Ақпарат

Репликация кезіндегі ДНҚ топологиясы - Биология

Репликация кезіндегі ДНҚ топологиясы - Биология


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Полимераза әр үлгіні оқып, жаңа комплементті тізбекті синтездеу үшін ата -аналық ДНҚ спиралінің екі тізбегі ашылуы керек. Бұл бөлінуді катализдейтін ферменттер деп аталады ДНҚ спиральдары. Олардың белсенділігін биохимиялық жолмен дуплексті ДНҚ-ны бір тізбекті ДНҚ-ға айналдыру арқылы өлшеуге болады.

ДНҚ спиральдары да екінші белсенділікке ие. Олар бір полярлы ДНҚ бойымен қозғала алады. Қозғалыстың полярлығын an көмегімен өлшеуге болады жылы vitroекі ерекше қысқа, таңбаланған жіптер ұзын жіптің екі ұшымен дуплексті болатын субстрат көмегімен талдау (5.22 -сурет). Геликаза бастапқыда субстрат ДНҚ-ның бір тізбекті бөлігіне байланысады және дуплексті аймаққа жеткенше оның бойымен жүреді, осы кезде ол дуплекстің ағылуын катализдейді. Қысқа, таңбаланған жіптердің біреуі немесе екіншісі, бір жолақты аймақ бойымен бақылау бағытына байланысты, вертолигамен ығыстырылады. 5.22А суреттегі А молекуласының орын ауыстыруы бұл геликазаның (DnaB) біржіпті ДНҚ бойымен 5 ' - 3' бағытта қозғалатынын көрсетеді, оның ішінде дуплексті бөлігіне жетеді. А фрагменті геликаза белсенділігімен ығыстырылды.

А.Б.

5.22-сурет: Бір аймақтағы геликазаны бақылау бағыты бойынша талдау.

5.22В суретте PriA деп аталатын спиралды бақылау талдауының нәтижелері көрсетілген. Ол бір тізбекті ДНҚ бойымен қай бағытта жүреді?

Жеті вертолет оқшауланған E. coli. Олардың барлығы үшін ерекше функция анықталмаған, сонымен қатар репликациялық айырда қандай әрекет ететіні толық анықталмаған. Негізгі спиральдар E. coliхромосомалық репликация PriA және DnaB болып көрінеді, олар праймерлерді жасау үшін машиналарда да қолданылады. 7-тарауда қарастырылатын қосымша геликаза – ДНҚ репарациясында қолданылатын геликаза II немесе UvrD.

Ата-аналық ДНҚ молекуласының екі тізбегі бөлінгеннен кейін олардың қайта жаңаруына жол бермеу керек. ДНҚ-ны бір тізбекті байланыстыратын ақуызмен қаптауSSB) мұны жасайды (5.21-сурет).SSB бастап E. coli төрт бірдей мономерлі суббірліктер кешенінен тұратын гомотетрамер. Мономерлі ақуыз суббірліктер 74 кДа; олар арқылы кодталады ссбген Мутанттар ссбДНҚ синтезін дереу тоқтатады, сондықтан олар созылу үшін қажет. Функцияны жоғалтқан мұндай мутанттар ДНҚ рекомбинациясында да ақаулы. SSB бір тізбекті ДНҚ-мен бірлесіп байланысады, және бұл формада бір тізбекті ДНҚ өзінің толықтырушы тізбегіне қосыла алмайды. Эукариоттарда кездесетін ақуыз - репликация факторы немесе RFA. Бұл гетеротример, яғни үш түрлі бөліктен тұрады.

ДНҚ тізбектерінің геликазалармен ашылуы ДНҚ жалпы топологиясына әсер етеді (5.23 -сурет). Мысалы, байланыстырушы нөмір өзгертілмейінше, шешілген әрбір 10 негізгі жұп үшін (DT=-1), бұралудың компенсаторлық артуы (DW=+1) болады. 2-тарауда бұрын талқыланғандай, байланыстыру санын өзгерте алатын ферменттер топоизомеразалар болып табылады. Бұл ферменттер топологиялық штаммды жеңілдету үшін репликация кезінде айналмалы рөл атқарады. In E. coli, бұл бұрылыс гираза ферменті болып табылады (5.3-кесте, 5.23-сурет). Бұл II топоизомераза АТФ энергиясын ДНҚ молекуласында қос тізбекті үзіліс жасау үшін қолданады, ДНҚ-ның басқа бөлігін үзілістен өткізеді және үзілісті қайта жібереді. Өту бағыты теріс спиральдық бұрылыс енгізілетіндей, сол арқылы ДНҚ ашылған кезде пайда болатын W оң өзгерісіне қарсы тұрады. Наладикс қышқылы немесе кумариндер сияқты гиразаны тежейтін қосылыстар да ДНҚ синтезін тежейді, бұл процессте гиразаның маңызды рөлін көрсетеді. Сүтқоректілердің жасушаларында топоизомераза I немесе топоизомераза II айналдырғыш ретінде қолданылуы мүмкін. Топоизомераза I супер ширатылған ДНҚ-да бір тізбекті ник жасайды, осылайша супер орамдардың босаңсуына мүмкіндік береді.

5.23-сурет. ДНҚ топологиясының репликация кезіндегі өзгерістері. ДНҚ геликазаларымен катализденетін АТФ-қа тәуелді бұралмаған (теріс ДТ) шиыршықтың компенсаторлық өзгерісін тудырады (оң DW), ол ДНҚ-гираза сияқты топоизомеразаның II әсерінен босатылады. Гираза АТФ-тәуелді, үш сатылы реакцияны катализдейді, ДНҚ-ның екі тізбегін ыдыратады, ДНҚ дуплексінің басқа бөлігін үзіліс арқылы өткізеді және үзілген жерді қайтадан тығыздайды. Гиразаның әрекеті оң DW -ді геликаза әсерінен теңестіру үшін теріс DW жасайды. X және Y ДНҚ молекуласының екі түрлі аймағын белгілейді. Сұр көрсеткі үзіліс арқылы дуплексті қозғалыстың бағытын көрсетеді. Gyrase - тетрамер және төрт қызғылт шар түрінде көрсетілген.


AP Biology 6.2 - Репликация

Бұл бөлімде біз ДНҚ -ның репликациялану жолына назар аударамыз – Жердегі тіршілік үшін маңызды процесс. Біз ДНҚ құрылымын түсінгеннен кейін ұсынылған ДНҚ репликациясының әртүрлі теорияларын қарастырудан бастаймыз: консервативті репликация, жартылай консервативті репликация және дисперсиялық репликация. Меселсон-Сталь эксперименті әйгілі түрде жартылай консервативті репликацияның ең дәл теория екенін анықтады. Осыдан кейін біз ДНҚ репликациясы процесіне енеміз. Біз екі тізбекті ДНҚ молекуласын ашатын геликаза мен топоизомераза ферменттерінен бастаймыз. Бірінші тесттен кейін біз ДНҚ-полимеразаның шаблон тізбегінен жаңа ДНҚ тізбегін құру үшін қалай жұмыс істейтінін көреміз. Соңында біз ДНҚ репликациясының соңғы қадамдарын көреміз, бұл процесті аяқтайды және ДНҚ репликациясының РНҚ транскрипциясына өте ұқсас екенін көреміз.


Спикерлер

  • Тіркеу мерзімі
  • 2021 жылдың 30 тамызы
  • Реферат тапсыру мерзімі
  • 20 шілде 2021 ж
  • Таңдалған қатысушылар хабарлама алады
  • 20 тамыз 2021 жыл
  • Төлеу мерзімі
  • 10 қыркүйек 2021 ж
  • СТУДЕНТ/ПОСТДОКТАР 75 евро
  • АКАДЕМИЯЛЫҚ 100 евро
  • ӨНЕРКӘСІП 200 евро

Тіркеуге мыналар кіреді:

Төлем

Төлем 3D Secure жүйесіне қосылады және несие картасы, шот-фактура немесе банктік аударым арқылы жүзеге асырылуы мүмкін.

Таңдау критерийлері

Қатысушылар ғылыми негізде, гендерлік баланс пен географиялық таралуда (кең таралуда) таңдалады.

Анықтамалық нұсқаулар

Авторефераттар тақырыпты, авторларды және аффилиирленгенді қоспағанда, 250 сөзден аспауы керек.

Плакат ерекшеліктері

Постер ең көбі 4 слайдтан тұруы керек. Постер жүргізушілері алдын ала жазылған ең көбі 3 минуттық флеш-сөйлеуді дайындайды.

Саяхат гранттары

Саяхат гранттарының орнына қатысушылар үшін ақы төлеуден бас тарту мүмкін болады. Өтініш берушілерге бұл шараға ақы төлеуден бас тарту үшін бөлек өтініш берудің қажеті жоқ, бірақ егер олар ақылы бас тартуды қарастырғысы келетінін тіркеу парағында көрсетуі керек. Жүлдегерлерді таңдауды ұйымдастырушы тікелей жүргізеді, ол барлық жарамды қатысушыларды хабардар етеді. Қосымша ақпаратты EMBO Travel Grants бетінде алуға болады.

Чилидегі, Үндістандағы, Сингапурдағы және Тайвандағы зертханаларда жұмыс істейтін кез келген ұлттың қатысушылары үшін арнайы төлемнен бас тарту мүмкіндігі бар. Өтініш беру үшін сұранысты растайтын электрондық поштаны кездесуді ұйымдастырушыларға жіберіңіз.

Бала күтімі бойынша жәрдемақы

EMBO курстары мен семинарлары EMBO курстары мен семинарлар қаржыландыратын кез келген жиналысқа қатысқан кезде қатысушылар немесе спикерлер бала күтімі бойынша қосымша шығындарды өтеуге гранттар ұсынады. Қолайлы шығындарға тәрбиешінің немесе бала күтімі мекемесінің ақысы, тәрбиешінің жол ақысы немесе баланы кездесуге апару жолақысы және т.б. кіреді. Грант алу үшін қарастырылатыныңызды қалайтыныңызды тіркеу формасында көрсетіңіз. Сондай-ақ бала күтімі бойынша жәрдемақыны қалай пайдаланғыңыз келетінін сипаттаңыз және сізге қажет соманы көрсетіңіз.


Репликация кезіндегі ДНҚ топологиясы - Биология

Джон Э.Херст (а, б), Лу Кауфман (с), В. Мартин МакКлейн(д) және Яомин Ши(а)

(a) Беркли, Калифорния университетінің химия бөлімі
(b) Құрылымдық биология бөлімі, Лоуренс Беркли ұлттық зертханасы
(c) Иллинойс университетінің математика бөлімі, Чикаго
(d) Уэйн мемлекеттік университетінің химия кафедрасы, Детройт

Реферат

I. Кіріспе

Көбінесе репликацияның белгілі бір бастауында басталғаннан кейін ДНҚ синтезі ДНҚ контурында бір-бірінен алшақ жатқан екі «өсетін шанышқыларда» екі жақты түрде жүреді (1). Жетекші тізбек синтезі үздіксіз және оны ДНҚ полимеразасы орындайды, ал артта қалу РНҚ примазасы, кем дегенде бір қосымша ДНҚ полимеразасы (а) және, мүмкін, РНаза Н қатысатын процесте үзіліссіз репликацияланады, РНҚ праймерлерін ыдыратады, және үзіліссіз синтезделген ДНҚ -ның қысқа бөліктерін (2000 а.к.) біріктіретін ДНҚ лигазасы. Полимеразалық кешендерге ДНҚ дуплексін ашатын геликазаның көмегімен ДНҚ дуплексінің бойымен таралуына және ДНҚ -ның әр полимерлену процесінің процестілігін жоғарылататын «сырғымалы қысқыштармен» көмектеседі (2). Түпнұсқа ДНҚ дуплексі ДНҚ ашылатын «өсетін шанышқыға» берілетіндіктен, әрбір жеке жіп полимераза кешенімен репликацияланады. Бұл қолжазбада геликазаны, жылжымалы қысқыштарды және алынған ДНҚ -ны қамтитын әрбір полимеразды кешен репликациялық шанышқы деп аталады, ал мұндай шанышқылар ДНҚ репликациясы туралы біздің топологиялық ойларымыздың негізі болып табылады.

Екінші сенімді факт - эукариоттық хромосомада бірнеше репликацияның пайда болуы (1). Әрбір бастапқыда екі репликация шанышқысы (1А-суретте көрсетілгендей, қарама-қарсы бағытталған) репликацияны бастаудың белгілі бір орнында жасалады, ол «бастапқы байланыстыру кешені» ORC байланысуымен анықталады деп есептеледі. Репликация кезінде екі шанышқы бір-бірінен ДНҚ контурында таралып, екі жаңа ДНҚ дуплексін жасайды.

Бұл жұмыста біз ақуыз компоненттерінің егжей -тегжейлі құрылымына немесе байланысына қатысты ешқандай болжам жасамаймыз, бұл репликация шанышқыларын анықтайтын немесе біздің талқылауымыз үшін ДНҚ -ның шаблондық тізбектерінің топологиялық тұтастығы туралы болжамнан басқа ешқандай құрылым қажет емес. Репликация алдында ДНҚ дуплексі. Басқалардың репликациясына қатысты ДНҚ топологиясының мәселелері өте құнды қарастырылды. (3) Көбінесе шешілген мәселелер репликацияның іргелес бастауларында басталған конвергациялық репликация шанышқылары арасындағы ата-аналық үлгі дуплексінде де, еншілес дуплексті аймақтарда да репликация процесі арқылы жасалған асқын бұралу немесе бұралу шиеленіс дәрежесіне қатысты. , олар да қолданылған жергілікті үлгінің мәліметтеріне байланысты. Бізді бұл жерде әр 10 негіздік жұп сайын айырдың белсенді айналуымен, таралу (3) кезіндегі диверсиялық репликациялық айырлардың белсенді айналуымен немесе диверсификацияның салыстырмалы айналуымен байланысты туындауы мүмкін жаңадан пайда болған дуплексті шиеленіс мәселесі толғандырады. жұп репликация шанышқылары, жай ғана диффузиядан. 1 -суретте репликацияланатын шанышқылардың салыстырмалы тәуелсіз айналуы туа біткен дуплексті ДНҚ -ның араласуына әкелетіні туралы графикалық мысал келтірілген. Шатасу мәселесі ата-аналық үлгі дуплексіндегі немесе жаңадан пайда болған (жаңа синтезделген) еншілес дуплекстердегі ДНҚ-ның аса бұралуы немесе бұралу шиеленісу мәселесінен бөлек екенін ескеріңіз.

Айырмалы репликациялық шанышқылардың арасында пайда болатын дуплекстердің ықтимал шиеленісуіне жол бермеу үшін біз шанышқылар физикалық байланысты, сондықтан бір -біріне қатысты айнала алмайды деп жорамалдаймыз. Егер репликация тәуелсіз димер шанышқыларына байланысты болса, репликация кезінде екі пайда болған ДНҚ дуплекстерінің сөзсіз шатасуы болады және сегрегация түйіспелерді жою үшін репликация процесінің өзінен тәуелсіз арнайы механизмді қажет етеді. Мүмкін болатын ең қарапайым шиеленіс 1-суретте мультфильмде көрсетілген.

1-сурет. Жіпті шатастырудың ең қарапайым жағдайы. (A) Қатыспайтын іргелес репликация шанышқылары. (B) Айырмалы репликация шанышқылары бір -біріне қатысты бір толық айналу арқылы айналады, бұл қарапайым шатасуды тудырады. (C) Митозда, оралған тоқсанды қыз ДНҚ дуплекстері өтусіз ажырай алмайды.

Сурет мультфильм болып табылады, онда көгілдір сопақ құрылымы жетекші жіппен әрекеттесетін репликациялық шанышқы ақуыздарының бөлігін білдіреді. Керісінше, қызыл дөңгелек құрылым айырдың артта қалған тізбегімен әрекеттесетін репликациялық шанышқы ақуыздарының сол бөлігін көрсетуге арналған. Шанышқы белоктарының осы екі тобының арасындағы физикалық байланыс толығымен ДНҚ арқылы болуы мүмкін немесе репликация шанышқысындағы белоктардың екі класы арасындағы ақуыз-белок әрекеттесуді қамтуы мүмкін. «Шанышқының айналуы» және демек, «жаңадан пайда болатын дуплексті түйісу» мәселесі жергілікті шанышқының құрылымына тәуелсіз, бірақ репликация кезінде ата -аналық шаблондардың топологиялық тұтастығының сақталуы туралы болжамға байланысты. Жаңа туып келе жатқан еншілес дуплекстердің ата-аналық дуплексінде әрекет ететін I класс топоизомеразасы біз айтып отырған топологиялық тұтастықты өзгертпейді. Екінші жағынан, шанышқылардың таралуы кезінде репликациялық шанышқылардың белсенді айналуына байланысты шиеленісті жеңілдететін ІІ класты топоизомеразалық белсенділікпен байланысты жергілікті құрылымды тану (4) болуы мүмкін. Біз мысалды қарапайымдылық үшін және мысал ретінде келтіреміз. Неғұрлым күрделі механизм қарастырылуы мүмкін және ұсынылды, онда бөлшектеу механизмі ата -аналық жіптердің топологиялық тұтастығы туралы болжамды бұзады.

Айырмалы өсіп келе жатқан шанышқыларды физикалық бекіту идеясы бұл авторларға тән емес. Классикалық жұмыста Сундин мен Варшавски (5) келесі мәлімдеме жасайды: «Егер репликация кезінде екі өсіп келе жатқан шанышқылар бір-біріне қатысты айналса, аналық хроматин жіптерінің шатасып кетуі мүмкін. Бұл қиындықты болдырмау үшін біз репликациялық шанышқылар бір -бірімен байланған және екілік кешенге бірегей бағытталған ». Сонымен қатар, Wessel, Schweizer және Stahl (6) SV40 екі бағытты репликациясында мұндай тіркеменің эксперименттік дәлелдерін хабарлады. Бұл жұмыс мұндай гипотезаның дұрыстығын дәлелдей алмайды. Біз бұл жерде осындай гипотеза жасаудың механикалық салдарын қарастырамыз. Барлық тірі жасушаларда жақсы белгіленген ферментативті белсенділіктер бар, олар тиісті жағдайда бір ДНҚ дуплексті екіншісінен өткізе алады (ІІ топтопоизомеразаның белсенділігі) (7). Кішкентай көлемде локализацияланбаған күрделі түйінде әрекет етуші ферменттің құрылымды тануға негізі бар кеңістік болады, бір тізбектің екіншісінен кездейсоқ өтуі түйін түйінін азайту сияқты жоғарылатады (8) . Ажырату түйіннің топологиясы туралы жаһандық білімді талап етеді, бірақ ферменттік жүйелер молекулааралық күштердің қысқа диапазонымен шектелген өте жергілікті көлемде сезініп, әрекет етуі керек. Гордиандық бөліну мәселесінің шешімі ұсынылды (4), онда фермент дуплексті ДНҚ-дағы екі бөлек байланыстырушы орынға қосылып, катенацияларды жергілікті танылатын құрылымға жинай отырып, бақылай алады (контур бойымен қоныс аударады). Мұндай механизм дөңгелек ДНҚ -ға оңай қолданылады. Бұл өсіп келе жатқан шанышқылардың арасында қолданылуы мүмкін, бірақ, егер олар бір -біріне физикалық түрде бекітілген болса, ең болмағанда шанышқының қоныс аударуының соңында. Тағы да біз біздің жұмысымыз бірнеше балама нұсқалардың қайсысы дұрыс екенін анықтауға арналмағанын баса айтамыз. Ол байланысты өсіп келе жатқан шанышқы гипотезасының топологиялық салдарын көрсетуді көздейді.

Қосылған өсіп келе жатқан шанышқы моделі «лямбда» деп аталатын математикалық оператор есебін қолдануға болатын молекулалық символизм түрінде көрсетуге мүмкіндік береді (9). Біз бұл жаңа ойлау әдісіне симбиологиялық атау береміз. Ламбда есептеулерінің негізгі тұжырымдамалары компьютердің озық тілдерінде енгізілген және бұл кез келген символдық хромосоманың тетрамерлік репликациясының егжей -тегжейлі символикалық сценарийін жасайтын нақты алгоритмді шабыттандырды. Қазіргі уақытта біз символикалық сценарийді хромосомалардың көбеюінің қарапайым фильміне деректер ретінде қолданамыз. Фильм қосылған репликация шанышқы моделінің ықтимал жанама әсерін көрсетеді, атап айтқанда репликация кезінде хромосоманың сызықтық конденсациясы. Болашақта ДНҚ -ның егжей -тегжейлі қасиеттерін (құрамы, серпімділігі, гистон және басқа тіркемелер, және топология) осындай симбиологиялық есептеулерге және олардың визуалды көріністеріне қосуға болады.

II. Байланысты өсіп келе жатқан шанышқы механизмі арқылы хромосомалардың репликациясы

2 -сурет. Қос бағытты байланысты тоғай шанышқысының репликациясы. А) Репликация комплексі толық емес ДНҚ дуплексі. (B) Бастау сигналының келуін қоса алғанда, кешеннің аяқталуы бір-біріне қатысты айналуға қабілетсіз екі ішкі артқы шанышқыны тудырады. (C) Репликацияның айырықша кешенінің қарама -қарсы жақтарынан дуплексті ДНҚ -ның екі жаңа ілмегі экструзияланатын репликацияның кейінгі кезеңі.

Шығу орны немесе ORC байланыстыру орны - репликацияланатын және экструдирленетін ДНҚ -ның бірінші бөлігі. Жаңадан синтезделген бастапқы аймақтар жасуша циклінде екінші рет қайталанатын репликацияның басталуына жол бермейді, себебі инициализация үшін басқа сигнал болмайды. Бір репликациялық шанышқылар кешенінен немесе көрші айыр кешендерінен пайда болған ілмектер тіпті хроматинді қайта жинақтағаннан кейін де тоқуға жеткілікті ұзын болуы мүмкін, бірақ жұп шанышқылар салыстырмалы ішкі айналуды сезінбесе, шатасу орын алмайды. Бұл мінсіз сегрегацияға мүмкіндік береді.

Эукариоттық геномда репликацияның шығу тегі шамамен 100 килобазалық жұп (1) бар сызықтық хромосомалар бар, олардың әрқайсысы 100 килобазалық жұп аймағы репликон деп аталады. S-фазасында репликацияның әр түрлі сызықтық байланысы бір мезгілде емес бағдарламаланған уақытта және белгілі бір сигналдардың көмегімен бағдарламаланған тәртіпте басталады.

3 -сурет - өте кішкентай хромосоманың репликациясының бейнесі. Ол бастапқы димерлердің орнында орналасқан ұзартылған күйде басталады (Cурет 3A). 3В-суретте репликативті шанышқы кешендері түзіледі және ДНҚ-ның шанышқы жұптары сөзсіз арқаға жасалады. 3C-суретте және 3D-суретте репликация жүріп жатқанда, жаңадан пайда болған ілмектер өседі және жинақталатын репликациялық шанышқы кешендері арасындағы ата-аналық дуплексті бөлімдер, ақырында, репликация шанышқы кешендерінің ұзартылған қатары ғана қалғанша қысқарады (сурет 3E), әрқайсысында бүйірлеріне бекітілген ДНҚ -ның ұзын, бірақ түйінсіз екі ілмегі. Бұл суретте көрсетілген ұзындықтың қысқаруы шынайы және митозға дейін хромосоманың конденсациясына ықпал етуі мүмкін. Хромосоманың конденсациясы үшін басқа фактордың эксперименттен де, метафазалық хромосомалық хроматидтердің диаметрінен әлдеқайда кіші болғандықтан, жаңадан репликацияланған ДНҚ ілмектерінің сызықтық ұзындығынан да маңызды екені белгілі, бұл соңғы конденсацияның басқа механизмдері маңызды екенін көрсетеді. метафазалық хромосоманың түзілуі.

Соңғы кадрда репликация комплекстері олардың түзілу сатысының кері бөлігінде қайтадан бөлінеді, ақуыздың жартысы әрбір қос тізбекке тағайындалады. Бұл кезде митоз басталуы мүмкін, ол ешқандай қателіктерсіз.

3E суреттегі толық соқтығысқан конфигурацияның егжей -тегжейі талқылауды қажет етеді. Соқтығысқан шанышқы кешендерімен тікелей байланыста болған ДНҚ-ның кішкене ұзындығы соқтығыс алғаш рет пайда болған кезде репликацияны аяқтаған жоқ және ол осы соқтығысқан құрылымдарға тән арнайы репликация механизмімен аяқталуы керек. ДНҚ репликациясындағы бұл «соңғы ойын» үлгі ретінде SV40 көмегімен біршама егжей-тегжейлі зерттелді, ал егер кедергісіз қалдырылған болса, ол шатастырмау үшін тиімді (5). Бұл процесс ІІ класты топоизомеразаның белсенділігін қажет ететіні хабарланды.

3 -сурет. Митозы бар хромосоманың өсіп келе жатқан шанышқы репликациясын байланыстыру. (A) күрделі жинақтау, (B) айыру, (C, D) репликация, (E) соқтығысу, (F) митоз.

Митоздан кейін хромосоманың кеңеюі қажет, осылайша оның ақпаратына G1 фазасында қол жеткізуге болады. Мүмкін, репликациялық шанышқы кешендері ДНҚ-дан диссоциацияланып, оның диффузия арқылы жасуша ядросында алатын көлемге дейін кеңеюіне мүмкіндік береді. Содан кейін жаңа кешендер ORC (10) шығу тегін тану кешендерімен қайта біріктіруге бағытталады. Балама ретінде, фильмде біз хромосоманың кеңеюін ДНҚ -да әлі де ажыратылған репликацияланатын ақуыздардың кейбір компоненттерінің қайтуымен байланысты және ДНҚ контуры бойымен қозғалу арқылы олардың репликация кезінде өз жолдарын кері қайтарумен байланысты болатынын көрсетеміз. , олар репликацияның шығу тегін немесе оларды анықтайтын ORC-ті тапқанша. Кеңейту фазасы туралы сұрақтар ДНҚ-полимераза суббірлігінің жұптасу ережелерін және шығу орындарының нақты орындарын анықтайтын тәжірибелік жұмыстарды қажет етеді, бірақ олардың ешқайсысы Гордиандық принцип бойынша проблемаларды қамтымайды.


Нәтижелер

Біздің негізгі мақсатымыз ДНҚ -гиразаға әсер етпей, Topo IV тежеу ​​болды. Осы себепті біз алдымен таңдадық E. coli DH5 㬟 ′ жасушалары мутацияны көтереді gyrA96 бұл жасушаларды налидикс қышқылының туындыларына төзімді етеді (25, 44). Шынында да, норфлоксацинге ұшыраған осы штаммның жасушалары ДНҚ гиразасына әсер етпестен катенандарды жинақтау үшін бұрын сәтті қолданылған (17, 45). Сонымен қатар, DH5㬟′ жасушалар мультимерлердің түзілуін болдырмайтын RecA − болып табылады (46, 47). RecA − штаммын қолданудың ыңғайлылығы 4 -суретте айқын көрсетілген А. pBR-терЕ@AatII RecA + болатын W3110 ұяшықтарын түрлендіру үшін қолданылды. Мономерлер мен мультимерлердің репликацияланбаған және ішінара репликацияланған формаларын бірлесіп анықтау, яғни димерлер, тримерлер және т.б. қызығушылық сигналдарын анықтауды қиындатады. Дегенмен, біз тоқтап қалған шанышқылары бар молекулалардың норфлоксациннің қатысуымен бұзылуға бейім екенін анықтадық (4-сурет. Б). 𠇋roken RIs ” деп белгіленген сигналдар айырларда сынған RI -ді көрсетеді (48, 49). Осы себепті ДНҚ гиразаға әсер етпей Topo IV тежеу ​​үшін біз Topo IV ts мутациясын тудыратын parE10 жасушаларына көштік (25, 26, 44). Жабайы типті штамммен салыстырғанда норфлоксацин болмаған кезде DH5 㬟 ′ жасушаларында бактериялық плазмидалардың топологиясына қандай да бір түрде әсер еткенін тексеру үшін біз рБР- репликацияланбаған формаларының суперкапитальды тығыздығын (σ) анықтадық.терЕ@AatII DHA 㬟 ′ ұяшықтарынан оқшауланған RecA −, Topo IV + және gyrA96 немесе RecA +, Topo IV + және Gyr + болып табылатын W3110 ұяшықтары. Алынған нәтижелер 5-суретте көрсетілген. Екі жағдайда да σ 𢄠.065 болды (модальды ΔЛк = �). Сондықтан, келесі эксперименттерде, Topo IV қатысуымен және болмауындағы РИ бұралу шиеленісін анықтау үшін, біз соңғы сағат ішінде шектік температураға ұшыраған DH5 㬟 ′ жасушалары мен parE10 жасушаларын қолдануға шешім қабылдадық.

pBR- интактілі түрінің иммунограммасытерЕ@AatII екеуінен де оқшауланған E. coli W3110 немесе DH5㬟′ жасушалары (норфлоксацин әсеріне ұшыраған) екі өлшемді агарозды гель электрофорезі арқылы талданған. A, W3110 ұяшықтары - RecA +, Topo IV + және Gyr + (44). B, DH5 㬟 ′ ұяшықтары RecA − және TopoIV + болып табылады және оларды көтереді gyrA96 бұл жасушаларды налидикс қышқылының туындыларына төзімді ететін мутация. DH5 㬟 ′ мәдениеті логарифмдік өсімге жеткенше өсірілді, содан кейін соңғы 15 минут ішінде 15 μ м норфлоксацинге ұшырады. Дейін дұрыс әрбір иммунограмманың репликацияланбаған CCC және OC бейнеленген ең маңызды белгілердің интерпретациялық диаграммасы болып табылады. қара. CCRI -лер суретте көрсетілген қызыл. Сандар мономерлерге (1) және мультимерлерге жатады: димерлер (2), тримерлер (3) және т.б. Сынған РИ көрсетіледі (48, 49).

PBR репликацияланбаған формаларытерЕ@AatII DH5 㬟 ′ немесе W3110 оқшауланған E. coli екі өлшемді агарозды гель электрофорезімен талданатын жасушалар. Екі өлшемді гельдердің репрезентативті иммунограммалары топоизомерлердің барлық популяциясын шешу үшін хлорохиннің әртүрлі концентрациясы болған кезде бірінші және екінші өлшемдердің қай жерде пайда болғанын көрсетеді. Бірінші өлшем 1 μg/мл қатысуымен болды, ал екінші өлшем 2 μg/ml хлорохиннің қатысуымен болды. Ең мол топоизомер a -мен көрсетілген көк көрсеткі. Екі жағдайда да жоғары оралу тығыздығы 𢄠.065 (модальды Δ)Лк = �).

Біз жасушалық штаммдардың екеуін pBR бактериялық плазмидаларымен өзгерттік.терЕ@StyI, pBR-терЕ@AatII және pBR-терЕ@DraI, жасушаларды логарифмдік өсуге жеткенше өсірді және ДНҚ -ны екеуінен де бөліп алды E. coli DH5 㬟 ′ жасушалары (мұнда Topo IV белсенді) немесе шектеу температурасында соңғы 1 сағат бойы өсірілген parE10 жасушалары (мұнда Topo IV белсенді емес). Үш плазмиданың зақымданбаған RI-ін тексеру үшін жоғары ажыратымдылықтағы екі өлшемді агарозагельді электрофорез және сәйкес зондтармен ДНҚ гибридизациясы қолданылды.

Алынған нәтижелер 6-суретте көрсетілген. Барлық иммунограммалар ОК қозғалғыштығына сәйкес келтірілді. Назар аударыңыз, хлорохиннің интеркаляциясы репликацияланбаған молекулалардың электрофоретикалық қозғалғыштығына әсер етпейді (29, 37, 50).

DH5-ден немесе parE10-дан оқшауланған үш плазмиданың бұзылмаған түрлерінің иммунограммалары E. coli екі өлшемді агарозды гель электрофорезімен талданатын жасушалар. Екінші өлшемі 5 μg/ml хлорохиннің қатысуымен болған екі өлшемді гельдер көрсетілген жоғарғы. -ға дұрыс Әрбір иммунограмма CCRI бейнеленген ең маңызды белгілердің интерпретациялық диаграммасы болып табылады қызыл. Ол қолданылатын жерде, CatAs (in көгілдір), CatBs (д қара көк) және CatCs (in жасыл) да көрсетіледі. Барлық иммунограммалар хлорохин әсер етпейтін мономерлердің (OCs) және репликацияланған аралық өнімдердің (OCRI) электрофоретикалық қозғалғыштығына сәйкес реттелген. Көк жебелер репликацияланбаған формалардың ең көп топоизомерін көрсетіңіз, және қызыл көрсеткілер барлық жағдайларда ең көп CCRI көрсетеді.

Хлорокинсіз талданған DH5㬟′ жасушаларынан оқшауланған барлық үш плазмидалардың репликацияланбаған түрлерінің электрофорездік қозғалғыштығы төмендегідей массасы мен пішіні бірдей дерлік молекулалар үшін күтілгендей болды: pBR- үшін 4385 бит.терЕPBR үшін @StyI 4449 bpтерЕPBR үшін @AatII және 4433 bpтерЕ@DraI (сол жақ баған 6-суретте). pBR- арасындағы жалғыз маңызды айырмашылықтерЕ@StyI, pBR-терЕ@AatII және pBR-терЕ@DraI - орналасқан жері терЕ (Cурет 3). Осы себепті үш плазмидалар үшін RI (OCRI) электрофоретикалық қозғалғыштығы әр түрлі болды, өйткені олардың массасы pBR- үшін 5525 bp болды.терЕ@StyI, pBR- үшін 7118 биттерЕ@AatII және pBR үшін 7979 bpтерЕ@DraI, тиісінше. CCRI-де көрсетілгенін ескеріңіз қызыл интерпретациялық диаграммаларда pBR- үшін репликацияланбаған CCC қозғалғыштығына жақын екінші өлшем кезінде электрофоретикалық қозғалғыштығы бар бірнеше топоизомерлер ретінде пайда болды.терЕ@StyI. PBR үшін-терЕ@AatII, CCRIs екінші өлшемде электрофоретикалық қозғалғыштығы бар нүктеден созылған топоизомерлер сериясынан құрылған доға ретінде пайда болды, бұл OCRI -ге дейін репликацияланбаған ОК -тен сәл жоғары. Ақырында, pBR- үшінтерЕ@DraI, CCRI -лер сонымен қатар қайталанбаған ОК -ден OCRI -ге дейін сәл төмен, екінші өлшемде электрофоретикалық қозғалғыштығы бар нүктеден созылған топоизомерлер сериясынан құралған доға ретінде пайда болды. Бұл жағдайда, алайда, RI топоизомерлерінің доғасы соңғы нашар бұралған молекулаларға иілуді көрсетті.

Хлорокинсіз талданған parE10 жасушаларынан бөлінген барлық үш плазмидалардың репликацияланбаған түрлерінің электрофорездік қозғалғыштығы DH5㬟′ жасушаларынан бөлінген ДНҚ-мен салыстырғанда ешқандай айырмашылықты көрсетпеді. Бұл иммунограммаларда толық репликацияланған катенандар (CatAs, CatBs және CatCs) анық көрінді. оң жақ баған 6 -суретте). Жоғарыда айтылғандай, Topo IV болмаған жағдайда плазмидалардың 20% -ы сыртқа шығады. терЕ-Тус репликациясының бітелуі және толық репликация, бірақ апалы дуплекстер бөлінбейді және катенендер жиналады (17, 29). pBR- жағдайында DH5- жасушаларынан оқшауланған ДНҚ иммунограммаларымен салыстырғанда parE10 жасушаларынан бөлінген CCRI үшін айтарлықтай айырмашылық байқалмады.терЕ@StyI және pBR-терЕ@DraI. Дегенмен, CCRI -ге сәйкес келетін доға үлгісі ( қызыл түсіндірме диаграммасында) pBR- үшінтерЕ@AatII айтарлықтай өзгеше болды. Екі жағдайда да RI топоизомерлерінің көпшілігі анықталатын ең жылдам электрофоретикалық ұтқырлықты көрсеткенімен, екінші өлшем кезінде төменгі электрофоретикалық мобильділікті көрсететін бірнеше топоизомерлерді parE10 жасушаларынан оқшауланған RI үшін анықтауға болады. Керісінше, DH5㬟′ жасушаларынан бөлінген ДНҚ жағдайында CCRI доғасы толық дерлік болды. Бұл бақылау кем дегенде pBR-терЕ@AatII, parE10 жасушаларынан оқшауланған CCRI -лер (мұнда Topo IV белсенді емес) DH5 㬟 ′ (Topo IV белсенді болатын) жасушаларынан оқшауланғандарға қарағанда бұралмалы кернеуге ие болды.

Әр түрлі жасушалық штаммдардан оқшауланған осы RI-дің бұралу кернеуін басқа жолмен салыстыру үшін екі өлшемді гель жүйесінің екінші өлшемі кезінде ғана 5 μg/ml хлорохин қосылды. Хлорокин - ДНҚ қос спиралының екі тізбегі арасында өзара әрекеттесетін жазық молекула. Бұл интеркалация ДНҚ бұрылысын өзгертеді. Бактериалды плазмидалар (−) -супероверленгендіктен, хлорохин алдымен (−) -сверкопирингті жояды және торды (+) қосады-барлық түптік (−) -супершығуды алып тастағаннан кейін ғана суперқаптау (37, 51). Оның үстіне, құрамында үш жақты айырлар бар ішінара репликацияланған молекулаларда репликацияланбаған аймақтың асып кетуі үш жақты кері айыр немесе тауық табандары деп аталатын төрт жақты қосылыстарға айналатыны бірнеше рет көрсетілді (37, 50, �). Төртінші иін ұзындығы әртүрлі болатын төрт жақты қосылыстары бар молекулалар (+) аса ширатылған емес және nicked RIs сияқты электрофоретикалық қозғалғыштықты көрсетеді.

Бұрын айтылғандай, ДНҚ топологиясына РИ-нің репликацияланбаған аймағындағы хлорохиннің интеркаляциясы ғана әсер етеді деп күтілуде. Осы себепті бұл pBR- ге қатты әсер етеді.терЕ@StyI, бірақ pBR-де еместерЕ@DraI (29, 37). Біз 5 μg/ml хлорохинді таңдадық, өйткені біз pBR322 үшін ΔЛк = 0, бұл концентрация � (+)-суперспиральдарды енгізеді. 4 Шынында да, алынған нәтижелер біздің күткенімізді растады. DH5㬟′ жасушаларынан оқшауланған үш плазмида үшін хлорохиннің репликацияланбаған молекулаларға интеркаляциясының әсері бірдей болды (жанындағы сол жақ баған 6-суретте). The effect on the shape of the arc corresponding to partially replicated molecules, however, differed for the three plasmids. For pBR-terE@StyI, the electrophoretic mobility of CCRIs during the second dimension in the presence of 5 μg/ml chloroquine changed in a way similar to the change observed for unreplicated CCCs. Taking into account that CCRIs cannot re-gain mobility after the removal of all their native (−)-supercoiling (37, 50), we may conclude that in the presence of 5 μg/ml chloroquine the modal topoisomer for pBR-terE@StyI CCRIs was close to 0 (indicated by the corresponding қызыл көрсеткі in Fig. 6 ). For pBR-terE@AatII, the arc of CCRIs changed its shape dramatically. It described a smooth arc without chloroquine. This arc, though, turned into an acute angle in the presence of chloroquine during the second dimension. In this case the modal topoisomer was 𢄣 (indicated by the corresponding қызыл көрсеткі in Fig. 6 ). For pBR-terE@DraI, however, the change in the shape of the arc was subtle. If we compare these results with those obtained for the same three plasmids isolated from parE10 cells, the differences were obvious (see the оң жақ баған on Fig. 6 ). pBR-terE@StyI CCRIs were not fully relaxed, and the majority of the molecules still showed an electrophoretic mobility higher than their corresponding OCRIs. The modal topoisomer in this case was 𢄤 (indicated by the corresponding қызыл көрсеткі in Fig. 6 ). This means that for pBR-terE@StyI CCRIs isolated from parE10 cells, exposure to 5 μg/ml chloroquine during the second dimension was not enough to remove all the torsional tension. For pBR-terE@AatII, the shape of the arc of CCRIs was not as abrupt as in the case of the molecules isolated from DH5㬟′ cells. Indeed, here most of the CCRIs were still torsionally tensioned and the modal topoisomer was � still showing an electrophoretic mobility significantly higher than their corresponding OCRIs (indicated by the corresponding қызыл көрсеткі in Fig. 6 ). For pBR-terE@DraI, however, the change in the shape of the arc was once again only subtle (the modal topoisomer was � for DH5㬟′ қарсы � for parE10). Altogether, these observations indicated that 5 μg/ml chloroquine added during the second dimension affected the mobility of CCRIs differently. The results obtained confirmed that CCRIs isolated from parE10 cells were more torsionally tensioned than those isolated from DH5㬟′ cells. The effect of chloroquine was notable for pBR-terE@StyI, less apparent for pBR-terE@AatII, and almost negligible for pBR-terE@DraI. Unreplicated plasmids isolated from cells where Topo IV is inactive are slightly more (−)-supercoiled than those isolated from cells where Topo IV is active (44, 54). As mentioned previously, here we used the RecA − DH5㬟′ cells to avoid the formation of multimers due to recombination.

It was recently shown that torsional tension reduces the probability for Topo IV to create replication knots (29, 55,�). In contrast, it is well known that the level of DNA knotting is proportional to molecular mass (40, 59). To further confirm the results obtained so far, we decided to measure DNA knotting in the replicated region of the RIs isolated from DH5㬟′ and parE10 cells. We anticipated that the number and complexity of replication knots would be higher for pBR-terE@DraI and lower for pBR-terE@StyI. To facilitate the quantitation of replication knots, we digested the RIs of the three plasmids with AlwNI. This restriction enzyme cuts the plasmids only once at the unreplicated region (see Fig. 3 ). The resulting digested molecules consisted of linear DNAs containing an internal bubble. These molecules were analyzed in two-dimensional gels allowing the identification of unknotted and knotted forms after hybridization with proper probes. Finally, the signals corresponding to unknotted қарсы knotted molecules were quantitated by densitometry (29, 43). The results obtained confirmed our expectations ( Fig. 7 ). For both cell strains (DH5㬟′ and parE10) the percentage of knotted bubbles increased with the size of the bubble (40). This observation suggests that torsional tension was higher for those CCRIs isolated from parE10 cells (29, 55,�).

Comparison of knotted and unknotted RIs of the three plasmids isolated from either DH5㬟′ or parE10 E. coli cells analyzed by two-dimensional agarose gel electrophoresis. DNA was isolated, digested with AlwNI, and analyzed in two-dimensional gels. The area of the immunogram where unknotted and knotted RIs migrated was scanned and analyzed by densitometry. In each case, immunograms are shown to the сол, diagrammatic interpretations are in the орта, and densitometric profiles are to the дұрыс. The сандар жанында top right corner of each profile indicate the ratio of knotted/unknotted molecules. Note that for both cell types, this ratio was higher for pBR-terE@DraI. For each plasmid, however, the ratio was always higher for the RIs isolated from DH5㬟′ cells.


TOPOLOGICAL DYNAMICS IN THE UN-REPLICATED REGION OF REPLICATION INTERMEDIATES

The situation becomes even more complicated during replication. The cartoons in Figure 2 illustrate the changes in topological sign and chirality that occur as replication progresses in a circular covalently-closed (CCC) molecule in vivo. In bacteria, un-replicated circular molecules are maintained negatively supercoiled by the combined action of DNA gyrase introducing (-) RH supercoils and topoisomerase I keeping it under control (Figure 2A).

As replication starts, the advance of replication forks generates (+) supercoiling (over-winding of the DNA duplex) that transiently accumulates only immediately ahead of the forks (Figure 2B). RH (-) crossings and LH (+) ones cancel each other because they cannot co-exist in the same topological domain. Topo IV removes some of the LH (+) supercoils that form as a result of the advance of replication forks, and DNA gyrase introduces RH (-) supercoils to keep the un-replicated region negatively supercoiled. Note that in the cartoon represented in Figure 2B the upper part of the un-replicated region appears positively supercoiled while the lower part is negatively supercoiled. As mentioned above, this situation is inconsistent and it is presented here only for didactical reasons. The advancing rate of the DNA helicase far exceeds the capacity of Topo IV and DNA gyrase to completely eliminate all the overwound LH (+) supercoiling that transiently accumulates immediately ahead of the advancing forks. [ 12 ] To solve this conundrum, Champoux & Been proposed that fork swiveling allows some of these LH (+) supercoils to migrate from the un-replicated to the replicated region. [ 12 ] This causes intertwining of the newly made sister duplexes. The nodes between sister duplexes in the replicated region are called pre-catenanes. [ 13 ] Migration of each crossing from the un-replicated region to the replicated one generates two pre-catenane crossings (Figure 2C).

It is important to note that replication intermediates contain two regions that in vivo behave as independent topological domains: the un-replicated and the replicated regions. The combined action of Topo IV, DNA gyrase and swiveling of the forks guarantee that the un-replicated region is always kept negatively supercoiled (Figure 2C).


TOPOLOGICAL DYNAMICS IN THE REPLICATED REGION OF REPLICATION INTERMEDIATES

The sister duplexes in the replicated region cannot be supercoiled because rotation of the free ends of the nascent strands of the duplex dissipates all the torsional tension that might form in vivo as well as in vitro. In replication intermediates, it is energetically favorable for supercoils of the un-replicated region to diffuse to the replicated one, and vice-versa, with opposite handedness. [ 4 ] For this reason, the LH supercoil crossings that transiently accumulate immediately ahead of the forks (Figure 2B) migrate to the replicated region as RH pre-catenane crossings. As crossing DNA duplexes run in opposite directions in the un-replicated region, whilst they run in the same direction in the replicated one, the (+) sign of the crossings is maintained after their diffusion to the replicated region (Figure 2C). Hence, replication intermediates in vivo comprise RH (-) crossings in the un-replicated region and RH (+) pre-catenane crossings in the replicated one (Figure 2C). As replication forks keep advancing, the un-replicated region becomes progressively smaller, with fewer (-) supercoils, while the replicated region becomes larger, with more and more RH (+) pre-catenanes (Figure 2C). Finally, once replication is completed, the fully replicated sister duplexes end-up heavily catenated (Figure 2F). Topo IV is responsible for the elimination of all catenane crossings leading to the segregation of the newly made sister molecules. [ 14 ] At the same time, DNA gyrase progressively introduces (-) supercoiling in the daughter CCCs [ 15 ] to start the cycle again (Figure 2G).


DNA topoisomerase II

DNA topoisomerase II is ATP dependent enzyme which required 2 ATP molecule per reaction. It acts of entire double-stranded DNA, cut it and rejoin it. Topo II relaxes positive supercoiling in eukaryotic DNA.

One special type of DNA topoisomerase II found in prokaryote named “DNA gyrase” which introduces supercoiling in bacterial DNA. DNA gyrase performs both functions of releasing as well as introducing negative supercoiling in bacterial DNA.

Image credit: “Molecular biology of the gene”, 7th edition by Watson. The image represents how topoisomerase II cut dsDNA and relax it.

Another important function is performed by topoII, are catenation and de-catenation. Imagine two linked rings. DNA molecules are catenated in the same manner. Here, topoisomerase cut the dsDNA and decatenate it for relaxing. Further, it catenates the decatenated DNA for supercoiling.

Image credit: “Molecular biology of the gene”, 7th edition by Watson. the Image represents catenation and decatenation.

The process of decatenation is a very important process as it allows separation of the DNA molecule into two daughter cells, after replication.


Реферат

The replication of chromosomal DNA is a fundamental event in the life cycle of every cell. The first step of replication, initiation, is controlled by multiple factors to ensure only one round of replication per cell cycle. The process of initiation has been described most thoroughly for bacteria, especially Ішек таяқшасы, and involves many regulatory proteins that vary considerably between different species. These proteins control the activity of the two key players of initiation in bacteria: the initiator protein DnaA and the origin of chromosome replication (oriC). Factors involved in the control of the availability, activity, or oligomerization of DnaA during initiation are generally regarded as the most important and thus have been thoroughly characterized. Other aspects of the initiation process, such as origin accessibility and susceptibility to unwinding, have been less explored. However, recent findings indicate that these factors have a significant role. This review focuses on DNA topology, conformation, and methylation as important factors that regulate the initiation process in bacteria. We present a comprehensive summary of the factors involved in the modulation of DNA topology, both locally at oriC and more globally at the level of the entire chromosome. We show clearly that the conformation of oriC dynamically changes, and control of this conformation constitutes another, important factor in the regulation of bacterial replication initiation. Furthermore, the process of initiation appears to be associated with the dynamics of the entire chromosome and this association is an important but largely unexplored phenomenon.


2 Answers 2

This article (DNA Topology: Fundamentals by Mirkin SM) probably defines and describes linking number better than I ever could:

The fundamental topological parameter of a covalently closed circular DNA is called the linking number (Lk). Assume that one DNA strand is the edge of an imaginary surface and count the number of times that the other DNA strand crosses this surface (Figure 3). The algebraic sum of all intersections (which accounts for a sign of every intersection) is the Lk. Two important features of the Lk are evident from Figure 3. First, Lk is always an integer. Second, Lk cannot be changed by any deformation of the DNA strands, i.e. it is topologically invariant. The only way to change Lk is to introduce a break in one or both DNA strands, rotate the two DNA strands relative to each other and seal the break. Another characteristic of a circular DNA is called twist, or Tw. Tw is the total number of helical turns in circular DNA under given conditions. Since DNA is a right handed helix with 10.5 base pairs (bp) per turn, Tw is a large positive number for any natural DNA. Take a planar, circular DNA and try to locally separate the two DNA strands, i.e. to decrease the Tw. Since Lk cannot change, a decrease in Tw will be compensated by several positive writhes of the double helix (Figure 4). Writhing (Wr) is the third important characteristic of circular DNA, describing the spatial pass of the double helix axis, i.e. the shape of the DNA molecule as a whole. Wr can be of any sign, and usually its absolute value is much smaller than that of Tw. The above consideration can be formalized by the following equation: Lk = Tw + Wr. Note, that while Lk is an integer, neither Tw nor Wr should be such. Also, neither Tw nor Wr are topological invariants and their values easily change.

Linking number is simply the number of times one strand of DNA passes over the other. Compare this to:

You can, perhaps, think of twist as the passing over of strands within the helix and writhe as the passing over of strands when the entire helix crosses itself. Both twist and writhe involve strands of DNA passing over the other and so both contribute to the linking number. In the absence of writhe, linking number and twist are equal and both describe the same thing: the number of helical turns. However, in the presence of writhe, twist alone is insufficient to describe the topology of DNA because it doesn't account for the passing of the entire helix over itself.

Since twist is the number of helical turns, actually counting it in your image is not necessarily difficult, just time consuming. The image already has the twists numbered, and I've put a red do at every turn of the double helix. I've also circled, in blue, every point where the double helix passes over itself (writhe):

In that image, in may be difficult to visualize (and even understand!) that the strands only cross over each other 36 times (Lk), even though there are 42 helical turns (Tw). While twist and writhe are different modes of strand crossing, it is important to realize that they are interchangeable without breaking the strands. Let's consider a simpler example, where Lk = -1 (Wikipedia: DNA Supercoil):

In the lower image, the strands do not form a helical structure (Tw = 0) but they do both pass over each other together (Wr = -1). Can you imagine that if you were to "unfold" the superhelix (Wr = 0), the two individual strands would still be linked together in a helical structure (Tw = -1)? Neither could I, so I made a video with my shoelaces:

I hope that answers your question. Let me know if I misunderstood what you were asking or if anything needs clarification. You may also find my shoelace video on the topology of helicase-mediated DNA unwinding informative.