Ақпарат

Метанол фиксациясы өсірілген жасушаларды деформациялай ма?

Метанол фиксациясы өсірілген жасушаларды деформациялай ма?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Өсірілген жасушаларда иммунофлуоресценция талдауларын орындаған кезде мен метанолды бекітуді (10 минут бойы @ -20⁰C) қолданамын. Жалпы айтқанда, бұл антиденелерді өте жақсы бояуға әкеледі. Алайда, жасушалар фиксацияға дейін фазалық контрастты микроскопияға қарағанда айтарлықтай ерекшеленеді. Бұл менің ПИ -ді бұл суреттерді рецензенттер қалай қабылдайтыны туралы алаңдатады.

Метанол фиксаторы қалай жұмыс істейді және неге жасуша морфологиясының өзгеруіне әкеледі? Бұл әсерді азайту үшін реттелетін параметрлер бар ма?


Иә, кез келген түрдегі фиксация морфологияға әсер етуі мүмкін. Егер сіз ақуызға толы майлы қабықты (яғни жасуша мембранасын) алып, оны қатаң етіп жасасаңыз, сізде кейбір айырмашылықтар болады.

Мұның қызықты көрінісін целлофан/шөгілетін ораманы серологиялық тамшуырға орап, құрғақ мұзға және метанол ваннасына батыру арқылы жасауға болады. Бұл гистология жұмысына кіріспес бұрын мен студенттерге үнемі көрсететін нәрсе.

Сізге қажет нәрсеге оралыңыз. Сіз қандай жасушаларды қолданасыз және нені өсіресіз? Сіз ацетонды бекітіп көрдіңіз бе және ол сіздің пластикті бұзғанын білесіз бе? Ацетонды бекітуге қажетті уақыт пен концентрация жеткілікті аз, сондықтан көптеген заманауи камера слайдтары оны жеңе алады. Бекіту кезінде мембрананың өткізгіштігі қажет пе?

Мен сіз өлшейтін негізгі әсерді білмеймін, бірақ сізде жақсы бақылаулар бар деп есептесеңіз, оны бекітуден өткеннен кейін көре аласыз. Бақылау құралдарының әсері емделген топтарға ұқсас болуы керек, егер емдеуге арнайы фиксатор әсер етпесе.

Кейбір жалпы ұсыныстарға көшу. Менің ойымша, сіз оларды алып тастаған түзеткіштерді қайта қарауыңыз керек, өйткені мен олардың қолданылуына сенімді емеспін. Мен студенттерге үнемі жүгінуді ұсынатын негізгі дереккөз - тапсырмаға сәйкес келетін Уайлидің «Х-дегі ағымдағы протоколдар» кітабы. Бұл жағдайда ең өзекті мәтін деп ойлаймын Иммунологиядағы қазіргі хаттамалар, және сәйкес бірлік 21.4 «Иммуногистохимия».

Менің ойымша, егер сіз формалинді маскировкамен айналысатын болсаңыз, бұл сұраққа өте пайдалы және маңызды - 21.4.3 -кесте.

Бұл адам антигендеріне арналған, бірақ «антигенді алу» процесі көп жағдайда тышқан жасушалары үшін жұмыс істейді. Сіз антиген формалинмен блокталуы мүмкін деп дұрыс айтасыз, бірақ көбінесе шешімді шешпейді, өйткені MtOH көбінесе морфологияға қатал. 1 протоколды қолдау үшін:

Формалин немесе параформальдегид фиксациясы ақуызды айқастырып, көбінесе антигендерді арнайы антиденелер үшін қолжетімсіз етеді. Әр түрлі рН буферлерімен жоғары температураны біріктіретін антигенді іздеу хаттамасы бекітілген ұлпада немесе тіркелген жасушалық препараттарда, әсіресе ядро ​​немесе цитоплазмадағы детерминанттарда маскалануы мүмкін антигендік детерминанттарды маскировкалауда өте тиімді болды (Тейлор мен Ши, 2013).

Менің хаттаманы өзгерту:

Натрий цитратының буфері: 0,1 М лимон қышқылы/0,1 М натрий цитраты, рН 6,0

  1. Үлгіні лайнер -рокерде 5 минут д/к культура көлемінде 5 минут бойы жуыңыз. H2O
  2. Слайдтарыңызды 1мМ цитрат буферіне Coplin құмыраларына салыңыз, қақпағы сәл жабық
  3. Құмыраны соңғы күйінде өлшеңіз, сонда сіз қанша су қосу керектігін білесіз
  4. Микротолқынды пеш 4-7 мин. Сіз оның қайнағанын қаламайсыз, және сіз желдетуге рұқсат беруді ұмытпауыңыз керек
  5. Құмыраны қайтадан өлшеп, суды қосыңыз
  6. Микротолқынды пеште тағы 4-7 минут пісіріңіз, қайтадан қайнатқыңыз келмейді
  7. Пештен шығарып, орындыққа отырғызып, оны бөлме температурасына дейін жеткізіңіз. Егер сіз мұны тым тез жасасаңыз, сіз мембрананы бұзасыз.
  8. Бөлме температурасына оралғаннан кейін, 2x PBS+0,05% Tween20 қоспасын 10 минуттан жуыңыз.
  9. IHC қайталап көріңіз, ол қазір жұмыс істейтін шығар.

Эпидермистің өсу факторы рецепторының GFP синтездік ақуызына қолданылатын жабысқақ өсірілген жасушалар үшін фиксация протоколдарын салыстыру

Белоктардың субклеткалық таралуын талдау сигнал беру сияқты процестерді түсіну үшін өте маңызды. Көптеген жағдайларда көптеген компоненттерді параллель талдау фиксинг пен иммунофлуоресцентті таңбалауды қажет етеді. Сондықтан фиксация процедурасы in vivo ақуыздың таралуын сақтайтынына көз жеткізу керек. Жасыл флуоресцентті протеинмен (GFP) біріктірілген ақуыздар осы мақсат үшін тамаша құрал болып табылады. Дегенмен, флюорофор түзілуінің немесе деградациясының ерекше аспектілерін, яғни GFP синтез белоктарын анықтауға кедергі келтіруі мүмкін реакцияларды ескеру қажет.

Әдістері:

Эпидермальды өсу факторы рецепторының (EGFR) GFP -мен, сондай -ақ жабысқақ культуралы жасушаларда тұрақты немесе уақытша бос еркін еритін GFP -нің синтездік белоктары in vivo таралуды кәдімгі эпифлуоресценция мен лазерлік сканерлеу микроскопиясымен бекітілгеннен кейін салыстыру үшін сынақ жағдайлары болды. Жанама иммунофлуоресценция GFP сигналының және синтез ақуызындағы GFP полипептидінің таралуын салыстыру үшін қолданылды.

Нәтижелер:

Параформальдегидті (PFA) фиксациялау кейіннен Mowiol антифагентті агентіне бекітеді, бірақ Tris- немесе HEPES буферлі тұзды ерітіндісінде емес, плазмалық мембранадан EGFR-нің перинуклеарлық аймаққа ішінара қайта бөлінуіне әкелді. Қайта бөлу GFP және EGFR иммунофлуоресценциясымен расталды. Mowiol орнатылған жасушалардағы in vivo таралуы сақталды, егер жасушалар PFA/метанолды бекіту процедурасымен өңделсе, ол еритін ГФФ флуоресценциясын сақтайды. Анти-GFP антисарысу N-терминалды синтез ақуызы үшін теріс болды.

Қорытындылар:

Біріктірілген PFA/метанол протоколы трансмембраналық және еритін цитоплазмалық ақуыздарды бекіту үшін әмбебап қолданылады және GFP флуоресценциясын сақтайды. Цитометрия 35: 353-362, 1999. © 1999 Wiley-Liss, Inc.


Кіріспе

Эмбриондық дің жасушаларын (ESC) және индукцияланған плюрипотентті дің жасушаларын (iPSCs) қоса алғанда, плюрипотентті дің жасушалары (ПСК) регенеративті медицинада, ауруларды модельдеуде және жасушалық терапияда үлкен үмітке ие 1,2,3. PSC өсіру үшін митомицин С (MMC) немесе гамма-сәулеленумен өңделген тышқанның эмбриондық фибробласттары (MEFs) әдетте өзін-өзі жаңартуды және плюрипотенттілікті 4,5,6 сақтау үшін фидер жасушалар ретінде пайдаланылды. Жақында химералардағы эмбрионға сәйкес және плацента трофобласттарына үлес қосатын кеңейтілген/кеңейтілген потенциалды дің жасушалары (EPSCs) да MEF фидер жасушаларында құрылды және өсірілді 7,8. MMC-MEF қолданудың болжамды себептері МЭФ лейкемия ингибиторлық факторы (LIF), фибробласттың өсу факторы (FGF), сүйек морфогенетикалық ақуызы (BMP) және т.б. қоса алғанда өсу факторларын шығаруы және бөлуі мүмкін болғандықтан болды. 9,10,11, ХҚКО -ны плюрипотентті күйде ұстау. Дегенмен, MMC және MEF фидер жасушаларын радиациялық өңдеуді қолданудың көптеген кемшіліктері болды. Біріншіден, МЭФ дайындау - күрделі және уақытты қажет ететін процесс 12,13. Екіншіден, MMC қымбат және қалдық MMC ESCs 14 -ке цитотоксикологиялық әсер етуі мүмкін. Сонымен қатар, гамма -сәулеленуді қолдану үшін арнайы жабдықтар мен құрылғылар қажет. Үшіншіден, жануарлардан алынған MEFs адамның әлсірететін ауруларын емдеу үшін пайдаланылуы мүмкін 16,17 мәдениетті адам PSCs қолдануын шектейтін ксеногендік компоненттерді сақтайды. Сондықтан фидерсіз культура жүйелері MEF фидер жасушаларын ауыстырудың балама тәсілдері болып табылады. Рекомбинантты және синтезделген макромолекулалармен қапталған мәдени тағамдар, оның ішінде желатин 18, матригел 19, 20,21,22 жасушадан тыс матрицалық протеиндер, синтетикалық полимерлер 23,24, гидрогель 25,26, рекомбинантты Е-кадхерин субстраты 27, гликозаминогликан 27 және олигопептид 28, сонымен қатар 28,29,30 өлшемді 3D тіректері ХҚО өңдеу үшін әзірленді және қолданылды. Дегенмен, бұл әдістер трансплантация қолданбаларында ықтимал проблемалары болуы мүмкін немесе арнайы өсу факторлары мен медианы қажет ететін жануарлар өнімдерін пайдаланады.

Жақында есептер глютаральдегид (GA) мен формальдегид (FA) химиялық заттары тінтуір мен адамның ХҚКО 31,32,33 плурипотенттілігін сақтау үшін пайдаланылатын фидерлік жасушаларды түзете алатынын көрсетті. GA және FA қалдықтарын PBS арқылы бірнеше рет жуу үшін қажет болатын GA және FA көмегімен химиялық бекіту процедуралары, содан кейін бекітілген жасушаларды 4 ° C температурада сақтауға немесе алдымен мұздатып кептіруге және одан әрі пайдалану үшін бөлме температурасында сақтауға болады 31, 32,33. Қоректендіргіш жасушалардың GA және FA фиксациясының негізгі тұжырымдамасы фидер жасушаларын жасаудың дәстүрлі әдісін ауыстырудың ыңғайлы әдісін қамтамасыз етуі мүмкін.

Жасушадан тыс матрица (ECM) жасуша бетінің рецепторларымен және адгезия молекуласымен байланысу арқылы діңгек жасушаларының адгезиясына, көші -қонына, дифференциациясына және көбеюіне әсер етеді, мысалы, 34,35,36. ӨСҚ қажет ететін өсу факторлары мен цитокиндерді шығара алмайтын метанолмен бекітілген фидерлік жасушалар әлі де ECM ақуыздарын бекітілген жасушалардың бетінде сақтайды және өздігінен жаңару мен дифференциация арасындағы тепе-теңдікті бақылау үшін ХҚК үшін сигналдар береді. Коллагеназа-IV-коллаген-IV, фибронектин, ламинин және витронектин 37 сияқты ECM ақуыздарын ыдырататын металлопротиназа матрицасының бірі. Осылайша, коллагеназа-IV емдеу метанол бекітілген фидер жасушаларының бетінен коллаген-IV мен фибронектинді кетіруге қабілетті. Демек, жасушалар коллагеназа-IV өңделген метанолмен бекітілген фидер жасушаларында өсірілгенде, PSC-тердің плюрипотенттілігі мен адгезия қабілетіне әсер етуі мүмкін.

Бұл зерттеуде біз PSC өзін-өзі жаңартуды және ұзақ мерзімді кеңейту үшін плюрипотенттілікті сақтаудың жаңа әдісін әзірледік. Метанолмен бекітілген фидер жасушалары тышқан, адам және шошқаның плурипотентті бағаналы жасушаларын өсіру үшін ғана емес, сонымен қатар антибиотиктерге төзімді скрининг және қайталап қолдану үшін де қолданылды. Сонымен қатар, біз ECM протеиндерінің коллаген-IV мен фибронектиннің ХҚК-ны бекіту және ХҚК-нің қарапайым плюрипотенттілігін сақтау үшін шешуші маңызы бар екенін көрсеттік.


Органикалық еріткіштер

Органикалық еріткіштер белоктарды тұндыратын және липидтерді бөліп алатын сусыздандыру әдісі арқылы үлгілерді бекітеді. Үлгілерді бекіту үшін ең көп таралған органикалық ерітінділер - метанол, этанол және ацетон. Метанолды бекіту мұз тәрізді метанолмен өсірілген жасушалармен бірнеше минут ішінде орындалуы мүмкін және жасушаның өткізгіштігінің қосымша артықшылығы бар. Тағы бір артықшылығы - альдегидтерге қарағанда алкогольді зертханада қолдану әлдеқайда қауіпсіз.

Органикалық еріткіштерді қолданудың кемшіліктері - олар цитозолды немесе ядролық ақуыздарды бөліп алады, ал үлгі дегидратация мен регидратациядан өтеді, бұл органеллалар мен жалпы жасушалық құрылымды бұзуы мүмкін.


Бекіткіш агенттерді салыстыру: IF үшін метанол мен ацетон

Иммунофлуоресценция - мақсатты антигендерді анықтау үшін флуоресцентті таңбаланған антиденелерді қолданатын күшті әдіс, бірақ фиксация әдісін таңдау алынған нәтижелерге үлкен әсер етеді.

Біз жасушаларды жөндегенде, мақсат - бұл құрылымды мүмкіндігінше жергілікті күйге жақын ұстау, сонымен қатар антиденелерге олардың антигендеріне қол жеткізуге мүмкіндік беру.

Иммунофлуоресценцияны бекіту үшін екі негізгі топ қолданылады. Бұл альдегидті бекітетін заттар және органикалық еріткіштер. Көптеген жағдайларда альдегидті фиксаторларды қолданатын кросс-байланыс әдісі жақсырақ, өйткені ол жасуша құрылымын жақсы сақтайды, бірақ антигенділіктің төмендеуі де болуы мүмкін, яғни бұл әрдайым бола бермейді.

Бұл антигендердің өздері де өзара байланысты болғандықтан, сіздің антиденеңізді антигендерді тануға кедергі келтіреді. Айқас байланыстыруға байланысты проблемаларды болдырмау үшін альдегидтермен бекіткеннен кейін органикалық еріткіштерді немесе өткізгіштік сатысын қолдануға болады.

Бұл блог жазбасында біз ең көп таралған екі органикалық еріткіш пен метанол мен ацетонды қолданғанда күтуге болатын негізгі айырмашылықтарды қарастырамыз.

Біріншіден, органикалық еріткіштер қалай жұмыс істейді?

Метанол мен ацетон дегидрогенизация мен ақуызды тұндыру арқылы әсер етеді, осылайша ақуыздарды бекітеді. Бұл дегеніміз, жасушалар бірден өткізгіш болады.

Метанолдан бастап, біз сізге органикалық еріткіштерді фиксатор ретінде қолданудың оң және теріс жақтарын және оларды қашан қолдану керектігін айтатын боламыз.

Метанол көбінесе мұздатылған бөліктерді, жасуша өсіру жасушаларын немесе жағындыларды бекіту үшін қолданылады.

Жасушалық архитектураны сақтау.

Мұздатылған тіндердің бөлімдері мен жасушалары.

Ақуыздардың екіншілік құрылымын тұрақтандыру.

Формальдейхпен байланыстыру проблемаларын болдырмау.

Көптеген эпитоптарға күшті әсер етеді

Суда еритін және липидті компоненттер жоғалуы мүмкін.

Үшінші құрылымды ақуыздарға әсер етеді

Метанолды қашан қолдану керек?

Микротүтікшелердегі антигендерді визуализациялауға тырысқанда метанолды қолдану керек.

Мен білуім керек басқа нәрсе бар ма?

Метанол жиі -20С температурада қолданылады. Мұның себептері әртүрлі, айқынырақ иммунофлуоресценция суреттерінен процесті бақылауға дейін, өйткені метанолды қолдану жылдам процесс және оны осы төмен температурада қолданбаған болсаңыз, ұстап тұру үшін липидтер жеткіліксіз болуы мүмкін. кез келген құрылым.

Күшті сусыздандыратын агент, ол ұлпа ақуыздарының қайтымсыз тұнбасын тудыруы мүмкін.

Кейде эпитопаларға аз зиян келтіреді.

Еритін және липидті компоненттер жоғалады.

Ацетонды қашан қолдануым керек?

Метанолға қарағанда гистологиялық жақсы сақтау үшін.

Эпитоптарды жоғары дәрежеде сақтау.

Мен білуім керек басқа нәрсе бар ма?

Ацетон өткізгіш болады және басқа өткізгіштік қадам жасаудың қажеті жоқ.

Ацетонды -20 кезінде де қолдану керек.

Метанол мен ацетонды бірге қолдансаңыз қалай болады?

Сондай-ақ, ацетон эпитоптарға аз зиян келтіретіндіктен, метанол мен ацетон комбинациясын қолдануға болатынын атап өткен жөн. Ацетон мұздатылған тіндерге қолданылады, оларды тұндырады, содан кейін бекіту үшін метанол қолданылады.

Кейде ацетон метанолдан кейін сусыздандыру үшін қолданылады.

Метанол мен ацетон иммунофлуоресценциясын қолдану туралы ойларыңыз бен тәжірибеңіз қандай? Төменде түсініктеме беріңіз немесе бізге @CiteAb сайтында жазыңыз.

– Элеонора және CiteAb командасы

Егер сіз көбірек білгіңіз келсе, мұнда қосымша оқу ұсынылады:

IF -те CiteAb -те қолдануға арналған антиденелерді шолыңыз [Сілтеме]

R&D жүйелері: IHC/ICC үлгілерін сәйкес бекіту [Сілтеме]

Bitesize Bio: Жасуша мен тіндерді бекіту 101 [Сілтеме]

Ғылыми зертхана: Иммунофлуоресценцияға үлгіні қалай дайындау керек [Сілтеме]

[email protected]: Иммунофлуоресценция үшін жасушаны бекіту шарттарын оңтайландыру [Сілтеме]


19-тарау Агар-қабатты иммунофлуоресценция: цитоскелеттік компоненттерді және олардың химотаксис кезіндегі өзгерістерін жоғары ажыратымдылықпен зерттеу

Бұл тарауда кәдімгі иммунофлуоресценция кездесетін екі негізгі мәселені еңсеретін агар-қабат әдісі сипатталған. Бұл (1) формальдегидтің фиксациясы нәтижесінде пайда болатын жасушалардың күрт жиырылуы және/немесе деформациясы және (2) дөңгелек немесе цилиндрлік пішінге байланысты флуоресценцияның қабаттасуына байланысты жеткіліксіз ажыратымдылық. Диктиостелий жасушалар. Бұл мәселелер суық абсолютті метанолмен лезде фиксацияны жүргізе отырып, тірі жасушаларды жұқа агарозды парақтың қабатымен тегістеу арқылы шешіледі. Бұл процедура қалыңдығы 1-2 pm және ені 20-30 pm болатын жасушаларға әкеледі және жіп тәрізді құрылымдарды фокустық жазықтыққа параллель бағыттауға көмектеседі. Жоғары титрлі моноклональды антиденелерді қолдану арқылы актиннің, миозиннің және тубулиннің спецификалық таралуы Dictyostelium-да сипатталған. Миозин жіпшелері химотактикалық ынталандыруға динамикалық түрде жауап беретін таралуын уақытша өзгертетіні көрсетілген. «Агар-қабаттасу» иммунофлуоресценциясы, әдетте, ұсақ және дөңгелек омыртқасыздар үшін бұлшықетсіз жасушалар мен төменгі организмдердің жасушалары үшін пайдалы болып көрінеді. Бұл әдіс цитоскелеттік элементтердің динамикалық ерекшеліктері мен егжей -тегжейлі ұйымдастырылуы туралы құнды ақпарат бере алады, әйтпесе оларды жеткілікті ажыратымдылықпен көруге болмайды.


Сипаттама

Микроскопиялық бейнелеу арқылы жеке ұяшықтардағы сигналдық оқиғаларды талдау бейнелеусіз әдістерге қарағанда бірнеше артықшылықтарға ие. Цитометрияны бейнелейтін пластинаны оқудан және басқа да бір жасушалы әдістерден, мысалы, ағынды цитометриядан, бейнелеудің басты артықшылығы - жасуша асты және жасушадан тыс ұзындық шкалалары бойынша морфологиялық және кеңістіктік ақпаратты жинау мүмкіндігі. Бұл дәрі-дәрмектің цитотоксикалық скринингі үшін жасуша негізіндегі талдаулар үшін артықшылық болуы мүмкін, мұнда тіпті салыстырмалы түрде қарапайым морфологиялық өлшемдер, мысалы, ядро ​​аймағы, клиникалық нәтижені болжайтыны көрсетілген. Бейнелеу цитометриясы бірнеше жүздеген жабысатын жасушалар туралы кеңістіктік ақпаратты жинай алады, сонымен қатар жалғыз жабысатын жасушалардағы сигналдың сандық көрсеткіштерін және популяциядағы жасушалар арасындағы айырмашылықтардың сандық көрсеткіштерін қамтамасыз етеді. Біз миозиннің жеңіл жасушаларының фосфорлануының сандық, жасушалық иммунофлуоресценттік талдауын жасаудың орындылығын қарастырдық, миозин жасушалық бөлінуді қоса алғанда, көптеген маңызды жасушалық процестердің маңызды делдалы болып табылады.

Микроскопияның артықшылықтарын пайдалану үшін үлгінің жалпы морфологиясын сақтау және сонымен бірге миозиннің жеңіл тізбегі фосфорлануы үшін оңтайлы сигнал алу маңызды болды. Біз алдымен бірнеше бекіту әдістерін скрининг үшін сапалы критерий ретінде жалпы жасуша морфологиясын пайдаландық. Біз төрт түрлі фиксация реагенттерін тексердік: этанол (EtOH), метанол (MeOH), ацетон (Ac) және параформальдегид (PFA). PFA жасуша морфологиясын жақсы сақтайды, ал этанол, метанол және ацетонды органикалық еріткіштер фиксатор ретінде әр түрлі нәтиже береді, ал кейбір жағдайларда үш еріткіштің кез келгенін қосқанда жасушалардың жиналуына әкеледі (деректер ұсынылмайды). РФА фиксациялық реагент ретінде таңдалды, және өткізгіштіктің оңтайлы стратегиясын таңдау үшін өткізгіштіктің төрт түрлі әдісі скринингтен өткізілді. Бөлме температурасында PFA арқылы фиксациядан кейін жасушалар метанолмен (PFA+MeOH, 4°C), этанолмен (PFA+EtOH, 4°C), ацетонмен (PFA+Ac, 4°C) немесе тритон X-100-мен өткізгіштікке ие болды. PBS (PFA+TX100, бөлме температурасы). Біз сонымен қатар 0,5% тритон X-100 ерітіндісіне PFA ерітіндісіне (PFATX, бөлме температурасы) қосу арқылы бір мезгілде бекіту мен өткізгіштік процедурасын тексердік. Өткізгіштік әдісті бағалау критерийі ретінде ф-актиннің кернеу талшықтарының бойында фосфо-MLC антиденелерінің бояуы болуы пайдаланылды. Әр түрлі өткізгіштік әдістері бояу үлгілерінде айқын айырмашылықтарға әкелді. Жоғарыда келтірілген критерийлерге сүйене отырып, PFATX миозинді жеңіл тізбекті фосфорлану мен актиндік кернеу талшықтарын сақтауға арналған әдістердің ішінде оңтайлы деп табылды.

Осы үлгіні бекіту әдісін пайдалана отырып, миозиннің жеңіл тізбегінің фосфорлануы MLC фосфорлануын тежейтін препарат концентрациясын жоғарылату функциясы ретінде өлшенді және алынған мәндер Western blotting әдісімен орындалған ұқсас өлшемдермен салыстырылды және эквивалентті деп табылды. Талдау қосымша әдіспен расталды, соның ішінде ECM тығыздығын өзгерту, миозин фосфорлануын белсендіру және талдауды басқа жасуша түрінде орындау. Бұл әрекеттің негізгі құрамдас бөлігі NIST-те жоғары контрастты бояуды пайдалана отырып, жасуша денелерін таңбалау және сегменттеу үшін бұрын әзірленген инфрақұрылымның және автоматтандырылған микроскопияға арналған құралдардың болуы болды.


Сілтемелер

Баспагерден бас тарту: Бұл баспаға қабылданған өңделмеген қолжазбаның PDF файлы. Біз өз клиенттерімізге қызмет ретінде қолжазбаның алғашқы нұсқасын ұсынамыз. Қолжазба соңғы дәйексөз түрінде жарияланғанға дейін көшіруден, теруден және алынған дәлелдемелерді қараудан өтеді. Өндіріс процесінде мазмұнға әсер етуі мүмкін қателер табылуы мүмкін екенін ескеріңіз және журналға қатысты барлық заңды жауапкершіліктен бас тарту туралы мәлімдемелер.


Эндотелиалды жасуша трансвеллінің миграциясы мен инвазиясын талдаудың хаттамалары

Трансмиграциялық талдау хаттамасы

1. Эндотелий жасушаларының культурасын дайындаңыз. 5X10 3 жасуша/см 2 (немесе тиісті өнім нұсқаулығында ұсынылғандай) PromoCell эндотелий жасушаларын ұсынылған эндотелий өсу ортасын қолданатын қолайлы культуралық сауытта. Қоректік ортаны әр 2-3 күн сайын ауыстырыңыз. Жасушалардың 70-90% қосылу деңгейіне жетуіне рұқсат етіңіз.
2. Талдау ортасын дайындаңыз. Эндотелиалды жасушалық базалық ортаға 10% FBS қосу арқылы талдау ортасының тиісті мөлшерін дайындаңыз (мысалы, 9 мл базальды орта + 1 мл FBS).
3. Медиа мен реагенттерді бөлме температурасына реттеңіз. Талдау ортасы мен PromoCell DetachKit компоненттерін бөлме температурасында 1-2 сағат бойы алдын ала қыздырыңыз.
4. Сынақ ортасын дайындаңыз. Зерттелетін затты талдау ортасында ерітіңіз. 24 ұңғымалы пластинаның бір ұңғымасына 750 мкл сыналатын ортаны қолдану керек. Оң бақылау ретінде пайдалану үшін 20 нг/мл VEGF немесе bFGF бар бір қосымша сынақ ортасын дайындауды ұсынамыз. Теріс бақылау құралы ретінде химиотактикалық факторсыз қолдануға болады.
5. 24 шұңқырлы пластиналарды дайындаңыз және сынақ ортасын қосыңыз. 24 ұңғымалы пластинаның ұңғымаларына жасушалық культура кірістірулерін салыңыз. Әрбір ұңғыманың сыртқы бөлігіне 750 мкл сынақ ортасын қосыңыз.
6. Эндотелий жасушаларын ажыратыңыз. Эндотелий жасушалары 70-90% қосылуы керек. Қоректік ыдыстан ортаны алып тастаңыз және 200 мкл/см 2 PBS (D8537) қосу арқылы жасушаларды жуыңыз. PBS алыңыз және 100 мкл/см 2 трипсин/EDTA (T3924) қосыңыз. Кемені жабыңыз және жасушаларды микроскоппен тексеріңіз. Ұяшықтар ажырай бастағанда, қалған ұяшықтарды босату үшін ыдыстың жағын ақырын түртіңіз. 100 мкл/см 2 трипсинді бейтараптандыру ерітіндісін (T6414) қосу арқылы трипсин ерітіндісін бейтараптандырыңыз және культуралы ыдысты 30 секундқа ақырын шайқаңыз.
7. Ұяшықтарды санаңыз. Жасуша суспензиясын центрифуга түтігіне ауыстырып, түтікшені бөлме температурасында 220 х г 4 минут бойы айналдырыңыз. Супернатантты алып тастаңыз және жасуша түйіршіктерін 5 мл талдау ортасына қайта салыңыз. Ұяшық нөмірін стандартты процедураға сәйкес анықтаңыз.
8. Клетка мәдениетіне кірістірілген жасушалар. Жасушаның концентрациясын талдау ортасымен 1x105 жасушаға/мл сұйылтыңыз. 24 ұңғымалы пластинадағы жасуша культурасының кірістірулеріне 500 мкл жасуша суспензиясын (= 5X10 4 ұяшықтар) мұқият қосыңыз.
9. Трансмиграция экспериментін бастаңыз. 24 ұңғымалы пластиналардағы жасушаларды ылғалдандырылған инкубаторға (37 ° C, 5% СО)2) 3-6 сағат ішінде. Инкубация уақытында мембранада зерттелетін заттың градиенті дамиды. Жасушалар кеуектер арқылы градиент бойымен мембрананың төменгі жағына қарай жылжиды және сол жерде жабысады.
10. Мембрананың жоғарғы жағындағы қоныс аудармайтын жасушаларды алып тастаңыз. Барлық жасуша культурасының кірістірулерінен ортаны абайлап алып тастаңыз. Содан кейін, пинцет көмегімен кірістірулерді алып тастаңыз және әр ұңғымадан ортаны сорыңыз. Енгізулерді ұңғымаға қайтарғаннан кейін, мақта тампонын пайдаланып мембрананың жоғарғы жағындағы миграцияланбаған жасушаларды алып тастаңыз. Құдық пен кірістіру арасындағы саңылауға PBS тамызыңыз.
11. Миграцияланған жасушаларды бекіту және бояумен жалғастырыңыз.

Инвазиялық талдау хаттамасы

1. Эндотелий жасушаларының культурасын дайындаңыз. Ұсынылған эндотелий өсу ортасын қолдана отырып, қолайлы культуралық ыдыста PromoCell эндотелий жасушалары 5X10 3 жасуша/см 2. Қоректік ортаны әр 2-3 күн сайын ауыстырыңыз. Жасушаның 70-90% қосылу деңгейіне жетуіне рұқсат етіңіз.
2. Инвазиялық талдау камераларын дайындаңыз және ортаны және реагенттерді тиісті температураға реттеңіз. Эндотелий жасушаларының негізгі ортасына 10% FBS қосу арқылы талдау ортасының сәйкес мөлшерін дайындаңыз (мысалы, 9 мл негізгі орта + 1 мл FBS). Әрбір ұңғымаға 750 мкл талдау ортасын және жасуша культурасының кірістіруіне 500 мкл Matrigel/ECM гелін қосыңыз. 24 шұңқырлы пластинаны ылғалдандырылған инкубаторға салыңыз (37 °C, 5% CO2) 1-2 сағат.
3. Сынақ ортасын дайындаңыз. Зерттелетін затты талдаушы ортада ерітіңіз. 24 шұңқырлы пластинаның бір шұңқырына 750 мкл сынақ ортасын пайдалану керек. Оң бақылау ретінде қолдану үшін 20 нг/мл VEGF немесе bFGF бар бір қосымша сынақ ортасын дайындауды ұсынамыз. Ешқандай химотаксистік факторсыз теріс бақылау талдау ортасы ретінде пайдалануға болады.
4. Сынақ ортасын ұңғымаларға қосыңыз. Matrigel/ECM Gel жабындысын 24 ұңғымалы пластинаның ұңғымасынан пинцетпен алып тастаңыз және әр ортадан талдау ортасын сорыңыз. Ұңғымаларға кірістірулерді қайтарғаннан кейін ұңғы мен кірістіру арасындағы саңылауға 750 мкл сынамалық ортаны тамызыңыз.
5. Эндотелий жасушаларын ажыратыңыз. Эндотелий жасушалары 70-90% біріккен болуы керек. Қоректік ыдыстан ортаны алып тастаңыз және 200 мкл/см 2 PBS (D8537) қосу арқылы жасушаларды жуыңыз. PBS алыңыз және 100 мкл/см 2 трипсин/EDTA (T3924) қосыңыз. Ыдысты жауып, жасушаларды микроскоппен зерттеңіз. Жасушалар ажырай бастағанда, қалған жасушаларды босату үшін ыдыстың бүйірінен ақырын түртіңіз. 100 мкл/см 2 трипсинді бейтараптандыру ерітіндісін (T6414) қосу арқылы трипсин ерітіндісін бейтараптандырыңыз және культуралы ыдысты 30 секундқа ақырын шайқаңыз.
6. Ұяшықтарды санаңыз. Жасушалық суспензияны центрифугалық түтікке аударып, түтікшені 220 х г бөлме температурасында 4 мин айналдырыңыз. Шөгінділерді алып тастаңыз және 5 мл талдау ортасында жасушалық түйіршікті қайта суспензиялаңыз. Ұяшық нөмірін стандартты процедураға сәйкес анықтаңыз.
7. Matrigel/ECM гельмен қапталған жасушалық культурадағы кірістірілген жасушалар. Жасушаның концентрациясын талдау ортасымен 1x10 5 жасушаға/мл сұйылтыңыз. Matrigel жабыны бар кірістірулерден талдау ортасын Matrigel қапталған бетіне тигізбестен алып тастаңыз. 500 мкл жасуша суспензиясын (= 5X10 4 ұяшық) жасуша культурасының кірістірулеріне мұқият қосыңыз.
8. Инвазиялық экспериментті бастаңыз. Матригельмен қапталған кірістірілген жасушаларды ылғалдандырылған инкубаторда инкубациялаңыз (37 ° C, 5% СО2) 16-28 сағат. Инкубация уақытында мембранада зерттелетін заттың градиенті дамиды. Зерттелетін заттың оң стимуляциясы кезінде жасушалар матрицаны бұзады, градиент бойымен саңылаулар арқылы мембрананың төменгі жағына көшіп, сонда жабысады.
9. Мембрананың үстіңгі жағындағы миграцияланбаған жасушаларды алып тастаңыз. Matrigel/ECM гельмен қапталған барлық кірістіргіштерден ортаны абайлап алыңыз. Содан кейін, пинцет көмегімен кірістірулерді алып тастаңыз және әр ұңғымадан ортаны сорыңыз. Енгізулерді ұңғымаға қайтарғаннан кейін, мақта тампонын пайдаланып мембрананың жоғарғы жағындағы миграцияланбаған жасушаларды алып тастаңыз. Ұңғыма мен кірістіру арасындағы саңылауға 750 мкл PBS тамызыңыз.
10. Көшірілген жасушаларды бекіту мен бояуды жалғастырыңыз.

Миграцияланған жасушаларды талдау

Жасушаны бекіту және бояу
1. Мембраналарды бекітіңіз және кірістірулерді құрғатыңыз. Ұңғымалардан PBS мұқият алып тастаңыз және ұңғымаларға 750 мкл суық метанол (34860) (4 ° C) қосыңыз. Бөлме температурасында 20 минут қайнатыңыз. Метанолды абайлап шығарып, 30 минут күтіңіз. Осы уақыт ішінде мембрана ауада кебеді. Кептіруден кейін мембрананы 4 ° C температурада сақтауға және кейінірек өңдеуге болады.
2. Жасушаларды бояу. Ұңғымаларға 750 мкл кристалды күлгін (V5265) қосыңыз және 20 минут бойы бөлме температурасында инкубациялаңыз.
3. Мембрананы жуыңыз. Бояу ерітіндісін абайлап алыңыз және тазартылған сумен үш рет мұқият жуыңыз.
4. Талдауды жалғастырыңыз.

Талдау

1. Көрнекі сандық. 24 ұңғымалы пластинаның ұңғымаларына 750 мкл дистилденген су құйыңыз және инверттелген микроскоптың көмегімен мембрананың төменгі бөлігіндегі қоныс аударылған жасушаларды санаңыз.
2. Микропластикалық оқу құрылғысының көмегімен колориметриялық сан. Ұңғыларға 750 мкЛ 10% сірке қышқылын (A6283) құйыңыз және 24 шұңқырлы пластинаны мұқият шайқау кезінде 30 секунд инкубациялаңыз. Мембранадағы жасушалар сірке қышқылының әсерінен лизиске ұшырайды және жасушалардағы кристалды күлгін шығарылады. 24 ұңғымалы пластинадан кірістіруді алыңыз және микропластинаны оқу құралының көмегімен 595 нм 10% сірке қышқылының оптикалық тығыздығын оқыңыз.

Нәтижелер

2 -сурет. VEGF арқылы ынталандырылған эндотелий жасушаларының in vitro жасуша миграциясы. VEGF жоқ (сол жақта) және ортада 20 нг/мл VEGF бар мембрана арқылы көшкен жасушалар (оң жақта). Жасушалар кристалды күлгінмен боялған.


Сандық голографиялық микроскоппен метанолдағы тірі жасушаларды морфологиялық өлшеу

Жасуша морфологиясы - жасушаның күйін бағалауға, дәрілік реакцияға және уыттылыққа скринингке байланысты көптеген қосымшалардың зерттеу негізі. Биомедициналық салада сандық фазаны анықтау тірі жасушалар үшін сөзсіз үрдіс болып табылады. Бұл жұмыста әртүрлі концентрациядағы метанолмен өңделген HeLa жасушаларының морфологиялық өзгеруі цифрлық голографиялық микроскопияның көмегімен анықталған. Ықшам кескін-жазықтық цифрлық голографиялық жүйе талшық элементтеріне негізделген. Тірі жасушалардың сандық фазалық бейнесі сандық талдаумен бірге алынады. Статистикалық талдау көрсеткендей, 12,5% немесе 25% метанолмен өңделген HeLa жасушаларының ауданы мен орташа оптикалық қалыңдығы айтарлықтай төмендейді, бұл аз концентрациядағы метанол жасушаның жиырылуын тудыруы мүмкін екенін көрсетеді. 50% метанолмен өңделген HeLa жасушаларының ауданы қалыпты жасушаларға ұқсас

, бұл концентрациясы жоғары метанолдың бекітуші әсерін көрсетеді. 12,5%, 25%және 50%метанолмен өңделген жасушалардың максималды оптикалық қалыңдығы өңделмеген жасушалардан үлкен, бұл метанол әсерінен HeLa жасушаларының пикнозын білдіреді. Нәтижелердің барлығы цифрлық голографиялық микроскопияның жапсырмасыз тірі жасушалардың морфологиялық өзгеруін өлшеуге арналған инвазивті емес бейнелеу баламасын ұсынғанын көрсетеді.

1. Кіріспе

Жасуша морфологиясы оның әр түрлі функциялары мен қызметімен тығыз байланысты, қазіргі биомедициналық пән мен өмір туралы ғылымның зерттеу негізі болып табылады. Кәдімгі жасуша мәдениетінде тірі жасушаның мөлшері жасушаның көбеюіне немесе жасушаның өлуіне байланысты өзгереді, ал жасушалардың тіршілік ету дәрежесін жасушаның морфологиясы бойынша да бағалауға болады. Апоптоз жасушаның бағдарламаланған өлу процесі ретінде даму мен гомеостазда маңызды рөл атқарады, ал морфологиялық өзгеріс апоптоз бен некрозды ажыратудың типтік белгісі болып табылады [1, 2]. Жасуша морфологиясы тірі жасушаларға қоршаған ортаның әртүрлі факторларының немесе ісікке қарсы препараттар сияқты әртүрлі медициналық емдеудің қалай әсер еткенін де аша алады [3, 4]. Сонымен қатар, қант диабеті, темір тапшылықты анемия, талассемия сияқты кейбір ауруларда жасуша морфологиясы айтарлықтай өзгереді [5, 6]. Қарапайым бақылаумен салыстырсақ, жапсырмасыз тірі жасушалардың морфологиялық өзгерісінің фазалық сандық анықталуы биомедициналық зерттеулердің өзекті сұранысына айналды.

Оптикалық микроскопия - бірнеше ғасырлар бойы биологиялық және медициналық зерттеулердің негізгі және қуатты құралы. Биологиялық жасушалар фазалық нысандар деп аталатын мөлдір нысандардың бір түрі дерлік болғандықтан, интенсивтілікке негізделген жарық микроскопиялық бейнелеудің әдеттегі әдісі жасушалар мен қоршаған орта арасындағы барабар контрастты қамтамасыз ете алмайды. Флуоресцентті микроскопия тірі жасушаларды фототоксикалық және цитотоксикалық ететін және өкінішке орай жасушалық мінез -құлыққа әсер етуі мүмкін контраст мәселесін шешу үшін экзогенді заттамалық контраст агенттерін қажет етеді, мысалы, родамин, акридин -апельсин, жасыл флуоресцентті ақуыз (GFP). Бұл мәселелерде тірі жасушаларды жапсырмасыз визуалды бақылауға қол жеткізу үшін көптеген оптикалық фазалық бейнелеу әдістері жасалды. Фазалық-контрастты бейнелеу әдістері, мысалы, Zernike фазалық контраст микроскопы немесе дифференциалды интерференциялық контраст (DIC) микроскопы, шамасы, фазалық немесе жартылай фазалық объектілердің контрастын жоғарылатады, алайда олар сапалық тәсілдер болып табылады және жасушааралық құрылымның сандық ақпаратын бере алмайды. Сондықтан, Фурье фазалық микроскопия (FPM), Гильберт фазалық микроскопия (HPM), дифракциялық фазалық микроскопия (DPM) және цифрлық голографиялық микроскопия (DHM) сияқты толық өрісті және сандық фазалық контрастты бейнелеуді алу үшін бірнеше әдістер әзірленді. [8–13]. Басқа бейнелеу әдістерімен салыстырғанда DHM өзінің артықшылықтары үшін зерттеулерге көбірек назар аударды. DHM объектінің толқындық бетінің сандық амплитудасы мен фазалық ақпаратын бір цифрлық голограммадан ала алады, бұл нақты уақытта анықтауға мүмкіндік береді. Since the numerical focusing can be implemented by the wave propagation theory, DHM does not demand to strictly record the hologram in the focused image plane of the object, and the digital autofocusing algorithm can help to search the best in-focused image. Furthermore, DHM does not need any complex scanning configuration and possesses a simple setup accordingly.

The noninvasive cell imaging based on DHM has attracted more attention in the biomedical field. Rappaz et al. measured the physiological parameters of the neurons and the testate amoebae by using premagnification digital holography [12, 13]. Kemper et al. studied the invasion mechanism of the living pancreas carcinoma cells and the interaction mechanism of the anticancer drug through the dynamic detection of living cells based on DHM system [14]. Kim et al. achieved the quantitative imaging of ovarian cancer cells through the angular spectrum method. Besides, they also quantitatively studied the wrinkling of a silicone rubber film by motile fibroblasts based on digital holography [15, 16]. Jeong et al. utilized the digital holographic optical coherence imaging to track the effect of cytoskeletal anticancer drugs on tissue inside its natural 3-dimension (3D) environment using time-course measurement of motility within tumor tissue [17]. Pavillon et al. applied the digital holographic microscopy to the early and label-free detection of cell death of the mouse cortical neurons [18]. However, it is also essential to develop the effective setup of DHM and expand its new applications.

The active ingredients of many drugs that are hardly soluble in water can only be dissolved in the organic solvents with high polarity [19, 20]. Methanol, as a kind of organic solvents, is often applied to the in vitro pharmacodynamic screening. Nevertheless, the methanol solution with high concentration has toxic effects on living cells thus the methanol should be diluted to a low concentration when it is used for cell culture. In addition, the fixation of tissues and cells is a key process of immunohistochemistry. Methanol is a frequently used fixative with good penetration [21, 22]. It can remove the lipids leading to cellular dehydration, meanwhile, the proteins instantaneously precipitated on the cytoskeleton. The fixative effects of methanol terminate or reduce the response of exogenous or endogenous enzymes to prevent autolysis of the cells in order to maintain the inherent shape and structure of the tissue cells, more importantly, to preserve antigenicity, and to prevent the loss or diffusion of antigen. In this paper, HeLa cells (human cervix carcinoma cell) are used as the tested sample. The cell morphological change treated with methanol solutions of different concentration is studied by the DHM imaging system. In combination with the numerical analysis and image processing, the surface area and optical thickness of cells are calculated, and the results show that the methanol solutions with different concentrations have diverse effects on the morphology of living HeLa cells.

2. Материалдар мен әдістер

2.1. Principle of Digital Holographic Microscopy

Digital holographic microscopy, as a quantitative phase-contrast imaging method, is essentially a kind of optical interferometry to detect the phase delay related to the light passing through the tested object. When passing through a relatively transparent sample, the intensity of the light changes very little, while the light through the sample speeds up or slows down and brings a corresponding phase change as indicated in Figure 1. The phase delay or advance depends on the relation of the refraction index between the sample and surrounding environment. Since the phase information is proportional to the optical path length called optical thickness, a depth profile of the tested sample can be calculated. Therefore, digital holography is particularly suitable to measure the phase object such as the living cells and microoptical elements.


Бейнені қараңыз: Метиловый спирт. Осторожно! Мифы и реальность. (Ақпан 2023).