Ақпарат

QPCR тиімді цифрландыру циклдерінің ең аз саны?

QPCR тиімді цифрландыру циклдерінің ең аз саны?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Менің qPCR деректерімде флуоресценция шыңдарының пайда болуы арқылы кері транскриптаза (NRT) бақылауларымда гДНҚ ластануына қатысты айқын мәселе болды.

Менде бірнеше DNase өңдеулері (Turbo DNase, Life Technologies) және РНҚ тазарту (Qiagen, RNeasy) бар/байлануда. Мені мазалайтын шектеу факторы-мен қолда бар мРНҚ-ны бірнеше емдеу/тазарту арқылы жойып жіберемін.

Менің сұрағым - флуоресценцияны өлшеу үшін қолданатын цикл санын азайта аламын ба? Егер цикл санын 25-30-ға дейін төмендетсем, қате кететін аспект бар ма (эксперименттің өзі деректерді талдауға қатысты)? Менің барлық ластануларым шамамен 30 цикл мен одан жоғары диапазонда пайда бола бастайды (Ct мәндерімен анықталғандай).

Жауап беруге көмектесетін басқа ақпарат қажет болса, маған хабарлаңыз!

Ең жақсы


Сандық полимеразды тізбекті реакцияға арналған нұсқаулық (qPCR)

qPCR – нақты уақыттағы полимеразды тізбекті реакция деп те аталады-қазіргі уақытта тіндердің аз мөлшерінде РНҚ анықтау мен санының алтын стандарты. Дегенмен, техниканың өзі бірқатар факторларға байланысты табысқа жету мүмкіндігін арттыру үшін кейбір кеңестер мен амалдарды қарастырайық.

Бұл түпнұсқа ғылыми байланыстың бастамасы The Addictive Brain -пен бірлесіп жазылды. Біз сансыз ПТР мен qPCR реакцияларын қолданатын жеке тәжірибеге негізделген Chinmaya ’s жеке кеңестері мен амалдарын ұсынуға қуаныштымыз!


Реферат

Бұл зерттеу вируленттілік гендерінің экспрессиясын сандық бағалау үшін әртүрлі әдістемелік стратегияларды таңдауға және растауға бағытталған. ascC және ascV qPCR бойынша Aeromonas salmonicida субсп. сальмоницидтер (Аэр. сальмоницидтер).

Әдістер мен нәтижелер

geNorm, Normfinder және BestKeeper алгоритмдерін пайдалана отырып, qPCR үшін анықтамалық гендер олардың негізінде таңдалды. in vitro үште өрнек тұрақтылығы Aer. сальмонидоз штамдар Генді күшейту тиімділігі нақты уақыт режимінде ПТР-шахтер және LinReg ПТР бағдарламасымен есептелген, олар бұрын бактериалды гендердің экспрессиясын талдау кезінде қолданылмаған. Өрнегі ascC және ascV вируленттік гендер Аэр. сальмоницидтер штамм тұрақты немесе спецификалық генді күшейту тиімділігімен біріктірілген бір (ең аз немесе ең тұрақты) немесе ең тұрақты үш референттік генді қосқанда үш сандық модельмен бағаланды. Ең тұрақты анықтамалық гендер g болдыжыл, proC және rpoC, ал rpoD және fabD ең төмен тұрақтылар болды. Сандық модельдер әр түрлі өрнектерді көрсетті.

Қорытынды

mRNA экспрессиясын сандық бағалаудың оңтайлы стратегиясы үш алгоритмнің комбинациясын және ең тұрақты үш анықтамалық генді қамтитын сандық модельді пайдалану болды. Нақты уақыттағы ПТР Miner немесе LinReg ПТР күшейту тиімділігін бағалау үшін құнды құрал болды.

Зерттеудің маңыздылығы мен әсері

Бұл зерттеуде қолданылған әдістер бұрын жарияланған әдістерге қарағанда qPCR көмегімен сенімді экспрессия деректерін берді. Вируленттілік гендерінің сандық және экспрессиялық динамикасы қалай болатынын жақсы түсінуге ықпал етеді Аэр. сальмоницидтер оның иесімен және қоршаған ортамен өзара әрекеттеседі, демек, осы қоздырғыштың әсерінен эпизоотиялардың алдын алу үшін.


Нәтижелер

TaqMan ® , UPLs ® , Tail-негізделген стратегия ddPCR-де салыстырмалы нәтижелер береді

Алдымен біз Universal Probe Technologies (UPL ® , Roche) ddPCR қондырғысында дәстүрлі 5′ гидролиз зондтарымен (Taqman ®) салыстырмалы түрде жұмыс істейтінін анықтадық. Біз екі генді қолдана отырып, cDNA кірістерін сұйылтумен, ddPCR -де анықтау деңгейін салыстырдық (SI, SII сурет). Алғашқы салыстыру TaqMan ® мен UPL ® зондтары арасында (SI сурет) 7 және 8 эксонды анықтайтын праймерлермен жүргізілді. hTERT (адам теломеразасының кері транскриптазасы, NCBI Gen ID: 7015) cDNA -дан. Біздің эксперименттерімізде әмбебап зондтар дәстүрлі 5'-гидролиздік зондтар сияқты тиімді болды, олар сызықтық регрессиялар арасында табылған күшті байланысты корреляциямен (сәйкестіктің жақсылығы) көрсетілген (R 2 = 0.9999 p & lt 0.0001).

Roche зондтары (Universal Probes Library® LNA модификацияланған 8–9 ДНҚ-олигомерлер) тамшылық сандық ПТР-де жұмыс істейтінін қосымша растау үшін біз жалпы анықтамалық генге қосымша сынақ жүргіздік, HPRT (гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфераза, NCBI генінің идентификаторы: 3251). Принциптің дәлелі ретінде біз 5′ құйрықты немесе «әмбебап зонд» стратегиясын (тамшылдық сандық ПТР-құйрық немесе ddPCR-құйрық деп аталады) 19 сынадық. Бұл стратегияда әмбебап зонд тізбегіне қосымша реттілік (Roche Universal Probes®) алдыңғы праймердің 5′ ұшына қосылады (1-суретте және SII суретте көрсетілген). Бұл жағдайда тура және кері праймерлер арасындағы жүйелілікті білмей-ақ кіріс материалының (яғни, NGS немесе mRNA деңгейі үшін кітапханалық сандық көрсеткіш) нақты сандық анықтауға болады. Бұл тұжырымдаманы растау үшін біз алдымен «ddPCR-Tail» стратегиясын қарапайым сандық жүйеде сынап көрдік (яғни, гендік өрнек: бір күшейту өнімі). Біз гендік праймерді қолдандық HPRT праймерлерге № 22 ішкі әмбебап зонд кітапханасы (UPL#22) және бірізділік 5 -құйрықты зондпен (UPL No52). Құйрық және ішкі зонд стратегиясы ұқсас концентрация мәндерін беретінін анықтау үшін біз жалпы РНҚ-дан жасалған cDNA сериялық сұйылтуларын қолдандық. Біз екі әдіс арасындағы күшті корреляцияны байқадық, ол екі сызықтық регрессия қисықтары арқылы анықталды (сәйкестіктің жақсылығы R 2 = 0.9923, p & lt 0.0001), бұл әр түрлі стратегиялар арасындағы ұқсас анықтауды көрсетеді (TaqMan ®, ішкі және құйрықты UPLs ®) ( SII сурет).

DGPCR-Tail көмегімен NGS кітапханаларын титрлеу абсолюттік кіріс молекулаларының санын береді

PE әмбебап праймер 1.0 (Illumina) 5′ тізбегін қосу арқылы NGS сандық анықтауға ddPCR-Tail стратегиясын қолдандық және ddPCR-Tail әдісін NGS ДНҚ кітапханасын сандық анықтау үшін қолданылатын басқа әдістермен салыстырдық. Дәл сол үлгі QuBit, qPCR, ddPCR және ddPCR-Tail көмегімен коммерциялық жинақтармен (6 түрлі индекспен) сандық анықталды (Cурет 2). Молярлықтар тиісті технологияға сәйкес есептелді және қажет болғанда стандартты қисықпен түзетілді (мысалы, qPCR үшін KapaBiosystem). Барлық сандық әдістер бір концентрация диапазонындағы кітапханаларды сәтті бағалады (50-250 нМ). Бір индекс үшін (ATTCCT), молярлық ddPCR жиынтығымен (465 нМ) ерекшеленді, бұл жиынтықта қолданылатын зондтар мен нақты индекс тізбегі арасындағы үйлесімділікті ықтимал түрде анықтайтын сыртқы көрсеткіш. Соған қарамастан, бөлек алынған барлық индекстелген кітапханалардың өлшемдері әрбір әдісті салыстыру кезінде айтарлықтай ерекшеленеді (Cурет 2c). Шынында да, Sidak-тың бірнеше салыстыру сынағы (альфа = 0,05) арқылы есептелген түзетілген p мәндері бір ерекшелікпен (GATCAG: ddPCR-Tail және qPCR реттелген p мәні = 0,0956) 0,0001-ден төмен p мәндерін көрсетті. Сондықтан секвенирлеу нәтижесінің нәтижесі ғана қандай сандық әдіс ең сенімді болғанын нақты анықтайды. ddPCR немесе ddPCR-Tail пайдалану биоанализатор талдауымен анықталған орташа өлшемге қарсы кітапхананы кері есептеуді қажет етпейді (Cурет 2b, бұл ddPCR негізіндегі сандық көрсеткіштерді аз уақыт пен реагентті қажет етеді. QuBit немесе qPCR көмегімен сандық анықтау қосымша есептеулермен кітапханалардың молярлығын анықтау үшін қосымша жабдықты қажет етеді. qPCR және QuBit салыстырмалы өлшемдерді береді, ал ddPCR өлшемдері абсолютті.

(а) Келесі буын тізбегінің диаграммасы (NGS) эксперименттік дизайн. Төрт сандық әдісті қолдана отырып, біз өндірушілердің нұсқауларына сәйкес HeLa жасушаларынан дайындалған ДНҚ кітапханаларын титрледік. Күшейту сатысында алты түрлі индекс қосылды. NGS ағындық ұяшығындағы сегіз жолақтың төрт жолы әрбір әдісті салыстыру үшін (бірегей индекстік жолақ) және біріктіру дәлдігі үшін төрт жолақ (әр жолақ үшін алты индекс пулы) пайдаланылды. (б) Кітапханалардың биоанализаторының кескіні, ДНҚ -ның 280 -ден 450 -ге дейінгі біртекті жағындысын көрсетеді. Барлық алты көрсеткіш бірдей орташа өлшемді көрсетеді. (в) Сәйкесінше QuBit, qPCR, ddPCR және ddPCR-Tail тәсілдерін қолданатын барлық индекстер үшін сандық анықтау нәтижесі. Барлық сандық көрсеткіштер (ddPCR-Tail қоспағанда) өндірушінің нұсқауларына сәйкес орындалды (Invitrogen, BioRad және KapaBiosystem). ddPCR-Tail стратегиясы шамалы модификациялары бар ddPCR сияқты бірдей аппаратты пайдаланды (50 нМ праймерлер 65 °C температурада 30 секундқа үш сатылы ПТР күйдіру, 72 °C кезінде 30 секунд ұзарту уақыты). Үш еселенген эксперименттер, сұйылту қисығының көмегімен есептелетін орташа мән (бір санға орташа алғанда 12 мән, QuBit үшін 6). Орташа ± SD көрсетілген.

DdPCR-Tail NGS үшін сезімтал және сенімді титрлеуді береді

Paired-End (PE-Seq) экспериментінің төрт жолағын қолдана отырып, біз қолданылған титрлеу әдісіне негізделген 6 индексті біріктірдік және оларды реттедік (PE-100nt, HiSeq2500 Illumina). Біздің мақсатымыз титрлеудің әр түрлі әдістерін салыстыру болды, осылайша оқылымдағы нақты дәйектілікке емес, оқылымның сапасы мен қайта бөлінуіне бағытталды (3 -сурет, SIII). Біз алдымен Q ұпайларын пайдаланып FastQ деректерін зерттедік. Q балл-бұл негіздің (нуклеотидтің) қате аталу ықтималдығын көрсететін мән, оқылатын әрбір нуклеотидке Q ұпайы беріледі (есептеу фрер тәрізді алгоритммен жасалады, ол бастапқыда Sanger реттелу эксперименттері үшін жасалған) . Дүниежүзінде Q баллының 20 -сы 100 -дегі 1 қателік деңгейін көрсетеді, сәйкесінше қоңырау шалу дәлдігі 99%. PE-seq-те 34-тен жоғары болса, Q ұпайы «жақсы» болып табылады (қате деңгейі 2500-де 1-ге жуық 99,96% дәлдік). Бұл эксперименттерде біз QuBit және ddPCR-Tail сәл жақсырақ Q ұпайларын (бір жақты ANOVA p < 0,0001, тек QuBit және ddPCR-Tail арасында бірнеше салыстырулар үшін түзетуді пайдалана отырып айтарлықтай айырмашылықтар жоқ) орташа 34 және сәйкес келетінін байқадық. стандартты ауытқу (SD) ± 0,15 және ± 0,13. Салыстырмалы түрде, ddPCR және qPCR орташа Q бағасын 33 құрайды (дәлдік 99,95%), SD мәндері сәйкесінше ± 0,17 және ± 0,15 құрайды (3а -сурет). Дегенмен, Q баллының мәні оқулардың жалпы санын есептемегенде толық емес (3б -сурет). DdPCR және qPCR әдістері көбірек оқуды шығарды (± SD ddPCR = 414 ± 2,42 және qPCR = 402 ± 27 миллион ПФ оқуды білдіреді, яғни жарықтандырғыштың сүзгісінен өтеді), бұл жолдың шамадан тыс жүктелуін болжайды, бұл кластерлерді бөлуге қиындық туғызады, демек Q Гол. Мұны кітапханалар концентрациясының төмен бағалануымен, ПТР күшейтуінің сәтсіздігінің салдарымен немесе титрлеудің екі анализінде де белгілі бір реттіліктерді қолдайтын зондпен/ферментпен байланысты мәселелермен түсіндіруге болады.

(а) Төрт бөлінген жолдан алынған орташа сапа (Q) ұпайларының кестесі (бір жүктеме ретінде есептеледі) және төрт титрлеу әдісі бойынша жинақталған алты индекс (барлығы 1 титрлеу үшін 7 орташа Q баллының 1 жиынынан). Сапа көрсеткіштері өте жақсы (34 QE нәтижелері үшін алтын стандарт), QuBit және ddPCR-Tail стратегиясының оңтайлы нәтижелерінен жақсы (орташа ± SD, QuBit = 34.23 ± 0.15 ddPCR-Tail = 34.18 ± 0.13). (б) Біріктіру нәтижелерінен (жинақталмаған және жинақталған эксперименттен) қол жетімді оқулардың жалпы саны (PF оқулары), яғни негізгі басқарудан өткен және бірегей кластерлер ретінде анықталған оқулар санын білдіреді. Әрбір талдау үшін индекстелмеген көрсеткіштер 2%-дан азды құрайды (сәйкесінше qPCR = 1,55%, QuBIT = 1,54%, ddPCR = 1,32%, ddPCR-Tail = 1,49%). Барлық әдістер 350 миллионнан астам оқуды берді: qPCR және ddPCR (402, 414) QuBit және ddPCR-Tail (357, 372). Қайталанатын эксперименттерден есептелген орташа ± SD көрсетілген. (в) Орташа индекстің орташа индексі көрсетілген. (d) Төрт түрлі титрлеу әдістерінен төрт түрлі жолақтардағы алты индексті нақты бөлу.

Әрі қарай, индекстелген әдісті қолдана отырып, біз индекстеу реттілігіне қарамастан титрлеу әдістерінің қайталануын бағаладық, өйткені барлық кітапханалар бірдей (дәл сол дайындықтан) және техникалық репликаларды білдіреді. Ең дұрысы, сенімді және сезімтал әдіс бірнеше үлгілерді гомогенді түрде (тең қатынаста) индекстеуге мүмкіндік береді. Индекстелген кітапханаларды оңтайлы теңдестіру нәтижесінде

Индекстелген кітапханаға 16% (шамамен 100% алтыдан бір). QuBit және ddPCR-Tail ДНҚ индекстелген кітапханалар арасындағы төмен вариацияға қатысты шаралар арасындағы ең аз өзгергіштігі бар ең тұрақты нәтижелерді қамтамасыз етті (3c-сурет) (сәйкесінше ddPCR-Tail SD ± 3.1 QuBit SD ± 1.9 төмен стандартты ауытқу есебінен хабарланды) qPCR SD ± 7,2 және ddPCR SD ± 8,9). Дегенмен, индекстер тізбегі арасындағы шынайы қайта бөлуді бағалау үшін деректерді ұсынған кезде (3d-сурет), біз кейбір индекстердің шамадан тыс ұсынылғанын байқадық. Мысалы, ATTCCT индексі qPCR титрлеуімен шамадан тыс ұсынылған, ал ddPCR титрлеуінде ол мүлдем жоқ. Бұл диспропорциялар индекстің өзектілігімен байланысты мәселеге немесе титрлеудің ішінара сәтсіздігіне байланысты болуы мүмкін. ddPCR-Tail және QuBit талдаулары индекс тепе-теңдігіне қатысты ең жақсы нәтижелерге қол жеткізді, бұл бір реттік тәжірибелерді дәл және теңдестірілген түрде мультиплекстеуге мүмкіндік береді. Сондықтан, бұл әр кітапхананың бірдей реттілікке ие болатынына сенімділікпен бір жолаққа көбірек индекстелген кітапханаларды жүктеп, бір үлгідегі реттілік құнын азайтуға және бір үлгідегі реттілік құнын азайтуға мүмкіндік береді.

ddPCR-Tail әдісінің сезімталдығын бағалау үшін біз ДНҚ-ның төмен мөлшері, ДНҚ өлшемдеріндегі кең гетерогенділігі және праймер димерлерінің іздері бар кейбір күрделі NGS кітапханаларының сандық көрсеткіштерін анықтадық. Нәтижелерді ең жиі қолданылатын qPCR сандық анықтау әдісімен салыстырдық. Біз Hi-C тізбегі үшін дайындалған күрделі кітапханаларды талдадық (4а, б-сурет), 21,22 геномдық хроматин құрылымын зерттеу үшін NGS негізіндегі әдіс. Талдау үшін қажет көптеген ферментативті қадамдардың арқасында дайындалған ДНҚ мөлшері шектеулі. ПТР ауытқуын азайту үшін NGS алдында кітапхананың санын анықтау үшін өте сезімтал құрал болуы керек 18. Бұл жағдайда кітапхананың нашар болуы оқудың аз болуына ғана емес, сонымен қатар репрезентативті тізбектердің болмауына әкеледі. ПТР -ны күшейту кезінде енгізілген бұрмалануға байланысты сирек кездесетін байланыстарды елемеуге болады және өзара әсерлесу деңгейлері бұрмалануы мүмкін. DdPCR-Tail әдісі qPCR әдісімен 6 кітапхананың 4-те есептелген эквивалентті сандық нәтиже берді (4а NGS-2, p = 0.99 NGS-3, p = 0.99 NGS-4, p = 0.94 NGS- 6, p = 0,99 тиісінше, реттелген р мәндері Sidak -тың бірнеше салыстыру сынағы альфа = 0,05 көмегімен есептеледі). Бұл ddPCR-Tail ДНҚ санына qPCR сияқты сенімді екендігі туралы біздің бұрынғы байқауымызды растайды.

(а) NGS кітапханаларының аз болуының екі әдісін салыстыру, qPCR мен ddPCR-Tail жүйесін қолдана отырып титрлеу нәтижелері. Талдау үш данада орындалды және сұйылтуды түзету коэффициенттері арқылы есептелген орташа мән (әр үлгіге орташа 18 мән). Орташа ± SD көрсетілген. (б) QPCR өлшеуінің соңғы молярлығын есептеу үшін пайдаланылатын биоанализатор кескінінің нәтижелері, QPCR стандартты қисықпен біріктірілген NGS кітапханасының орташа өлшемін пайдалана отырып KapaBiosystem ұсынған алгоритм. (в) Барлық кітапханалар жоғары сенімділікпен сәтті сандық анықталды (барлығы 0,9 сызықтық регрессия), ddPCR Tail стратегиясы кітапханалардың гетерогенділігіне қарамастан жақсырақ жалпы сызықтылықты көрсетті.

Ақырында, біз гетерогенді Hi-C кітапханаларында техниканың тұрақтылығын қарастырдық (4с-сурет). DdPCR-Tail жақсы сызықтық регрессия корреляциясын береді (Студенттік T-тест p = 0,04 сурет 4c) және qPCR (сурет 4a NGS-1 және NGS-5) салыстырғанда кішірек стандартты ауытқулар. NGS-1 және NGS-5-те байқалған үлкен стандартты ауытқуларды түсіндіре алатын екі әлеуетті қате көздеріне тәжірибе ішілік вариациялар (яғни, фермент белсенділігі) және техникалық өзгергіштік (тамшуырлау) жатады.

Алайда, техникалық индикативті өзгергіштікті барынша азайту және статистикалық талдаудың күшін арттыру үшін біз талдауды үш еселенген түрде орындадық (әр сұйылту нүктесінің үш еселенуі, әр түрлі үлгідегі 18 мәнге сәйкес 3 түрлі талдауда), екі кітапхананың сандық көрсеткіші ddPCR-Tail ұсынған нәтижемен салыстырғанда статистикалық тұрғыдан әр түрлі және өзгермелі болып табылады (4а-сурет NGS-1 түзетілген р мәні & lt 0.0001 NGS-5 реттелген p мәні & lt 0.0001, Сидақтың бірнеше салыстыру сынағы). DdPCR-Tail алты түрлі HiC кітапханасының титрлеуінде көрсетілгендей, qPCR-мен салыстырғанда көбірек қайталанатын сандық көрсеткіштерді қамтамасыз етеді. ddPCR-Tail өте сезімтал болғандықтан, кітапханалардың санын анықтау үшін қолданылатын үлкен сұйылту дәлелдейді, бұл әдісті ең аз ПТР күшейтуімен кітапханаларды титрлеу үшін қолдануға болады: NGS эксперименттері үшін қажетті ДНҚ материалының шектеуін секвенсердің сыйымдылығына жылжыту .


2. Концептуалды ойлар

2.1 Аналитикалық сезімталдық талдау арқылы дәл өлшеуге болатын үлгідегі көшірмелердің ең аз санын білдіреді, ал клиникалық сезімталдық талдау осы жағдай үшін оң деп анықтайтын берілген бұзылысы бар адамдардың пайызы. Әдетте сезімталдық ретінде көрсетіледі анықтау шегі (LOD), бұл берілген аналитикалық процедураның көмегімен ақылға қонымды сенімділікпен анықталатын концентрация (95% ықтималдылық жиі қолданылады). Теориялық тұрғыдан мүмкін болатын ең сезімтал LOD-бұл ПТР-ға 3 көшірме (28), Пуассон таралуын ескере отырып, ПТР-ге кем дегенде 1 дананы қосудың 95% мүмкіндігі және бір көшірмелі анықтау. Эксперименттік процедуралар әдетте үлгіні өңдеу қадамдарын (яғни экстракцияны) және қажет болған жағдайда кері транскрипцияны қамтиды. Егер көлем өзгерсе және осы қадамдардың тиімділігі есептелсе, теориялық тұрғыдан мүмкін болатын ең сезімтал LOD тіннің нанограммасына көшірмелер сияқты экспериментке қатысты бірліктерде көрсетілуі мүмкін. Эксперименттік нәтижелер теориялық мүмкін болатын LOD -дан төмен болса, ешқашан хабарланбауы керек. Сонымен қатар, «0» нәтижелері мағынасыз және жаңылыстырады. qPCR талдауларындағы LOD бағалаулары С логарифмдік табиғатымен қиындайдыq, себебі C.q шаблон концентрациясы нөлге тең болғанда анықталмаған. QPCR -де LOD -ты тиісті анықтау мен модельдеу жалғастырылған зерттеулердің бағыты болып табылады (26).

2.2 Аналитикалық ерекшелік qPCR талдауы үлгідегі басқа да арнайы емес нысандарды емес, сәйкес мақсатты реттілікті анықтайды. Диагностикалық ерекшелігі талдау осы шарт үшін теріс деп анықтайтын, берілген шарты жоқ адамдардың пайызы.

2.3 Дәлдік бүктемелік өзгерістер немесе көшірме санының бағалаулары ретінде ұсынылған тәжірибелік өлшенген және нақты концентрациялар арасындағы айырмашылықты білдіреді.

2.4 Қайталану мүмкіндігі (қысқа мерзімді дәлдік немесе талдау ішіндегі ауытқу) бір талдауда қайталап талданған бірдей үлгілермен талдаудың дәлдігі мен беріктігін білдіреді. Ол C үшін SD ретінде көрсетілуі мүмкінq дисперсия Немесе көшіру саны немесе концентрация дисперсиясы үшін SD немесе түйіндеме қолданылуы мүмкін. CV-мен бірге түйіндемелерді қолдануға болмайдыqs, дегенмен( 29).

2.5 Қайта шығару мүмкіндігі (ұзақ мерзімді дәлдік немесе талдау аралық ауытқу) орындалу арасындағы немесе әртүрлі зертханалар арасындағы нәтижелердің өзгеруін білдіреді және әдетте көшірме нөмірлерінің немесе концентрацияларының SD немесе CV ретінде көрсетіледі. Cq Әртүрлі орындалулардан жасалған мәндер үзілістің өзіндік вариациясына (30) жатады, сондықтан есеп беру интервалы Cq вариация дұрыс емес.

Мақсатты гендерге арналған мРНҚ концентрациясын сипаттайтын басылымдар мақсаттың не екенін нақты көрсетуі керек. Көптеген адам гендерінің және басқа көпжасушалы организмдердегі көптеген гендердің транскрипттері балама түрде біріктірілген( 31)( 32) және бұл сплайсинг нұсқалары әртүрлі ұлпаларда немесе дамудың әртүрлі кезеңдерінде хабарланған сплайцинация үлгілеріндегі өзгерістері бар альтернативті ақуыз изоформаларын көрсетеді. Демек, бір экзонға негізделген RT-qPCR талдаулары қосылыстардың бірқатар нұсқаларын анықтауы мүмкін, ал интронды қамтитын праймерлер селективті болуы мүмкін, бірақ кейбір қосылыс нұсқаларын мүлдем өткізіп жіберуі мүмкін. Жақында экспрессиясында аллельдік теңгерімсіздікті көрсететін аутосомды таңбаланбаған гендер сипатталды (33). Біріктірілген бұл нәтижелер мРНҚ-ның бір немесе ең көбі 2 экзонына ғана бағытталған RT-qPCR талдауын пайдалану белгілі бір геннің экспрессия деңгейін сипаттау үшін енді жеткіліксіз екенін білдіреді. Демек, праймерлер үшін реттілік туралы ақпарат олардың спецификациясының белгілі нұсқаларына және бір нуклеотидті полиморфизм позициясына қатысты транскрипт пен бір нуклеотидті полиморфизм деректер базасында құжатталу ерекшеліктеріне баға берумен бірге берілуі тиіс. RTprimerDB дерекқорынан (34) (35) таңдалған праймер жиынтығы үшін бұл барлық тиісті ақпаратты қамтитын RTprimerDB веб -сайтынан (http://www.rtprimerdb.org) оңай орындалады. Коммерциялық талдаулар үшін лот туралы ақпарат және жеткізушілердің эксперименттік валидация критерийлері қажет. Тек силикода расталған тексерілмеген коммерциялық талдаулар мен талдаулардың нәтижелері туралы есеп беруден бас тартуға болады.

Есте сақтау керек, мРНҚ-ның бар-жоғын анықтау бұл мРНҚ-ның ақуызға ауысатыны туралы немесе, шын мәнінде, функционалдық ақуыздың трансляциялануы туралы ақпарат бермейді.

Иммуногистохимия, вестерн-блотинг немесе басқа ақуыз-сандық әдістер әрқашан сандық жасушалық мРНҚ деректерін растай алмайды. Қазір мРНҚ- және белок-концентрация деректері (36) арасында сәйкессіздік жиі болатыны жақсы дәлелденді, бұл әсіресе көп функциялы ақуыз кешендерінің бөлігі болып табылатын белоктарды анықтайтын мРНҚ-ларға қатысты (37). Ақырында, белгілі бір микроРНҚ -ның болуы мен қызметі туралы білу гендік экспрессияны түсіну үшін мРНҚ түрлерін санай алатындай маңызды екені белгілі болды (38).

РНҚ -ның сандық мәліметтерінің көпшілігі абсолютті емес, салыстырмалы екенін білу қажет. Осылайша, стандарттау үшін пайдаланылатын эталонды гендер немесе материалдар өте маңызды және RT-qPCR экспериментінің дұрыстығын бағалау кез келген салыстырмалы-сандық анықтаманың сәйкестігін ескеруі керек. Сондықтан әмбебап анықтамалық ДНҚ және РНҚ калибрлеу материалдарын жасау өте пайдалы (39)( 40) болса да, әмбебап панацея (41)( 42) болмайды.

RT-qPCR эксперименттерінде жасалған хабарланған өрнек мәндерінің дисперсиясының көп бөлігі тәжірибелік хаттамалардағы вариацияға ғана байланысты емес, сонымен қатар әр түрлі деректерді өңдеу алгоритмдері қолданатын түзетулерден туындайды, олардың әрқайсысы деректер туралы өз болжамдарын жасайды. Демек, qPCR жиі «тас» немесе «алтын стандарт» болып жарияланғанымен, іс жүзінде бұл «стандарт» айнымалы болып табылады және нәтижелер туралы есеп беру талдаулар мен түсіндірмелердің едәуір күрделі болуын талап етеді [43].


PMA-qPCR түрлендірілген өміршеңді жылдам өлшеу әдісі Лактобактерия spp. ашытылған сүт өнімдерінде

Өмірге қабілетті сүт қышқылды бактериялардың сандық көрсеткіштері ашытылған сүт өнімдерінің маңызды сапалық көрсеткіші болып табылады, бірақ табақтарды санау болып табылатын қазіргі анықтау әдісі көп уақытты қажет етеді. Бұл зерттеу жалпы өміршеңдігін анықтауға және санауға мүмкіндік беретін өзгертілген PMA-qPCR талдауын сипаттайды. Лактобактерия spp. ашытылған сүт өнімдерінде. Мұнда 24 тірек штаммның 16S rRNA гендік тізбегіне негізделген жаңа жұп праймерлер мен кіші ойық байланыстырғыш зондтар жасалған, олардың 13-і әр түрлі Лактобактерия коммерциялық ашытылған сүт өнімдерінде жиі қолданылатын түрлер. Кейіннен, жылуды өлтіру әдісімен салыстырғанда, PMA-qPCR бастапқы оңтайландыру үшін 20 циклды гомогенизация әдісі таңдалды. Стандартты қисықтар дайындалып, алынған тиімділік 97% құрады (R 2 = 0.992), бұл PMA-qPCR әдісінің мүмкін және тиімді екенін көрсетеді. Оған қоса, өміршең Лактобактерия spp. анықтау диапазоны ашытылған сүт өнімдеріндегі анықтау талаптарына сәйкес келетін 10 3–10 9 CFU/мл болды. Сонымен қатар, өміршеңдердің жалпы саны Лактобактерия spp. алты түрлі коммерциялық ашытылған сүт өнімдері үш жеке әдіспен бағаланды (MRS агар, qPCR және PMA-qPCR плиталар саны). PMA-qPCR және пластиналар санауымен алынған нәтижелерді салыстыру ұқсас болды, және екеуі де сәйкесінше төмендеді, бұл жарамдылық мерзімінің аяқталуынан 30 күн өткен соң штаммның өміршеңдігінің төмендеуімен жақсы корреляцияны көрсетеді. Бұл жұмыста белгіленген PMA-qPCR процедурасы өміршеңдігінің мөлшерін анықтауға мүмкіндік береді Лактобактерия spp. шамамен 3 сағ ішінде анықтау тиімділігін айтарлықтай арттырады және ашытылған сүт өнімдерін сынауда кең қолдану перспективаларына ие.

Бұл жазылу мазмұнының алдын ала қаралуы, сіздің мекеме арқылы кіру.


Праймерді күйдіруді оңтайландыру

Бұл қадамда праймерлердің мақсатты ДНҚ -мен байланысуын қамтамасыз ету үшін реакция температурасы төмендетіледі. Көбінесе 0,5-2 минут инкубация уақыты праймерді жасыту үшін жеткілікті. Жасыту температурасы балқу температурасын есептеу арқылы анықталады (Тм) ПТР күшейту үшін таңдалған праймерлер. Жалпы ереже - ең төменгі Т -ден 3-5 ° C төмен күйдіру температурасынан бастаум праймерлерден.

Т.м праймердің 50% және оның қосымша реттілігі дуплексті құрайтын температура ретінде анықталады және оны бірнеше тәсілдермен есептеуге болады. Праймерді бағалаудың қарапайым әдісі Tм формула бойынша ДНҚ олигосында болатын нуклеотидтер саны бойынша:

Тұз концентрациясы (Na +) праймерді күйдіруге әсер ететіндіктен, Т.м формуламен дәлірек есептеуге болады:

Т.м = 81,5 + 16,6(log[Na + ]) + 0,41(%GC) – 675/праймер ұзындығы

Олигоның әрбір көрші динуклеотид жұбының термодинамикалық тұрақтылығын тұздар мен праймерлердің концентрацияларымен үйлестіре отырып, Т.м сонымен қатар Ең жақын көрші әдісі деп аталатын әдіспен есептеуге болады [1,2]. Бұл әдіс сонымен қатар арнайы ДНҚ полимеразалары үшін ұсынылған праймерді жасыту температурасын анықтауға арналған онлайн құралымыздың негізі болып табылады.

Т. -да маңызды бір мәселем есептеу-бұл ПТР қоспаларын, қосалқы еріткіштерді және модификацияланған нуклеотидтерді қолдану. Бұл реагенттердің болуы Т -ны төмендетедім праймер-шаблондар кешені. Мысалы, 10% DMSO күйдіру температурасын 5.5-6.0 ° C төмендетуі мүмкін [3]. Сол сияқты, ПТР-де dGTP-ді 7-деаза-dGTP-мен ауыстыру да Т-ны төмендетеді.м. Бұл жағдайда күйдіру температурасы сәйкесінше реттелуі керек.

Назар аударыңыз, есептелген Тм мән праймерді жасыту үшін бастапқы эталондық температура ретінде берілген. Күшейту нәтижелеріне байланысты күйдіру температурасы қосымша оңтайландыруды қажет етуі мүмкін. Мысалы, егер нәтижелер күшейтілмесе немесе төмен болса, оңтайландыру кезінде күйдіру температурасы 2-3 ° С қадаммен төмендетілуі мүмкін. Егер спецификалық емес ПТР өнімдері пайда болса, онда спецификаны жақсарту үшін күйдіру температурасын 2-3 ° C (кеңейту температурасына дейін) өсіруге болады.4-сурет).

Сурет 4. Әр түрлі жасыту температураларына байланысты ПТР күшейту нәтижелері. Бұл тәжірибеде орнатылған праймердің есептелген күйдіру температурасы 54 ° С құрайды.

Бұл оңтайландыру қадамын барынша азайтуға және уақытты үнемдеуге көмектесу үшін кейбір ДНҚ полимеразаларының реакция буфері изостабилизациялық компоненттермен жасалған. Бұл арнайы құрам жасыту қадамы кезінде праймер-шаблон дуплекстерінің тұрақтылығын арттырады, осылайша өнімділікті жақсартады және ПТР ерекшелігін арттырады. Бұған қоса, буфер әмбебап температурада (мысалы, 60°C), тіпті әртүрлі балқу температурасындағы праймерлерде де ПТР праймер-үлгісін жасыту мүмкіндігін береді.

Бейне: ПТР үшін әмбебап күйдіру температурасының артықшылықтарын қараңыз

ПТР -дегі күйдіру қадамының маңыздылығын, ПТР арнайы әзірленген буферін қолдану арқылы оңтайландыру қадамдарын айналып өтуді және буфермен қосылатын әмбебап күйдіру температурасының артықшылықтарын біліңіз.

Күйдіру температураларын оңтайландыру үшін градиентті термиялық циклдің блоктары танымал опциялар болып табылады, мұнда ең жоғары және ең төменгі температуралар блок бойынша орнатылады, осылайша температураның ауытқуы бір уақытта бірқатар ұңғымалар немесе реакциялар бойынша бағалануы мүмкін. Практикада ұңғымалардың температурасын дәл бақылайтын шынайы градиентке жету қиын және ПТР оңтайландыру кезінде температураны дәл бақылау үшін бөлек қыздыру/салқындату қондырғылары бар «градиенттен жақсы» блоктар ұсынылады (Сурет 5). (Толығырақ: Жылулық велосипедшілердің пікірлері).

Сурет 5. «Градиенттен жақсы» стандартты градиенттік технологияларды қолдана отырып, жылу циклдерінің блоктық температурасын салыстыру.


5 ҚОРЫТЫНДЫ

Басқарушылық шешімдер eDNA сауалнамасының нәтижелерін қолдана отырып қабылданады, сондықтан eDNA зерттеулерінің деректері сенімді, қорғалған және жоғары сапалы кепілдік стандарттарымен орындалуы керек. Қоршаған ортаның ДНҚ талдауын әзірлеу, тестілеу және валидациялау - бұл процестің маңызды қадамдары, және eDNA қауымдастығында талдаудың нақты анықтамалары қажет. Белгілі концентрациялары бар тамаша жағдайларда өнімділіктің талдау сапасының көрсеткіштерін хабарлау кез келген eDNA зерттеуіндегі бірінші қадам болып табылады және одан кейін дала үлгілерін пайдаланып талдаудың қосымша көрсетілімі қажет. Талдау шектеулерін түсіну қалған eDNA зерттеу хаттамаларын құру үшін берік негіз береді. Біз eDNA зерттеулеріне қолданылуы мүмкін анықтамалар мен анықтау әдістерінің біріккен жиынтығын сипаттаймыз және анықтамалар мен тәсілдер өз кезегінде осы көрсеткіштерді түсіндіру мен пайдалануды бағыттайды. Осы және басқа qPCR өнімділік көрсеткіштерінің анық есеп беруі qPCR деректерін зерттеулер бойынша бағалауды және салыстыруды жеңілдетеді және ресурстар менеджерлеріне шешім қабылдау үшін дұрыс негіз береді.


GM санының нақты уақыт режиміндегі ПТР репликациясының минималды санын бағалауға арналған имитациялық тәсіл

Азық-түлік пен жемдегі генетикалық түрлендірілген (GM) ингредиенттерді сандық анықтау әдетте нақты уақыттағы сандық ПТР (RT-QPCR) пайдаланады. Соңғы жылдары көптеген жаңа RT-QPCR талдаулары әдіс өнімділігін арттыруға көмектесті. Осы талдаулардағы үлгіні қайталау деңгейі жоғары сенімді нәтижелерді алу үшін ескеру қажет негізгі аспект болып табылады. Бұл мақалада біз ПТР репликациясының әр түрлі деңгейлерінің әсерін нәтижеге байланысты өзгергіштік тұрғысынан объективті бағалау үшін GM және RT-QPCR деректер жиынтығына қолданылатын модельдеу әдісін қолдануды сипаттаймыз және бұл мүмкін екенін көрсетеміз. Нәтиженің сенімділігін кейіннен төмендетпестен, репликацияның төмендетілген деңгейін пайдаланыңыз. Мысал деректер жиынын пайдалана отырып, біз нәтиженің орташа мәнін айтарлықтай өзгертпестен, репликацияның үлгі деңгейін алтыдан үш ПТР репликасына дейін төмендетуге болатынын көрсетеміз. Мұндай тәсілді пайдалану дәл нәтиже алу үшін қайталаулардың ең аз санын пайдалануды жеңілдетеді, осылайша сандық талдауларға қатысатын маңызды ресурстарды үнемдейді.

Бұл жазылу мазмұнының алдын ала қаралуы, сіздің мекеме арқылы кіру.


Қосымша деректер файлдары

Бұл жұмыстың онлайн нұсқасында келесі қосымша деректер бар: geNorm өрнегінің тұрақтылық сюжеттерін көрсететін сурет (Қосымша деректер файлы 1) нейробластома үлгі жиынтығында miRNA CV орташа мәнін көрсететін сурет (Қосымша деректер файлы 2) cumulative distribution of miRNA CV values (Additional data file 3) a figure showing ChIP-chip results for the miR-17-92 cluster (Additional data file 4) a figure showing ChIP-qPCR results for the miR-17-92 cluster (Additional data file 5) a figure showing ChIP-chip results for the miR-181a-1/miR-181b-1 cluster (Additional data file 6) a figure showing miR-17-92 expression in neuroblastoma cell lines (Additional data file 7) a figure showing overall differential miRNA expression in the neuroblastoma sample set (Additional data file 8) a figure showing fold change expression difference correlation for MYCN downregulated miRNAs (Additional data file 9) a figure showing hierarchical clustering of neuroblastoma cell lines based on miRNA expression (Additional data file 10) a table listing the MIQE checklist (Additional data file 11) a collection of RDML files containing miRNA expression for all data sets (Additional data file 12).


Бейнені қараңыз: Quantitative PCR explanation (Ақпан 2023).