Ақпарат

Түс таңдау әдісімен рекомбинантты хостты таңдау

Түс таңдау әдісімен рекомбинантты хостты таңдау


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Рекомбинантты ДНҚ технологиясында, рекомбинантты емес рекомбинантты хостты таңдау үшін бізде әртүрлі техника түрлері бар.

Мен айтып отырған - бұл түс таңдау 2 маркерді қолдану әдісі (бір антибиотикке төзімді ген мысалы үшін. Ампициллин, және басқа Z-ген). Біз репортер гені ретінде Z-генін қолданамыз. Біз мұнда векторсыз E. Coli хост ұяшы ретінде қолданамыз.

Енді барлық нұсқалары (трансформаторлар және трансформанттар) бар Петри табақшасына Ампициллинді қосқанда, - трансформацияланбайтындар өледі. Трансформаторлар аман қалады.

Енді біз осы петриден жасалған ыдыстың көшірмесіне X-gal қосамыз, ал кейбір колониялар β- галактозидаза ферментінің әсерінен көк түске айналғанын көреміз, ол өз кезегінде плазмидада бұзылмайтын Z-генімен шығарылады. Бұл біздің көк колониялар рекомбинантты емес дегенді білдіреді.

Менің сұрағым-

Петри табақшасында алынған ортада глюкоза да болуы керек, солай емес пе? Әйтпесе, рекомбинанттар Z-генінің әсерінен түс реакциясын береді (X-гал-лактозаның гомологы) хромосомалық ДНҚ (Оперон түсінігі).

Сұрақ ақымақтық болуы мүмкін, өйткені біз бактериялардың өсуі үшін негізгі қажеттіліктерді қамтамасыз етуіміз керек (ол анық глюкоза).

Бізде глюкоза болмаған жағдайда растағым келді! =б


Сіз айтып отырған Z гені болуы керек lacZ $ alpha $ және $ omega $ пептидтерінен жасалған $ beta- $ galactosidase кодтайды. Ешқандай пептид өздігінен жұмыс істемейді.

$ бета- $ галактозидаза Х-галдегі гликозидтік байланысты үзіп галактоза мен 5-бром-4-хлор-3-гидроксиндол түзеді. Содан кейін соңғы өнім 5,5'-дибромо-4,4'-дихлоро-индигоға дейін димерленеді және тотығады, қарқынды көк өнім бұл анықтау және мөлшерлеу оңай.

Әрі қарай, сіз бактериялық штаммның генотипін тексеруіңіз керек, себебі олардың геномында тек $ omega $ -пептид кодталған. Осылайша, $бета-$галактозидазаның ферментативті белсенділігі $альфа$-пептид қоршаған ортада болғанда ғана қалпына келеді және бұл процесс деп аталады. $ alpha $-толықтыру.

Клондау мен экспрессия үшін жиі қолданылатын екі штамм E. coli Dh5$alpha$ және TOP10 болып табылады.

Dh5a генотипі келесідей:

F- 80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rK-, mK+) phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1

Мұнда, lacZΔM15 M15 сегментінің жоғалғанын көрсетеді lacZ, ал мутантты ақуыз тек $omega$-пептидке ие болады.

TOP10 генотипі келесідей:

F- mcrA Δ (mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 araD139 Δ(ara leu) 7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG

Тағы да сіз байқайсыз lacZΔM15, бұл әлі де пептидтік емес сегмент.

Соңында, сіздің сұрағыңызға. Ортада бастапқы энергия көзі ретінде глюкоза болмаса да және тек X-гал болса да, сіздің қабылдаушы бактерияларыңыздың опероны (менің ойымша, бұл E. coli) функционалды $бета-$галактозидазаны өздігінен шығара алмайды. Сонымен қатар, $alpha$-пептидті кодтайтын векторлық тізбегі бұзылған рекомбинанттар $alpha$-комплементациясын көрсетпейді. Сонда түс реакциясы болмайды! :D

Сілтеме:
1.Invitrogen™ құзыретті жасушаларының генотиптері - TOP10, алынған: https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/life-science/cloning/competent-cells-for-transformation/chemically-competent/top10f-genotypes.html.
2.Invitrogen ™ құзыретті жасушаларының генотиптері - DH5a, алынған: https://www.thermofisher.com/us/kz/home/life-science/cloning/competent-cells-for-transformation/chemically-competent/dh5alpha-genotypes.html.
3. Лэнгли, К.Э .; Вилярехо, М.Р.; Фоулер, А.В.; Заменхоф, П.Дж .; Забин, I. (1975). «Бета-галактозидаза альфа-комплементациясының молекулалық негізі». Америка Құрама Штаттарының Ұлттық Ғылым Академиясының еңбектері. 72 (4): 1254-1257. doi: 10.1073/pnas.72.4.1254. PMC 432510 тегін қол жетімді. PMID 1093175. 4.


Рекомбинанттарды идентификациялау және ампрессивті таңдауды инактивациялау әдісі

рДНҚ қолайлы хост жасушаларына енгізілгеннен кейін рДНҚ молекулаларын алған жасушаларды анықтау өте маңызды. Бұл процесс скрининг немесе іріктеу деп аталады.

Әдетте, іріктеу әдістері антибиотиктерге төзімділік, β-галактозидаза сияқты фермент немесе GFP (Жасыл флуоресцентті ақуыз) сияқты ақуыз экспрессиясы және тағамдық қажеттіліктің тәуелділігі немесе тәуелсіздігі сияқты белгілі бір белгілерді білдіруге немесе көрсетпеуге негізделген. лейцин амин қышқылы ретінде.

РЕКОМБИНАНТТАРДЫ ТҰРАҚ ТАҢДАУ:

Егер қабылдаушы E.coli жасушалары pBR322 плазмидасын алған болса, онда бұл жасушалар құрамында антибиотик ампициллин немесе тетрациклин бар ортада өседі, ал қалыпты E.coli жасушалары антибиотиктермен өледі. Осылайша, тек трансформацияланған жасушалар, бірақ аз ғана, өсу мен бөліну үшін таңдалады.

ИНСЕРЦИОНАЛДЫҚ ТАҢДАУДЫ ИНАКТИВАЛАНДЫРУ ӘДІСІ:

Бұл тікелей таңдаудан гөрі тиімді әдіс. Бұл тәсілде генетикалық белгінің бірі бөгде ДНҚ енгізу арқылы бұзылады.

Антибиотиктерге төзімділік гендер жақсы кірістіру инактивация жүйесі ретінде әрекет етеді.

pBR322 плазмидасында екі антибиотикке төзімділік гені бар, біреуі ампициллинге (ampr гені), екіншісі тетрациклинге (тет r гені). Егер мақсатты ДНҚ Bam HI көмегімен tet r геніне енгізілсе, тетрациклинге төзімділік қасиеті жоғалады. Мұндай рекомбинанттар сынаққа сезімтал болады.

Мұндай рекомбинанттар (құрамында tet r генінде мақсатты ДНҚ бар) тетрациклині бар ортаға өскенде, олар өспейді, себебі олардың тет r гені инактивацияланған. Бірақ олар ампициллинге төзімді, себебі amp r гені функционалды.

Екінші жағынан, өздігінен байланған рекомбинанттар ампициллин мен тетрациклинге төзімділік көрсетеді. Сондықтан олар антибиотиктері бар ортада өседі.

КӨК-АҚ ТАҢДАУ ӘДІСІ:

Рекомбинантты плазмиданың болуын скринингтің тағы бір күшті әдісі көк-ақ таңдау деп аталады.

Бұл әдіс векторда бар lac-Z генін енгізу арқылы инактивациялауға негізделген (мысалы, PUC19).

Бұл ген белсенділігі X-gal деп аталатын түссіз субстратты көк түсті өнімге бөле алатын β-галактозидаза ферментін көрсетеді.

Егер lac-Z гені кірістірудің болуына байланысты инактивацияланса, онда ферменттер экспрессияланбайды. Демек, егер трансформация экспериментінен кейін E.coli хост жасушалары ампициллин мен Х-гал құрамында қатты медиа пластинамен қапталған болса, онда көк түске боялған колониялар трансформацияланған (антибиотиктерге төзімді) жасушалары бар, бірақ кірістіруі жоқ фермент).

Ақ түске боялған колониялар ампициллинге төзімді және кірістірілген рДНҚ -ға ие, сондықтан болашақ эксперимент үшін қолданылатын жасушалар.


ДНҚ -ның рекомбинантты түзілуінің 3 негізгі әдісі

Шетелдік ДНҚ -ның үзілуіне әкелетін рестрикциялық фермент белгілі бір бөліну орнында векторлық ДНҚ -ның біртіндеп үзілуіне әкеледі. Векторлық ДНҚ -ның біріккен ұштары бөтен ДНҚ -ның біріктірілген ұштарымен комплементарлы нуклеотидтер тізбегіне ие. Мұны Eco RI ферментінің мысалында суреттеуге болады, бір тізбекті ұштарында бірдей негіздік тізбектері бар ұқсас жабысқақ ұштар шығарылады.

Векторлық ДНҚ -ның екі ұшы бөгде ДНҚ -ның комплементарлы ұштарына сәйкес келгенде, олардың екеуі H байланысы арқылы ұсталады. Нуклеин қышқылының екі бөлек тізбегі өзара әрекеттесіп, жекелеген тізбектерде бар комплементарлы базалық жұптардың өзара әрекеттесуі арқылы дуплексті молекула түзеді (24.9 -сурет).

Ұшы жабыспайтын шетелдік ДНҚ фрагменті алдымен 3 ′ гидроксилді ұшына гомополимер құйрығын қосу арқылы жабысады. Гомополимерлік құйрық - бұл ұқсас бірнеше нуклеотидтердің тізбегі, мысалы, поли А (AAAAA … ….) Немесе поли Т (ТТТТТ … ..).

Енді ДНҚ фрагменті мен вектордың нуклеотидтік комплементарлы тізбектері ферментінің терминалы дезоксинуклеотидил трансфераза көмегімен ковалентті байланысады (24.10 және 24.11 -суреттер).

ДНҚ лигаза ферменті екі іргелес нуклеотидтердің 3𔃺 H және 5′фосфаты арасындағы фосфодиэфирлік байланыстарды катализдеу арқылы екі ДНҚ молекуласының кесілген ұштарын тығыздайды және тұрақтандырады. Бұл әдістің басты артықшылығы - шетелдік ДНҚ сегментін химер ДНҚ -ның клондалған көшірмелерінен сол ферментті қолдану арқылы қалпына келтіру арқылы оңай алуға болады.

Сонымен қатар, бұл техниканың екі кемшілігі бар:

(i) векторлы ДНҚ-ның немесе бөтен ДНҚ-ның екі ұшы ұшынан-ұшына қосылуы мүмкін және оларды енгізер алдында қайта айналдыруға болады,

(іі) Клонданатын сегменттегі тану орны ыңғайлы жерде болмауы мүмкін. Бұл процесте кірістіруде рекомбинантты молекулаларды сәйкестендіруге мүмкіндік беретін таңдалатын маркер болуы мүмкін. Антибиотикалық маркер жиі қолданылады. Векторсыз хост жасушасы белгілі бір антибиотиктерге ұшыраған кезде өледі, ал векторлы иесі төзімді болғандықтан өмір сүреді.

Химиялық ДНҚ -ның салыстырмалы түрде үлкен бөліктерімен ішек таяқшасының трансформациясын жасушаларды CaCl өңдеу арқылы жеңілдетуге болады.2 оларды өткізгіш ету үшін төмен температурада. Бұл процедурамен трансформацияланатын ДНҚ жасушаға бүтін енеді және иесі бактерия өміршең болып қалады. рДНҚ-ның E.coli-ге енуіне температураны 2-5 минутқа кенеттен 42°С-қа дейін көтеру де ықпал етеді.

Бұл температурада E. coli жасушалық мембранасы макромолекулаларға өткізгіш болады, енді макро-молекулаларға өтетін таяқшаның штамдары пайда болды. Содан кейін трансформацияланған E. coli жасушасының өсуі кезінде плазмиданың рекомбинантты ДНҚ-сы репликацияланады.

Бактериялық жасушаның құрамында бірнеше плазмидалар бар, олардың кейбіреулері рекомбинантты, ал қалғандары плазмидалы көліктер. Мұндай жағдайларда E. coli түрлендірілген жасушаның клонында рекомбинантты ДНҚ молекуласы бар ма, әлде плазмидалы көлік бар ма, анықтау оңай болмауы мүмкін.

Трансформацияланған хостты іріктеу мен оқшаулау олардың антибиотиктерге төзімділігіне, түсінің өзгеруіне немесе басқа да сипаттамаларына байланысты. Әр түрлі векторлардың әр түрлі қасиеттерге ие болуы оларды әр түрлі қосымшаларға жарамды етеді. Кейбір сипаттар симметриялы клондау сайттарын, өлшемін және жоғары көшірме санын қамтуы мүмкін.

Трансформацияланған жасушаларды антибиотиктерге төзімділік негізінде таңдау үшін плазмидті антибиотикке төзімді гендердің экспрессиялануына мүмкіндік беру үшін жасушаларды антибиотиксіз ортада шамамен бір сағат бойы инкубациялау маңызды.

Содан кейін жасушаларды антибиотиктері бар қатты ортаға орналастыруға болады, онда антибиотиктерге төзімділік маркері бар рекомбинантты плазмидтері бар колонияларды таңдау үшін колония түзіледі, ал қарсылық белгісі жоқтар өлтіріледі. Енгізуді анықтаудың бұл процедурасы әдейі инактивация деп аталады.

pBR-322 штаммында екі түрлі антибиотик маркерлері бар - тетрациклинге төзімділікке жауап беретін tet-r гені және ампициллинге төзімділік үшін amp-r гені. Екі геннің бірі ферменттерді рестрикциялау кезінде және бөтен ДНҚ енгізу кезінде белсенді болмайды. Енді жасушалар ампициллині бар ортаға жалатылған болса, барлық тірі колониялар амп-рге төзімді болуы керек.

Рекомбинантты ДНҚ түзілуі: №. 2. Фаг кіріспе немесе трансфекция:

Фагты енгізу - трансфекцияға тең келетін трансфекция процесі, тек бактериялық плазмиданың орнына фаг қолданылады. In vitro қаптамасында вектор рекомбинантты ДНҚ бар фагты бляшкаларды шығару үшін ламбда немесе M 13 фагтарды пайдаланады. Рекомбинантты ДНҚ-ны әртүрлі таңдау әдістері арқылы анықтауға болады. Алғаш рет бактериофаг бөтен ДНҚ -ны E. coli жасушаларына беру үшін қолданылды.

Егер вектор бактериофаг болса, оның бактерия иесінде репликациялануы фаг бөлшектеріне әкеледі, олардың әрқайсысында мақсатты геннің бірдей көшірмесі болады. Фагтық векторлар қолданылған кезде жасушалардың популяциясы вирустармен жұқтырылады және вирустардың репликациясы өздігінен жүреді.

Ақыр соңында, мақсатты гені бар фаг ДНҚ бактериялық хромосомаға енгізіледі, онда ол қалыпты хромосоманың бір бөлігі сияқты қайталанады. Осылайша, бұл векторлар мақсатты гендермен бірге бактерия иесіне енгізіледі. Бұған әдетте ДНҚ лигаза ферментінің көмегімен қол жеткізіледі. Байланыс үшін векторлық ДНҚ мен мақсатты ДНҚ бірдей шектеуші эндонуклеазамен кесілген болуы маңызды.

Рекомбинантты ДНҚ түзілуі: №. 3. Бактериялық емес трансформация:

Бұл процесс трансформацияға ұқсас. Бұл екеуінің айырмашылығы-бактериялық емес трансформацияда E. coli сияқты бактериялар қолданылмайды. Микроинекцияда ДНҚ фрагменті тікелей жасушаның ядросына енгізіледі | түрлендірілген.

Биолистикада иеленуші жасушалар ДНҚ-мен қапталған алтын немесе вольфрам бөлшектері сияқты жоғары жылдамдықтағы микро-снарядтармен бомбаланады (24.12-сурет).


Нәтижелер

Таңдау жүйесі

Экспрессия үшін таңдау үшін біз мақсатты мембраналық ақуызды C – термиялық таңдамалы маркерге біріктіреміз, ол дәріге төзімділік фенотипін береді, осылайша С-терминус цитоплазмада болса, селективті ортада өсу мақсатты мембраналық ақуызды көрсетеді. Мутацияның препаратқа төзімділікті қамтамасыз етудің көптеген әдістері болуы мүмкін, бұл біріккен мембраналық ақуыздың экспрессиясына еш қатысы жоқ, біз екі қабатты таңдау стратегиясын қолданамыз, онда бір мембраналық ақуыз нысаны екі есірткіге төзімділік белгілерінің біріне қосылады. бөлек плазмидалар. Мембраналық ақуыз экспрессиясын жоғарылатпастан екі препаратқа да төзімділік беретін мутация алу ықтималдығы өте төмен болуы керек. pSEL1 және pSEL2 деп аталатын екі таңдау плазмидалары 1(A) суретте көрсетілген.

Плазмидаларды таңдау жүйесі. A: Мақсатты мембрана ақуызының кодтау тізбегі pSEL1 және pSEL2 деп аталатын екі үйлесімді плазмидадағы екі түрлі таңдалатын маркерлермен біріктірілген. Екі плазмида да P пайдаланадыЖАМАН промоутер. PSEL1 плазмида р15 репликациясының шығу тегі бар және триметопримге төзімділік беретін таңдамалы белгі ретінде тышқан дигидрофолат редуктазасын (mDHFR) қолданады. PSEL2 плазмидінің таңдаулы маркер ретінде канамицинге төзімділігі (KanRes) бар және репликацияның colE1 шығу тегі бар. B: Жақсартылған мутанттарды таңдау үшін пайдаланылатын екі плазмида жойылады in vivo асқорыту сирек кездесетін геминг эндонуклеаз I-CreI көмегімен. pSEL1 және pSEL2 22bp I-CreI кесу орнын қамтиды. I-CreI тетрациклинге төзімділігі мен репликацияның температураға сезімтал шығу тегі бар pSC101 плазмидасында кодталған және бұл конструкция pCURE деп аталады.

Біз бастапқыда жақсы экспрессияланған мембраналық ақуызды (GlpF) және нашар экспрессияланған мембраналық ақуызды (SPP) шығаратын жасушалардың селективті орталарындағы өсуін салыстыру арқылы жүйені сынадық. 2 -суретте көрсетілгендей, pSEL1 мен pSEL2 -де GlpF бар жасушалар және pSEL1 мен pSEL2 -де SPP сақтайтын жасушалар дәрі -дәрмектерсіз индукциялық индукция кезінде тірі қалды, бұл ақуыздардың ешқайсысының индукциясы жасушалар үшін өлімге әкелмейтінін көрсетеді. Индукциясыз дәрілік препараттарды таңдаған жағдайда құрылымдардың ешқайсысы өмір сүруге мүмкіндік бермеді. Индукциялық жағдайларда және іріктеу болған кезде тек GlpF синтезін білдіретін жасушалар ғана тірі қалады. Осылайша, біздің іріктеу жүйесі мақсатты мембраналық ақуыздың жоғары деңгейін білдіретін жасушалар мен ақуызды аз мөлшерде білдіретін жасушаларды тиімді және таза түрде ажыратады.

Таңдаудың тиімділігі. Жақсы экспрессияланған мембраналық ақуызды, глицеринді жеңілдететін GlpF өндіретін TOP10 жасушалары E. coli, pSEL1 мен pSEL2 -де нашар көрсетілген мембраналық ақуызды, сигнал пептидті пептидазаны (SPP) білдіретін жасушалармен салыстырылды. Археоглобус fulgidus, pSEL1 және pSEL2. Препаратты таңдаған кезде GlpF экспрессивті жасушалар ғана өмір сүре алады.

Таңдалған мутанттарды емдеу

Мутантты селекциядан кейін штаммдардан pSEL1 және pSEL2 селекция жүйесінің плазмидаларын алып тастау қажет. Біз штаммдар мен плазмидаларға қолданған кезде дәстүрлі емдеу әдістері өте тиімсіз екенін анықтадық. Сондықтан біз бұл жұмыс үшін тез және тиімді емдеу әдісін жасадық.

Біздің емдеу әдісінде таңдау кезінде қолданылатын плазмидалар жойылады in vivo сирек кесетін эндонуклеазамен, гомингтік эндонуклеаза I-CreI-мен ас қорыту. 16 1 (А) суретте көрсетілгендей, I-CreI тану орны pSEL1 және pSEL2 енгізілді. Іріктеу плазмидаларын жою үшін I-CreI эндонуклеазаны кодтайтын және репликацияның температураға сезімтал бастауын қамтитын pCURE деп аталатын үшінші плазмидті енгіземіз [ 1(В)-сурет ]. pCURE-дан көрсетілген I-CreI екі pSEL плазмидасын қорытады және pCURE кейіннен жоғары температурада өсу арқылы жойылады. Бұл әдісті қолдана отырып, штаммды тек 2 күнде сенімді түрде емдеуге болады.

Rhomboid-Rv1337 экспрессиясын жақсартатын штаммдарды таңдау

Тиімді іріктеу жүйесімен және жоғары тиімді емдеу жүйесімен біз оқшаулау қабілетін тексердік E. coli мембраналық ақуыздың экспрессиясын жақсартатын мутанттар. Біз MTb альфа-спиральды ішкі мембраналық ақуызды Rv1337, ромбоидты ақуызға бағыттадық, себебі ол батыстан блоттау арқылы анықталатын төмен деңгейде көрсетілген алдыңғы жұмыстан белгілі үлкен ақуыз. Сонымен қатар, rhomboid-Rv1337-де цитоплазмалық C-терминусы бар, ол pSEL1 және pSEL2-де қолданылатын C-терминалды таңдалатын маркер біріктірулерімен таңдау үшін қажет. Rv1337 экспрессиясы жасушаларға улы болып көрінеді, себебі индукциядан кейін жасушаның өсуі күрт төмендейді.

Іріктеу екі кезеңмен жүргізілді. Біріншіден, ромбоид-Rv1337 кодтайтын pSEL1 бар TOP10 жасушалары 2-аминопуриннің негізгі аналогымен (2AP) немесе mutD5 мутаторлық генімен мутагенизацияланды, ал колониялар триметоприм препараты бар ортада өсу қабілеті үшін таңдалды. Екінші қадамда триметопримге төзімді колониялар ромбоид-Rv1337 кодтайтын pSEL2 конструкциясымен біріктірілді және өзгертілді. Екі плазмидтік құрылымды қамтитын жасушалар содан кейін триметоприм де, канамицин де бар ортада таңдалды. Бұл екі сатылы процедураның артықшылығы - плазмидалық трансформация тиімділігінің төмен болуына байланысты мутанттарды жоғалтпай, бірінші сатыда мутагенизацияланған жасушалардың үлкен санын жабуға болады. Байытылған пулды екінші қадамда мақсатты мембрана ақуызының экспрессиясына байланысты шынымен аман қалған жасушаларды оқшаулау үшін таңдауға болады. Триметопримнің бірінші іріктеуінен (100 және#x02013200 μg/мл) 10 000 мутагенизацияланған жасушадан 1-і аман қалды, ал триметоприм таңдалған колониялардың шамамен 1000-нан 1-і екінші сатыдан аман өтіп, екі канамицинде де өсе алды (10 � және #x003bcg/ml) және триметоприм (100� μg/ml).

Біз таңдалған 47 колонияны скринингтен өткіздік, және вестерн блотинг негізінде 17 ромбоид-Rv1337 экспрессиясының жоғарылауын көрсетті. Біз ақуыз өндірісінің ұлғаюын көрсететін тәуелсіз мутагенизацияланған мәдениеттерден бес клонды таңдадық және біз оларды жоғарыда сипатталған әдісті қолдана отырып, селекциялық плазмидалардан емдедік. Біз бұл штамдарды EXP-Rv1337-1, EXP-Rv1337-2, EXP-Rv1337-3, EXP-Rv1337-4 және EXP-Rv1337-5 деп атаймыз.

Өрнек нәтижелерін тексеру үшін біз емделген мутанттарды pSEL1 және pSEL2 кодтайтын rhomboid-Rv1337 көмегімен қайта түрлендірдік. Таңдалған, емделген және қайта өзгертілген бес мутанттағы экспрессияның ұлғаюы 3-суретте көрсетілген. 3 (А) суретте көрсетілген батыс блоттың сапалық зерттеуі мембраналық ақуыздың мақсатты өндірісінің айқын жоғарылауын көрсетеді. Бұл өсім жолақтарға қосылған ақуыз стандартының белгілі мөлшерлерінің қарқындылығымен салыстыру арқылы сандық түрде анықталды. 3(B)-суретте көрсетілгендей, таңдалған штаммдар ромбоидті-Rv1337 біріктірулерінің экспрессиясын 75 есеге дейін жақсартты.

Таңдалған EXP мутанттарындағы MTb rhomboid-Rv1337 экспрессиясының жоғарылауы. A: N-терминалы 6 × үшін арнайы антиденені қолданатын батыс блота жабайы типтегі pSEL1 және pSEL2 және 5 EXP мутантты штаммында көрсетілген, rhomboid-Rv1337 мембрана ақуызының тегіне жатады. PSEL1 өрнегі әдетте pSEL2 -ге қарағанда төмен, себебі оның көшірме нөмірі аз. Үлгілер OD негізінде қалыпқа келтірілді600. Әрбір гельге экспрессияның ұлғаюын сандық анықтау үшін ақуыз концентрациясының стандарты (1000 нг-тан 3,9 нг тазартылған 6×His-белгіленген биотин лигазасының екі еселенген сұйылту сериясы) жүктелді. B: PSEL1 және pSEL2-де ромбоид-Rv1337 экспрессиясының еселенуі. Бүктеменің ұлғаюы денситометрия мен ақуыз концентрациясының стандарттарымен салыстыру арқылы анықталды. Барлық гистограммалар үшін үш сынақта қатпарлардың ұлғаюы орташаланады және стандартты ауытқу хабарланады.

Таңдалатын маркерге қосылмаған өрнек

Біздің жалпы іріктеу жүйеміз мақсатты ақуызды біріктіру серіктесіне бекітуді талап ететіндіктен, белок маркер ақуызы қосылмай экспрессияланған кезде мутациялардың тиімді болғанын тексергіміз келді. 4-суретте таңдалатын маркерлерге біріктірілген немесе қосылмаған ромбоид-Rv1337 өрнегі көрсетілген. Жабайы түр және барлық мутантты штаммдар үшін синтезі бар өрнек деңгейлері біріктірусіз өрнектен анық төмен болды (4-суретті қараңыз). Осыған қарамастан, EXP штамдары ақуызға маркермен қосылмағанына қарамастан жабайы түрмен салыстырғанда ромбоид-Rv1337 экспрессиясын жақсартты.

Таңдалатын маркерге қосылмай өрнек өнімділігі. Rhomboid-Rv1337 pSEL1 және pSEL2 екеуінде де біріктіру ретінде немесе pBAD/HisA және pBAD/HisA/p15A екеуінде біріктірусіз көрсетілді. Салыстырмалы масса бірліктері (RMU) - бұл ерікті түрде 1,0 -ге белгіленген жабайы түрге қатысты көрсетілген мембраналық ақуыздың мөлшері. RMUs N-terminal 6 ×His ромбоид-Rv1337 тегіне бағытталған батыс блоттарды талдау және ақуыз концентрациясының стандартымен салыстыру арқылы анықталды.

T7 промоторымен таңдалған штамдардың өнімділігі

Бізге мутантты эффектілер біздің іріктеу процесінде қолданған арабинозды промотор жүйесіне тән пе, әлде жалпы алғанда тиімді ме, соны білуге ​​қызығушылық танытты. Мысалы, C41 және C43 эффектілері T7 промоутеріне тән екені анықталды. 7 Сондықтан біз T7 РНҚ полимеразасын енгізу үшін барлық штаммдарды � көмегімен лизогенизацияладық және мутанттарды T7 промотор жүйесінде тиімділікке сынадық. 5-суретте көрсетілгендей, барлық мутанттар T7 промоторының артындағы Rv1337 экспрессиясын төрт есеге дейін жақсартты. Осылайша, мутанттарда байқалған жақсартылған экспресс промоутердің кез келген түріне мүлдем тән емес, дегенмен EXP-Rv1337-5 арабинозды промоутерден әсер ету үшін тиімдірек болып көрінеді.

T7 промоутерімен сөйлесу. Штамдар T7 промоторы арқылы канамицинге төзімділікке біріктірілген ромбоидты-Rv1337 экспрессиялау қабілетіне сыналған. Т7 полимеразасы жабайы түрдегі штаммға және мутанттардың әрқайсысына λ-DE3 көмегімен лизогенизация арқылы енгізілді. Экспрессияның ұлғаюы әрбір мембраналық ақуыздың N-терминалы 6 ×His тегіне бағытталған батыс блоттарды талдау арқылы анықталды.

EXP мутанттары ақуызды мембранаға жеткізеді

Біз іріктеу әдісі енгізуші денелерден гөрі мембранаға енгізуді жанама түрде таңдайды деп күттік, өйткені біріктіру серіктесі дәрілік заттарға төзімділік беру үшін бүктелген және белсенді болуы керек. Мутанттардың жоғарылауы мембрананың экспрессиясына сәйкес келетінін бағалау үшін біз дифференциалды центрифугалауды жүргіздік. Әр үлгінің ерімейтін, еритін және мембраналық фракциялары оқшауланған, кейін батыстық блотинг әдісімен талданған. Тазалау кезінде әр түрлі фракцияларға арналған ақуыздар да қосылды: (1) инклюзивті денелерде кездесетін стрептавидин, (2) еритін болып табылатын мальтозаны байланыстыратын ақуыз (МБФ) және (3) GlpF, ақуыздар мембрана. Нәтижелер 6 -суретте көрсетілген. Жабайы типтегі штаммда ромбоид-Rv1337 толығымен дерлік мембранаға экспрессияланды, ерімейтін фракцияда аз мөлшерде ақуыз анықталды. Алайда, мутантты штаммдардың барлығында ромбоид-Rv1337 тек ерімейтін фракцияда анықталатын компоненті жоқ мембранаға экспрессияланған болып шықты. EXP мутанттары ақуыздың инклюзивті денелерге шунттаудан гөрі, ақуызды мембранаға енгізуіне әкеледі, ал шын мәнінде таңдалған мутанттарға енгізу жақсартылған сияқты.

Мембраналық экспрессияны талдау. pSEL1 және pSEL2-де Rv1337 экспрессиясы бар жабайы типті және мутантты штаммдарды фракциялау орындалды. Фракцияның тиімділігін бағалау үшін мембраналық ақуызды білдіретін жасушалары бар лизиске дейін дақылдар өсірілді (E. coli GlpF), еритін ақуыз (MBP) немесе инклюзивті денелерге бағытталған ақуыз (стрептавидин). Әр үлгінің ерімейтін (IB), еритін (Sol) және мембраналық (MF) фракциялары әрбір ақуыздың 6 ×His тегіне бағытталған батыс блоттау арқылы талданды. [Түс фигурасын www.interscience.wiley.com сайтында қол жетімді онлайн шығарылымнан көруге болады.]:

Таңдалған мутанттарды басқа мембраналық ақуыз нысандарына қолдану

Біз ромбоид-Rv1337 экспрессиясын жақсарту үшін таңдағанымызбен, оқшауланған штаммдар басқа мембраналық ақуыздардың экспрессиясын жақсартуы мүмкін. Бұл мүмкіндікті тексеру үшін біз жабайы типтегі және EXP мутантты штаммдарындағы MTB басқа мақсаттарын және әр түрлі түрлерден жасалған бірнеше ромбоидты конструкцияларды білдірдік (I кесте). Rv2835 қоспағанда, индукциядан кейін жасушалардың өсуі күрт төмендегенін байқау негізінде бұл мақсаттардың барлығы жасушалар үшін улы болып көрінеді. 7 -суретте көрсетілгендей, таңдалған мутанттардың бірінде немесе бірнешеуінде бұл нысандардың өрнегін жақсартуға болады. EXP-Rv1337-5 әсіресе тиімді М. jannaschii ромбоидты, D. мелангастер ромб тәрізді және MTb Rv2835, өрнекті шамамен сәйкесінше 10-, 20- және 90 есе жақсартады.

I кесте

EXP мутанттарында сыналған мембраналық протеин мақсаттарының экспрессиясы

МақсатGI нөміріОрганизмБолжамдық функцияМW (кДа)# TM спиральдары
Rv133715,608,477M. туберкулезіРомбоидты отбасының ақуызы25.86
Rv274615,609,883M. туберкулезіPGP синтезі22.14
Rv283515,609,972M. туберкулезABC тасымалдаушысы34.16
Rv011015,607,252M. туберкулезіРомб тәрізді белок26.97
MJR15,669,882М. жаннашиРомб тәрізді белок21.36
Ро 124,655,197D. меланогастерРомбоидты отбасының ақуызы39.37

Мембраналық ақуыздың басқа мақсаттарының экспрессиясының жоғарылауы. Әр түрлі мембраналық ақуыздық мақсаттар EXP мутанттарында rhomboid-Rv1337 көмегімен таңдалды. Экспрессияның еселенуі әрбір мембрана ақуызының 6×His тегінің N-терминалына және ақуыз концентрациясының стандартына бағытталған вестерн дақтарын талдау арқылы анықталды. The Туберкулез микобактериясы (MTb) Rv2746 және Rv2835 мақсаттары pSEL2-де канамицинге төзімділікке біріктіру ретінде көрсетілді. MTb (Rv0110) екінші ромб тәрізді протеаза синтезсіз экспрессияланды. Ромбоидты протеазалар Метанококк jannaschii (MJR) және Drosophila melanogaster (Rho 1) SUMO-ға N-терминалды синтезбен өрнектелген. EXP-Rv1337-5 штамынан MTb Rv2835 экспрессиясының үлкеюінің стандартты ауытқуы 55 құрайды.

Мутанттардың салыстырмалы плазмидалық көшірме саны

Таңдалатын маркерге біріктірілген ромбоидты-Rv1337 экспрессиясы екі емес (көрсетілмеген) бір плазмидадан экспрессияланғанда жақсарғанын анықтадық. Осылайша, экспрессияны арттырудың бір айқын жолы плазмида көшірмелерінің санын азайту болады. Біз EXP мутанттарының көшірме санын бағаладық. 8-суретте көрсетілгендей, барлық мутанттарда EXP –Rv1337 𠄴 қоспағанда, жабайы типті TOP10 штаммымен салыстырылатын плазмидті көшірме нөмірі болды, ол көшірме санын күрт төмендеткенін көрсетті. EXP –Rv1337 𠄴 ішіндегі қысқартылған көшірме саны өрнекті C7 және C43 штаммдары T7 промоутерінің экспрессиясы үшін жасайтын деңгейге дейін баяулатуы мүмкін. 7 , 13

Плазмидтердің көшірме нөмірін талдау. Штаммдар pSEL1 және pSEL2 кодтайтын rhomboid-Rv1337 көмегімен қайта түрлендіріліп, ортаңғы кезеңге дейін өсті. Үлгілер OD негізінде қалыпқа келтірілді600 және ішкі тазарту бақылауы ретінде HindIII қорытылған pUC19 плазмидасымен бірге колонка тазартылды. Содан кейін үлгілер агарозды гельде талданды.


Хост жасушасына рекомбинантты ДНҚ енгізу

Бөтен ДНҚ-ны тасымалдайтын рекомбинантты векторды қолайлы хост жасушасына көшіру қажет. Бұл рекомбинантты векторларды енгізудің бірнеше әдістері және олар вектордың түрі мен хост ұяшығы сияқты бірнеше факторларға байланысты.

Кейбір жиі қолданылатын процедуралар келесідей:

ТРАНСФОРМАЦИЯ:

РДНҚ технологиясында тірі жасушаға рДНҚ енгізудің ең кең тараған әдісі трансформация деп аталады.

Алайда табиғатта көптеген жасушалардың түрлену жиілігі (мысалы, ашытқы мен сүтқоректілер жасушалары) өте аз. Екіншіден, барлық уақытта қабылдаушы жасушалар трансформацияланбайды, өйткені олар оған дайын емес.

Жасушаларда құзыреттілік факторлары дамыған кезде трансформация құбылысы пайда болады.

Трансформацияға әсер ететін кейбір факторлар бар, мысалы, шетелдік ДНҚ молекуласының концентрациясы, хост жасушаларының тығыздығы, температура және т.

Бұл процедурада бактериялық жасушалар қоршаған ортадан ДНҚ алады.

1970 жылы Мендель мен Гюго E.coli жасушалары кальций хлориді (CaCl) ішінде қысқа уақытқа тоқтатылғанда сыртқы ДНҚ -ны алуға қабілетті болатынын анықтады.2) шешім.

ТРАНФЕКЦИЯ:

Трансфекция - бұл бөтен ДНҚ -ны химиялық заттардың әсерінен өсірілген қожайын жасушаларына көшіру.

Зарядталған химиялық заттар, мысалы, катионды липосома, кальций фосфаты DEAE декстран қабылданады және ДНҚ молекулаларымен араласады.

Алушы хост ұяшықтары осы қоспамен қапталған.

ЭЛЕКТРОПОРАЦИЯ:

Рекомбинантты ДНҚ енуіне мүмкіндік беретін қабылдағыш жасуша мембранасында өтпелі микроскопиялық тесіктерді құру үшін электр тогы қолданылады.

МИКРОИНЪЕКЦИЯ:

Экзогенді ДНҚ -ны эукариоттық векторларды қолданбай -ақ жануарлар мен өсімдік жасушаларына тікелей енгізуге болады.

Микроинъекция процедурасында бөтен ДНҚ көруді жақсарту үшін фазалық контрастты микроскоптың астындағы жұқа микро шприцтің көмегімен реципиент жасушаларына тікелей енгізіледі.

Алтынның немесе вольфрамның микроскопиялық бөлшектері қызықтыратын ДНҚ-мен қапталған және бөлшектердің тапаншасына ұқсас құрылғымен жасушаларға бомбаланған. Сондықтан биолитика термині қолданылады.

Ескерту: Шетелдік гендерді енгізудің тағы бір әдісі - табиғи генетикалық инженер Agrobacterium tumefaciens.


Рекомбинантты ДНҚ негіздері


Сонымен рДНҚ дегеніміз не?
Бұл өте жақсы сұрақ! rDNA рекомбинантты ДНҚ дегенді білдіреді. Бұрын
Біз & quotr & quot бөліміне кіреміз, біз ДНҚ -ны түсінуіміз керек. Сізбен бірге болғандар
биология ғылымы ДНҚ туралы білетін шығар, бірақ көптеген ChemE білмейді
орта мектептен бастап ДНҚ -ны көрген. ДНҚ – барлық ақпаратты сақтаушы
ағзаны жаңғырту үшін қажет. Барлық ДНҚ тұратын негізден тұрады
қант, фосфат және бір азот негізі. Азоттың төрт негізі бар,
аденин (А), тимин (Т), гуанин (G) және цитозин (С). азот
негіздер жұпта кездеседі, A & amp T және G & amp C жұптасады. Кезектілік

азот негіздерін шексіз орналастыруға болады және олардың құрылымы белгілі

төмендегі суретте көрсетілген әйгілі & quotdouble спираль & quot; Қолданылатын қант

ДНҚ - дезоксирибоза. Төрт азоттық негіз барлық организмдер үшін бірдей. The

әртүрлілікті тудыратын негіздердің реттілігі мен саны. ДНҚ жоқ

шын мәнінде ағзаны жасайды, ол тек ақуыздарды жасайды. ДНҚ транскрипцияланады

мРНҚ-ға және мРНҚ белокқа ауысады, содан кейін ақуыз түзеді

ағза. ДНҚ тізбегін өзгерту арқылы белоктың болу тәсілі

қалыптасқан өзгерістер. Бұл басқа ақуызға немесе белсенді емес ақуызға әкеледі.

Енді біз ДНҚ дегеннің не екенін білсек, рекомбинант осы жерде енеді.
Рекомбинантты ДНҚ – бір ДНҚ бөлігін алудың жалпы атауы, және
және оны басқа ДНҚ тізбегімен біріктіру. Осылайша, рекомбинантты атау!
Рекомбинантты ДНҚ кейде & quotchimera & quot; деп аталады
ДНҚ -ның әр түрлі тізбектері, ғалымдар ДНҚ -ның жаңа тізбегін құруға қабілетті.
Ең көп таралған рекомбинантты процесс екі ДНҚ -ны біріктіруді қамтиды
әр түрлі организмдер.

Рекомбинантты ДНҚ қалай жасалады?
Рекомбинантты ДНҚ жасалатын үш түрлі әдіс бар. Олар
Трансформация, фагты енгізу және бактериялық емес түрлендіру. Әрқайсысы
төменде бөлек сипатталған.

Трансформация
Трансформациядағы бірінші қадам - ​​енгізілетін ДНҚ бөлігін таңдау
векторға айналдырады. Екінші қадам - ​​бұл ДНҚ бөлігін шектеумен кесу
ферментті енгізеді, содан кейін ДНҚ лигазасы бар векторға ДНҚ кірістіруін байлайды. Кірістіруде таңдау мүмкіндігі бар
рекомбинантты молекулаларды анықтауға мүмкіндік беретін маркер. Антибиотик
маркер жиі пайдаланылады, сондықтан векторы жоқ негізгі жасуша белгілі бір әсерге ұшыраған кезде өледі
антибиотик, ал векторы бар хост тірі болады, себебі ол төзімді.

Вектор трансформация деп аталатын процесс кезінде негізгі ұяшыққа енгізіледі. Бір
ықтимал хост жасушасының мысалы - E. Coli. Қабылдаушы жасушалар арнайы болуы керек
бөгде ДНҚ қабылдауға дайын.

Таңдалатын маркерлер антибиотиктерге төзімділік, түс өзгерістері немесе басқалар болуы мүмкін
түрлендірілген хосттарды трансформацияланбаған хосттардан ажырата алатын ерекшелігі.
Әртүрлі векторлар оларды басқаларға қолайлы ету үшін әртүрлі қасиеттерге ие
қолданбалар. Кейбір қасиеттер симметриялы клондау сайттарын, өлшемін және қамтуы мүмкін
жоғары көшірме саны.

Бактериялық емес трансформация
Бұл жоғарыда сипатталған Трансформацияға өте ұқсас процесс. The
екеуінің арасындағы айырмашылық тек бактериялық емес E. Coli сияқты бактерияларды қолданбайды
хост үшін.

Микроинжекция кезінде ДНҚ тікелей жасушаның ядросына енгізіледі
түрлендірілген. Биолистикада хост жасушалары жоғары жылдамдықпен бомбаланады
қапталған алтын немесе вольфрам бөлшектері сияқты микрожобалар
ДНҚ -мен.

Фаг Кіріспе
Фагтарды енгізу – трансфекция процесі, ол трансформацияға тең,
бактериялардың орнына фаг қолданылады. Вектордың in vitro қаптамасы қолданылады.
Бұл ламбда немесе MI3 фагтарын қолданып, құрамында рекомбинанттары бар фаг тақталарын шығарады.
Жасалған рекомбинанттарды айырмашылықтар арқылы анықтауға болады
әр түрлі іріктеу әдістерін қолданатын рекомбинанттар мен рекомбинанттар.


RDNA қалай жұмыс істейді?
Рекомбинантты ДНҚ қабылдаушы жасуша рекомбинантты гендердің ақуызын шығарғанда жұмыс істейді.

Рекомбинантты ақуыздың едәуір мөлшері экспрессия болмаса, иесі шығармайды
факторлар қосылады. Ақуыздың экспрессиясы қоршаған генге байланысты
транскрипция мен аудармаға арналған нұсқауларды қамтамасыз ететін сигналдар жинағы
жасуша бойынша геннің. Бұл сигналдарға промотор, рибосоманың байланысуы жатады
сайт және терминатор. Шетелдік ДНҚ енгізілген экспрессия векторлары,
бұл сигналдарды қамтиды. Сигналдар түрлерге тән. E. Coli жағдайында бұлар

сигналдар E. Coli сигналдары болуы керек, өйткені E. Coli сигналдарды түсінбейді

адамдық промоторлар мен терминаторлар.

Егер генде интрондар болса немесе әрекет ететін сигналдар болса, проблемалар туындайды
бактериялық иесінің терминаторлары ретінде. Бұл мерзімінен бұрын тоқтатылуға және рекомбинантқа әкеледі
ақуыз дұрыс өңделмеуі, дұрыс бүктелмеуі немесе тіпті деградациялануы мүмкін.

Эукариоттық жүйелерде рекомбинантты ақуыздардың өндірілуі әдетте жүреді
ашытқы мен жіп тәрізді саңырауқұлақтар. Жануарлар жасушаларын пайдалану фактіге байланысты қиын
Бұл көптеген бактериялардан айырмашылығы берік тірек бетіне мұқтаж және күрделі өсуге ие
қажеттіліктер. Алайда, кейбір белоктар бактерияда түзілу үшін тым күрделі,

сондықтан эукариоттық жасушаларды пайдалану керек.


РДНҚ неге маңызды?
Рекомбинантты ДНҚ соңғы бірнеше жылда маңыздылыққа ие болды және
рекомбинантты ДНҚ 21 ғасырда генетикалық тұрғыдан маңыздырақ болады

Аурулар көбейіп, егістік көлемі қысқарады. Төменде

рекомбинантты ДНҚ әсер ететін кейбір аймақтар.

  • Жақсы дақылдар (құрғақшылық пен ыстыққа төзімділік)
  • Рекомбинантты вакциналар (В гепатиті)
  • Орақ жасушалы анемияның алдын алу және емдеу
  • Цистикалық фиброздың алдын алу және емдеу
  • Қан ұю факторларының өндірісі
  • Инсулин өндірісі
  • Рекомбинантты фармацевтикалық препараттарды өндіру
  • Инсектицидтерді өздері шығаратын өсімдіктер
  • Ұрық сызығы және соматикалық гендік терапия


Болашақта не күтіп тұр?
Енді біз рекомбинантты ДНҚ-ның негізін түсіндік, бұл
рекомбинантты ДНҚ болашаққа қалай әсер ететінін қарастыратын уақыт. Қай салалар
және өрістер rDNA арқылы қалыптастырылады? рДНҚ денсаулыққа қалай әсер етеді және
RPI студенттерінің келесі ұрпақтағы өмір салты? Біздің сайтқа басыңыз
Жауапты білу үшін rDNA әсер ету туралы мәлімдеме!

Поп -викторина уақыты!
Сізге рекомбинантты ДНҚ -ны қаншалықты жақсы білетіндігіңізді анықтау үшін біз
Сізге тіпті а
аға ChemE жасай алуы керек. Көз жеткізіңіз және қосымшаны қараңыз
ақпарат төменде берілген, себебі бұл сұрақтар күрделі болуы мүмкін! Барлық
сұрақтарға жауап беру үшін қажетті ақпаратты осы бетте табуға болады,
немесе байланысты беттер. Дайын болған кезде төменге басыңыз.

Қосымша Ақпарат
Жоғарыда келтірілген ақпарат кереметтерге кіріспе ғана
Рекомбинантты ДНҚ. Білімге деген тілегіңізді орындау үшін Мэтт және
Бет интернетті терең білімі бар ең жақсы веб-сайттарды іздеді
рДНҚ туралы. Төмендегі сілтемелерді және қысқаша ақпаратты таба аласыз
бетте сипатталғандардың сипаттамасы. Ләззат алыңыз!

Жиі қолданылатын редрикциялық эндонуклеазаларды тану реттілігі.

Эукариоттар мен бактериялар генінен синтезделген адам белоктары туралы ақпарат.

Өсімдіктермен жасалған гендік жобалар туралы ақпарат.

Information about gene subtraction projects that have been done with plants.

Basic information about what DNA is

А SHOCKWAVE application illustrating DNA replication

A video that illustrates protein synthesis

Information about how gene splicing differs from conventional agriculture

Information about the merits of agricultural gene splicing

Information about treating genetic diseases in the womb

A Question and Answer about gene therapy

The Recombinant DNA chapter of an online textbook

A Recombinant DNA problem set and tutorial

The NIH Guidelines for research involving Recombinant DNA

An online textbook covering the protocols for Recombinant DNA

A clearinghouse of links concerning Clinical Trials

Information about gene therapy for human patients

Recombinant DNA and the synthesis of human insulin

A repository of information concerning Medical Biotechnology

Created by Matthew Kuure-Kinsey and Beth McCooey for Biochemical Engineering Fall 2000


TOOLS OF RECOMBINANT DNA TECHNOLOGY

Following are the key tools of recombinant DNA technology:
Restriction enzymes, polymerase enzymes, ligases, vectors, and the host organism

Restriction Enzymes

The enzymes which cut the DNA are called restriction enzymes. Hind II was the first restriction endonuclease to be discovered. Hind II always cuts DNA molecules at a particular point by recognizing a specific sequence of six base pairs. This specific base sequence is called the recognition sequence for Hind II. Today, more than 900 restriction enzymes are known. Different enzymes recognize different sequences.

Exonuclease: These enzymes remove nucleotides from the ends of the DNA.

Endonuclease: These enzymes make cuts at specific positions within the DNA.

Nomenclature of Restriction Enzymes: Each enzyme is named after the bacterium from which it was isolated. The naming system is based on bacterial genus, species and strain. Following table shows the name of EcoRI restriction enzyme and the implied naming system.

Derivation of EcoRI name
Қысқарған сөзМағынасыСипаттама
ЕІшек ауруыGenus
cocoliтүрлер
RRY 13Strain
IFirst identifiedOrder of identification

Palindromes: A group of letters that form the same word when read both forward and backward is called a palindrome. Restriction enzyme cut at the palindrome sequence in a DNA. Following is an example of palindrome sequence:

5' —— GAATTC —— 3'
3' —— CTTAAG —— 5'

Restriction enzymes cut the strand of DNA a little away from the centre of the palindrome sites, but between the same two bases on the opposite strands. This leaves single stranded portions at the ends. There are overhanging stretches called sticky ends on each strand. These are named so because they form hydrogen bonds with their complementary cut counterparts. This stickiness of the ends facilitates the action of the enzyme DNA ligase.

When cut by the same restriction enzyme, the resultant DNA fragments have the same kind of ‘sticky-ends’ and, these can be joined together (end-to-end) using DNA ligases.

Unless, the vector and the source DNA are cut with the same restriction enzyme, the recombinant vector molecule cannot be created.

Separation and isolation of DNA fragments: The cutting of DNA by restriction endonucleases results in the fragmentes of DNA. These fragments can be separated by a technique known as gel electrophoresis. Since DNA fragments are negatively charged molecules they can be separated by forcing them to move towards the anode under an electric field through a medium/matrix.

Agarose is the most commonly used matrix. It is a natural polymer which is extracted from sea weeds.

The DNA fragments separate according to their size through sieving effect provided by agarose gel. So, smaller fragments move farther than longer fragments.

The separated DNA fragments are stained with ethidium bromide. After that, exposure to UV radiation makes them visible. The DNA fragments appear as bright orange bands in this case.

The separated bands of DNA are cut out from agarose gel and extracted constructing recombinant DNA by joining them with cloning vectors.

Cloning Vectors

A small piece of DNA taken from a virus, a plasmid or the cell of a higher organism, that can be stably maintained in an organism, and into which a foreign DNA fragment can be inserted for cloning purposes is called a cloning vector.

The following are the features that are required to facilitate cloning into a vector.

  1. Origin of replication (ori): The sequence from where replication starts in the DNA is called the Origin of Replication (ori). When a piece of DNA is linked to this sequence, it can be made to replicate within the host cell. If you want to recover many copies of the target DNA, it should be cloned in a vector whose ‘ori’ supports high copy number.
  2. Selectable marker: These are the substances which help in identifying and eliminating non-transformants and selectively permitting the growth of the transformants. Generally, the genes which encode resistance to antibiotics (ampicillin, chloramphenicol, tetracycline, kanamycin, etc.) are considered useful selectable markers for E. coli. Қалыпты E. coli cells do not carry resistance against any of these antibiotics.
  3. Cloning sites: All cloning vectors have recognition sites for the commonly used restriction enzymes. But to link the alien DNA, the vector needs to have very few, preferably single, recognition site. Ligation of alien DNA is carried out at a restriction site present in one of the two antibiotic resistance genes.

Example: A foreign DNA can be ligated at the Bam H I site of tetracycline resistance gene in the vector pBR322. The recombinant plasmids will lose tetracycline resistance due to insertion of foreign DNA but they can still be selected out from non-recombinant ones by plating the tranformants on ampicillin containing medium.

After that, the transformants (growing on ampicillin containing medium) are transferred on a medium which contains tetracycline.

The recombinant will grow in ampicillin containing medium but not in tetracycline containing medium.

But non-recombinants will grow in medium containing both the antibiotics. In this case, one antibiotic resistance gene helps in selecting the transformants, while other antibiotic resistance gene gets inactivated due to insertion of alien DNA. Thus, it helps in selection of recombinants.

Ескерту: Selection of recombinants due to inactivation of antibiotics requires simultaneous plating on two plates having different antibiotics. Hence, it is a cumbersome process.

Alternate selectable markers have been developed which can differentiate recombinants from non-recombinants on the basis of their ability to produce color in the presence of chromogenic substrate.

In this case, a recombinant DNA is inserted within the coding sequence of an enzyme, α-galactosidase. This results into inactivation of the enzyme. (It is called insertional inactivation).

The presence of chromogenic substrate gives blue-colored colonies if plasmid in bacteria does not have an insert.

Presence of insert results into insertional inactivation of α-galactosidase, and no color is produced by the colonies. Such colonies are identified as recombinant colonies.

Vectors for cloning genes in plants and animals: Bacteria and viruses have been transferring their genes to transform eukaryotic cells in order to force them to do what the bacteria or viruses want. Now, these tools of pathogens can be transformed into useful vectors for delivering beneficial genes to humans. For example the tumor inducing (Ti) plasmid of Agrobacterium tumifaciens has now been modified into a cloning vector which is no more pathogenic to the plants. This vector can now be utilized to transfer beneficial genes into many plants.

Competent Host (For Transformation with Recombinant DNA)

We know that DNA is a hydrophilic molecule. Hence, it cannot pass through cell membranes. In order to force bacteria to take up the plasmid, the bacterial cell needs to be ‘competent’’ to take up DNA. This is done by treating the bacterial cells with a specific concentration of a divalent cation, e.g. calcium. It increases the efficiency with which DNA enters the bacterium through pores in its cell wall.

Recombinant DNA can then be forced into such cells in following steps:

  • Cells along with recombinant DNA are incubated on ice.
  • They are then briefly placed at 42°C (heat shock).
  • Then they are put back on ice.

Micro-injection: In this method, recombinant DNA is directly injected into the nucleus of an animal cell.

Gene Gun: This method is applied for plant cells. In this method, cells are bombarded with high velocity micro-particles of gold or tungsten coated with DNA.

Disarmed Pathogen: When the disarmed pathogen infects the cell, it transfers the recombinant DNA into host.


Yeast protein expression systems – Saccharomyces cerevisiae

The highly developed genetic system, ease of use, reduced time input and costs have made S. cerevisiae an attractive organism for the expression and production of recombinant proteins. Yeasts are able to carry specifically designed plasmids and this ability is valuable in a recombinant protein expression system. The plasmid used consists of restriction sites that can be used to insert the gene sequence of interest. Transformation of yeasts with the plasmid produces the desired protein and can be appropriately scaled up.

3 -сурет. Yeast protein expression system – Saccharomyces cerevisiae

Expression of protein using S. cerevisiae involves the following steps:

  • use of competent E. coli cells to take up DNA sequence of interest (Catalog Numbers CMC0001, CMC0004, CMC0014)
  • integration of the DNA into bacterial genome or circularization of the DNA sequence to exist as a plasmid
  • selection of transformed E. coli using a selection marker (antibiotic) (Catalog Numbers L5667, L0168, L0543, L0418, L8795)
  • expansion of selected E. coli in appropriate culture media, such as classic LB options (product numbers L2542, L3522, L3147) or EnPresso™ Y Defined Media (product number Y22001)
  • isolation of DNA or plasmid
  • transformation into yeast (yeast transformation kit, Catalog Number YEAST1)
  • screen the transformants for integration of DNA into yeast chromosome
  • selection and scaling-up of high expressing yeast clones in appropriate culture media (Catalog Numbers Y1375, Y1501, Y1751, Y2001, Y1376, Y0750)
  • isolation and purification of intracellular/secreted proteins

Мүмкіндіктер

  • low cost culture methods
  • suitable for both intracellular and secreted proteins
  • provides eukaryotic post-translational glycosylation of proteins although it results in high

Community Surveys

William L. Thompson , . Charles Gowan , in Monitoring Vertebrate Populations , 1998

Plot Selection Method

The random selection method used for choosing which plots to survey could have a significant impact on the chance of encountering a given species. One could stratify an area by species’ habitat affiliations ( Fig. 4.3 ). However, this would require prior life history information, or at least historical records of occurrence, for the species in question. Species would have to be grouped by habitat preference with different sampling frames constructed by group. This would obviously remove the possibility of collecting distributional data in a single survey.

Figure 4.3 . Two strata, separated by a thick line, hypothetically based on a habitat affiliation for a given species. The probability of selecting a plot containing an individual of a given species is much greater in the smaller stratum (preferred habitat) than for the larger stratum.

The advantage of using stratified random sampling to increase the chance of selecting a plot that contains a member of a target species is shown in ( Fig. 4.3 .) We use the simplest case of a single species to demonstrate this advantage, but the same principle applies for groups of species as well. Note that there are 50 empty plots out of 100 in the sampling frame so that without stratification the chance of picking an occupied plot would be, on average, 1 in 2 or 50%. However, stratifying by habitat yields one stratum in which 20 of 25 (80%) of the plots contain at least one individual and another stratum that has only 30 of 75 (40%) plots that are occupied. Sampling effort then can be concentrated in the small stratum to increase the probability of selecting occupied units.

Stratification of the sampling frame by some attribute associated with spatial clustering of species may be effective when applied to a single species, but probably cannot be implemented for more than several related species. That is, the greater the number of target species, the greater the possible number of different cluster patterns. One species may be clustered in riparian habitat whereas another may be aggregated in grasslands. There is simply no way to have one optimum and worthwhile stratification design that can account for the many different patterns of distribution the aggregation of a species is a species trait, and cannot be accommodated for all the different species with a single stratification design or plot size. Thus, one ends up with a suboptimal allocation of effort for all species. That is, the reasonable approach under these circumstances is to select a simple random sample of the entire sampling frame, which means there is no stratification and no optimum allocation of sampling effort.


Қорытынды

The D4R dominant host range selection represents a quick and stringent method to generate recombinant MVA viruses. The method represents an alternative to current selection techniques that rely on additional marker genes, chemical agents, and multiple rounds of plaque purification. In contrast to traditional homologous recombination protocols and to the recently described BAC cloning procedure, the less laborious D4R-dominant host range selection approach by principle does not require foreign marker genes, resulting in MVA recombinants that are free from marker gene sequences and that thus meet the state-of-the-art requirements for use as live vaccines.


Бейнені қараңыз: Хосты редкие и самые красивые и другое август 2017 (Ақпан 2023).