасының ішінде оңай оралған. Асқын ширатылған ДНҚ молекуласы бұралған кезде пайда болатын резеңке жолаққа қосылған керілуге ​​ұқсас бұралу жағдайында қалады.

ДНҚ молекуласы не оң, не теріс бағытта қозғалады, бұл табиғаттағы гипертермофильді емес организмдердің барлығында басым әрекет ететін теріс супер орам. Теріс супер орамда ДНҚ молекуласы өз осінің айналасында оң жақ қос спиральға қарама-қарсы бағытта бұралған.

ДНҚ молекуласы кезектесіп супер орамға және босаңсуға болады. Өйткені суперкоиль ДНҚ-ны бактериялық жасушаға орау үшін қажет, ал босаңсу ДНҚ репликациясы үшін қажет. 5.35 -суретте ковалентті жабық дөңгелек дсДНҚ молекуласында суперқайту қалай жүретіні көрсетілген, сонымен қатар ДНҚ молекуласы қалай босаңсығанын көрсетеді.

Бактериалды және архаальды ДНҚ -да супервирлеу ДНҚ -гираза ферментінің көмегімен жүзеге асады, ол топоизомераза деп аталатын фермент түрі, әсіресе топоизомераза II.

Процесс бірнеше қадамдар арқылы аяқталады:

(i) Дөңгелек босаңсыған ДНҚ-ның бір тізбегі екіншісінің үстіне жатады,

(іі) бір бөлікті екінші қабатқа қою спиральдың екі жерде жанасуына әкеледі, ал ДНК-гираза (топоизомераза II) бір жерде жанасу аймағында қос тізбекті үзіліс (ник) жасайды және (3) үзілген (жыртылған) қос жіп бүтін емес жіптің қарама-қарсы жағында қайта жабылады, нәтижесінде ДНҚ молекуласында суперкаптама пайда болады.

Топоизомераза I деп аталатын басқа ферменттің әсерінен ДНҚ молекуласындағы суперкапинг жойылады. Бұл фермент ДНҚ-да бір тізбекті үзіліс енгізеді және қос тізбекті ДНҚ-ның бір тізбегінің айналасында айналуына әкеледі. ДНҚ -ның супервирленген күйінің босаңсыған күйге оралуы.

Дегенмен, үзіліс (ник) жасаған сайын бактериялық ДНҚ -ның толық босаңсып кетуіне жол бермеу үшін ДНҚ -да суперкапталған домендер болады (5.36 -сурет). Шын мәнінде, қос тізбекті бактериялық ДНҚ бір суперкапшықта емес, бірнеше оралған домендерде орналасады.

E. coli -де 50 -ден астам суперкапкаланған домендер бар, олардың әрқайсысы белгілі бір ақуыздармен байланысып тұрақтанады деп есептеледі. Дегенмен, осы домендердің біріндегі қос тізбекті ДНҚ-ның бір тізбегіндегі ник ДНҚ-ның басқа домендерде босаңсуына мүмкіндік бермейді.


Бейнені қараңыз: ДНҚ, гендер және хромосомалар, олардың құрылымы (Ақпан 2023).