Ақпарат

4.2: Мутацияға генетикалық скрининг - Форвард генетика - Биология

4.2: Мутацияға генетикалық скрининг - Форвард генетика - Биология


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Белгілі бір биологиялық процеске әсер ететін гендерді анықтаудың бір әдісі - үлкен популяцияда кездейсоқ мутация туғызу, содан кейін белгілі бір биохимиялық жолдың бұзылуынан туындауы мүмкін фенотиптері бар мутанттарды іздеу. Бұл стратегия мутантты скрининг жүздеген әртүрлі биологиялық процестердің молекулалық компоненттерін анықтау және түсіну үшін өте тиімді қолданылды. Мысалы, есте сақтау мен оқудың негізгі биологиялық процестерін табу үшін зерттеушілер мутагенизацияланған популяцияларды скринингтен өткізді Дрозофила үйренуге қалыпты қабілеті жоқ шыбындарды (немесе дернәсілдерді) қалпына келтіру. Барлық организмдер арасындағы биологияның ұқсастығына байланысты модельдік ағзаның осы мутантты экраны арқылы анықталған кейбір гендер адамның оқуына және есте сақтауына, соның ішінде Альцгеймер ауруы сияқты жағдайларға қатысты болуы мүмкін.

- Генетикалық экрандар

Әдеттегі мутантты экранда зерттеушілер ата -аналық популяцияны мутагенмен емдейді. Бұл тұқымдарды EMS -де сіңіруді немесе мутагенді шыбындарға берілетін тағаммен араластыруды қамтуы мүмкін. Әдетте мутагенге тікелей әсер ететін адамдарда фенотиптер көрінбейді, өйткені барлық жасушаларда ДНҚ-ның әрбір тізбегі дербес әсер етеді. Осылайша, индукцияланған мутациялар гетерозиготалы болады және жалғыз жасушалармен шектеледі. Алайда, генетиктер үшін ең маңыздысы - мутагенденген индивидтердің ұрық қабатындағы мутациялар. The ұрық сызығы гаметалар және олардың кез келген даму прекурсорлары ретінде анықталады, сондықтан олардан ерекшеленеді соматикалық жасушалар (яғни репродуктивті емес жасушалар) дененің. Индукцияланған мутациялардың көпшілігі рецессивті болғандықтан, мутагенге ұшыраған даралардың ұрпақтары жаңа мутациялардың гомозиготалы (немесе гемизиготалы) болуына мүмкіндік беретіндей жұптастырылуы керек. Мұны істеу стратегиялары организмдер арасында әртүрлі. Қалай болғанда да, индукцияланған мутация пайда болатын ұрпақ жаңа фенотиптердің болуын тексере алады. Тиісті мутант анықталғаннан кейін генетиктер мутантты фенотипке негізделген мутацияланған геннің қалыпты қызметі қандай екендігі туралы қорытынды жасай бастайды. Мұны молекулалық -генетикалық әдістермен әрі қарай зерттеуге болады.

Ағзаның мутагенге әсер етуі хромосомалар бойында кездейсоқ позицияларда мутация туғызады. Генетикалық экранда қалпына келтірілген мутантты фенотиптердің көпшілігі функциясының жоғалуы мутациялар Бұл аллельдер ДНҚ тізбегіндегі өзгерістерге байланысты, ол бұдан былай жабайы типтегі аллель сияқты белсенді ақуызды бірдей деңгейде шығармайды. Функционалды аллельдер рецессивті болады, өйткені жабайы аллель гаплосифицитті (3 тарауды қараңыз). Белсенді белок түзбейтін функциясының жоғалуы аллель деп аталады аморфты, немесе нөл. Екінші жағынан, функциясын жартылай жоғалтқан аллельдер деп аталады гипоморфты. Сирек жағдайда мутантты аллельде болуы мүмкін функцияның пайда болуыбелсенді белоктың көп бөлігін шығарады (гиперморф) немесе жаңа қызметі бар белсенді ақуызды өндіру (неоморф). Ақырында, антиморф аллельдер доминантты және жабайы типті функцияға қарама-қарсы белсенділікке ие; антиморфтар ретінде де белгілі басым теріс мутациялар


Алға генетика

Алға генетика фенотипке жауапты генетикалық негізді анықтайтын молекулярлық -генетикалық тәсіл. Алға генетикалық әдістер фенотипті анықтаудан басталады және зерттелетін сипаттаманы көрсететін модельдік организмдерді табады немесе жасайды.

Бұл бастапқыда табиғи түрде пайда болатын мутацияларды қолдану арқылы немесе мутанттарды радиациямен, химиялық заттармен немесе енгізуші мутагенезбен индукциялау арқылы жасалды (мысалы, транспозициялық элементтер). Кейінгі көбею жүреді, мутантты индивидуалдар оқшауланады, содан кейін ген картаға түсіріледі. Форвардтық генетиканы ДНҚ -ның өзгертілген тізбегінің фенотиптік әсерін талдау арқылы геннің қызметін анықтайтын кері генетикаға қарсы деп санауға болады. [1] Мутантты фенотиптер көбінесе қандай ген жауапты екенін білместен бұрын байқалады, бұл олардың мутантты фенотипінің (мысалы, Дрозофила) атымен аталатын гендерге әкелуі мүмкін. қызғылт ген мутанттарда көздің түсіне байланысты аталады). [2]


Гиперандрогенемиясы бар Классикалық емес CAH аналықтарын генетикалық скрининг CYP11B1 генінің жаңа мутациясын анықтайды.

Мақсаты: Бүйрек үсті безінің туа біткен гиперплазиясы (CAH) - әр түрлі ауырлықтағы симптомдары бар эндокринді аутосомды -рецессивті ауру. Жеңіл гиперандрогенемия-бұл КАГИ классикалық емес пациенттердегі ең жиі кездесетін клиникалық белгі және 95% жағдай CYP21A2 генінің мутациясымен анықталады. Осы зерттеуде классикалық емес CAH (NC-CAH) үшін екінші жиі кездесетін себеп, CYP11B1 генінің мутацияларына байланысты 11β-гидроксилаза тапшылығы зерттеледі.

Дизайн: CYP21A2 және CYP11B1 гендерін тікелей секвенирлеу арқылы скринингі CAH күдігі бар емделушілерде ықтимал генетикалық ақауларды анықтау үшін жүргізілді.

Нәтижелер: CYP11B1 нұсқалары CYP21A2 мутацияларымен қатар сирек жағдайларда ғана CYP клиникалық диагнозы бар емделушілерде бірге болатыны байқалды. 75 NC-CAH бар жалпы 23 әйел емделуші CYP21A2 генінде бір ғана мутациямен анықталды. CYP11B1 гендік мутациясы, p.Val484Asp, CAH бар науқаста гетерозиготалы күйде анықталды. p.Val484Asp романының құрылымдық сипаттамасы қоршаған бета парағының бұрмалануын және құрылымдық элементтердің қарама-қарсы жағында пайда болатын қуыстың жанама тұрақсыздануын тудыруы мүмкін, бұл ферментативті белсенділіктің ішінара бұзылуына әкеледі.

Қорытындылар: CYP21A2 генінің мутациялары NC-CAH жағдайларындағы ең жиі кездесетін генетикалық ақаулар, тіпті бұл пациенттер гетерозиготалы күйде болса да. Бұл мутациялардың әртүрлі фенотипі бар, бұл кортизол синтезі бұзылуларының өзгермелі дәрежесіне әкеледі, сонымен қатар CYP11B1 мутанттары CAH тудыратын ақаулардың сирек түрі екені анық.


Нәтижелер

Камеор мутантты популяциясын өндіру

Камеор – ерте гүлдейтін бақша бұршақ сорты, ол өзінің репродуктивті циклін төрт айдың ішінде аяқтайды, жылыжай жағдайында жылына бірінен соң бірі үш ұрпақ беруге мүмкіндік береді. Бұршақ негізінен өздігінен ұрықтанатын болса да, кейбір қалдық айқас тозаңдану орын алуы мүмкін. Жұқтыруды болдырмау үшін, бір тұқымнан алынған 100 Камеор өсімдіктері болжамды жеті бұршақ хромосомасының [23] әр қолына таралған 16 қысқа тізбекті қайталау маркерлерінің жиынтығының көмегімен генетикалық біркелкілікке талданды және жәндіктерге тұқым қою үшін қалдырылды. дәлелді жылыжайлар. Барлығы 10 000 Caméor тұқымы шығарылып, мутантты популяцияны құру үшін қолданылды.

Максималды мутация тығыздығын өсімдіктердің қолайлы өмір сүру жылдамдығымен теңестіру үшін біз алдымен 8-ден 57 мМ EMS-ке дейінгі дозалар ауқымын пайдалана отырып, 100 тұқым партиялары бойынша «өлтіру-қисық» талдауын жүргіздік. Өңделген бірінші буындағы мутантты (M1) өсімдіктердің көпшілігі ерте көшеттер кезеңінде өсудің баяулауын көрсетті, бірақ олардың барлығы қалпына келді. Әр емдеуден отыз өсімдіктер пісіп жетілгенге дейін өсіріліп, құнарлылық пен тұқым шаруашылығына бағаланды. Ең жоғары дозаларда құнарлылықтың жоғары жоғалуы байқалды, өсімдіктердің 30%-дан азы 32 мМ EMS жоғары дозаларда құнарлы болды. Өсімдіктердің 50% -ына 16 мм және 24 мм тұқым себуге мүмкіндік беретін EMS ең жоғары дозалары тұқымдардың үлкен партияларында сақталды және сыналды (1 -кесте). Бұл екі дозаның арасында 16 мм ЭМС жоғары тұқым өндіруге бейімділікпен аз айырмашылық байқалды, сондықтан популяция өндірісі үшін 20 мМ ЭМС соңғы дозасы қолданылды. Бір түйіршіктегі тұқымдардың орташа саны 24 мм ЭМС өңделгендерге қарағанда 16 мм өңделген өсімдіктер үшін сәл жоғары болды. 16-24 мМ EMS дозаларымен өңделген M1 өсімдіктерінің бүршіктеріндегі ұсталған эмбриондардың жоғары жылдамдығы оның мутагенездің жақсы тиімділігін дәлелдеді. 8600 М1 қондырғыларының әрқайсысы 5 М2 -ден астам тұқым шығарған 4817 -ден астам желі жеке -жеке жиналды. M3 тұқымын өндіру үшін M1 өсімдігіне төрт М2 тұқым екі литрлік құмыраларға себілді және M3 тұқымдары А және В деп аталатын екі бауырлас өсімдіктерден жиналды. Жапырақ материалы А ( деп аталатын ең сау көрінетін өсімдіктен жиналды. 1 -сурет). Тұқым қорлары желілерді көбейту, тарату және ұзақ мерзімді сақтау үшін Дижондағы Дәнді бұршақ тұқымдас қор орталығына жіберілді.

Бұршақ EMS мутант кітапханасын құру. Камеор тұқымдары EMS мутагенизацияланған. Жәндіктерге төзімді емес жылыжайда өздігінен ұрықтандырылған 8600 М1 өсімдіктерінің 4817-сі әрқайсысы 5 М2-ден астам тұқым шығарды. M1 ата-анасына A-D деп аталатын төрт М2 тұқымы жетілуге ​​дейін өсті және фенотиптер үшін бағаланды. М3 тұқымын қою үшін қалған А деп аталатын өсімдіктерден ДНҚ алынды. М3 тұқымы резерв ретінде апалы В өсімдіктерінен жиналды. Жиналған М3 тұқымдары дәнді бұршақ дақылдарының биологиялық ресурстық орталығына тарату, желілерді ұстау және мутант кітапханасын ұзақ сақтау үшін жіберілді.

Камеор мутантты популяциясының фенотипі

Біз тура және кері генетика үшін пайдалануға болатын анықтамалық мутанттық топтаманы құруды көздегендіктен, біз мутант популяциясының жүйелі фенотипін жүргіздік. Біздің фенотипті бағалау өну кезеңінен бастап жеміс піскенге дейінгі негізгі даму кезеңдерінде М2 отбасына төрт өсімдіктердің визуалды сипаттамасына негізделген. Фенотипті бағалауды жеңілдету үшін біз бұршаққа бейімделген фенотиптің онтологиясын анықтадық. Бұл фенотиптеу құралы барлық фенотиптік өзгерістерді қамтымайды (мысалы, түбірлерді бағалау жүргізілмеді) және салыстырмалы түрде қысқа вегетациялық кезеңде көптеген мутантты сызықтарды жоғары өткізу қабілеттілігімен бағалау үшін құрастырылған. Мутантты өсімдіктерді сипаттау үшін қолданылатын сөздік иерархиялық ағашта ұйымдастырылған және әртүрлі деңгейлерде топтастырылған фенотиптердің 107 ішкі санаттарынан тұрады. Қолданылатын сөздіктің толық тізімі 1-қосымша деректер файлында және әрбір негізгі фенотип санатындағы жолдар саны 2-кестеде көрсетілген.

4817 M2 отбасының 1840-ы көрінетін фенотипті көрсетті, бұл сызықтардың 38% құрайды. Көрінетін фенотипті көрсеткен сызықтардың ішінде 45% бір фенотип үшін бағаланды және 55% бірнеше фенотипті көрсетті, яғни олар бірнеше негізгі фенотип санатына жатады (2а-сурет). Плеиотропияның бұл көрсеткіші бағаланбайды, өйткені фенотиптік сипаттама M2 отбасына тек төрт мутантты сызықты жоғары өткізу қабілетті визуалды бақылауға негізделген. М2 тұқымдасына өсімдіктердің көп мөлшерінің егжей -тегжейлі морфологиялық және биохимиялық сипаттамасы мутантқа фенотиптік әсердің жоғарылауына және осылайша плейотропияның жоғары жылдамдығына әкеледі. Ең жиі байқалатын фенотиптер сабақ мөлшеріне, жапырақтар мен өсімдіктердің архитектурасына байланысты, одан кейін котиледондар, қопсытқыштар мен тұқымдарға қатысты, ал фенотиптердің ең аз мөлшері гүлдерге, өсімдіктердің архитектурасына және жапырақшаларының морфологиясына қатысты (2б -сурет). Сипатталған бастапқы категорияларға сәйкес келетін фенотиптердің мысалдары 3-суретте көрсетілген.

Мутантты популяцияның фенотиптік сипаттамаларының таралуы және плейотропия жылдамдығы. (а) Әрбір фенотиптік топтағы М2 отбасылардың саны. x осі 2-кестеде келтірілген тоғыз негізгі фенотиптік санатты көрсетеді, ал у осі M2 отбасыларының жалпы санын көрсетеді. Әрбір жолақ сәйкес санаттағы мутанттар санын білдіреді. Көк жолақ санат белгісіндегі бірінші санмен берілген плейотропты мутанттардың санын көрсетеді (бірнеше фенотипі бар). Қызыл жолақ плейотропты емес мутанттарды білдіреді және санат белгісіндегі екінші санмен беріледі. (б) 1-5 негізгі фенотиптік категорияларды (x осі) бөлісетін M2 отбасыларының жалпы саны (y-осі). Бір фенотиптік санатқа арналған жолақ тек бір фенотиптік топқа (плеиотропты емес мутанттар) қанша мутанттардың санатталғанын көрсетеді, ал 2-5 фенотиптік санаттар үшін жолақтар сәйкесінше екі-бес фенотипті бөлісетін мутанттар санын көрсетеді. Әр жағдайда мутанттардың жалпы саны жолақтың жоғарғы жағында көрсетіледі.

Тоғыз негізгі фенотиптік топты білдіретін мутантты фенотиптердің мысалдары. (а) 566-өсімдік: тоқаш түсті, альбинос. (б) 939 зауыты: өсімдіктердің архитектурасы, бұталы өсімдіктердің архитектурасы, жапырақтардың түсі өте ашық, сабағының түсі ақшыл -жасыл, тым ергежейлі. (с) 54-өсімдік: өсімдік архитектурасы, анықтаушы өсу. (d) 1,236 өсімдік: өсімдіктердің архитектурасы, жапырақтардың базальды түсі, ақшыл жасыл, сары жапырақтардың мөлшері, орташа сабақтарының мөлшері, ергежейлі. (e, f) Зауыт 903: жапырақ, конус тәрізді жапырақты гүлдер, стерильді гүлдер. (g) Өсімдік 1,567: жапырақты, бұрмаланған стипул, күміс-аргент. (h) 630 зауыты: гүлдер, гүлді қырыққабат типті гүлшоғыры бар гүлдер, барлық сабағы қалыпты емес, ергежейлі жапырақ, көтерілген.

Caméor TILLING платформасы

Бұршақ TILLING платформасын орнату үшін ДНҚ үлгілері 4704 M2 өсімдіктерден дайындалды, олардың әрқайсысы тәуелсіз отбасын білдіреді және 8 M2 отбасының бассейнінде ұйымдастырылады. TILLING -тің негізгі факторларының бірі - өңделетін геннің аннотацияланған геномдық реттілігінің болуы. Бұршақ геномы әлі реттелмеген болса да, мақсатты гендердің геномдық тізбегін алу бұршақ пен өсімдік зауыты арасындағы синтездің жоғары деңгейімен жеңілдетіледі. Medicago truncatula, ол тізбектелуде [24]. PRIMER3 құралымен [27] біріктірілген CODDLE бағдарламасы (Codons Optimized for Letsious Lezions [25, 26]) TILLING үшін ең жақсы ампликонды анықтау үшін қолданылады. TILLING үшін қолданылатын ПТР өнімдерінің максималды өлшемі шамамен 1500 bp құрайды, сондықтан ұзын гендер бірнеше ампликондарға бөлінеді. Бұршақ геномының күрделілігіне және ПТР -да қолданылатын геномдық ДНҚ -ның аздығына байланысты ПТР күшейту өнімінің сапасы мен мөлшерінің өзгеруін азайту үшін кірістірілген ПТР жүргізіледі. Мутация анықталған күшейтілген нысандарда сәйкес келмейтін ENDO1 эндонуклеаза көмегімен анықталады, бұған дейін [28]. Жеке мутантты сызықтар бассейннің ыдырау кезеңінен кейін анықталады, содан кейін мутацияланған негіз реттілікпен анықталады.

Мутагенез жобасының негізгі мақсаты - әр локус мутацияланған және бірнеше аллельмен ұсынылған қаныққан ресурсты құру. Бір локуста бірнеше аллельдің болуын бағалау үшін біз бұршақ метил трансфераза 1 генінің мутациясын тексердік (PsMet1) [29]. 1,383, 1,310 және 1,149 bp үш ампликондары өңделді (4-сурет) және 96 мутант анықталды (5-сурет). Мутациялардың тізбектік талдауы көрсеткендей, 6 интрондық, 37 үнсіз, 50 миссенс және 3 мәнсіз мутация (4б -сурет). сипаттамасы болса да PsMet1 мутанттар осы мақаланың ауқымынан тыс, біз М3 тұқымдық А қорынан алынған мутантты аллельдерді алу әпке В өсімдіктерінен жиналған резервтік М3 тұқымдық қорын қолданудың қажеті жоқ екенін анықтадық (1 -сурет). Экзоникалық мутанттар негізінен гетерозиготалар түрінде болды (90 мутацияның 79 -ы), бірақ мутация үшін 11 сызық гомозиготалы болды. EMS мутагенезінде күткендей, бұл мутациялар экрандалған ампликондарда салыстырмалы түрде біркелкі таралды (4б -сурет).

Болжамдалған және алынған мутацияны салыстыру. (а) Мысал ретінде CODDLE бағдарламасының шығысы PsMetI геномдық реттілік. Экзондар ақ жәшіктермен, ал интрондар қызыл сызықтармен көрсетілген. CODDLE бағдарламасы G: C -ден A: T -ге ауысуы кодталған ақуызға зиянды әсер етуі ықтимал болатын геннің аймақтарын анықтау үшін қолданылды (фирузада байқалған ықтималдық қисығымен көрсетілген). CODDLE алгоритмі гомологиялық ақуыздардың мәліметтер қорына қосылуын салыстыру арқылы ақуыздардың сақталуын бағалауға негізделген. Үшін PsMetI, үш фрагмент осы CODDLE нәтижелері бойынша таңдалды (көк сызықтар). Сыртқы және ішкі праймерлер кірістірілген ПТР көмегімен әр аймақты күшейтуге арналған. (б) Геннің үш аймағында анықталған мутациялардың графикалық көрінісі PsMetI. Бұл сызба мутациялардың таралуын суреттеу үшін гендік модельде мутацияны бейнелейтін PARSESNP бағдарламасы [43] арқылы жасалды. Күлгін үшбұрыштар үнсіз мутацияны, ал қара және қызыл үшбұрыштар сәйкесінше миссенс пен қиылысу мутациясын білдіреді.

TILLING экраны. Мысал a PsMetI Сегіз рет біріктірілген бұршақ ДНҚ -сындағы TILLING экраны. Бөліну реакциясының суреті екі арнадан (IRD700 және IRD800 бояғыштары) жиналады. Бояу таңбаланған екі ДНҚ тізбегінен (қызыл немесе жасыл) бөлінетін өнімдердің мөлшері (дөңгелектелген) ПТР өнімнің толық көлеміне дейін (гельдің жоғарғы жағы) қосылады. ПТР артефактілері шынайы мутанттардан сары нүктелермен (қызыл және жасыл қосылған) ерекшеленеді, өйткені олар екі арнада бірдей мөлшерде пайда болады. Бөліну өнімінің өлшемі (өлшемді анықтау баспалдағын суреттің сол жағында және ортасында көруге болады) бір нуклеотидтік полиморфизм фрагментте шамамен қай жерде орналасқанын көрсетеді.

Мутантты популяцияның сапасын одан әрі бағалау үшін біз TILLING экранын басқа 19 генге дейін кеңейтіп, сол гендердің 371 нүктелік мутациясын анықтадық (3 -кесте). EMS үшін күтілгендей, барлық мутациялар G:C-тен A:T-ке ауысу болды [6, 30]. Экзондарда табылған индукцияланған мутациялар 66,75% миссенс, 28,51% үнсіз және 4,74% тоқтату мутациялары болды (4 -кесте). Байқалған миссенс мутациясының саны CODDLE (63.80%) болжаған мөлшерден көп болғанымен, біз тоқтатылған мутацияны болжамнан сәл төмен пропорцияда қалпына келтірдік (6.90%). Көптеген өңделген ампликондар интрондық сегменттерге ие болғандықтан, кейбір қалпына келтірілген мутациялар интрониялық болды. Олардың кейбіреулері мРНҚ -ның қосылу тиімділігіне әсер етуі мүмкін болса да, мұндай әсерді болжау мүмкін емес. Осылайша, интрондық мутанттар әрі қарай сипатталмады. Керісінше, қалпына келтірілген синонимді емес мутациялардың көпшілігі қызығушылық тудырады, себебі олар фенотиптердің пайда болуына немесе жоғалуына әкелуі мүмкін. Мұндай мутациялар ақуыздың ішкі домендік құрылымына қатысты функциясын бөлуге мүмкіндік береді.

Грин бойынша 20 мақсатты гендегі мутация жиілігін есептедік (3-кесте). т.б. [6]: мутация жиілігі ампликон өлшеміне скринингтен өткен үлгілердің жалпы санына көбейтілген анықталған мутанттардың жалпы санына бөлінгенге тең. Біз орташа мутация жылдамдығын 200 кб сайын бір мутация деп бағаладық. Бұл мутацияның тығыздығы 300 кб бір мутацияның жылдамдығынан 1,5 есе жоғары. Арабидопсис, бүгінгі күнге дейін ең жақсы сипатталған TILLING мутантты популяциясы [6]. Сондықтан, бұршақ мутантты популяциясын құру үшін қолданылатын 16-24 мМ ЭМС дозасы ТИЛЛИНГ үшін қолайлы доза болып көрінеді. Орташа алғанда, біз өңделген генге 34 аллельді анықтадық (бүкіл популяцияның TILLING деңгейіне қалыпқа келтірілгеннен кейін). Миссенс мутацияларының жартысына жуығы кәдімгі ақуызға зиянды әсер етуі керек екенін ескере отырып [31], өңделген килобазаға 25 аллель фенотиптік талдаулар үшін жеткілікті болады.

UTILLdb мәліметтер қорын орнату

Біз фенотиптердің 107 ішкі санатын пайдалана отырып, фенотиптік өзгерістер үшін мутанттық популяцияда 4,817 сызық жинадық. TILLING экрандарында біз 20 геннің мутациясын іздедік және 467 аллельді анықтадық. Фенотип жазбаларынан да, TILLING мақсатты гендерінен де кеңейтілген деректерді басқару және біріктіру үшін біз UTILLdb мәліметтер қорын енгіздік. UTILLdb төрт негізгі модульді өзара байланыстыратын дерекқордың реляциялық жүйесі бойынша жасалған: сызықтар, фенотип санаттары, тізбектер мен мутациялар. Деректердің екі негізгі түрі қол жетімді: мутанттардың морфологиялық фенотиптері және қол жетімді болған жағдайда егілген гендер мен сәйкес аллельдердің тізбегі. UTILLdb тізбекті BLAST құралы [32] арқылы немесе фенотиптік ерекшелікті кілт сөзді іздеу арқылы іздеуге болады. Іздеу нәтижесі әр жолдың фенотипін, сәйкес суреттермен және бар болса, мутацияланған ретпен көрсететін нәтижелер кестесі ретінде көрсетіледі. Осылайша, пайдаланушы белгілі бір гендегі мутацияны бөлетін сызықтар бірдей фенотиптерді бөлісе ме, жоқ па деп сұрай алады. UTILLdb қолданушылары талдаған кезде TILLING мутанттарының фенотиптік сипаттамасы егжей -тегжейлі болады деп күтеміз, UTILLdb мутантты сызықтардың паспорттық деректерін қажет болған жағдайда кеңейтуге немесе өзгертуге болатындай етіп жасалған. UTILLdb веб-интерфейс арқылы жалпыға қолжетімді [33]. Тұқымға тапсырыс беруді жеңілдету үшін сілтеме жүзеге асырылады. UTILLdb сонымен қатар Caméor TILLING платформасында сүйікті генін өңдегісі келетін пайдаланушылар үшін кіру нүктесі болып табылады. Осы экрандардың нәтижелері, сондай-ақ анықталған мутанттардың фенотипі UTILLdb жүйесінде жүзеге асырылады.


3. Мақсатты таңдалған мутагенез

Мақсатты таңдалған мутагенез кездейсоқ мутагенизацияланған геномнан белгілі бір гендегі мутацияны анықтау үшін қолданылады. Бұл әдіс EMS немесе UV/TMP көмегімен стандартты мутагенезді қамтиды, мысалы, полимеразды тізбекті реакцияны (ПТР) немесе қызығушылық тудыратын генді зақымдайтын жануарларды анықтаудың басқа әдісін қолдану арқылы скрининг.

Екі қауымдық консорциум, C. elegans Нокаут консорциумы (celeganskoconsortium.omrf.org) және C. elegans Жапонияның ұлттық биоресурстық жобасы (NBRP, http://www.shigen.nig.ac.jp/c.elegans/mutants/index.jsp) қазіргі уақытта геннің әр геніне мутантты аллельдерді анықтау үшін мақсатты түрде таңдалған мутагенезді қолданады. C. elegans геном ( C. elegans Deletion Mutant Consortium, 2012). Осы топтармен бірге 6700 -ден астам жою немесе нөлдік аллель оқшауланған және олар ғылыми ортаға қол жетімді ( C. elegans Мутациялық консорциумды жою, 2012 ж.). Штамдар C. elegans Нокаут консорциумы Каеноргабдит Генетика орталығы (CGC, http://www.cbs.umn.edu/research/resources/cgc) аллельді белгілеумен Жарайды ма немесе gk. NBRP арқылы жасалған, аллельді белгілеумен штаммдар tm , Материалдарды тасымалдау туралы келісімді ұсынғаннан кейін қол жетімді (Mitani, 2009). Жою штаммдары Wormbase тізімінде берілген, олар қызығушылық тудыратын ген үшін аллель бар-жоғын анықтау үшін алдымен кеңесу керек. Олай болмаған жағдайда, Консорциумнан штаммды жоюды сұрауға болады. Штаммды алғаннан кейін маңызды емес мутацияларды жою үшін оны кесіп өту керек. Штамда мутацияның болуын тексеру әрқашан маңызды. Сонымен қатар, мақсатты таңдау арқылы алынған жою мутациясына проксимальды қайталанулар қосылуы мүмкін, нәтижесінде қарастырылатын ген үшін міндетті гетерозиготалық болады. Бұл жағдайларда мутантты штаммды фенотиптік бағалау геннің толық жоғалуына байланысты ақауларды анықтамауы мүмкін. Байқалған ақаулыққа қызығушылық тудыратын ген жауапты екенін растау үшін трансгендік құтқару эксперименттерін жүргізу және/немесе бірнеше аллельдерді зерттеу керек ( C. elegans Мутациялық консорциумды жою, 2012 ж.). Миллиондық мутациялар жобасы (http://genome.sfu.ca/mmp/) жинаудан басқа, 20000 генде 800000 -нан астам бір нуклеотидті полиморфизмді және 16000 -нан астам инделді анықтады. C. elegans Deletion Mutant Consortium, 2012 Томпсон және басқалар, 2013). Бұл SNP-тің кейбіреулері гендік функцияға әсер етпесе де, көпшілігі пайдалы құрылымдық-функционалды мәліметтерді бере алады.

3.1. ПТР көмегімен мақсатты түрде таңдалған мутагенез

Мақсатты таңдалған мутагенездің мақсаты-мутагенизацияланған жануарлардың бассейндері бар кітапхананы құру, ол ДНҚ-ның арнайы зақымдалуына скрининг жасай алады. Жою аллельдерін ПТР көмегімен анықтау нүктелік мутацияларға қарағанда оңайырақ, сондықтан UV/TMP және EMS таңдаулы мутагендер болып табылады (Lesa, 2006). Кітапхана құрылысы үшін 600000 гермафродит кездейсоқ мутагенденген. Мутагенге ұшыраған жануарлар ауырған соң, олар ағартылады және L1-ге түнде M9-да жұмыртқадан шығуға рұқсат етіледі. Содан кейін L1 -лер әрқайсысы 500 жануардан тұратын 1152 субмәдениетке (55 мм NGM пластиналары) бөлінеді. Өзін-өзі ұрықтандырудың екі буынынан кейін, табақшадағы жануарлардың 20% -ы геномдық ДНҚ оқшаулау үшін 96 ұңғымалы он екі пластинаға шайылады (Lesa, 2006). Қалған жануарлар 15 ° C температурада алты аптаға дейін сақталады. Кітапханаларды мұздатуға болатынына қарамастан, тірі жануарлар кітапханалары мутантты қалпына келтіруде сәтсіздікке бейім емес (Lesa, 2006).

Қызығушылық тудыратын геннің жойылуын іздеу үшін әдетте үш тәсіл қолданылады: ПТР шектеулі жағдайлары, уландырғыш праймерлер және термостабильді рестрикция ферменттері. Әрбір тәсіл ерекшелікті арттыру үшін қызығушылықтың геномдық тізбегін шектейтін кірістірілген ПТР праймерлерін пайдаланады және әрбір әдіс үлкенірек жабайы түрдегі өнімдерге қарағанда жойылу өнімдерін күшейтуді қолдайды (Edgley және басқалар, 2002 Jansen және басқалар, 1997 Wei et al., 2002 Зваль және басқалар, 1993). Бұл әдістердің барлығы жоғары жалған позитивті көрсеткіштерге бейім (50%-90%), сондықтан әрбір жинақталған үлгі екі данада скринингтен өтуі керек (Янсен және т.б., 1997). Кітапхананы құруға арналған толық хаттама және улы праймер ПТР әдісі WormBook-тің Кері генетика тарауында қол жетімді.

3.1.1. Шектеулі ПТР ұзарту уақыты (Янсен және басқалар, 1997)

Әрбір кітапхана пулы алдымен қызығушылық аймағы бойынша 2,5-3,5 кб қашықтықта жобаланған праймер жұбымен (бір праймер үшін 10 пмоль) инкубацияланады, содан кейін кірістірілген праймер жұбымен бірінші ПТР 1:500 сұйылтуын инкубациялайды (Liu et al. ., 1999). Полимеразаны, нуклеотидтерді және буферді қосқаннан кейін, жою өнімдерінің жинақталуына қолайлы болу үшін сынамалар қысқа ұзарту уақыттарымен (45 с -тен 1 минутқа дейін) циклмен өңделеді (Жансен және т.б., 1997). ДНҚ полимеразаларының белгілі бір айналым жылдамдығы (белгілі бір уақыт ішінде полимерленген нуклеотидтердің максималды саны) бар, олар қолданылатын Taq түріне байланысты өзгереді (Корнберг және Бейкер, 1992). Мысалы, егер жабайы түрдегі (WT) өнім 2 кб болса, жою өнімі 500 а.к., ал Taq полимеразасының айналым жылдамдығы 1 кб/мин болса, WT реакциясын аяқтау үшін шамамен екі мин қажет болады. жою өнімі үшін секунд. Егер ұзарту уақыты 45 с -пен шектелсе, тек жою өнімі күшейтіледі. Көптеген раундтарда кейбір WT өнімдері күшейтіледі, бірақ жоюға қарағанда әлдеқайда баяу. Бұл азырақ жойылатын аллельді анықтау мүмкіндігін айтарлықтай арттырады. Анықталған жойылулар көлемі бойынша орташа алғанда 1,4 кб шамасында өзгереді (Liu және т.б., 1999). Аяқталған реакциялар агарозды гельде орындалады және жабайы түрдегі өнімнен аз өнімі бар бассейндер анықталады. Бұл бассейндегі кітапхана жануарлары жеке немесе кішігірім бассейндерде жалатылып, тиісті зақымданған жалғыз гермафродиттерді анықтау үшін қайта тексеріледі (Янсен және т.б., 1997).

3.1.2. Уытты праймер әдісі (Эдгли және басқалар, 2002)

Бұл тәсіл өлшемі 500 bp -ден кіші жою үшін байыту үшін жасалған (Edgley et al., 2002). Протокол шектеулі ПТР ұзарту уақыты әдісіне ұқсас, тек бірінші ПТР сыртқы праймерлерінің арасына үшінші праймер қосылады (3-сурет). Бұл уытты праймер жабайы түрдегі толық өніммен бәсекелесетін жабайы геномдық ДНҚ-ны ғана күшейтуге арналған, осылайша екінші ПТР үшін қол жетімді жабайы шаблонның санын азайтады. Кірістірілген праймерлердің екінші жиынтығы тек жойылған өнім мен улы праймер өнімінің әсерінен жалпы концентрациясы екі есе азайтылған жабайы түрдегі өнімді байланыстыра алады. Бұл жойылудың жабайы өнімге қатынасын жақсарту арқылы сезімталдықтың 500 есе артуына әкеледі. Қысқа ұзарту уақытын (45 с) пайдалану да жойылатын өнімнің синтезін жеңілдетеді. Уытты праймер күшейтілген жою өнімдерінің орнын анықтайтындықтан, әдетте нөлдік аллельдерді генерациялау үшін геннің 5 -ші және 4 -ші ұштарын бағыттаған дұрыс (Эдгли және басқалар, 2002).

Сурет 3. Жоюды анықтауға арналған улы праймер әдісі. Бұл әдіс сирек кездесетін, жойылған ДНҚ-ны бай, толыққанды, жабайы түрдегі өнімге байытады. Бірінші ПТР-да a, b және p праймерлері жабайы үлгіні, мутантты үлгіні және ‘у’ шаблонды жасау үшін пайдаланылады. Екінші ПТР-да бұл өнімдер жойылған өнімнің сигналын арттыру үшін a’ және b’ праймерлері бар үлгі ретінде пайдаланылады. Улы праймерсіз толық ұзындықтағы өнім ПТР реакциясында басым болады, ал жою өнімі анықтау шегінен төмен. Улы праймер қосылған кезде толық ұзындықтағы күшейту азаяды және жойылатын өнім анықталады.

3.1.3. Термотұрақты шектеу ферменттері (Хуанг және т.б., 2006 Wei et al., 2002)

Бұл сирек қолданылатын әдісте праймерлік жұптар аралықта термостабильді ферментті тану орны бар мақсатты гендегі тізбектер анықталады (Вэй және т.б., 2002). Бұл ферменттер жоғары температурада тұрақты, бұл оларды ПТР-мен пайдалану үшін өте қолайлы етеді. Жинақталған геномдық ДНҚ ПТР-ге дейін 2 сағат ішінде қорытылады, бұл геномдық ДНҚ-ны ажыратады және жабайы типті шаблонның мөлшерін азайтады. Ферменттер сонымен қатар ПТР күшейту кезінде жабайы түрдегі кез келген өнімді үздіксіз ажырату үшін қосылады. Кірістірілген праймердің екі жиынтығы қолданылады. Мақсатты жою тізбегінде рестрикциялық ферменттің орны жоқ және бөлінбейді, осылайша реакцияның сезімталдығын арттырады (Wei et al., 2002). Осы әдісті қолдану арқылы 330 бит-тен 1,7 кб-қа дейінгі жоюлар табылды (Хуанг және т.б., 2006 Wei et al., 2002). Тексерілген термостабильді шектеу ферменттері кіреді Psp GI, Tli Мен, Bst UI, Маймыл КИ және шай қасық 45I (Хуанг және басқалар, 2006 Вэй және басқалар, 2002).

3.2. ӨҢДЕУ

TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) қызықтыратын гендегі нүктелік мутацияларды және шағын индекстерді анықтауға мүмкіндік береді (McCallum et al., 2000). Басында әзірленген Arabidopsis thaliana , TILLING мутацияланған геномды мутацияланбаған геномға будандастырғаннан кейін сәйкессіздіктердің орнын анықтау үшін бір тізбекті ДНҚ нуклеазасын қолданады (Colbert және т.б., 2001 Till et al., 2003). Бұл әдіс қызығушылық тудыратын гендегі нүктелік мутацияларды оқшаулау үшін бір рет қана қолданылған C. elegans , ол басқа организмдерде көбірек қолданылды. Популяциядағы мутациялар C. elegans EMS немесе ENU көмегімен жасалады (Gilchrist et al., 2006). Қызықты генге бағытталған ПТР жануарлардың көптеген бассейндерінен алынған геномдық ДНҚ -да орындалады (4 -сурет). Праймерлер әртүрлі флюорофорлармен белгіленіп, өнімнің 5’ және 3’ ұштарын әртүрлі түстермен белгілейді. ПТР -дан кейін әр реакциядағы ДНҚ денатурацияланады. Содан кейін қайта өңдеу жабайы типті және мутантты ДНҚ арасында гетеродуплекс түзуге мүмкіндік береді. Қайта өңделген ДНҚ балдыркөк шырыны сығындысынан (CJE) алынған CEL1 бір тізбекті ДНҚ нуклеазасымен инкубацияланады (Till және т.б., 2004). CJE гетеродуплексті ДНҚ-ны кесіп тастайды, онда сәйкессіздік немесе индель бір жіпшелі дөңес тудырады. Үлгілер денатурацияланатын LI-COR гельдерінде орындалады және гельдер қай бассейнде сәйкессіздік орын алатынын анықтау үшін екі флуоресцентті арнада да зерттеледі (Гилхрист және т.б., 2006). In a screen for ten genes (ranging from 788 bp to 9.1 kb in size), 71 mutations were identified. Of these, 59% constituted missense alleles, and 3% were nonsense alleles (Gilchrist et al., 2006).

Figure 4. TILLING allows identification of point mutations in pools of mutated DNA. Both mutated DNA and wild-type DNA are subjected to PCR, using differentially labeled 5’ and 3’ primers (here in green and red). The PCR products are denatured and reannealed slowly, so that heteroduplex DNA forms between a mutated DNA strand and a wild-type DNA strand. The reannealed PCR products are treated with Cel1, an enzyme that specifically cleaves heteroduplex DNA. The reaction is visualized on a LI-COR gel in two fluorescence channels. When heteroduplex DNA is cut, smaller DNA fragments are seen in both the green and red channels within the same lane. Full-length, uncut product will be prominent at the top of the gel.

Individual mutagenized F1 animals are plated singly onto 1500 seeded NGM plates. After the food supply is expended, half of the animals are frozen at 󔽘°C. The other half are used to generate genomic DNA individually into 96-well plates. To reduce the number of PCR reactions, eight F1 DNA samples are pooled together for analysis. Once a positive pool has been identified, DNA genomic samples are assayed individually to determine from which plate the sample originally arose. PCR primers are designed over an area of 1.5 kb, mainly encompassing exonic regions. Primers can be designed using the program CODDLE to select for regions high in G/C content, which are most prone to mutation by EMS (Gilchrist et al., 2006).

3.3. G4 DNA-induced deletion mutagenesis

The consensus sequence G3+Н.1-7G3+Н.1-7G3+ Н.1-7G3+ қатпарлар in vitro to form a guanine quadruplex (G4) structure that may block replication in vivo (Kruisselbrink et al., 2008). The FANCJ protein (DOG-1 in C. elegans ) is a DNA helicase required for proper replication of such guanine-rich tracts (Kruisselbrink et al., 2008). In dog-1 mutants, these tracts are prone to 5’ deletions. There are more than 2,900 guanine quadruplex sites in the C. elegans genome, annotated in Wormbase under “G4 Motif” in GBrowse, and over 1,600 genes are located 5’ of a G4 site (Pontier et al., 2009). Of ten genes assayed in one study, 11 deletion alleles were generated, most of which were up to several kilobases upstream of the G4 site targeted (Pontier et al., 2009). This method has been used once to generate deletion alleles (Pontier et al., 2009).

dog-1(pk2247) mutants are picked to individual NGM plates and allowed to grow until no OP50 remains on the plate (Pontier et al., 2009). Half of the animals on each plate are rinsed off with M9 for genomic DNA isolation. Prior to DNA isolation, animals are split into two groups. If a deletion is present in only one of the samples, it probably arose from a somatic event. However, if a deletion is detected in both samples, it is most likely a heritable mutation (Pontier et al., 2009). Deletions are screened using any of the PCR protocols described above. After isolation, the strain is outcrossed to wild-type animals to remove the dog-1 mutation and any off-target deletions.


What is Forward Genetics?

Forward genetics can be defined as the path of determining the basis of genetics that is responsible for a particular phenotype. Naturally occurring mutations and mutants that are induced by radiation, chemicals or transposable elements (insertional mutagenesis) were the initial approaches for forward genetics. It is then followed by breeding, isolation of the mutant individuals and lastly the mapping of the gene. Forward genetics is performed to determine the gene function through the analysis of the phenotypic effects of DNA sequences that are altered. Therefore, it is considered antagonistic to reverse genetics. Mutant phenotypes are usually examined beforehand to identify the particular gene responsible and can give rise to genes being named after the respective mutant phenotype. Дрозофила қызғылт gene named after the mutant’s eye color is an example.

In the context of conventional genetical approach, a researcher handling the determination process of the genetic basis for phenotypes would directly map the gene on the particular chromosome where it is present. This is done through cross-breeding with different individuals where those individuals carry different other uncommon traits. Statistical analysis will be carried out to determine the frequency of occurrence where the two traits are inherited together. This convention methodology of mapping takes a considerable long period of time.


Drosophila Models of Huntington Disease

LESLIE M. THOMPSON , J. LAWRENCE MARSH , in Animal Models of Movement Disorders , 2005

1. Screens

Genetic screens can identify mutations that lead to more severe (enhancers) or less severe (suppressors) phenotypes. Two types of mutations can be screened: loss-of-function alleles in which a mutation typically causes the activity of one allele to be lost, or gain-of-function alleles in which the mutation is caused by an insertion of a transposable P-element containing a UAS based enhancer and promoter (EP), resulting in ectopic activation of the gene in the presence of GAL4 drivers. Eye degeneration of a polyQ alone expressing fly model (UAS-127Q) was used in a P-element screen for modifiers of the phenotype [ 28 ]. Several modifiers were identified, highlighting a role for protein folding pathways (dHDJ1, dTPR2) and suggesting a possible association with pathways involved in cell proliferation and DNA replication (Дрозофила homolog of human myeloid leukemia factor 1, MLF1) [ 29 ]. Using the SCA1 model to screen for suppressors and enhancers of the phenotype, several classes of modifier genes were identified. These included transcriptional regulating genes, protein modification genes, and chaperones as modifiers of mutant ataxin 1 pathology [ 25 ].


Genomic screening: A pet subject

Many canine inherited diseases are late onset conditions that are often not apparent until maturity. Breeders and owners must therefore wait until a puppy grows before knowing if it is affected. This delays vital preventive veterinary treatment and can result in breeding from affected animals, thus perpetuating the disease. Replacing this traditional approach with genomic screening is a much faster way to manage breed-specific problems genomic carrier status is easy to screen in young puppies, so breeders and owners do not have to wait for clinical signs before taking action.

Moreover, with more research, scientists are also finding that different gene mutations cause the same or similar diseases. For example, various genes associated with retinal function cause progressive retinal atrophy (PRA) and blindness in many dog breeds. Inheritance is mostly as an autosomal recessive gene (PRCDin many breeds, PDE6Bin the Irish setter, RD3in collies, and PDE6Ain cardigan Welsh corgis all cause rod-cone dysplasia), but in the Siberian husky and Samoyed the condition is due to RGPR, an X-linked gene, and autosomal dominance is the route for bullmastiffs and English mastiffs (RHO). Golden retrievers are affected by two different gene mutations (SLC4A3және TTC8) causing PRA. There is still a lot to learn about heritability and disease expression in dogs.


Материалдар мен тәсілдер

Mutagenesis and breeding

ENU mutagenesis followed standard protocols (S tottmann and B eier 2010). In brief, 6- to 8-week-old A/J mice (Jackson Labs) were injected i.p. with a fractionated dose of ENU once weekly for 3 weeks with 90, 95, or 100 mg/kg ENU (Sigma). A/J mice were used due to their ability to tolerate larger doses of ENU with acceptable morbidity and mortality, thus increasing their mutation load and increasing productivity of the screen (W eber т.б. 2000). ENU was prepared using standard methods and dissolved in ethanol. After allowing for a period of infertility following the mutagenesis, a standard three-generation breeding scheme was followed (B ode т.б. 1988 H erron т.б. 2002 also see Results and Figure 1 ). The A/J males were crossed with FVB/J females (Jackson Labs), retinoic acid response element (RARE)-lacZ–positive females, or Lis1 heterozygous females (largely from a 129 background). The resulting G2 females were backcrossed to generate G3 embryos or postnatal day (P) 14 pups. For timed pregnancies, successful matings were identified by the presence of a copulation plug, and noon of the day of detection was set as embryonic day (E) 0.5. All animals were housed in accordance with the Harvard Medical School Center for Animal Resources and Comparative Medicine.

ENU breeding scheme. (A) A traditional three-generation breeding scheme for recovering recessive traits in the third generation (G3). G0 males are mutagenized and outcrossed to generate the G1 population. These are again outcrossed to generate G2 females, which may carry any given ENU mutation. These are backcrossed to the G1 male to create the G3 generation, which is then screened for phenotype(s). Solid indicates homozygosity for an ENU mutation, open indicates no mutation, solid/open indicates heterozygosity. (B) Introduction of a reporter allele is accomplished by mating RARE-lacZ–positive animals to the G1 male and genotyping subsequent females for the transgene. (C) Similarly, a sensitizing locus is incorporated by mating Lis1 heterozygous females with G1 males.

Mouse genotyping

RARE-lacZ mice were genotyped with standard lacZ primers (F-TTTAACGCCGTGCGCTGTTCG, R-GATCCAGCGATACAGCGCGTC). Lis1 heterozygotes were identified using primers for the neomycin resistance cassette (F-TCCTGCCGAGAAAGTATCCATCAT, R-CCAGCCGGCCACAGTCGT) as previously described (H irotsune т.б. 1998). Looptail mice carry a mutation in the vang-like 2 (Vangl2) gene, and heterozygous mice were identified by their abnormally looped tail. Direct sequencing of the mutation (in the eighth exon of vangl2) was done to genotype embryos (F-AGAGGATGAAGGGTGGGTG, R-GTGTCAGGGCCAGAGAACC).

Whole-genome single nucleotide polymorphism scanning

To map our mutations, we genotyped a custom whole-genome panel of 768 single nucleotide polymorphism (SNPs) with the Illumina GoldenGate technology at the Broad Institute Center for Genotyping and Analysis. A total of 256 of the 768 SNPs on this panel were polymorphic between A/J and FVB/J. The initial genomic interval carrying the mutation was defined by flanking SNPs, which identified a homozygous A/J haplotype shared by all affected animals. Fine mapping was done by analyzing further meioses with microsatellite markers, restriction fragment length polymorphisms [identified via the MGI database http://www.informatics.jax.org/strains_SNPs.shtml or the algorithm SNP2RFLP (B eckstead т.б. 2008)], or direct sequencing of SNPs. Sequencing of candidate genes was done with standard methods, either exon-based sequencing or using random-primed cDNA from mutant RNA for transcript analysis. Primer design was either with Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) or via the Exon Primer function in the University of California at San Francisco (UCSC) Genome browser (http://genome.ucsc.edu/). All DNA sequencing other than SNP mapping was done at the Dana-Farber/Harvard Cancer Center DNA Resource Core. In two of these mutant lines, crn2 және hith2, our initial mapping was with a cohort of affected animals with multiple phenotypes and resulted in two candidate regions. Analysis of more embryos and standard microsatellite mapping demonstrated that not all phenotypes were allelic and allowed us to focus on the chromosomal location reported in Table 2 for mapping crn2 және hith2.

2-кесте

АтыPhenotype descriptionХромосомаInterval (Mb)Locus
Brain dimple (brdp)Telencephalic dysmorphology mild hydrocephaly1315� (3)
Cleft lip and palate, exencephaly (clpex)Cleft lip and palate, exencephaly781� (4)
Cleft palate 1 (clft1)Cleft palate only1183� (10)Irf6
Rudolph (rud)Cortical dysmorphology, shortened long bones1160� (8)Hsd17b7
Craniorachischisis (crn2)Craniorachischisis1549� (4 а )Scrib
Progressive hydrocephalus (prh)Progressive hydrocephaly30� (4)
Cleft face (clft3)Midline fusion defect, small brain, encephalocele150� (4)
Hole in the head 2 (hith2)Encephalocele, hydrocephalus836� (4 а )Casp3

Eight monogenic mutations were recovered in this screen. The causal gene or initial mapping interval from the whole-genome SNP scan is reported with the number of mutants used in parentheses.

Histology and immunohistochemistry

Histological analysis used standard methods (N agy 2003). Embryos were fixed in either Bouin's fixative or 4% paraformaldehyde followed by paraffin embedding and sectioning at 14 μm. Sections were stained with hematoxylin and eosin or Cresyl violet. Caspase-3 immunohistochemistry was performed on paraffin sections following the manufacturer's instructions using reagents described below. After deparaffinization of the slides, antigen retrieval was performed with Citra Buffer (Biogenex). Blocking against background from avidin𠄻iotin immunohistochemistry was done with commercial reagents (DAKO, Vectorlab). Slides were incubated with a primary antibody against full-length caspase-3 (Cell Signaling) overnight at 4° at 1:200. Visualization was with a biotin-labeled secondary antibody (Vectastain Universal ABC kit) and counterstained with hematoxylin QS (Biogenex).

Талдау crn2 cochlear phenotype

E18 whole-mount cochleae were fixed in 4% paraformaldehyde, dissected to expose the sensory epithelium, and stained with Alexa Fluor-conjugated phalloidin (1:200 Invitrogen). Images shown are confocal projections of the cochlear sensory epithelium. Absolute rotation of hair-cell stereocilia bundles was assessed at positions of 5, 25, and 50% of the total cochlear length from the basal end of the duct, as previously described (M ontcouquiol т.б. 2003). Data are presented as the average deviation from 0° error bars represent SEM. Significant differences were determined by two-tailed т-тест.


Supporting information

S1 сур. Волбахия recovers from severe titre reduction within four fly generations.

Салыстырмалы Волбахия titres of the progeny of tetracycline-treated flies. wMelCS_b-carrying females laid eggs in food containing varying doses of tetracycline. The progeny of three females were used to set up the experiment. At the first generation, four females were randomly selected for egg-laying in antibiotic-free fly food and Волбахия titre was measured using qPCR. Titres of untreated females were used to normalize the qPCR results. The progeny of a female with the median titre was used to set up the next generation. Волбахия titre in the F1 was significantly determined by the concentration of the antibiotic (б < 0.001 for all doses compared with control at generation 1), but recovered to normal within four fly generations (б > 0.05 for all doses compared with control at generation 4).

S2 Fig. EMS decreases female fecundity and Волбахия titre in the next generation in a dose-dependent manner.

The total number of eggs (A) and adults (B) from females treated with varying doses of EMS. The reproductive output of 10 females was determined in the first ten days after EMS treatment by daily transferring females to new vials for egg laying. Females fed on a sucrose solution served as controls. Each dot represents the total number of eggs (A) or adults (B) laid by individual females during ten days. The effect of EMS on the reproductive output of females was estimated using a non-linear model and was highly significant (б < 0.001 for both numbers of eggs and adults per female). (C and D) Волбахия titres in the F1 progeny of females treated with varying EMS doses. Волбахия titre was quantified on individual females (n = 5–13 per dose), after laying eggs for three days. Волбахия titres were normalized against the titres of untreated females. Dashed red lines represent the mean value predicted using non-linear models. The effect of EMS on Волбахия titres in the next generation was highly significant (б < 0.001 for both panels).

S3 Fig. Isolation of over-proliferative Волбахия variants.

(A-D) Relative Волбахия titres in a control (wMelCS_b) and EMS-treated D. меланогастер сызықтар. Flies to set up the next generation was selected as described for Fig 1. Line 2B was isolated in the same batch as Line 2A (wMelOctoless) and they may be not independent. Likewise, Lines 3A (wMelOctoless2), 3B, and 3C were also isolated in a same batch.

S4 Fig. Generation of isogenic D. melanogaster lines with wMelPop2 and wMelOctoless.

The first, second and third chromosomes of flies carrying wMelPop2, wMelOctoless, and wMelOctoless2 were replaced through the use of balancer chromosomes. Волбахия infection (and also mitochondria) was kept in the stock by crossing females with Волбахия with indicated males. The mitochondria are only shown in females because of its strictly maternal transmission. All males were free of Волбахия инфекция. Dashed lines indicate the genotype selected from the previous cross. Virgin female in the first cross were considered mutant in all chromosomes (*), for illustrative purposes. Question marks (?) represent recombined chromosomes.

S5 Fig. Proliferation of wMelOctoless and wMelOctoless2 in a host isogenic genetic background.

Салыстырмалы Волбахия titres in D. malanogaster males carrying wMelOctoless and wMelOctoless2 at 0 and 7 days post adult eclosion, at 25°C. This experiment was set-up as described in Fig 1. Relative Волбахия titre was determined using qPCR and normalized to that of 0–1 days-old wMelCS_b-infected males. Each dot represents the relative titre of a single male.

S6 Fig. Confirmation of amplification and deletion of Octomom genes by qPCR.

The amplification and deletion of individual Octomom genes (wMel loci WD0507WD0514) was confirmed using qPCR in wMelPop2 and wMelOctoless, respectively. The copy number of three genes outside the Octomom region (wMel loci WD0505, WD0519, және rpoD) were also determined. Five females carrying wMelCS_b, wMelPop2, and wMelOctoless were used in the analysis. Көшірме нөмірі wMelPop2 and wMelOctoless genes is relative to that of wMelCS_b.

S7 Fig. Selection for lines carrying Волбахия with a desired Octomom copy number.

The relative copy number of genomic WD0513 жылы Волбахия-carrying stocks throughout 30 fly generations. Each generation, 5–20 females were randomly collected for egg-laying for 3–4 days and used to determine the relative copy number of WD0513, as a proxy for the Octomom copy number. The progeny of a single female was used to set up the next generation. qPCR results were normalized to that of wMelCS_b, which has a single copy of Octomom per genome.

S8 Fig. Octomom region is amplified in tandem in wMelPop2 and wMelPop.

Oxford Nanopore MinION reads supporting the amplification of the Octomom region in tandem in wMelPop2 and wMelPop Волбахия variants. We mapped wMelPop2 and wMelPop long reads (BioProject: PRJNA587443) to the the Octomom region in their genomes (Accessions CP046922.1 and CP046921.1, respectively) using minimap2 v2.17-r941 [48] and plotted the alignment summary (S7 Table) for illustrative purposes.

S9 Fig. Identification of the genetic bases for over-proliferation of the Волбахия in Line 2B and Line 3A (wMelOctoless2).

Relative coverage in the genomic region containing the Octomom region. As in Fig 2B, Illumina paired-end reads were mapped to wMelCS_b (GenBank: CP046924.1) genome, and the number of reads mapping to each position were normalized by dividing to the median coverage across the genome. Coverage information for wMelCS_b, wMelPop2 and wMelOctoless is also given in Fig 2B. We identified the deletion of Octomom as the cause of proliferation in lines 2B and line 3A (wMelOctoless2), as no other difference was found when compared to wMelCS_b.

S10 Fig. The amplification or deletion of Octomom increase Волбахия proliferation rate in adults.

Time-course of relative Волбахия titres in adults at 18°C (A), 25°C (B) and 29°C (C) with different Волбахия variants. Replicate of experiment shown in Fig 3. Волбахия titres were determined and analysed as described for Fig 3.

S11 Fig. Octomom copy number determines Волбахия titres on the day of adult eclosion.

Салыстырмалы Волбахия titres on the day of adults eclosion. Males developed at 25°C were collected within 24 hours after eclosion for Волбахия titre measurement using qPCR. Data used in this figure are also shown in Fig 3 and S10 Fig (time point 0). Letters represent significant groups after б-value correction.

S12 Fig. wMelPop2 and wMelPop are phenotypically indistinguishable.

(A) WD0513 copy number of wMelPop2 and wMelPop in two experimental replicates. Қолдану WD0513 as a proxy, the Octomom copy number of wMelPop2 and wMelPop was tightly controlled prior to phenotypic comparison. (B) Волбахия relative titres at 25°C. The progeny of wMelPop2- and wMelPop-infected females carrying three copies of Octomom was used to set up the experiments. Males that developed at 25°C were collected upon eclosion, aged to specific time-points and used to determine Волбахия titres using qPCR. Волбахия titres were normalized to that of wMelCS_b-carrying flies collected on the day of eclosion. Proliferation rates of wMelPop2 and wMelPop were not different (б = 0.32). (C) Lifespan of males (solid lines) and females (dashed lines) flies at 25°C. Males were transferred to new vials every five days, while females every four days. (D) Coefficients of a Cox mixed model, representing the effect of wMelPop2 and wMelPop on the lifespan relative to wMelCS_b-carrying flies. wMelPop2 and wMelPop was equally pathogenic (p = 0.29).

S13 Fig. Octomom copy number dynamics throughout fly development and during adult life.

Relative copies of WD0513 бойы D. меланогастер development (A) and during adult life (B). WD0513 relative copy numbers were determined in samples shown in Fig 4 (for panel A) and Fig 3 and S10 Fig (for panel B). WD0513 copies were normalized to that of 0–1 old wMelCS_b-infected males. (A) Vertical dashed lines separate developmental stages (i.e. eggs, larvae, pupae, and adults). The x-axis is not in a continuous scale. (B) The two replicates are represented by different symbols.

S14 Fig. wMelPop2 and wMelOctoless are pathogenic to both males and females.

Lifespan of D. меланогастер males at 18°C (A), 25°C (B), and 29°C (C). Survivorship was determined as in Fig 5. This is a replicate of Fig 5. (D) Survival of D. меланогастер females at 25°C. Survival was determined as in Fig 5, except that females were transferred to new vials every four days. The experiment was performed twice. (E) Coefficients of a Cox mixed model of the lifespan of females relative to Волбахия-free control. Both replicate experiments were pooled for statistical comparisons. Bars represent the standard error of the coefficient, and letters the statistically significant groups.

S15 Fig. Волбахия variants, not differences in the host genetic background, are pathogenic.

(A-B) Survival of D. меланогастер females at 29°C. Virgin wMelCS_b-carrying females were crossed with males carrying wMelOctoless or wMelPop2 (with 3 or 8–9 Octomom copies) and vice-versa. The resulting progeny developed at 25°C and was placed at 29°C after adult eclosion. The survival of 50 female progeny, which have the same genetic background but differ in Волбахия infection, was determined per condition, per replicate. Females were maintained in groups of ten and transferred to new vial every four days. The experiment was performed twice. (C) Coefficients of a Cox mixed model representing the effect of the parental crosses on the survivorship of females. Significance was accessed after p-value correction for multiple comparisons, and significant groups are represented by letters.

S16 Fig. Correlation between Волбахия-induced phenotypes and bacterial titres or doubling time.

(A-C) Correlation between Волбахия titre at the day of eclosion and the strength of life-shortening phenotype determined at 18°C (A), 25°C (B), and 29°C (C). The y-axis represents the strength of Волбахия life-shortening phenotype (estimated using Cox mixed model shown in Fig 5). The x-axis represents the natural log of the relative Волбахия titre estimated using a linear mixed model. Bacterial titres were normalized to that of wMelCS_b-infected flies (shown in S11 Fig). (D and E) The correlation between the strength of anti-viral protection and Волбахия doubling time. The y-axis represents the strength of anti-viral protection (estimated using Cox mixed model shown in Fig 6). The x-axis represents Волбахия doubling time in adults at 18°C (D), or 25°C (E) (shown in Table 1). The Pearson correlation coefficient (r) and its significance (p) are given in each panel. A grey line represents the trend (fit of linear regression). Error bars represent the standard errors of the estimates. None of these correlations were statistically significant and they complement correlations shown in Fig 5 and Fig 6.

S17 Fig. Survival of flies with different Волбахия variants after challenge with DCV or buffer solution.

(A) Survival of males carrying different Волбахия variants after a challenge with DCV (A) or a buffer solution (B and C). Fifty 3–5 days-old Дрозофила males, per line, were pricked with DCV (10 9 TCID50/ml) or buffer and survival curves were determined at 18°C for 40 days. A is a replicate of Fig 6A, 6B and 6C are controls for these experiments. (D) Coefficients of Cox mixed models of buffer-pricked flies. Both replicates were pooled for statistical analysis. Bars represent the standard error of the estimate, and the letters the statistically significant groups after p-value correction.

S1 кестесі. Number of F1 females screened for new over-proliferative Волбахия variants per experimental condition.

wMelCS_b-infected G0 females, raised in control or antibiotic-treated food (12.5 μg/ml), were fed different doses of ethyl-methanesulfonate (EMS) and allowed to lay eggs in individual vials. F1 females were collected as virgins, mated to non-mutagenized males and also allowed to lay eggs individually. F1 females were used for Волбахия titre measurement when were 10-days old. Number of F1 females tested per experimental condition is shown.

S2 кестесі. Coverage statistics of the sequencing project.

Coverage statistics (mean and range) of Illumina reads mapped to either Волбахия or mitochondria of D. меланогастер Release 6 genome sequence (KJ947872.2:1–14,000). Sequencing data of each Волбахия variants are mapped to own genome assembly (BioProject ID: PRJNA587443), except for Волбахия in Line 2B and wMelOctoless2 which were mapped to wMelCS_b genome (Accession: CP046924.1). ND–not determined.

S3 Table. Flies infected with new over-proliferative Волбахия variants did not inherit mutated mitochondria.

Illumina reads on flies infected with different Волбахия variants were mapped to the mitochondria of D. меланогастер Release 6 genome sequence (KJ947872.2:1–14,000). A summary of the mapping is given in S2 Table. The mitogenome of flies infected with wMelCS_b, wMelOctoless and wMelPop2 was identical. We found an SNP unique to flies infected with wMelCS-like variants (G→A on position 10,793) but absent in flies infected with wMelPop. We confirmed this SNP using Sanger sequencing.

S4 Table. Assembly and annotation statistics.

Волбахия genomes were assembled using the Unicycler v0.4.8-beta pipeline and annotated using NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline v4.10. wMel reference genome (Accession: AE017196.1) is included for comparison purposes.

S5 Table. SNPs and indels between newly assembled wMel and wMel reference genome.

The genome of a newly assembled Cluster III wМел Волбахия variant (Accession: CP046925.1) was aligned to wMel reference genome (Accession: AE017196.1) using Mauve v2.4.0. All the differences were confirmed via Sanger sequencing.

S6 Table. SNPs and indels between wMelCS_b and and wMel reference genome.

геномы wMelCS_b (Accession: CP046924.1) was aligned to wMel reference genome (Accession: AE017196.1) using Mauve v2.4.0.

S7 Table. Alignment summary of long reads supporting the amplification of the Octomom region in tandem.

Long reads (MinION, Oxford Nanopore) reads supporting the amplification of the Octomom region in tandem in wMelPop2 (Accession: CP046922.1) and wMelPop (Accession: CP046921.1) genomes. Long reads were mapped to Octomom region using minimap2 v2.17-r941 and the number of Octomom copies determined using blastn v2.8.1+.

S8 Table. Primers used for amplification and quantification of individual Волбахия гендер.

Primers used in this study have been previously described [16,17].

S9 Table. List of primers used to improve Волбахия draft genomes.

Primers used to amplify and sequence, using Sanger technology, genomic regions containing predicted differences between Волбахия draft genomes.

S1 Text. Confirmation of the amplification and deletion of the Octomom in wMelPop2 and wMelOctoless, respectively.

Геномдары wMelCS_b, wMelPop2 and wMelOctoless were aligned using Mauve v2.4.0. The three-fold amplification of Octomom in wMelPop2 and its deletion in wMelOctoless were the only difference identified when compared with wMelCS_b.


Бейнені қараңыз: Страшнее дельты: штамм может быть самым заразным - Россия 24 (Желтоқсан 2022).