Ақпарат

Белоктардағы суыққа бейімделу, реттілік және құрылымдық деңгейде

Белоктардағы суыққа бейімделу, реттілік және құрылымдық деңгейде


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Біржасушалы эукариоттарда суық бейімделуді іздегенде көп жұмыс табылмайды. Көбінесе теңіз мезофилі мен психрофилінің арасындағы жалпы тізбекті салыстырмалы тізбекті талдау да нақты нәтиже бермейді. Егер мен құрылымдық деңгейде оқуды жоспарлап отырсам (гомологияны модельдеу) мен жауап ала аламын ба? Зерттеу үшін қандай параметрлер түрін іздей аламын? Қандай ақуыздар мұз байланыстырушы немесе антифриз ақуыздарынан басқа суық бейімделуді қамтамасыз етеді деп күтілуде, себебі IBP & AFP тізбекті салыстыру арқылы табылмайды. Осыған байланысты кейбір ойлар айтуға бола ма?

Рахмет


Дәл осы мәселе бойынша жұмыс істейтін зерттеу топтары бар; Ферменттердегі суыққа бейімделуді түсіну. Сіз бұл туралы бірнеше мақаладан оқи аласыз, мысалы: «Фермент суыққа бейімделуді есептеу» немесе «Micrococcus antarcticus ішіндегі психрофильді β-глюкозидаз BglU-ның суық бейімделуінің молекулалық құрылымдық негізі» немесе «Суыққа бейімделуге жауап беретін арнайы амин қышқылдары». Micrococcus antarcticus β-глюкозидаза BglU '

Жалпы деңгейде әдетте кездесетін бірнеше құрылымдық сипаттамалар бар. Олар әдетте әлдеқайда икемді (яғни тұз көпірлері мен басқа да осындай тұрақтандыратын байланыстар аз). Икемділік полипептидтік тізбек арасында және оның ішінде берік байланыстың аздығынан, тіпті бұзылған аймақтардың болуына байланысты. Икемділік сонымен қатар олар әдетте әлдеқайда тұрақты емес және олармен жұмыс істеу қиынырақ екенін білдіреді. Олар өнеркәсіптік тұрғыдан қызықты, өйткені төмен температурада жұмыс істей алатын ферменттердің дамуы жүретін реакциялардың құнын төмендетуі мүмкін. Бұл негізінен жасыл индустрияға жасалған қадам. Сондай-ақ аминқышқылдарының әртүрлі қатынасы мен көптігі және олардың қайда орналасқаны туралы болжамдар бар. Мұны тексеру үшін сізге арнайы белоктар туралы мақалаларды оқу керек еді.

Практикалық тұрғыдан алғанда, суыққа бейімделген ферменттер әдетте арктикалық микроорганизмдерден оқшауланады және олардың температураға төзімділігін анықтау үшін зертханада сипатталады. Ондай ферменттердің құрылымы шешіледі (көп жұмыстан кейін) және суыққа бейімделуді түсінуге негіз болады.

Сұраққа нақты жауап беру үшін, Жоқ, ақуыз тізбегіне (өз бетінше) қарап, бір нәрсенің суыққа бейімделгенін білу шындыққа жанаспайды, мұны зертханада эксперименталды түрде анықтау керек. Алайда, егер ақуыз суыққа бейімделген организмнен болса (әдетте арктикалық бактериялар), оны зертханада тексермес бұрын суыққа бейімделген деп айтуға негіз бар. Сіз сондай -ақ оның суыққа бейімделген ақуыздарға қатыстылығын анықтау үшін сомалық биоинформатиканы (мысалы, жарылыс іздеу) қолдана аласыз. Сондай-ақ, егер сіз қарап отырған ақуыздың нақты түрі жақсы зерттелсе, сіз гомологиялық модельдер жасауға тырысып, оның суыққа бейімделген туыстарына құрылымы жағынан ұқсастығын немесе оның мезофильді немесе тіпті термофильді түріне көбірек ұқсас екенін білуге ​​болады. әріптестер. Бұл өте алыпсатарлық, және мен теориялық тұрғыдан болжанған бейімделулерге көп салмақ салмас едім - сіз ең болмағанда қызықтыратын ақуыздың суыққа бейімделген организмдерден екенін білуіңіз керек, тіпті (есептеу) неліктен және қалай болуы мүмкін екенін іздеуді бастау үшін. суыққа бейімделу.


Ортологиялық протеин тізбегіне негізделген суық бейімделудің молекулалық сипаттамасы Vibrionaceae түрлері

Психрофильді 298 ақуызды отбасының жиынтығы Салмонцид вибрионы гамма-протеобактериялардың мезофильді вибрион/фотобактерия тармағы ортологиялық реттілігінен ажырататын генотиптік сипаттамаларды анықтау үшін құрастырылған.Vibrionaceae отбасы). Салыстырмалы барлауда біз биоақпараттық және статистикалық әдістерді негізге алдық. Қызықты ақпарат алмастыру матрицаларында, ал аминқышқылдарды алмастыру процесінде асимметрия үлгісінде табылды. Құрамдық айырмашылықпен бірге олар Ile, Asn, Ala және Gln амин қышқылдарын ең психофильді қатысуы бар аминқышқылдары ретінде анықтады. Ile және Asn күшейтілген, ал Gln және Ala басылған. Икемсіз Pro қалдығы икемді құрылымда күтілгендей, цикл аймақтарында да басылады. Деректер жинағы болжанған субклеткалық орналасуына сәйкес жіктелді және талданды және біз 183 жасушаішілік және 65 мембраналық ақуызға қосымша зерттеу жасадық. Нәтижелеріміз психрофильді белоктардың мезофильді белоктар сияқты ақуыздың өзегіндегі гидрофобты және зарядтық үлестері ұқсас екенін, ал еріткіш әсер ететін бетінің ауданы едәуір гидрофобты екенін көрсетті. Сонымен қатар, психрофильді жасушаішілік (бірақ мембраналық емес) ақуыздар бетінде айтарлықтай теріс зарядталған. Біздің талдау молекулалық бетте икемді аминқышқылдарына артықшылық беру гипотезасын қолдайды. Суық климаттағы өмір белгілі бір аминқышқылдарын алмастырудан гөрі көптеген кішігірім құрылымдық өзгерістер арқылы алынған сияқты.

Бұл жазылу мазмұнының алдын ала қаралуы, сіздің мекеме арқылы кіру.


Фон

Тыйым салынған жағдайда өмір сүретін микроорганизмдер экстремофилдер деп аталады, олардың ашылуы алғашқы тіршілік формаларының бірегей бейімделуін көрсетеді. Бұл микроорганизмдер олардың оңтайлы өсу жағдайларына сәйкес топтастырылады, мысалы, қышқылдық рН жағдайында оңтайлы өсуді көрсетеді), алкалифилдер (сілтілік рН жағдайында өркендейді), барофилдер (үлкен қысым кезінде тірі қалады), эндолиттер (ішкі тереңдікте өмір сүреді). тау жыныстары), галофильдер (тұздың жоғары концентрациясында дамитын), психрофильдер (оңтайлы температура 20°С-тан төмен) және термофилдер (оңтайлы температура 45-80°С), гипертермофилдер (оңтайлы температура 80°С жоғары) [1]. Жер биосферасының белгілі экстремофильді жағдайларының ең үлкен қамтылуы 10°С-тан төмен. Мысалы, жердің төрттен үш бөлігін мұхиттар алып жатыр, олар орташа температураны бір градустан үш градусқа дейін сақтайды. Сонымен қатар, Арктика мен Антарктиканың ұлан -ғайыр құрлықтары жыл бойы тұрақты түрде қатып қалады [1]. Крио мекендеу орталарының басқа бірнеше мысалдарына суық шөлдер, биік тау топырағы, теңіз мұзы, суық үңгірлер, теңіз шөгінділері, мәңгі тоң топырақтары, мұздық, қар және т.б.

Белгілі психрофилдердің көпшілігі архея мен бактериялардың сорттарына, ал ашытқылардың, саңырауқұлақтар мен балдырлардың бірнеше түріне жатады [2]. Судың тоңу температурасына жақын төмен температураның өмірге қауіпті әсерінен өркендеу қабілеті олардың барлық жасушалық компоненттерінен, соның ішінде олардың мембраналарын, энергия өндіретін жүйелерін, ақуыз синтезін жүргізетін аппараттарды, биодеградативті ферменттер мен компоненттердің көптеген бейімделуін қажет етеді. қоректік заттардың сіңірілуіне және т. Арнайы механизмдермен дамыған психрофилдер бұл тауашаларды табысты колониялады [2, 5]. Психрофильді ақуыздар мезо және (гипер) термофильді гомологтармен салыстырылатын тізбектер мен құрылымдарды көрсетеді, әсіресе төмен температурада катализатор ретінде тиімді жұмыс істеу қабілеті бар ферменттер [6]. Бұл ақуыздардың қалыпты температурада термотабілеттілігі биотехнологияда, биоремедиацияда, тамақ өнімдерінде, тоқыма бұйымдарында, био-катализаторлардағы суы аз жағдайларда және жуғыш заттарда және т.

Жоғарыда келтірілген фактілерге байланысты, 1970 жылдардың ортасынан бастап, негізінен белоктардың (негізінен ферменттердің) жоғары температуралық жағдайларға бейімделуіне ықпал ететін жүйелілік пен құрылымдық атрибуттарға көп көңіл бөлінді. Көптеген зерттеушілер термофильді және мезофильді ақуыздар арасындағы реттілік пен құрылымға негізделген параметрлерді салыстырды [10]. 1990 жылдардың аяғында антарктикалық микроорганизмдерден альфа-амилаза [11] сілтілік протеаза [12] триозофосфат изомераза [13] малатдегидрогеназа [14] сияқты криофильді ферменттердің үшөлшемді құрылымын шешуге бағытталған ізашарлық күш-жігердің арқасында. ақуыз деректер банкіндегі (PDB) қол жетімді құрылымдар, топтар суық бейімделудегі белоктардың құрылымдық негізін шешуге бағытталған [4, 15-20].

Экстремофилдердің протеомаларының реттілігінің тұрақты өсуі экстремалды жағдайларға бейімделуді түсінудің көптеген жаңа жолдарын ашты [16, 21-25]. Әр түрлі организмдердің протеомаларынан алынған ғаламдық аминқышқылдарының артықшылықтары мен алмастыру үлгілерін кешенді түрде салыстыруға болады [26-28]. Әр түрлі статистикалық әдістермен бірге гомологиялық тізбектерді қолдана отырып, біз аминқышқылдарының алмастыру үлгілерінің олардың оңтайлы өсу жағдайларына бейімделуімен мүмкін болатын корреляциясын зерттеу үшін психрофильді, мезофильді, термофильді және гипертермофильді микроорганизмдердің протеомаларына кеңінен талдау жүргіздік. Бұл қолжазбада біз психофилді және мезофильді организмдердің әрқайсысынан алты мүшенің толық реттелген протеомаларын салыстырмалы талдау нәтижелерін талқылаймыз.


Әдебиеттер

ван ден Бург, Б. Экстремофилдер жаңа ферменттердің көзі ретінде. Ақша Опин. Микробиол. 6, 213–218 (2003).

Гомес, Дж. & Штайнер, В. Экстремофильдер мен экстремозимдердің биокаталитикалық потенциалы. Тағамдық технология. Биотехнология. 42, 223–235 (2004).

Хау, Д.В. & Дэнсон, М.Ж. Экстремозимдер. Ақша Опин. Химия Биол. 3, 39–46 (1999).

Дэнсон, MJ & amp Hough, D.W. Ақуыздың галофильділігінің құрылымдық негізі. Құрастыру Биохимия. Физиол. А 117, 307–312 (1997).

Madern, D., Ebel, C. & amp Zaccai, G. Ферменттердің галофильді бейімделуі. Экстремофильдер 4, 91–98 (2000).

Gros, M. & amp Jaenicke, R. Ақуыздар қысымда. Еуро. J. Биохим. 221, 617–630 (1994).

Daniel, I., Oger, P. & Winter, R. Жоғары қысым жағдайында өмірдің және биохимияның пайда болуы. Химия Soc. Аян. 35, 858–875 (2006).

Лаура, Ф.М., Частейн, Р.А., Бланкеншип, Л.Э., Яянос, А.А. & Бартлетт, Д.Х. Пьезофилдердің бірегей 16S рРНҚ гендері филогенезді де, бейімделуді де көрсетеді. Қолданба. Қоршаған орта. Микробиол. 73, 838–845 (2007).

Стеттер, К.О. Экстремофилдер және олардың ыстық ортаға бейімделуі. FEBS Lett. 452, 22–25 (1999).

Херст, L. D. және Merchant, A. R. Жоғары гуанин-цитозин мазмұны жоғары температураға бейімделу емес: прокариоттар арасындағы салыстырмалы талдау. Проц. R. Soc. Лонд. B 268, 493–497 (2000).

Nakashima, H., Fukuchi, S. & amp Nishikawa, K. РНҚ, ДНҚ мен белоктардың жоғары және төмен температураға бактериялық бейімделуі үшін композициялық өзгерістер. J. Биохим. 133, 507–513 (2003).

Хачане, А.Н., Тиммис, К.Н. & Мартинс дос Сантос, В.А.П. Урацил термофильді және психрофильді прокариоттардың 16S рРНҚ құрамы олардың оңтайлы өсу температурасымен кері байланысты. Nucl. Қышқылдар Рез. 33, 4016–4022 (2005).

Feller, G. & Gerday, C. Психрофильдік ферменттер: суық бейімделудегі ыстық тақырыптар. Нат. Аян микробиол. 1, 200–208 (2003).

D'Amico, S., Marx, J. C., Gerday, C. & amp Feller, G. Экстремофильді ферменттердегі белсенділік -тұрақтылық қатынастары. J. Биол. Химия 278, 7891–7896 (2003).

Диас, C. L. т.б. Гидрофобты эффект және оның суық денатурациядағы ролі. Криобиология 60, 91–99 (2010).

Sicheri, F. & amp Yang, D. S. C. Қысқы бақалардан алынған антифриз ақуызының мұз байланыстырушы құрылымы мен механизмі. Табиғат 375, 427–431 (1995).

Антифриз ақуыздары: құрылымы мен функциясының механизмдері. Химия Аян. 96, 601–617 (1996).

Jaenicke, R. & amp Böhm, G. Экстремалды ортадағы ақуыздардың тұрақтылығы. Ақша Опин. Құрылым. Биол. 8, 738–748 (1998).

Кумар, С. & amp Нусинов, Р.Термофильді ақуыздар жылуды қалай қабылдайды? Ұяшық Мол. Өмір туралы ғылым. 58, 1216–1233 (2001).

Vieille, C. & amp; Zeikus, G.J. Гипертермофильді ферменттер: көздері, қолданылуы және термостабильділіктің молекулалық механизмдері. Микробиол. Мол. Биол. Аян. 65, 1–43 (2001).

Березовский, I. N. & Shakhnovich, E. I. Физика және термофильді бейімделу эволюциясы. Проц. Natl Acad. Ғылым. АҚШ 102, 12742–12747 (2005).

Lazaridis, T., Lee, I. & amp Karplus, M. Гипертермофильді және мезофильді рубредоксиннің динамикасы мен ашылу жолдары. Ғылыми ақуыз. 6, 2589–2605 (1997).

Ковачич, Ф., Мандриш, А., Пуджари, C., Стродел, Б. & Джейгер, К.Э. Эстеразалардың термиялық бейімделуін анықтайтын құрылымдық ерекшеліктері. Protein Eng. Дес. Сел. 29, 65–76 (2016).

Домини, B. N., Minoux, H. & Brooks, C. L. III. Термофильді белоктардың тұрақтылығының электростатикалық негізі. Ақуыздар 57, 128–141 (2004).

Миссимер, Дж. т.б. Конфигурациялық энтропия ақуыз термостабильділігінде тұзды көпірлік желілердің рөлін түсіндіреді. Ғылыми ақуыз. 16, 1349–1359 (2007).

Roca, M., Liu, H., Messer, B. & Warshel, A. Термиялық тұрақтылық пен ферменттердің каталитикалық күші арасындағы байланыс туралы. Биохимия 46, 15067–15088 (2007).

Bjelic, S., Brandsdal, B. O. & amp vqvist, J. Ферменттік реакция жылдамдығының суық бейімделуі. Биохимия 47, 10049–10057 (2008).

Исаксен, Г.В., vqvist, J. & amp Brandsdal, B. O. Ақуыз бетінің жұмсақтығы-трипсиннің суыққа бейімделу ферментінің бастауы. PLoS есептеуі. Биол. 8, e1003813 (2014).

Исаксен, Г.В., vqvist, J. & amp Brandsdal, B. O. Ферменттердің бетінің қаттылығы каталитикалық жылдамдықтардың температураға тәуелділігін реттейді. Проц. Natl Acad. Ғылым. АҚШ 113, 7822–7827 (2016).

Åqvist, J., Wennerström, P., Nervall, M., Bjelic, S. & Brandsdal, B. O. Монте-Карло тұрақты қысым алгоритмі бар су мен биомолекулалардың молекулалық динамикалық модельдеулері. Химия Физ. Летт. 384, 288–294 (2004).

Kitchen, D. B., Reed, L. H. & Levy, R. M. Жоғары қысымдағы сольватталған ақуыздың молекулалық динамикасын модельдеу. Биохимия 31, 10083–10093 (1992).

Paci, E. Биомолекулалардың жоғары қысымды имитациясы. Биохим. Биофиз. Acta 1595, 185–200 (2002).

Low, P. S., Bada, J. L. & amp Somero, G. N. Ферменттердің температуралық бейімделуі: бос энергияның рөлі, энтальпия мен активация энтропиясы. Проц. Natl Acad. Ғылым. АҚШ 70, 430–432 (1973).

Lonhienne, T., Gerday, C. & Feller, G. Психрофильді ферменттер: белсендірудің термодинамикалық параметрлерін қайта қарау жергілікті икемділікті түсіндіруі мүмкін. Биохим. Биофиз. Acta 1543, 1–10 (2000).

Siddiqui, K. S. & amp Cavicchioli, R. Суыққа бейімделген ферменттер. Анну. Аян биохимия. 75, 403–433 (2006).

Fields, P. A. & amp Somero, G. N. Суыққа бейімделудің ыстық нүктелері: Антарктикалық нототеноидты балықтардың лактат дегидрогеназа А4 ортологтарының конформациялық икемділігінің локализацияланған жоғарылауы. Проц. Natl Acad. Ғылым. АҚШ 95, 11476–11481 (1998).

Altermark, B., Niiranen, L., Willasen, N. P., Smalås, A. O. & Moe, E. Суыққа бейімделген эндонуклеаза I салыстырмалы зерттеулері Vibrio salmonicida және мезофильді Тырысқақ вибрионы. FEBS J. 274, 252–263 (2007).

Liang, Z. X., Tsigos, I., Bouriotis, V. & amp Klinman, J. P. Термофильді және психрофильді спирт дегидрогеназаларындағы гидридті-трансферлік параметрлерге ақуыздың икемділігінің әсері. J. Am. Химия Soc. 126, 9500–9501 (2004).

Даниэль, Р.М & Дэнсон, М.Ж.Ферменттің каталитикалық белсенділігіне температураның қалай әсер ететіні туралы жаңа түсінік. Трендтер Биохимия. Ғылым. 35, 584–591 (2010).

Хоббс, Дж. т.б. Фермент катализінің жылу сыйымдылығының өзгеруі ферменттің катализделген жылдамдығының температураға тәуелділігін анықтайды. ACS Chem. Биол. 8, 2388–2393 (2008).

Аркус, В.Л. Прентис, Е.Ж. т.б. Фермент-катализделген жылдамдықтардың температураға тәуелділігі. Биохимия 55, 1681–1688 (2016).

Нгуен, В. т.б. Фермент катализіндегі термоадаптацияның эволюциялық драйверлері. Ғылым 355, 289–294 (2017).

Элиас, М., Wieczorek, G., Rosenne, S. & Tawfik, D. S. Ферментативті жылдамдық -температураға тәуелділіктің әмбебаптығы. Трендтер Биохимия. Ғылым. 39, 1–7 (2014).

Петреску, И. т.б. Психрофильді ашытқыдан ксиланаза Cryptococcus adeliae. Экстремофильдер 4, 137–144 (2000).

Smalås, A. O., Heimstad, E. S., Hordvik, A., Willasen, W. P. & amp Male, R. Ферменттердің суық бейімделуі: лосось мен сиыр трипсиндерінің арасындағы құрылымдық салыстыру. Ақуыздар 20, 149–166 (1994).

Olufsen, M., Smalås, A. O., Moe, E. & Brandsdal, B. Суық бейімделу стратегиясы ретінде икемділікті арттыру. J. Биол. Химия 280, 18042–18048 (2005).

Papaleo, E., Riccardi, L., Villa, C., Fantucci, P. & amp De Gioia, L. Икемділік және ферменттік суыққа бейімделу: эластаздар отбасының салыстырмалы молекулалық динамикасын зерттеу. Биохим. Биофиз. Acta 1764, 1397–1406 (2006).

Папалео, Е. т.б. Психрофильді және мезофильді трипсиндердегі ақуыздың икемділігі. Трипсинге ұқсас серин-протеазадағы ақуыз динамикасының эволюциялық сақталуының дәлелі. FEBS Lett. 582, 1008–1018 (2008).

Åqvist, J., Kazemi, M., Isaksen, G. V. & amp Brandsdal, B. O. Энтропия және фермент катализі. Acc. Химия Res. 50, 199–207 (2017).

Kazemi, M. & amp Åqvist, J. Аррениус өрескел күштерінің есептеулерінен алынған химиялық реакция механизмдері. Нат. Коммун. 6, 7293 (2015).

Kazemi, M., Himo, F. & amp vqvist, J. Circe эффектісіз энтропия бойынша фермент катализі. Проц. Natl Acad. Ғылым. АҚШ 113, 2406–2411 (2016).

Åqvist, J. & amp Kamerlin, S. C. L. Ерекше үлкен энтропиялық қосылымдар рибосомада GTP гидролизінің жоғары жылдамдығына мүмкіндік береді. Ғылым. Респ. 5, 15817 (2015).

Åqvist, J. & amp Kamerlin, S.C. L. GTPaza әр түрлі кластарындағы сақталған мотивтер катализдің арнайы режимдерін белгілейді. ACS Catal. 6, 1737–1743 (2016).

Варшель, А. Ферменттер мен ерітінділердегі химиялық реакцияларды компьютерлік модельдеу (Вили, 1991).

Åqvist, J. & Warshel, A. Валенттік байланыс күш өрістерін және басқа гибридті кванттық/классикалық тәсілдер арқылы ферменттік реакцияларды модельдеу. Химия Аян. 93, 2523–2544 (1993).

Снайдер, MJ, Gaunitz, S., Ridgway, C., Short, SA & Wolfenden, R. Температураның каталитикалық тиімділікке, жылдамдықты арттыруға және цитидиндеаминазаның өтпелі күйге жақындығына және субстратты жою катализінің термодинамикалық салдарына. «зәкір». Биохимия 39, 9746–9753 (2000).

Outzen, H., Berglund, G. I., Smalås, A. O. & Willasen, N. P. Атлантикалық лососьден алынған трипсиндердің температурасы мен рН сезімталдығы (Салмо салар) сиыр мен шошқа трипсинімен салыстырғанда. Құрастыру Биохимия. Физиол. B 115, 33–45 (1996).

Ганем, М., Ли, Л., Винг, С & Шрамм, В.Л. Адамды сиыр пуринді нуклеозид фосфорилазаға қарай өзгертетін алыстағы мутациядан термодинамика өзгерді. Биохимия 47, 2559–2564 (2008).

Исаксен, Г.В., Åqvist, J. & Brandsdal, B. O. Компьютерлік модельдеу арқылы анықталған пуриндік нуклеозид-фосфорилаза реакциясының термодинамикасы. Биохимия 56, 306–312 (2017).

Leiros, H. K. S., McSweeney, S. M. & amp; Smalås, A. O. Трипсиннің атомдық разрядтық құрылымдары құрылымдық радиациялық зақым туралы түсінік береді. Acta Crystallogr. D 57, 488–497 (2001).

Либшнер, Д., Даутер, М., Бжушкевич, А. & amp Даутер, З. Ақуыз кристалды құрылымдарының репродуктивтілігі туралы: трипсиннің бес атомдық ажыратымдылық құрылымы. Acta Crystallogr. D 69, 1447–1462 (2013).

Беллиссент-Фунель, М. т.б. Су белоктардың құрылымы мен динамикасын анықтайды. Химия Аян. 116, 7673–7697 (2016).

Pucci, F. & Rooman, M. Ақуыздың термиялық тұрақтылығының және суыққа бейімделудің физикалық және молекулалық негіздері. Ақша Опин. Құрылым. Биол. 42, 117–128 (2017).

Родригес-Корреа, Д. & Дальберг, А.Э. экстремалды термофилден рибосомаларда пептидилтрансферазаның кинетикалық және термодинамикалық зерттеулері Thermus thermophilus. РНҚ 14, 2314–2318 (2008).

Siddiqui, K. S., Cavicchioli, R. & Thomas, T. Псиротолерантты және термофильді археялардың ұзарту факторы 2 (EF-2) ақуыздарының термодинамикалық белсендіру параметрлері. Экстремофильдер 6, 143–150 (2002).

Мерлино, А. т.б. Суыққа бейімделген темір супероксиді дисмутазалардағы құрылымы мен икемділігі: бөлінген ферменттің жағдайы Pseudoalteromonas haloplanktis. J. Құрылым. Биол. 172, 343–352 (2010).

Струвай, C. & amp Феллер, Г. Психрофильді ферменттердегі төмен температуралық белсенділікті оңтайландыру. Int. Ж.Мол. Ғылым. 13, 11643–11665 (2012).

Harms, MJ & amp Thornton, J. W. Эволюциялық биохимия: ақуыз қасиеттерінің тарихи және физикалық себептерін ашу. Нат. Аян Генет. 14, 559–571 (2013).

Шойчет, Б.К., Баасе, В.А., Куроки, Р. & Мэттьюс, Б.В. Ақуыздың тұрақтылығы мен ақуыз функциясының байланысы. Проц. Natl Acad. Ғылым. АҚШ 92, 452–456 (1995).

Dang, L. X., Merz Jr, K. M. & amp Kollman, P. A. Ақуыздың тұрақтылығы бойынша бос энергия есептеулері: Th4-157 → T4 лизоцимінің Val-157 мутациясы. J. Am. Химия Soc. 111, 8505–8508 (1989).

Пан, Y. P. және Daggett, V. Химотрипсин ингибиторының гидрофобты жою мутанттары үшін эксперименталды және есептелген қатпарлы бос энергияларды тікелей салыстыру 2. Биохимия 40, 2723–2731 (2001).

Seeliger, D. & amp de Groot, B. L. Ақуыздардың термостабильділігін алхимиялық бос энергия модельдеуін қолдана отырып есептеу. Биофиз. Дж. 98, 2309–2316 (2011).

Folch, B., Dehouck, Y. & amp Rooman, M. Температураға тәуелді статистикалық потенциалдармен анықталған термо- және мезостабилизаторлы ақуыздардың өзара әрекеттесуі. Биофиз. Дж. 98, 667–677 (2010).

Pucci, F., Bourgeas, R. & Rooman, M. Статистикалық потенциалдарды пайдалана отырып, нүктелік мутациялар кезінде ақуыздың термиялық тұрақтылығының өзгеруін болжау: енгізу HoTMuSiC. Ғылым. Респ. 6, 23257 (2016).

Эйринг, Х.Химиялық реакциялардағы активтендірілген кешен. Дж.Хим. Физ. 3, 107–115 (1935).

Эванс, M. G. & Polanyi, M. Реакция жылдамдығын есептеуге өту күйі әдісінің кейбір қолданулары, әсіресе ерітіндіде. Транс Faraday Soc. 31, 875–893 (1935).

Bjelic, S. & amp vqvist, J. Катализ және аспартикалық протеазадағы бос энергияның сызықтық қатынастары. Биохимия 45, 7709–7723 (2006).

Рассел, Р.Дж., Фергюсон, Дж.М., Хоу, Д.В., Дансон, М.Дж. және Тейлор, Г.Л. Гипертермофильді археоннан алынған цитрат синтазасының кристалдық құрылымы. Pyrococcus furiosus ажыратымдылығы 1,9. Биохимия 36, 9983–9994 (1997).

Рассел, Р.Ж., Герике, У., Дэнсон, М.Ж., Хоу, Д.В. & Тэйлор, Г.Л. Антарктикалық бактериядан суық белсенді цитрат синтазасының құрылымдық бейімделуі. Құрылым 6, 351—361 (1998).

Leiros, H. K. S., Willassen, N. P. & amp; Еуро. J. Биохим. 267, 1039–1049 (2000).

Мерегетти, П. т.б. Психрофильді және мезофильді ферменттердің табиғи-мемлекеттік конформациялық ландшафты: жиналмалы шұңқыр моделін зондтау. J. Физ. Химия Б. 114, 7609–7619 (2010).

Olufsen, M., Brandsdal, B. O. & Smalås, A. O. Психрофильді және мезофильді урацил ДНҚ гликозилазасының салыстырмалы ашылатын зерттеулері: MD модельдеулері суыққа бейімделген ферменттің жылу тұрақтылығының төмендегенін көрсетеді. Ж.Мол. Граф. Үлгі. 26, 124–134 (2007).

Папалео, Э., Олуфсен, М., Де Гиоа, Л. & amp Брэндсдал, Б.О. Электростатиканы оптимизациялау суыққа бейімделу стратегиясы ретінде: суық және жылы белсенді эластазалардың жағдайлық зерттеуі. Ж.Мол. Граф. Үлгі. 26, 93–103 (2007).

Мичетти, Д. т.б. Суыққа және жылыға бейімделген эндонуклеаз А-ны салыстырмалы талдау және молекулалық динамика модельдеуін қолдана отырып салыстырмалы зерттеу. PLoS ONE 12, e0169586 (2017).

Папалео, Э., Паси, М., Тиберти, М. & Де Джойа, Л. Суыққа бейімделген ферменттің мезофильді тәрізді мутанттарының молекулалық динамикасы: мутациялар тудырған дистальды әсерлерді түсіну. PLoS ONE 6, e24214 (2011).

Занфорлин, Л.М. т.б. Олигомеризация суыққа бейімделу стратегиясы ретінде: GH1 β-глюкозидазаның құрылымы мен динамикасы Антарктикум В7 экзигобактериясы. Ғылым. Респ. 6, 23776 (2016).

Парвизпур, С., Размара, Дж., Рамли, A. N. M., MD Illias, R. & Shamsir, M. S. Жаңа психрофильді β-маннаназаның құрылымдық және функционалды талдауы. Гляциозима антарктида PI12. Дж. Есептеу. Көмекші Мол. Дес. 28, 685–698 (2014).

Ким, М.К. т.б. Антарктиканың серіппесінен эндо-β-1,4-d-маннаназадағы кеңейтілген цикл мен субстратты тану тораптарының функционалдық рөлін құрылымдық зерттеу. Cryptopygus antarcticus. Ақуыздар 82, 3217–3223 (2014).

Гатти-Лафранкони, П. т.б. Суық белсенді ферменттегі тұрақтылық эволюциясы спецификалық релаксацияны тудырады және температураға бейімделуге субстратпен байланысты әсерді көрсетеді. Ж.Мол. Биол. 395, 155–166 (2010).

Sigtryggsdóttir, ш. R., Papaleo, E., Thorbjarnardóttir, S. H. & Kristjánsson, M. M. Флуоресцентті сөндіру және молекулалық динамикамен бағаланған суық және ыстыққа бейімделген субтилизин тәрізді сериндік протеиназалардың икемділігі. Биохим. Биофиз. Acta 1844, 705–712 (2014).

Сие, Б.В. т.б. Термолизиндер тобындағы мырыш металлопротеазаларының катализдік және құрылымдық қасиеттері мен молекулалық динамикасымен анықталған терең теңіз мен арктикалық мұзды бактериялардан суыққа бейімделуі: конформациялық икемділік пен сутектік байланыс арасындағы байланыс туралы жаңа түсініктер. J. Биол. Химия 284, 9257–9269 (2009).

Adekoya, O. A., Helland, R., Willassen, N. P. & Sylte, I. Салыстырмалы реттілігі мен құрылымын талдау термолизин тұқымдасындағы ферменттің суыққа бейімделу ерекшеліктерін анықтайды. Ақуыздар 62, 435–449 (2006).


Суық белсенді RTX липазасының құрылымдық бейімделуі Pseudomonas sp. AMS8 штаммы гомология мен молекулалық динамиканы модельдеу тәсілдері арқылы ашылды

Психрофильді фермент типтік ферменттерден айырмашылығы оның экстремалды температураға бейімделу қабілетіне байланысты қызықты зерттеу пәні болып табылады. Компьютерлік бағдарламалық жасақтаманы пайдалана отырып, липаза AMS8 (LipAMS8) ферментінің болжамды құрылымы мен қызметі (психрофильділерден оқшауланған) Pseudomonas sp., Антарктика топырағынан алынған) зерттеледі. Фермент липазалармен маңызды реттілік ұқсастығын көрсетеді Pseudomonas sp. MIS38 және Serratia marcescens. Бұл ұқсастықтар ферменттің 3D молекулалық құрылымын болжауға көмектеседі. Бұл зерттеуде құрылымдық икемділік пен тұрақтылықты талдау үшін әр түрлі температурада 12 ns MD симуляциясы орындалады. Нәтижелер көрсеткендей, фермент 0 ° C және 5 ° C температурада ең тұрақты. Тұрақтылық пен икемділік тұрғысынан каталитикалық домен (N-терминус) каталитикалық емес доменге (С-терминус) қарағанда тұрақтылығын көбірек сақтады, бірақ каталитикалық емес домен каталитикалық аймаққа қарағанда жоғары икемділік көрсетті. LipAMS8 құрылымы мен қызметін талдау осы ақуыздың төмен температурада құрылымдық бейімделуіне жаңа түсініктер береді. Алынған ақпарат жақын арада төмен температуралы өнеркәсіптік қолдану мен молекулалық инженерия үшін пайдалы құрал бола алады.

1. Кіріспе

Липаза (триацилглицерол ацилгидролаза (E.C 3.1.1.3) деп те аталады) - серин гидролаза, ол триацилглицеролдың карбоксил эфирлі байланысында май қышқылдары мен глицерин өндіру үшін әрекет етеді [1]. Липазалар жиі кездеседі α/β-басқа гидролазаларда да болатын гидролаза қатпарлары [2]. Әдеттегі липаза серин, глутамин/аспартат және гистидиннің каталитикалық триадасынан тұратын белсенді учаскеден тұрады [3].

Липазалар тірі ағзалар арасында кеңінен таралған, соның ішінде бактериялар, эукария және археялар, Jaeger және т.б. [4]. Жақында психофильді бактериялар шығаратын липазалар зерттелді, себебі олардың оңтайлы температурасы төмен және өте төмен температурада белсенділігі жоғары. Бұл мезофильді және термофильді ферменттермен салыстырғанда анағұрлым жоғары икемділікке байланысты. Бұл ферменттер қаттылықтың шамадан тыс бұзылуынан қатты бұзылады. Сонымен қатар, психрофильді ферменттердің ерекше қасиеттері оларды биотехнологиялық мақсаттар үшін және тұрақтылық, икемділік пен белгілі бір белсенділік арасындағы мүмкін болатын байланыстарды зерттеу үшін құнды құрал ретінде пайдаланады [5, 6].

Алайда, төмен температурада ферменттің бейімделуі толық түсінілмеген, себебі психрофильді ферменттер туралы зерттеулер аз. Ғалымдар ашқан кейбір ерекшеліктерге тұз көпірлерінің азаюы, сәл төмен [Arg/(Arg + Lys)] қатынасы, полярлы емес қалдықтардың азаюы және ашық полярлы емес қалдықтардың жоғарырақ саны жатады [7]. Тұрақтылық тұрғысынан психрофильді ферменттер негізінен тұрақсыз, бұл әр түрлі көрсетілімдермен, соның ішінде флуоресцентті спектроскопиямен және басқа әдістермен дәлелденді. Фермент төмен температурада және калориметриялық энтальпияларда ашылуға бейім [8]. Зерттеушілер бұл ферменттердің бір ерекшелігі ферменттерді қоршап тұрған су құрылымының тұрақсыздығына жауап беретін олардың беттерінде полярлық емес қалдықтардың көп болуы деп болжайды. Аргинин мен пролин қалдықтары да аз, бұл омыртқаның икемділігін арттыруы мүмкін. Психрофильді ферменттердің икемділігіне қатысты зерттеулер (спектроскопиялық талдауды, динамикалық флуоресценцияны сөндіруді және молекулалық динамикалық модельдеулерді қолдану) психрофильді ферменттердің икемділігінің жоғарылауы психофилді ферменттердің эволюциясына ықпал етті деген идеяны қолдағанын ескеріңіз [9].

Экстремимдердің құрылымдық бейімделуін түсінудің маңыздылығы олардың әр түрлі өнеркәсіптік қосымшаларда пайдалы екендігімен түсіндіріледі. Осы уақытқа дейін бірнеше экстремофильді организмдер, әсіресе психрофилдер, өндірістік процестерге фермент көзі ретінде сипатталған және қолданылған. Бұрын Антарктика топырағынан психрофильді бактериялардың жаңа штаммы (белгіленген штамм AMS8) жасушадан тыс липаза белсенділігіне скринингтен өткен және молекулалық тәсілді қолдану арқылы әрі қарай талданған. 16S рДНҚ талдауы AMS8 штаммына ұқсас екенін көрсетті Pseudomonas sp. Липаза деп аталатын ген LipAMS8 476 аминқышқылдарынан тұратын полипептидті кодтаған 1431 бит ашық оқу шеңберімен AMS8 штаммынан сәтті оқшауланды. Бұл шикі липаза 20 ° C температурада максималды белсенділік көрсетті. Қосымша генетикалық зерттеулер анықтады LipAMS8 N-терминалды сигналдық пептид жоқ және С-терминалында глицин мен аспартатқа бай напептидтер тізбегі болды (тәжірибелік деректер).

Бұл зерттеуде бөлінген липазаның құрылымы мен қызметі Pseudomonas sp. AMS8 штаммы сәйкес бағдарламалық құралды қолдану арқылы болжанған құрылымды пайдалану арқылы зерттеледі. Төмен температурада ферменттің құрылымдық бейімделуі молекулярлық динамикалық модельдеу (MD симуляциясы) арқылы да зерттеледі. Бұл жаңадан оқшауланған фермент болғандықтан, өнеркәсіптік, биотехнологиялық және іргелі мақсаттарда қолданылуы мүмкін психофильді фермент әлеуетін одан әрі түсіну және ашу үшін қосымша зерттеулер қажет.

2. Материалдар мен әдістер

2.1. Бағдарламалық қамтамасыз ету

Ферменттердің болжамды құрылымын модельдеу мен имитациялау Windows 7 Ultimate операциялық жүйесі бар бір компьютерде (Intel (R) Core RM i5 процессоры, 650 @ 3,2 ГГц Co, 4,0 ГБ жедел жады) орындалды. Yet Another Scientific Scientific Artificial Reality Application (YASARA) бағдарламалық құралы [10] ДК-де орнатылды және LipAMS8 болжамды молекулалық құрылымын молекулалық модельдеу және молекулалық динамика (MD) модельдеу үшін пайдаланылды.

2.2. LipAMS8 реттілігі

ADM87309 қосылу нөмірі бар NCBI-дан алынған LipAMS8 ферментінің аминқышқылдарының тізбегі дәйектілікті талдау және модельдеу үшін салмағы 50 кДа болатын 476 амин қышқылы қалдықтарынан тұрады. BLAST [11] бағдарламасы LipAMS8 ферментімен жоғары реттілік сәйкестігі бар гомологиялық тізбекті анықтады. Реттілік сәйкестігінің ең жоғары баллына ие бірізділік белгілі бір сипаттамаларға, оның ішінде шығу түрі мен шешілген 3D құрылымдарының болуына қарай таңдалды. Кейіннен бірнеше ретті теңестіру Biology Workbench [12] ашық бағдарламалық құралын пайдаланып, ақуыз тізбегімен орындалды. Serratia marcescens [13] және Pseudomonas sp. MIS38 [14] бұл үлгілердің екеуі де жоғарыда айтылғандай қажетті критерийлерге сәйкес келді.

2.3. Салыстырмалы модельдеу және валидация

Үлгілеу үшін алынған липазалардың кристалды құрылымдары пайдаланылды Serratia marcescens [13] және Pseudomonas sp. MIS38 [14]. Липазалардың атомдық координаттары Serratia marcescens (PDB ID: 2qua) және Pseudomonas sp. MIS38 (PDB ID: 2z8x) протеин деректер банкінен алынды. 3D моделі YASARA [10] көмегімен жасалды. Валидация VERIFY3D [15] (оның қазіргі 3D құрылымындағы ақуыз тізбегінің жарамдылығын бағалау үшін) және Рамачандран сюжеті [16] (құрылымның геометриялық аспектілерін бағалау) көмегімен жүргізілді.

2.4. Әр түрлі температурадағы молекулалық динамика (МД) симуляциясы

MD симуляциясы молекулалық масштабта егжей-тегжейлі микроскопиялық модельдеу үшін қосымша ақпарат берді. Әдіс модельдік жүйелерді қолдану арқылы молекулалардың мінез -құлқына еліктеу арқылы конструктивті тәсілге сүйенеді. Неғұрлым қуатты компьютерлер мағыналы және пайдалы ақпаратты алуға шынайы үмітпен үлкен күрделілікті зерттеуге мүмкіндік береді [17].

Бұл зерттеуде MD симуляциясы суда орындалды. Бұл 0°C, 5°C, 25°C, 37°C, 50 температурада еріткіштің 6940 молекуласымен (соның ішінде NaCl және су) және 467 LipAMS8 аминқышқылдарының қалдықтарымен толтырылған траектория қорапшасының ішінде болжамды модельді модельдеуді қамтыды. °C және 100°C. Судың тығыздығы температураға байланысты өзгереді, өйткені судың теориялық тығыздығы температураға байланысты.

YASARA бағдарламалық жасақтамасында енгізілген AMBER03 [18] күш өрісінің параметрі MD модельдеу үшін пайдаланылды. Әрбір модельдеуде ақуыз моделі мен еріткіш молекуласы арасындағы байланыс аймағының айырмашылығын (CAD) азайту үшін бастапқы үлгі барынша азайтылды. Кішірейту кезінде коньюгаталық және ең тік түсу алгоритмдері қолданылды.

2.5. Симуляциялық талдау

Фермент өндірістің 6 наносекундына дейін болатын әрбір модельдеу үшін 240 сақталған қадамды қолдану арқылы зерттелді. Талдау әр түрлі температурадағы судағы ферменттің динамикалық қасиеттерін жақсырақ түсінуге мүмкіндік береді. Траекториялардың тұрақтылығын тексеру үшін ақуыз магистральдық және қалдықтары үшін орташа квадраттық ауытқу (RMSd) есептелді. Сонымен қатар, траекториялардың икемділігін зерттеу үшін әрбір қалдыққа орташа квадраттық ауытқу (RMSf) есептелді. Өндіріс уақытының 6 наносекунд (нс) ішінде ферменттің айналу радиусын (Rgyration) және еріткіштің қол жетімді бетінің ауданын (SASA) есептеу арқылы қосымша талдау жасалды.

3. Нәтижелер және талқылау

3.1. LipAMS8 салыстырмалы модельдеу
3.1.1. LipAMS8 модельдеу

Тізбекті туралау салыстырмалы модельдеуді пайдалана отырып, липаза AMS8 (LipAMS8) 3D құрылымын құру үшін қолайлы үлгілерді іздейді. Бұл зерттеуде кристалды құрылымдар Pseudomonas sp. MIS38 липаза және Serratia marcescens LipA ​​(дәйектілік сәйкестігі үшін 80% және 69% ұпай жинайды) модельдеу үлгілері ретінде таңдалды, себебі екеуі де LipAMS8 тізбегімен тураланған кезде реттілік сәйкестігінің ең жоғары ұпайларына ие. Екі шаблонда да RSCB PDB Data Bank -тен алуға болатын шешілген құрылымдар бар, бұл ферменттің 3D құрылымын болжау үшін маңызды.

LipAMS8 модельдеуде екі шаблон пайдаланылды, осылайша әр шаблоннан модель құрылды, сондай -ақ таңдалған екі үлгіні қолданып протеиннің ең жақсы конфигурациясы негізінде құрылған гибридті модель. Дегенмен, әрбір модельдің Z-балы ең маңызды параметр болып табылады, өйткені алынған әрбір үлгіден алынған ең жақсы Z-баллының мәні модельдің дәлдігі мен сапасын білдіреді. Кейіннен LipAMS8 үшін ең жақсы үлгі болады деп күтілетін гибридті құрылым тек қолдану арқылы алынғанмен салыстырғанда нашар Z-баллдарына байланысты қабылданбайды. Pseudomonas sp. Үлгі ретінде MIS38.

Модель Рамачандран сюжеті арқылы расталды (2 -сурет). Модельде ең қолайлы рұқсат етілген аймақта тұратын қалдықтардың 89,5% болды. Ең жақсы көрсеткіштер 90,0% және одан жоғары болса да, алынған балл қолайлы деп есептеледі, себебі бұл модель кристалды құрылым емес, болжам моделі (яғни, кристалды құрылым болжамдалғанға қарағанда толық шешілген құрылым). Алдыңғы зерттеуде Рамачандран учаскесінің теріс/рұқсат етілмеген аймағында орналасқан каталитикалық триаданың серинасы ферменттің белсенді конформациясы үшін ұсынылған болатын [19]. Алайда, бұл зерттеуден LipAMS8 каталитикалық үштігінің Ser 207 Рамачандран учаскесінің рұқсат етілген аймағында орналасқан. Бұл фермент белсенді емес конформацияда екенін көрсетеді, оны ферменттің байқалатын қақпақ құрылымы қолдайды (жабық конформация). Ферменттің белсенді конформациясын болжау қабықтың құрылымын бақылау арқылы да жүзеге асады.

1(b) және 1(c) суреттерде көрсетілген LipAMS8 үлгісін модельдеу үшін қолданылатын үлгі құрылымымен салыстырғанда, LipAMS8 болжамды үлгісі екі негізгі аймақты көрсетеді: каталитикалық (жасыл) және каталитикалық емес (көк) домендер, 1 (а) суретте көрсетілгендей. N-терминалындағы каталитикалық домен бай α спираль, ал С-терминалында каталитикалық емес домен басым β-жіптер. Каталитикалық домен сонымен қатар α/β-гидролаза қатпары және каталитикалық триада, оның құрамына Ser 207, His 255 және Asp 313 қалдықтары кіреді. Ser 207 G-X-S-X-G мотивтерінің пентапептидінде пайда болады (мұнда X оның 206 мен леуін 208 білдіреді) және олардың арасындағы күрт бұрылыста орналасқан. β-жіп және α-нуклеофильді шынтаққа ұқсайтын спираль (әдетте олардың құрылымдық тұқымдасында болады) α/β-гидролазалар) [20]. Бұл каталитикалық серинге Ser O нуклеофильді шабуыл кезінде пайда болатын теріс зарядты тұрақтандыратын оксианион тесігі көмектеседі деп болжайды.γ [19].


(а)
(б)
(c)
(а)
(б)
(c) (а) LipAMS8 3D құрылымын болжады. Құрылым каталитикалық (жасыл) және каталитикалық емес (көк) домендерден тұрады. Қақпақ боялған (қызыл). (b) және (c) LipAMS8 құрылымының (күлгін) 2QUA (күміс) және 2Z8X (сары) бар қабаттасуы.


LipAMS8 3D құрылымының Рамачандран сюжеті. Құрылым 89,5% құрайды, яғни қалдықтардың 89,5% ең қолайлы аймақта тұрады.

Әдетте липаза 2 конформациялық күйде болуы мүмкін: белсенді және белсенді емес. Қақпақ конформациясы (ашық немесе жабық) ферменттің белсенді немесе белсенді емес конформацияда екенін анықтайды. Липазаның белсенді конформациясы каталитикалық белсенділік үшін қажет [19]. Бұл зерттеуде каталитикалық домендегі каталитикалық орынды жабатын қақпақ тәрізді құрылым бар, бұл ферменттің белсенді емес конформациясын болжайды. Алдыңғы зерттеулерде ферменттің белсенді формасының қақпағы ашық, бұл субстраттың катализ үшін байланыстыратын жерге кіруіне мүмкіндік беретінін көрсетті [21]. Осылайша, осы зерттеудегі қақпақтың жабық конформациясы нуклеофильді Ser 207 субстратқа шабуыл жасай алмайтынын білдірді.Қақпақты ашу үшін су-май интерфейсі қажет, осылайша қақпақ субстраттар үшін каталитикалық қалтаға қол жеткізуді қамтамасыз ететін каталитикалық орынды ашу үшін модуляциялануы мүмкін [19]. Бұл LipAMS8 белсенділігін арттырады. LipAMS8 1 -ші қақпақшада гидрофобты қалдықтардың көп саны бар, оның ішінде Ала 51, Леу 53, Вал 54, Вал 57 және Вал 58. Бұл гидрофобты қақпақ қалдықтарының липидті интерфейспен тиімді өзара әрекеттесуіне мүмкіндік береді және қақпақтың ашылуын жеңілдетеді.

Осы зерттеуден LipAMS8 каталитикалық емес домендегі RTX мотивтерінен тұрады, бұл LipAMS8 I.3 субфамилиясына жататын RTX липазаларының бірі екенін көрсетеді. Бұл цистеин қалдықтарының болмауымен қосымша дәлелденеді [22]. Назар аударыңыз, RTX мотиві әр түрлі грамтеріс микроорганизмдерде бар [6]. Бұл мотив (глицинге бай апептидті емес тізбектерден тұрады) әдетте ферменттің карбокси-терминал бөлігінде орналасады [22]. LipAMS8 3D құрылымында RTX мотивтерінің тізбегі параллельді құрады β-ролл, ол әр мотивтің алғашқы 6 қалдығы кальций иондарын бекіту үшін пайда болады (Ca 2+). Қалған 3 қалдық қысқа мерзімде құрылады β-жіптер, нәтижесінде оң жақ спиралі пайда болады β-каталитикалық емес домендегі тізбек. RTX мотивтерінің нақты қызметі түсініксіз болып қалады. Алайда, олар рецепторлармен байланысатын домендер, секрецияны күшейткіштер және ішкі шаперондар болуы мүмкін [6].

LipAMS8 болжамды моделінде металл иондары бар, оның ішінде Ca 2+ 6 атомы және Zn 2+ 1 атомы бар. Есіңізде болсын, металл иондары ферменттердің едәуір бөлігіне каталитикалық белсенділікті қажет етеді. Металл иондары субстраттың белсендірілуіне және фермент құрылымының электростатикалық тұрақтануына да ықпал етуі мүмкін. Бұл зерттеуде Asp 128, Asp 130 және лиганд Zn 2+ байланыстыру орындарында өзара әрекеттеседі. Осы LipAMS8 құрамында Zn 2+ катализаторлық жерде орналаспайды, сондықтан ол ферменттің каталитикалық белсенділігіне ықпал етпеуі мүмкін. Иондар каталитикалық белсенділікке қосқан үлесімен қатар дисульфидтер функциясына ұқсас жергілікті және жалпы құрылымдық тұрақтылықты қамтамасыз ете алады [23]. Қорытындылай келе, LipAMS8 болжамды құрылымында металл иондары бар, олар жалпы құрылымдық тұрақтылыққа ықпал етуі мүмкін. Алайда, ферментте лизиндермен салыстырғанда аргининдер аз немесе жоқ, пролин мөлшері төмен және тұз көпірінің болмауы байқалады, бұл психофильді ферменттердің төмен температурада бейімделуіне ықпал етеді. Сонымен қатар, фермент мезофильді немесе термофильді ферменттермен салыстырғанда жоғары икемділікке ие болады деп болжануда, бұл психрофильді ферменттердің төмен энергия шығындарында белсенді болуына мүмкіндік береді [7].

3.1.2. Молекулярлық динамикалық (МД) модельдеу

MD модельдеу жоғары температурада модельдеу кезінде LipAMS8 құрылымындағы, икемділігіндегі және динамикасындағы өзгерістерді анықтау үшін жүргізілді. Конформациялық іріктеу 12 секундпен шектелді. LipAMS8-бұл суық әсер ететін фермент. Сондықтан жоғары температурада кинетикалық энергияның ұлғаюына байланысты молекулааралық күштердің бұзылуына байланысты температура 25 ° С -тан 100 ° С -қа дейін көтерілгенде құрылым денатурациялануы немесе ашылуы керек. Дегенмен, бұл зерттеуде, тіпті ферментті жоғары температурада имитациялағанда да, қайталама құрылымның көп ашылуы болмады. Бұл ең көбі 12 нс болатын конформациялық сынама алудың шектелуіне байланысты болуы мүмкін. Құрылымдық өзгерістерді көру үшін модельдеу уақытын ұзарту қажет болуы мүмкін.

3.1.3. Деректерді молекулалық динамиканы модельдеу

Бастапқы модельдердегі омыртқа атомдарының орташа квадраттық ауытқу (RMSd) мәндері ақуыз жүйесінің конвергенциясын бағалайды. Бұл зерттеуде 0°C, 5°C, 25°C, 37°C, 50°C және 100°C температурасында MD модельдеу кезінде азайтылған болжамды үлгі құрылымынан RMSd мәндері 3-суретте көрсетілген. 5° C, ақуыз табиғи тәрізді болып қалады және минималды құрылымнан орташа 1,83 with теңгеріледі. Бұл ферменттің 5 ° C температурадағы тұрақтылығын көрсетеді. 5 ° C -пен салыстырғанда, 0 ° C -та RMSd мәні ақуыздың 3D құрылымы 1000 пс жеткенде тұрақсыз болатынын көрсетті. RMSd мәні 2 Å жоғары мәндерге дейін ауытқи бастайды және тіпті 2525 ps кезінде 3,45 Å мәніне жетті. Мән 3675 пс 1.807 Å дейін төмендеді және 4000 пс 2 than жоғары көтерілді. RMSd тұрақсыз ауытқуы модельдеу кезінде байқалатын қайталама құрылым элементтерінің айырмашылығына сәйкес келеді. Алайда, құрылымдық тұрақтылық 5500 пс -тен кейін байқалады, себебі RMSd ауытқуының үлгісі сақталады және модельдеудің соңына қарай 12 -ден 2 Å -тен аспайды.


25 ° C, 37 ° C, 50 ° C және 100 ° C ферменттің тұрақтылығының флуктуациялық тренді симуляция кезеңінде RMSd мәндері 4,0 Å жоғары 3000 мм кезінде қалған симуляция кезеңінде құндылығын арттырды. Бұл ферменттің тұрақсыз күйі температура 25°C жоғары көтерілген кезде LipAMS8 ферментінің белсенділігі төмендегенін анықтаған тәжірибелік деректермен расталады. Зерттеу нәтижесінде біз 25 ° C, 37 ° C, 50 ° C және 100 ° C температурада және судың тығыздығының өзгеруіне молекуланы бейімдеу үшін ақуыздың ғаламдық 3D құрылымы өзінің табиғи құрылымын жоғалтады ( еріткіш). Осылайша, бұл нәтиже ақуыздың геометриялық координаттарының өзгеруі мен тұрақтылығының төмендеуінен болатынын көрсетеді.

Біз LipAMS8 үшін суда модельденген ең тұрақты температура 0 ° C және 5 ° C екенін анықтадық, өйткені төмен температура құрылымның тұтастығы мен тұрақтылығын сақтай отырып, конформациялық қозғалыстың аз болуына ықпал етеді. Екінші жағынан, 25 ° C пен 100 ° C арасындағы температура үшін ферменттің құрылымы тұрақсыз және бастапқы құрылымынан айтарлықтай ауытқиды. Суда 25°С-тан 100°C-қа дейінгі температурада модельдеу кезінде фермент құрылымының жоғары ауытқуы молекулалардың кинетикалық белсенділігінің жоғарылауына әкелетін молекулалық күштердің бұзылуымен байланысты болуы мүмкін. Алайда, ферментті органикалық еріткіште модельдеу кезінде болатын құрылымдық өзгерістермен салыстырғанда, судағы модельденген ферменттің құрылымдық өзгерістері соншалықты маңызды емес [24].

Бір қызығы, 0 ° C және 5 ° C орташа RMSd баллдары модельдеу кезінде тұрақты болды. Дегенмен, тұрақтылық Zn 2+ және Ca 2+ сияқты металл иондарының болуымен ықпал ететін деп есептелетін ферменттің каталитикалық аймағына ғана бейімделді. Басқа жағынан, 0°C және 5°C сияқты төмен температурада каталитикалық емес доменнің жоғары икемділігінен туындаған бұл ферменттің тұрақсыз күйі қандай да бір түрде болжауға болады, өйткені фермент өзін төмен температураға бейімдеу керек, соның арқасында кинетикалық энергия біртіндеп төмендейді. Егер осы кезде фермент олардың икемділігін арттырмаса, құрылым тым қатты болып кетуі мүмкін және катализ температурасының төмендеуін өтей алмайды.

4-суретте 0°C-ден 100°C-қа дейінгі температурада суда имитацияланған LipAMS8 үшін қалдыққа шаққандағы орташа квадраттық ауытқулар (RMSf) көрсетілген. Барлық температуралар үшін қалдық үшін орташа RMSf ұпайлары 1,12 Å пен 4,1 Å аралығында өзгереді. Ең жоғары тербеліс көрсеткіші 100°C. Бұл нәтиже жоғары температураның ферменттің икемділігіне әсеріне тең. Алайда, 0 ° C және 5 ° C ферменттің икемділігін салыстыру кезінде RMSf мәні 1,43 -тен 1,12 Å дейін төмендеді. Ферменттің төмен температурада жоғары икемділігі температураның төмендеуіне қарай «қату әсеріне» қарсы тұру үшін ферменттің бейімделуін болжауы мүмкін.


Каталитикалық учаскеде RMSf ұпайлары әртүрлі температураларда суда имитацияланған қалдықтардың жоғары икемділігін көрсетпейді. Икемділік әртүрлі температураларда орташа RMSf ұпайынан төмен мәнде сақталады. Бұл каталитикалық триаданың тұрақтылығы қалдыққа шаққандағы RMSd көрсеткішімен расталады.

Тұтастай алғанда, бір қалдыққа ауытқу үлгісі бір қалдыққа RMSd суретінде көрсетілген үлгіге ұқсас болды. Екі сан да каталитикалық емес аймақта жоғары тербеліс орын алатынын көрсетеді. Температуралар арасындағы ең тұрақты ауытқулар RTX қайталанулары болатын каталитикалық емес доменде тұратын 393–476 қалдықтарында орын алды. Доменнің икемділігі жоғары глицин қалдықтарының болуына байланысты пайда болуы мүмкін, олар ақуыз құрылымында икемділікті енгізетіні белгілі, өйткені оларда бүйірлік тізбектер жоқ [25]. LipAMS8 икемділігінің жоғарылауы (каталитикалық емес доменнің тұрақтылығының төмендігінен туындайды) каталитикалық емес домен LipAMS8 молекулалық құрылымының маңызды бөлігі болып табылатынын білдіруі мүмкін. Бұл домен төмен температурада жоғары фермент белсенділігіне ықпал етуі мүмкін.

Қақпақ құрылымының құрылымдық икемділігін тексеру 51-58 қалдықтарынан тұратын №1 қақпақтың кез келген температурада орташа RMSf баллынан жоғары емес екенін көрсетеді. Алайда, 148–167 қалдықтардан тұратын № 2 қақпақ температурада 148–153 қалдықтарда ауытқуға ие. Бұл әр түрлі температурада суда модельдеу кезінде қақпақ қалдықтарының икемділігін дәлелдейді. Бұл нәтиже LipAMS8 2 нөмірлі қақпағы субстраттардың болуы сияқты қолайлы жағдайларда конформациялық ауысудан өтуі мүмкін деген гипотезаға әкелді. №2 қақпақтағы 148–153 қалдықтары икемдірек, фазааралық белсендіру кезінде байланыстыру орнын ашу үшін қақпақ құрылымын ашатын ұстағыш ретінде әрекет етуі мүмкін. №1 қақпақтан айырмашылығы, №2 қақпақ икемді. Осылайша, №2 қақпақ субстрат болған кезде ашылатын бірінші қақпақ болуы мүмкін. Бірінші қақпақтың саңылауы айналасындағы су-май интерфейсі субстратты каталитикалық алаңмен байланыстыру үшін аз икемді. Қақпақтың ашылуы липазаның қақпақ тәрізді құрылымы бар маңызды қадам екенін ескеріңіз. Қақпақ құрылымында тұратын қалдықтардың икемділігі қақпақтың қозғалыс жылдамдығын анықтау үшін маңызды, ол төмен температурада фермент функциясының бейімделуінде маңызды рөл атқарады [7].

Әртүрлі температурадағы суда имитацияланған LipAMS8 құрылымында байқалатын құрылымдық икемділік органикалық еріткіште имитацияланған жағдайда төмендеуі мүмкін. Алдыңғы зерттеулер органикалық ерітіндідегі ферменттің жоғары қаттылығын көрсетеді [26]. Дегенмен, молекулярлық деңгейде ұсынысты қабылдау немесе қабылдамау үшін көп ақпарат жоқ. Ферменттердің сулы және сулы ортада құрылымдық икемділігін тексеру үшін ферменттің құрылымдық негізін салыстыру үшін қосымша имитация қажет.

ЛипАМС8 болжанған моделінің атомдық ауытқуларын талдау үшін магистральдық атомдардың бір қалдыққа орташа квадраттық ауытқуы (RMSf) талдауы және бір қалдыққа орташа квадраттық ауытқуы (RMSd) пайдаланылады. 5 -суретте 0 ° C, 5 ° C, 25 ° C, 37 ° C, 50 ° C және 100 ° C температурада бір қалдыққа RMSd көрсетілген. Барлық қалдықтар үшін орташа RMSd, оның ішінде терминалдық қалдық ақуыздың конформациялық икемділігі мен динамикасы арасындағы байланыс үшін ақуыздың икемділігін сапалы түрде өлшейді.


Деректерге сүйенсек, қалдықтардың RMSd орташа мәндері 0 ° C пен 5 ° C аралығында шамамен бірдей. Алайда, 25 ° C, 37 ° C, 50 ° C және 100 ° C температурада RMSd орташа мәндері 6,29 Å дейін жоғарылайды. Қалдықтардың RMSd орташа мәндерінің үлгісі барлық температуралардағы орташа квадраттық ауытқудың (RMSf) орташа мәндеріне ұқсас.

Фермент құрылымының геометриясының ауытқуы негізінен каталитикалық емес аймақта болды. 412–425 және 436–470 қалдықтарындағы қалдық үшін RMSd мәндері әрбір температурадағы RMSd орташа баллынан жоғары. Осыдан ферменттің дестабилизациясы бір зерттеу ұсынған ақуыздың барлығын қамтымайды [19]. Оның орнына ферменттің тұрақсыздануына ферменттің бір бөлігі кіруі мүмкін (осы зерттеуде байқалғандай). Сонымен қатар, деректер ферменттің тұрақсыздануы көбінесе каталитикалық аймақта жүреді деген постулатты жоққа шығарды [8]. Ферменттің тұрақсыздануы көбінесе каталитикалық емес доменде жүреді, бұл ферменттің 3D құрылымының тұрақтылығын жоғалтуды тудыратын қалдықтардың болуына байланысты болуы мүмкін. Бір қызығы,

-орнақтылығын сақтау үшін ұсынылады Pseudomonas sp. MIS38. RTX мотивтері мен Ca 2+ қатысуымен пайда болатын осы тізбектегі жою, өзгерту және мутация ферменттің құрылымдық конформациясының өзгеруіне және денатурациясына әкеледі. Алайда, біз RTX қайталануының қысқартылған/аз санын, металл иондарының санының аз болуын ұсындық. Pseudomonas sp. MIS38 LipAMS8 өте суық ортаға бейімделуінің себебі болуы мүмкін.

Каталитикалық доменді зерттеу Zn 2+ -пен әрекеттесетін Asp 128 және Asp 130 әр температурада RMSd орташа баллдарынан жоғары қалдық мәндері үшін RMSd бар екенін көрсетеді. Осылайша, Asp 128 және Asp 130 температураға бейімделуді ауытқитын және жұмылдыратын қалдықтардың қатарына жатады. Алайда, Asp 128 және Asp 130 ауытқуларының RMSd орташа көрсеткіштеріне қатынасы температураның жоғарылауымен төмендейді. Бұл жоғары температурада металдар мен Asp 128 және Asp 130 арасындағы жоғары өзара әрекеттесуді білдіреді. Бұл нәтиже Zn 2+ жоғары температурада ферменттің белсенді конформациясында құрылымдық тұрақтандыруға ықпал етеді деген алдыңғы зерттеумен толық сәйкес келеді [27]. Бұл нәтиже ферменттің жоғары температурада, әсіресе каталитикалық аймақта бейімделу ықтималдығының жоғары екендігін көрсетеді, себебі Zn 2+ фермент құрылымын тұрақтандырады.

4-суретте көрсетілгендей, каталитикалық доменде Са 2+ әрекеттесетін қалдықтар үшін ұпайлар сақталады. Бұл құрылымның бастапқы құрылымынан ауытқымауы үшін металдың каталитикалық доменді тұрақтандыруға ықпал ететінін көрсетті. Бұл нәтиже алдыңғы зерттеуде ұсынылған липазаның құрылымдық тұрақтылығындағы Ca 2+ функциясымен келіседі B. glumae липаза [28]. Кальцийдің LipAMS8 белсенділігіне әсері туралы эксперименттік мәліметтер Ca 2+ ферменттің құрылымдық тұрақтылығына ықпал етуі мүмкін деген пікірді растады. Осылайша, ферментативті қасиеттер сақталады және үлкен кірісті қамтамасыз ету үшін каталитикалық белсенділік жақсарады. Каталитикалық аймақта Са 2+ әрекеттесетін қалдықтардан айырмашылығы, каталитикалық емес домендегі Ca 2+ RMSd және RMSf жоғары мәндерге ие, бұл қалдықтың тұрақсыздануын және икемділігін көрсетеді. Қалдықтың тұрақтылығына Ca 2+ үлесі тұрақтылыққа ықпал етеді деген ұсыныспен келіспейді. Каталитикалық емес аймақта Ca 2+ -пен әрекеттесетін қалдықтың RMSd және RMSf баллдары Ca 2+ -тен бейімделу процесіне байланысты болуы мүмкін, сондықтан каталитикалық домен тұрақты болып қалады. Бұл құрылымдық тұрақтылық пен конфигурацияның өзгеруіне байланысты каталитикалық белсенділікке жауап беретін каталитикалық доменнің ашылуына және дисфункциясына жол бермейді.

12 нс траекториялар шегінде әртүрлі температурадағы ферменттің айналу радиусы (Rgyration) 6-суретте көрсетілген. Параметр динамикалық модельдеу кезінде ақуыз құрылымдарының кеңею үрдісі туралы ақпаратты береді. 5 ° С температурада жоғары және төмен температурада модельдеу кезінде ферменттің Ригирация баллымен салыстырғанда Ригирация көрсеткіші сақталады. LipAMS8 радиациясының радиациясының ең жоғары көрсеткіші 25 ° C температурада, симуляцияның 12 секундында 27.128 Å дейін өсті. Осыдан кейін 5 ° C температурадан басқа температураның басқа көрсеткіштері қосылады. Бұл төмен температурада құрылымның нативті жинақтылығын жоғалтпау үшін фермент құрылымының бейімделуін көрсетеді. Жалпы алғанда, нәтиже 3 -суретте көрсетілгендей фермент құрылымының ауытқуына пропорционалды, ал SASA 7 -суретте көрсетілгендей ақуызды сулы полярлы емес еріткішке [29] жылжыту үшін қажет бос энергияның берілуін көрсетеді. 5 ° C және 0 ° C температурадағы SASA көрсеткіштері модельдеудің 12 секундында сақталатын ауытқу үлгісін көрсетеді. 25 ° C -пен салыстырғанда фигураның симуляция кезеңінде ашылғанын көрсететін көрсеткіш жоғарылайды. Бұл температурада ферменттің таралуы ферменттің қайталама құрылымының құрылымдық өзгерістеріне пропорционалды. SASA баллының жоғарылауы 37°C, 50°C және 100°C температурада да байқалады.


Материалдар мен тәсілдер

Ақуыздың шамадан тыс экспрессиясы және тазартылуы

The ИаBglA-pET28a өрнек векторы түрлендірілді Ішек таяқшасы BL21 (DE3) жасушалары (Agilent Technologies, Санта Клара, АҚШ). Жасушалар 1L LB ортасында 37 ° C температурада өсірілді және ақуыз экспрессиясы 0,4 мМ изопропил -Д -тиогалактопиранозидпен (IPTG) 37 ° C температурада 3 сағат бойы индукцияланды. Жасушалар 7000 центрифугалау арқылы жиналды xg (20 мин, 4 ° C), А буферінде (20 мМ натрий фосфаты, 500 мМ NaCl, 20 мМ имидазол, рН 7,5) қайта суспензияланды, 1 мм ПМСФ қосылған және лизоциммен өңдеуден кейін ультрадыбыспен өңделген. Жасуша сығындысы центрифугалау арқылы анықталды (20 000 xg, 30 мин, 4 ° C) және үстіңгі қабат ÄKTA жүйесімен (GE Healthcare Bioscience, Питтсбург, АҚШ) біріктірілген 5 мл Hi-Trap хелатирленген HP бағанына (GE Healthcare Bioscience, Питтсбург, АҚШ) жағылды және алдын ала теңестірілді. A буфері. Байланысқан ақуыздар B буферінің сызықты емес градиентімен (20 мМ натрий фосфаты, 500 мМ NaCl, 500 мМ имидазол, рН 7,5) элюцияланды. β-глюкозидаза белсенділігі бар фракциялар біріктіріліп, Amicon Ultra центрифугалық қондырғыларды пайдаланып 5 мл-ге дейін концентрленді және бұрын натрий 20M-мен теңестірілген Superdex 75 16/60 бағаны (GE Healthcare Biosciences, Питтсбург, АҚШ) арқылы өлшемді алып тастау хроматографиясына жіберілді. , 150 мМ NaCl, рН 7,5, ағын жылдамдығы 0,5 мл/мин. Тетрамерлі және мономерлі пішіндер осы хроматографиялық қадам арқылы екі түрлі шыңда сәтті ажыратылды және SDS-PAGE талдауына сәйкес жоғары тазалықты көрсетті. Ақуыз концентрациясын А.280нм өшу коэффициентін қолдана отырып, 110,030 М −1 см −1.

Биохимиялық ферменттерді талдау

Фермент белсенділігі колориметриялық субстрат 4-нитрофенил β-D-глюкопиранозид арқылы өлшенді (бNPG, Sigma-Oldrich Co, Сент-Луис, АҚШ). Тәжірибелер субстраттың қанықтыру жағдайында (0,5 мМ) 100 мкл реакцияларда үш көшірмеде орындалды. бNPG) 40 мМ натрий фосфат буферінде рН 7.0. Соңғы фермент концентрациясы 20 нМ болды. Реакциялар каталитикалық белсенділік үшін оңтайлы жағдайларда (30 °C және рН 7,0) 10 минут бойы инкубацияланды және 100 мкл 1 М натрий карбонатымен (Na) тоқтатылды.2CO3).Ферменттің белсенділігі спектрофотометриялық түрде 405 нм -де бөлінуін бақылады б-инитрофенол Infinite® 200 PRO микропластинаны оқу құрылғысы (TECAN Group Ltd., Маннедорф, Швейцария). Өлшемдер ферменттің биологиялық бірлігі (тетрамер) үшін байқалатын максималды каталитикалық белсенділікті ескере отырып, салыстырмалы белсенділікпен (%) көрсетілген.

Дөңгелек дихроизм

Дүниежүзілік конструкцияны бағалау үшін дөңгелек дихроизм спектроскопиясы қолданылды ИаBglA тетрамерлі және мономерлі конформацияларда. CD өлшемдері CDF-426S/15 Peltier температурасын бақылау жүйесімен басқарылатын JASCO J-815 CD спектрометрінде алынды (Jasco Analytical Instruments, Оклахома, EUA). Барлық CD эксперименттері үшін ұзындығы 1 см болатын кварц кюветасы қолданылды және әр спектр орташа есеппен кемінде үш сканерледі. 20 мМ натрий фосфатында, 150 мМ NaCl, рН 7,5 құрамында ақуыз концентрациясы 5,8 мкм (тетрамер мен мономер үшін) болды. Барлық спектрлер өткізу қабілеті 2 нм және жауап беру уақыты 4 с/нм болатын 200–260 нм диапазонында 20 °C температурада алынды. CD деректері пішіндерді салыстыруға мүмкіндік беретін молярлық қалдық эллиптілігіне буферді алып тастады және қалыпқа келтірді.

Жарықтың динамикалық шашырауы

Гидродинамикалық радиус (Rс) мономерлік формасы ИаBglA динамикалық жарық шашырауы (DLS) арқылы анықталды. Деректер 20 ° C температурада Malvern Zetasizer Nano ZS 90 (Malvern Instruments, Worcestershire, Ұлыбритания) 633 нм лазермен, 90 ° шашырау бұрышы бар кварц ұяшығында жазылған. Өлшемді алып тастау хроматографиясынан тазартылған үлгілер әртүрлі концентрацияларда (0,3-тен 1,2 мг/мл) талданды және гидродинамикалық радиустар Стокс бойынша трансляциялық диффузия коэффициентінің (Dt) экстраполяциясынан орташа 20 жүгіруден кейін алынды. Эйнштейн теңдеуі.

Аналитикалық ультрацентрифугалау (AUC)

Тұндыру жылдамдығы (SV) эксперименттері Beckman Optima XL-A аналитикалық ультрацентрифугасы (Beckman Coulter Inc, Brea, EUA) арқылы жүргізілді. Деректер 220 және 280 нм анықтаулар үшін абсорбциялық оптикалық жүйені пайдаланып 35 000 айн/мин және 20 °C температурада жиналды. ИаBglA әр түрлі концентрацияларда (0,2, 0,4 және 1 мг/мл) 20 мМ натрий фосфатында, 150 мМ NaCl, рН 7.4 -те дайындалды. SV сканерлері ақуыздың молекулалық массасын анықтау үшін SEDFIT (v14.4d) 36 бағдарламасындағы c (s) әдісі арқылы талданды. Стандартты с (тар) таралуы 0,95 тұрақты реттеу деңгейімен және үйкеліс коэффициентімен (ƒ/ƒ) қолданылды.0) регуляциялау параметрі ретінде қолданылады. Стандартты тұндыру коэффициенттері (с20, в) буфердің тұтқырлығы, тығыздығы мен температурасы әсерінен болатын кедергілерді жою үшін түзетулер енгізілгеннен кейін үздіксіз c (S) қисықтарының шыңдарының максимумымен анықталды (ρ = 1,0039 г/мл және η = 0,0102643 Poise SEDNTERP бағдарламасы арқылы алынды) ). С °20,б шексіз сұйылтудағы мән s сызықтық регрессиясы арқылы алынды20, в Ақуыз концентрациясының функциясы 37.

Кіші бұрышты рентгендік шашырау

Кішкентай бұрыштық рентгендік шашырау (SAXS) өлшемдері D01A-SAXS2 сәулелік линиясынан монохроматикалық рентген сәулесінің көмегімен (λ = 1,488 Å) Бразилиялық синхротронды жарық зертханасында (LNLS, Кампинас, Бразилия) жүргізілді. ИаBglA үлгілері 20 мМ натрий фосфатында, 150 мМ NaCl, рН 7,4 1 және 2 мг/мл концентрациясында дайындалды. Үлгілер 30 минут ішінде 23,000 центрифугаланды xg және 4 ° C температурасы SAXS барлық эксперименттерінің алдында потенциалды агрегаттарды жою үшін. Үлгі мен детектор арасындағы қашықтық шашырау векторының диапазонын алу үшін 1000 мм-ге орнатылды (q) 0,013-тен 0,33 Å -1-ге дейін, бұл жерде q q-4π sinθ/λ ( 2θ - шашырау бұрышы). Үлгілер 20 °C температурада 1 мм жол ұзындығы слюда жасушаларында талданды және шашырау профильдері радиациялық зақымдануды және сәуленің тұрақтылығын бақылау үшін кезекті он кадрға (әрқайсысының ұзақтығы 10 секунд) жазылды. Алынған SAXS қисықтары FIT2D 38 бағдарламасының көмегімен буферден шығарылды және біріктірілді. Гирация радиусы (Rg) Гвинье 39 теңдеуінен және 40 GNOM пакетін пайдаланып жанама Фурье түрлендіру әдісімен анықталды. Сондай-ақ GNOM бағдарламасы бөлшектердің қашықтықты бөлу p(r) және максималды диаметрі D құру үшін пайдаланылдымаксимум. алу үшін DAMMIN бағдарламасы 41 қолданылды ab initio үшін үлгілер ИаBglA (қолдан жасалған атом моделі), экспериментальды шашырау деректеріне сәйкес келетін күйдіруді оңтайландыру процедурасы бойынша. Ақуыз пішіні орташа есеппен 20 түрлі арқылы қалпына келтірілді ab initio DAMAVER пакетін қолданатын модельдер 42. Алынған төмен ажыратымдылықтағы модель және кристалдық құрылым SUPCOMB 43 бағдарламасы арқылы қабаттасқан. Теориялық шашырау қисығы CRYSOL 44 бағдарламасының көмегімен кристаллографиялық атомдық координаталардан құрылды және эксперименталды шашырау деректерімен салыстырылды.

Дифференциалды сканерлеу калориметриясы

Жылу тұрақтылығы ИаBglA дифференциалды сканерлеу калориметриясымен (DSC) зерттелді. ИаBglA, 20 мм натрий фосфатында, 150 мМ NaCl және рН 7.4-те 2 мг/мл концентрациясында, VP-DSC құрылғысында 1 ° C/мин жылдамдықпен сканерленді (Microcal, GE Healthcare, Нортгемптон, АҚШ) 15-90 ° C аралығында 0,5 ° C қадаммен. DSC профилі буферден шығарылды, концентрациясы қалыпқа келтірілді және нәтижесінде эндотермдер интеграцияланғанға дейінгі және ауысымдық базистерді тағайындағаннан кейін біріктірілді. Термиялық индуциру ретінде ИаBglA тексерілген жағдайда қайтымсыз болды, талдау өтпелі температураның мәндеріне бағытталған (Т.м).

Ақуыздардың кристалдануы

Кристалдану тәжірибелері Honeybee 963 автоматтандырылған жүйесі (Digilab, Marlborough, MA) көмегімен 96-ұңғымалы плиталарда буды тарату әдісімен орындалды. ИаBglA 18 °C температурада 0,5 мкл ақуыз ерітіндісі 15 мг/мл және 0,5 мкл кристалдану күйі бар отыратын тамшыларда кристалданды. C2221 кристалдар 0,1 М CAPS (рН 10,5), 0,2 М литий сульфаты және 2 М аммоний сульфаты бар күйде өсірілді. орнында протеолиз (1:1000 (w/w) трипсиннің қатынасы:ИаBglA). П21 кристалдар 0,1 М TRIS (рН 8,5), 2% бар ортада алынды (в/в) PEG400 және 1,45 М литий сульфаты.

Мәліметтерді жинау және құрылымын анықтау

Рентген сәулелерінің дифракциясы туралы мәліметтер C2221 және П21 кристалдар (криопротектор 20% қорғалған) (в/в) глицерин) тиісінше PILATUS 2M және PILATUS3 6M детекторларымен жабдықталған Diamond Light Source (Oxfordshire, Ұлыбритания) MX2 сәулелік линиясында және LNLS (Campinas, Бразилия) линиясында жиналды. Деректер XDS 45 пакеті арқылы индекстелді, біріктірілді және масштабталды. Кристалл құрылымы β-глюкозидазаның атомдық координаттары бар PHASER бағдарламасының көмегімен молекулалық алмастыру әдістерімен шешілді. H. orenii (PDB ID: 4PTV) іздеу үлгісі ретінде. Құрылымдар TLS айнымалы циклдері, қос нақтылау (П21 кристалды) және REFMAC5 46 көмегімен шектелген нақтылау (жергілікті NCS шектеулерін қоса) және COOT 47 көмегімен модельді қолмен құру. Соңғы екі қалдық екі тізбекте де кристалдардан реттелген және модельденбеген. Соңғы құрылымдар MOLPROBITY 48 көмегімен расталды. Деректерді жинау және нақтылау статистикасы 3 -кестеде жинақталған. Кристалдық формалардың құрылымдық факторлары мен атомдық координаттары, Р21 және С2221, сәйкесінше 5DT5 және 5DT7 қосылу кодтары бойынша PDB -ге енгізілді.

Құрылымдық талдаулар

Құрылымдық қондырғылар ақуыз құрылымын салыстыру қызметі PDBeFold (http://www.ebi.ac.uk/msd-srv/ssm) көмегімен орындалды 49. Молекулалық өзара әрекеттесулер мен ақуыз интерфейстері PIC (http://pic.mbu.iisc.ernet.in/) 50 және EPPIC (http://www.eppic-web.org/ewui/) 51 серверлерінің көмегімен талданды. Ақуыз қуыстарының көлемі KVFinder 52 және CASTp 53 көмегімен есептелді. Суреттер PYMOL 54 көмегімен дайындалды.

Молекулалық динамикалық модельдеу

Биологиялық бірліктері үшін айқын шешуді қолданатын модельдеу жүйелері құрылды ИаBglA және ХоBglA (PDB ID: 4PTX). YASARA 55 көмегімен әрбір 250 пикосекунд сайын суретті сақтай отырып, 5 фемтосекунд уақыт қадамымен YAMBER3 күш өрісі арқылы 100 наносекундтық молекулярлық динамикалық модельдеу жүргізілді. Жүйелердің әрқайсысы температураны бақылауға арналған Berendsen термостатының көмегімен 10 және 30 ° C температурада модельденді. Қысым зонд ретінде еріткіш тығыздығының көмегімен бақыланды және қажет болған жағдайда еріткіш тығыздығының сәйкес мәндеріне сәйкестендіру үшін имитациялық ұяшықты изотропты түрде өзгерту арқылы модельдеу кезінде тұрақты болды.

Молекулалық динамиканы талдау

Орташа квадраттық тербеліс, сонымен қатар сутегі байланыстары, тұз көпірлері мен еріткіштерге қол жетімді аймақ арнайы сценарийлер мен 100 наносекундтық модельдеудің соңғы 80 наносекундының координаттары арқылы есептелді. Сутегі байланыстары байланыс энергиясы сутегі-акцепторлық қашықтыққа байланысты екенін ескере отырып, шектік мән ретінде 6,25 кДж/моль энергиясын ескере отырып анықталды. Электростатикалық жұптар олардың атомдары (сутегі емес) бір-бірінен 4 Å жақын болғанда қарастырылды. Еріткішке қол жетімді бетті YASARA бағдарламалық жасақтамасында енгізілген процедуралар арқылы есептеді.

Филогенетикалық талдау

Психротрофты бактериялардан алынған β-глюкозидазалардың ақуыз тізбегі NCBI артық емес дерекқорына қарсы BLASTp іздеулерінде жем ретінде пайдаланылды. Әр сұрауға 60 -тан 95% -ға дейінгі реттік сәйкестігі бар максимум төрт ақуыздық хит таңдалды. Салыстыру мақсатында гомолог ақуыздары ХоBglA да сол критерийлер арқылы шығарылды. Барлық ақуыз тізбектері MUSCLE 56 бағдарламалық жасақтамасының көмегімен реттелген. Бос орындар немесе жетіспейтін деректер бар позициялар сайтты қамтуды 80%шектеу арқылы бірнеше рет реттелуден ішінара шығарылды. Алынған деректер жиынының негізінде эволюциялық ағаш Максималды ықтималдық (ML) әдісін және MEGA бағдарламалық құралы (6.0 нұсқасы) 57 көрсеткен аминқышқылдарын алмастырудың ең жақсы үлгісін пайдалана отырып жасалды. Гамма таралымына сәйкес сайттар (+G) және инварианттық тораптардың (+I) болуына мүмкіндік береді. Ағаш топологиясының сенімділігі bootstrap 1000 репликациясына негізделген Bootstrap талдауының көмегімен бағаланды. Бактерия түрлерінің таксономиясы Uniprot білім қорынан алынды 58 . Бактериялар оңтайлы өсу температурасына қарай жіктелді, олар қол жетімді болғанда немесе минималды температурада олар психрофильді/психротрофиялық (Ттаңдау < 20 °C Тмин & lt 5 ° C), мезофильді (20 ° C & lt Tтаңдау & gt 40 ° C Т.мин & gt 5 ° C) және термофильді (Т.таңдау & gt 40 ° C Т.мин & gt 40 ° C) (S5 кестесі).


Белоктарда суық бейімделу, реттілік пен құрылымдық деңгейде - биология

Деректердің эксперименттік суреті

  • Әдіс: & nbspРентген сәулелерінің дифракциясы
  • Ажыратымдылық: & nbsp2,09 Å
  • R-Value Free: & nbsp0.236 және ас қасық
  • R-Value жұмысы: 0.184 және ас қасық
  • R-мәні байқалды: & nbsp0.184 және ас қасық

wwPDB тексеру  & nbsp3D есеп және nbsp Толық есеп

Антарктикалық бактериядан суық белсенді цитрат синтезінің құрылымдық бейімделуі.

(1998) Құрылымы & nbsp6: 351-361

  • PubMed: 9551556  PubMed сайтында іздеу
  • DOI: & nbsp10.1016/s0969-2126 (98) 00037-9
  • Қатысты құрылымдардың негізгі сілтемесі:  
    1A59
  • PubMed Аннотация: 

Ферменттердің төмен температураға бейімделуінің құрылымдық негізі аз зерттелген. Димерлік цитрат синтазасы термостабильділіктің құрылымдық негізін зерттеу үшін модельдік фермент ретінде қолданылды, бұрын анықталған 55 градус және 100 градус температурада тіршілік ететін организмдердің ферментінің құрылымы.

Ферменттердің төмен температураға бейімделуінің құрылымдық негізі аз зерттелген. Димерлі цитрат синтазасы термотұрақтылықтың құрылымдық негізін зерттеу үшін модельдік фермент ретінде пайдаланылды, 55 градус С және 100 градус С температурада мекендейтін организмдерден алынған ферменттің құрылымы бұрын анықталған. Мұнда зерттеу антарктикалық бактериядан алынған цитрат синтазасын қамту үшін кеңейтілген, бұл бізге суық белсенділіктің құрылымдық негізін және тіршіліктің шығуы белгілі барлық температура диапазонында термостылықты зерттеуге мүмкіндік береді.


БИОЛОГИЯНЫҢ ЖАЛПЫ СҰРАҚТАРЫ

1.Спираль/спираль пішіні соншалықты ықшам
2. Молекула ерімейді, осмостық белсенді емес (су потенциалына әсер етпейді)
3. Тыныс алу үшін ыдырайтын ферменттер арқылы глюкозаға оңай қол жеткізуге болады
4. Үлкен молекула жасуша/кросс-жасуша бетінен шыға алмайды
мембрана

2. конденсация арқылы қосылып, гликозидтік байланыс түзеді

4. Альтернативті молекулаларды & quot; аудару & quot;

5. ұзын түзу тізбектерді байланыстыратын сутегі байланыстары

6. целлюлоза жасуша қабырғаларын берік етеді

7. тургор қысымына/осмостық қысымға қарсы тұра алады

8. бұзылуы қиын байланыс

2. Пептидтік байланыстармен қосылады

3. Конденсация нәтижесінде түзіледі

4. Біріншілік құрылым - амин қышқылдарының реттілігі

5. Қосалқы құрылым – сутектік байланыстың әсерінен полипептидтік тізбектің қатпарлануы

6. Үшінші реттік құрылым сутегі байланысы мен иондық / дисульфидтік әсерге байланысты 3-D қатпарлы
облигациялар

2. Энергияның жылдам қолжетімділігін қамтамасыз ететін бір қадамдық реакцияға бөлінеді

3. Заттарды реактивті ету үшін оларды фосфорлайды

ҚАНТ КЕМІТПЕЙДІ
1. Бенедикт сынамасын жасаңыз және көк/теріс болып қалады
2. Қышқылмен қайнатыңыз, содан кейін сілтімен бейтараптандырыңыз
3. Бенедиктпен қызады және қызыл/қызғылт сарыға айналады (тұнба)

2. (Себеп) аминқышқылдарының реттілігінің өзгеруі

3. Мутациялар уақыт өте келе жиналады

4. Басқа мутациялар / басқа айырмашылықтар (амин қышқылында / негізде / нуклеотидтер тізбегінде / біріншілік
құрылымы) алыс туыстас түрлер арасындағы
НЕМЕСЕ
Бірнеше мутациялар / айырмашылықтар (амин қышқылында / негізде / нуклеотидтер тізбегінде / бастапқы құрылымында)
тығыз байланысты түрлері

Натрий иондары
1. Глюкоза/амин қышқылдарының бірігіп тасымалдануы (жасушаларға)
2. (Себебі) натрий белсенді тасымалдау/натрий калий сорғысы арқылы шығарылады
3. Натрий ионының концентрациясын/диффузия градиентін жасайды
4. Осмос/су потенциалына әсер етеді

Белсенді сайт икемді және субстраттың айналасында қалыптауы мүмкін

2. Белсенді аймақ тек мальтозаны толықтырады

3. Индукциялық сәйкестіктің сипаттамасы

4. Фермент - реакцияға қажетті активтендіру энергиясын төмендететін катализатор

(Бәсекелестік тежеу),
2. Ингибитордың субстратқа ұқсас формасы бар
3. Ол белсенді ферментті байланыстырады.
4. Қосымша субстрат қосу арқылы тежелуді жеңуге болады

салыстырғанда эпителий жасушасында натрийдің төмен концентрациясын сақтау
люмен

Глюкоза натриймен эпителий жасушасына өтеді
Тасымалдаушы/арна ақуызы арқылы
Глюкоза қанға өтеді

2. Эндопептидазалар полипептидтерді кішірек пептидтік тізбектерге бөледі

3. Экзопептидазалар терминалды аминқышқылдарын жояды

2. Көптеген митохондриялар белсенді тасымалдау үшін АТФ түзеді
3. Белсенді тасымалдауға қатысатын тасымалдаушы ақуыздар

4. Жеңілдетілген диффузияға арналған арна/тасымалдаушы ақуыздар

5. Натрий мен глюкозаның тасымалдаушы ақуызы арқылы натрий мен глюкозаның бірігіп тасымалдануы

2. Фосфолипид (екі қабатты) полярлы/липидте ерімейтін заттардың қозғалысын/диффузиясын болдырмайды.

3. Тасымалдаушы ақуыздар белсенді тасымалдауға мүмкіндік береді

4. Арналық/тасымалдаушы ақуыздар жеңілдетілген диффузияға/бірлескен тасымалдауға мүмкіндік береді

5. Арнаның/тасымалдаушының пішіні/заряды қандай заттардың қозғалатынын анықтайды

6. Каналдардың/тасымалдаушылардың саны қанша қозғалысты анықтайды

7. Мембрананың бетінің ауданы қаншалықты диффузия/қозғалысты анықтайды

2. Ұзын / үлкен молекула көптеген ақпаратты сақтай алады

3. Спиральды / оралған

4. Негізгі реттілік ақпаратты сақтауға мүмкіндік береді (ақуыз түзілуі)

5. Репликация жартылай консервативті түрде болуы мүмкін
тізбектер қосымша базалық жұптау арқылы шаблон ретінде әрекет ете алады

2. сутектік байланыстармен біріктірілген негіздік жұптасу

3. сутегі байланыстары әлсіз, сондықтан оңай үзіледі, бұл жіптердің бөлінуіне мүмкіндік береді

4. негіздер ашылады және үлгі ретінде әрекет етеді
5. A - T, C - G-мен

2. Негізгі жұптар арасындағы сутегі байланысын бұзады, оларды ашады

3. Бір ғана ДНҚ тізбегі шаблон қызметін атқарады

4. Ашық негіздерге тартылған РНҚ нуклеотидтері

5. Негізгі жұптастыру ережесі бойынша (тарту) (A-U & amp C-G)

6. РНҚ-полимераза РНҚ нуклеотидтерімен қосылып, пр-мРНҚ түзеді

3. тРНҚ молекулалары амин қышқылдарын рибосомаға әкеледі

4. Белгілі бір амин қышқылы үшін арнайы тРНҚ молекуласы бар

5. мРНҚ-дағы кодонға комплементарлы тРНҚ антикодоны

6. Пептидтік байланыс іргелес аминқышқылдары арасында түзіледі

7. тРНҚ бөлініп, басқа амин қышқылын жинауға кетеді

2. Аминқышқылдарының реттілігінің өзгеруі

3. Бұл сутегі/иондық/дисульфидтік байланыстардың орнын өзгертеді

2. интерфазадағы репликацияға байланысты екі бірдей хроматидтен жасалған хромосомалар

3. хромосомалар жасушаның экваторына ауысады

4. Хромосомалар жеке шпиндельді талшықтарға жабысады

5. Шпиндель талшықтары жиырылады және центромерлер бөлінеді

6. Апалы хроматидтер қарама-қарсы полюстерге жылжиды

7. Әр полюс барлық генетикалық ақпаратты алады

2. Хромосомалар өздерінің гомологиялық жұптарына бірігеді

3. Кросс-хромосомалар арасында, хиазманың түзілуі арқылы жүреді

4. Хромосомалар шпиндельді талшықтарға қосылады, сол арқылы центромералар

6. Гомологиялық хромосомалар қарама -қарсы полюстерге ауысады

2. І мейоздағы тәуелсіз ассортимент (гомологиялық хромосомалардың сегрегациясы)

3. II мейоздағы тәуелсіз ассортимент (хроматидтердің сегрегациясы)

+ Кез келген үшеуі:
4. Индивидтердің әртүрлі бейімделулерінің пайда болуына себеп болады, олардың кейбіреулері жақсы бейімделеді

7. Бұлар генге/аллельге өтеді

2. Өсімдік ұлпасының жұқа кесіндісін алып, слайдқа салыңыз

3. Калий йодидіндегі йодпен бояу.

2. Үлкен қоқысты / бүтін жасушаларды кетіру үшін сүзіңіз

3. Митохондрия/органеллалардың зақымдалуын болдырмау үшін изотоникалық ерітіндіні қолданыңыз

4. Ферменттердің зақымдануын азайту үшін салқын ұстаңыз/фермент денатурациясын болдырмау үшін буферді пайдаланыңыз

5. Ядро / жасуша фрагменттері / ауыр органоидтарды бөлу үшін төмен жылдамдықпен центрифуга

2. Кіші / полярсыз / липидтерде еритін молекулалар фосфолипидтер / қос қабатты арқылы өтеді
НЕМЕСЕ
Үлкен / полярлы / суда еритін молекулалар белоктардан өтеді

3. Су осмос арқылы жоғары су потенциалынан төмен су потенциалына ауысады

4. Шоғырлану градиентіне қарсы белсенді тасымалдау

5. Белсенді тасымалдау/жеңілдетілген диффузияға белоктар/тасымалдаушылар қатысады

6. Белсенді тасымалдау үшін энергия / АТФ қажет

2. Липидтердің қос қабатын кесіп өте алмайды

3. Жеңіл диффузия көмегімен тасымалданатын хлор иондары
арна/тасымалдаушы ақуыз

4. Оттегі зарядталмаған/полярлы емес

2. Көптеген митохондриялар АТФ шығарады / шығарады немесе белсенділерге энергия береді
тасымалдау

3. Белсенді тасымалдауға арналған тасымалдаушы ақуыздар

4.Жеңіл диффузияға арналған арна/тасымалдаушы ақуыздар

5. Симпорт/тасымалдаушы протеин арқылы натрий иондары мен глюкозаны бірге тасымалдау

2. Белсенді плазмалық жасушалар/жад жасушалары арқылы антиденелерді өндіруді қамтиды

3. Пассивті денеге сырттан енгізілген антиденелерді қамтиды

4. Белсенді ұзақ мерзімді, себебі антигенге жауап ретінде шығарылатын антидене

5. Пассивті қысқа мерзімді, себебі берілген антиденелер ыдырайды

2. Патоген жұтылған / жұтылған

3. Фагосома түзетін вакуольмен қоршалған

4. Вакуоль лизосомамен біріктіріледі

5. Лизосоманың құрамында вакуолға босатылатын ферменттер бар

Плазма жасушалары антиденелер түзеді

2 антиген В лимфоцитіндегі комплементарлы рецепторлармен байланысады

3 лимфоцит белсендіріледі

4 (В) лимфоциттер митоз арқылы көбейеді

2. Антиген антиген ұсынатын жасушаларда (макрофагтарда) көрсетіледі.

3. Қосымша рецепторлық ақуызы бар көмекші Т -жасушасы антигенмен байланысады

4. Көмекші Т жасушасы В жасушасын стимуляциялайды

5. Оның бетінде комплементарлы антиденемен

6. В жасушасы антидененің көп мөлшерін бөледі

3. Екінші экспозицияда жад жасушалары белсенді болып, антиденелер шығарады

4. Антиденелерді тез шығарады/ антиденелерді көбірек шығарады

2. Байланыс орнының үшінші реттік құрылымының пішіні

3. Антигендерге комплементарлы

Фермент ДНҚ көшірмесін жасау үшін АИТВ РНҚ пайдаланады

ДНҚ иесі жасушаның ДНҚ/хромосомасына қосылды

ДНҚ АҚТҚ РНҚ көшірмелерін жасау үшін пайдаланылды

Ал АИТВ капсидті ақуыздар/ферменттер

Вирустың жаңа бөлшектерін жинау

2. Енді қарыншаның атриумға қарағанда қысымы жоғары (толтыру / жиырылу есебінен).
Бұл атриовентрикулярлық клапандардың жабылуына әкеледі

3. Қарыншаның аортадан жоғары қысымы бар, ол жарты айлық клапанның ашылуына әкеледі

4. Бұл қолқадағы қысымның қарыншаға қарағанда жоғары болуына әкеледі (жүрек сияқты
босаңсытады) жарты айлық клапанның жабылуына әкеледі

2. Бір камералы қалың қабырғалар - диффузиялық қашықтықты азайтады

3. Тегіс (эндотелий) жасушалар – диффузиялық қашықтықты азайтады

4. Фенестрация - үлкен молекулалар арқылы өтеді

5. Кіші диаметрі / тар - көлемге / қысқаға үлкен бетті береді
диффузиялық қашықтық

6. Тар люмен - диффузияға көбірек уақыт бере отырып, ағын жылдамдығын азайтады

2. Сұйықтық пен еритін молекулалар шығып кетеді

3. Ақуыздар мен үлкен молекулалар артта қалады

4. Бұл судың әлеуетін төмендетеді

5. Су қайтадан капиллярдың веноздық шетіне қарай жылжиды
осмос арқылы

2. ауыз қуысы төмендетілген

3. су қысымның төмендеуіне байланысты түседі & amp;
көлемінің артуы

4. ауыз жабылады, оперкулум/операциялық клапан ашылады

5. көтерілген еден қысымның жоғарылауына және дыбыс көлемінің төмендеуіне әкеледі

гилл табақшалары немесе қайталама ламелла

капиллярлардың көп саны -& гт оттегін кетіру үшін / градиент сақтау үшін

жұқа эпителий -& gt қысқа диффузиялық жол

қысымның өзгеруі -градиентті ұстап тұру үшін көбірек су енгізу үшін & gt

2. Қысқа диффузиялық жолды қамтамасыз ету үшін жұқа альвеолалардың қабырғалары

3. Капиллярлық қабырғалар альвеолалар арасында жұқа, сондықтан қысқа диффузиялық жолды қамтамасыз етеді

4. Капиллярлардың/альвеолалардың қабырғаларында жалпақ жасушалар болады

5. Газдарды өткізетін жасуша мембранасы

6. Көптеген қан капиллярлары үлкен беттік аумақты қамтамасыз етеді

7. Қабырғааралық бұлшықеттер мен диафрагма бұлшықеттері диффузияны сақтау үшін өкпені желдету үшін қолданылады.
градиент

8. Ауаның тиімді өтуі үшін кеңірдек пен бронхиолалардың кең таралуы


МАТЕРИАЛДАР МЕН ТӘСІЛДЕР

Үлгі жинағы

Пареледон sp., Robson 1932, қаңтарда Антарктидадағы Мак-Мердо станциясында мұз астынан жиналды. Жиналған үлгіні доктор Крис Деврис мейірімділікпен ұсынды. Octopus bimaculatus, Verrill 1883, Wrigley Marine Lab, Two Harbors, Каталина аралы, Калифорния, АҚШ-тан SCUBA сүңгуімен жиналды. Octopus defilippi, Vérany 1851, Пуэрто -Рикодағы Рио -Грандеден жиналды. Octopus digueti, Perrier and Rochebrune 1894, San Lucas Cove, Santa Rosalia, Baja California Sur, Мексикадан жиналды. Bathypolypus arcticus (Prosch 1847) және Benthoctopus piscatorum (Verrill 1879) Норвегия, Шпицберген архипелагының солтүстік жағалауынан жиналды. Барлық үлгілерден жұлдызды ганглийлер бөлініп, кейін РНҚ -да сақталды (Амбион, Остин, TX, АҚШ) және –80 ° C температурада мұздатылды.

Молекулалық клондау

Жалпы РНҚ әрбір жұлдызды ганглионнан RNAqueous-Micro жинағы (Ambion) арқылы бөлініп алынды және SuperScript III бірінші тізбекті cDNA синтез жинағымен (Invitrogen, Carlsbad, CA, АҚШ) cDNA синтезі үшін үлгі ретінде пайдаланылды. Толық ұзындықтағы Na + /K + -ATPase α-бірліктері Taq полимеразасының көмегімен ПТР көмегімен күшейтілді (үшін O. bimaculatus және Пареледон сп.) немесе фузионды полимераза (О. дефилиппи, О. дигуети, B. arcticus және B. piscatorum) және а -ның UTR -не негізделген праймерлер Loligo opalescens Na + /K + -ATPase α -бірлік клоны [GenBank: EF467998 (Colina және т.б., 2007)]. Консенсус ретін алу үшін бірнеше cDNA клондары аяқталды.

Функционалды өрнек Ксенопус ооциттер

Әрбір түр үшін Na + /K + -ATPase α-суббірлігінің кодтау аймағы клондалған. Ксенопус pBSTA өрнек векторы (Лиман және басқалар, 1992) және T7 промоторлы жиынтықтарымен (mMessage mMachine T7 Ultra, Ambion немесе mScript mRNA өндіру жүйесі, Epicenter, Madison, WI, АҚШ) сРНҚ синтезі үшін үлгі ретінде пайдаланылады. Сондай-ақ кРНҚ кальмар алпауыт аксон жүйесінің жергілікті β-бөлшегі үшін жасалды [GenBank: EF467996 (Colina және т.б., 2007)]. Ооциттерге α- және β-суббірлік cRNA-лардың эквимолярлы қоспасы 80 нг енгізілді. Тәжірибелер инъекциядан кейін 3-4 күннен кейін жасалды. Ооциттер коллагеназамен ферментативті өңдеу арқылы хирургиялық жолмен жойылды және фолликулданды. Инъекцияға V және VI сатыдағы ооциттер таңдалды. Инъекциядан кейін ооциттер ND-96 ерітіндісінде (ммоль l –1 : 96 NaCl, 2 KCl, 1,8 CaCl) 18°C ​​температурада 3-4 күн бойы ұсталды.2, 1 MgCl2 және 5 Hepes pH 7,6). Тіркеуден бұрын ооциттер 45 минут бойы Na + жүктейтін ерітіндіге Na + жүктелді (ммоль l –1 : 100 Na-глутамат, 2,5 Na-цитрат және 5 Гепес рН 7,5) (Раковски және т.б., 1991). ).

Электрофизиологиялық өлшемдерге арналған эксперименттік ерітінділер

Сорғы функциясын бағалау үшін жасушадан тыс ерітінділер 5 ммоль л –1 К + ерітіндісі (ммоль л –1: 100 Na-глутамат, 5 К-глутамат, 5 BaCl) болды.2, 2 NiCl2, 5 бауыр, 2 MgCl2 және 0,3 нифлум қышқылы) және К + бос ерітінді (5 ммоль л –1 К + ерітіндісімен бірдей 5 ммоль л –1 қоспағанда) Н.-метил d -глюкамин 5 ммоль l –1 К + орнына ауыстырылды. Ouabain 5 ммоль л –1 К + немесе К + еркін ерітінділерінде де 100 мкмоль л –1 концентрациясында қолданылды. «Кесілген ооцит вазелин-саңылау» техникасын қолданған кезде (төменде қараңыз), ішкі ерітінді құрамында (ммоль л –1): 80 Na-глутамат, 20 TEA-глутамат, 10 MgSO4, 10 Hepes, 5 EGTA және 5 MgATP. Ішке электрлік қол жеткізу үшін ооциттер ішкі ерітіндідегі 0,2% (салм/көлем) сапонинмен өткізіледі. Барлық тәжірибелік ерітінділердің рН 7,5 -ке дейін реттелді Н.-метил d -глюкамин бөлме температурасында және 30 және 5°C арасында 0,2 бірлікке өзгеретіні анықталды.

Na + /K + -ATPase өрнек деңгейлері

Экспрессия деңгейлері конструкцияны білдіретін бүтін ооциттерден ауаға сезімтал жалпы ток ретінде бағаланды. Ооциттер екі микроэлектродтың кәдімгі күшейткіш күшейткішінің көмегімен қысылған (GeneClamp 500B Axon Instruments, Фостер-Сити, Калифорния, АҚШ). Аналогтық сигналдар 1 кГц жиілікте сүзіліп, Innovative Integrations SBC6711 A/D түрлендіргішінің (Simi Valley, CA, АҚШ) көмегімен цифрланды. GPATCH бағдарламалық құралын доктор Франсиско Безанилла мейірімділікпен қамтамасыз етті. Ооциттер 0 мВ ұстап тұрды, ал сорғылар 5 ммоль -1 К + ерітіндісімен толық іске қосылды, содан кейін уабейн қосылды. Эндогендік сорғының экспрессиясы инъекцияланбаған ооциттерден тіркелді. Экспрессия деңгейін бағалауға арналған барлық эксперименттер бөлме температурасында (∼22 ° C) жүргізілді.

Кернеуге тәуелділік және айналым жылдамдығын зерттеу

Кернеуге тәуелділік пен ауысу жылдамдығының эксперименттері «кесілген ооцит вазелин-саңылау» техникасының көмегімен жүргізілді (Taglialatela және т.б., 1992). Ооциттер эндогендік сорғылардың сигналын азайту үшін тек жануарлар полюсінен сынама алынған Dagan CA-1B жоғары өнімді ооциттер қысқышымен (Даган Корпорациясы, Миннеаполис, МН, АҚШ) қысылған (Холмгрен және Раковски, 1994). Бұл эксперименттерде ооциттер 0 мВ-та ұсталды және 10 мВ қадамдарымен –200-ден +50 мВ-қа дейінгі әртүрлі потенциалдарға көтерілді. Импульстердің ұзындығы 35 немесе 60 мс болды. Кернеу хаттамаларын басқару және аналогтық сигналдарды цифрландыру үшін GPATCH бағдарламалық құралы бар Innovative Integrations SBC6711 A/D тақтасы пайдаланылды. Баяу уақыт негізіндегі жазбалар («диаграмма жазбалары») MiniDigi 1A тақтасы мен AxoScope 9.0 бағдарламалық құралының (Axon Instruments) көмегімен жиналды. Сигналдар 100 кГц жиілікте алынды және 10 кГц жиілікте сүзілді. Жасушаішілік кернеу 1 моль-1 NaCl толтырылған 0,2–0,3 МΩ тамшуырмен өлшенді, ал 3% л/1 Na-MES (4-морфолинетансульфон қышқылы натрий тұзы) толтырылған көпірлер 3% (д/в) агарозада. Барлық эксперименттерде жазбалардың тұрақтылығы ток пен кернеудің айырмашылығынан алынған уақытты бақылау арқылы бағаланды.IВ) эквивалентті уақыт аралығында бірдей эксперименттік жағдайларда алынған қатынастар. Бұл эксперименттер ∼22 ° C температурада жүргізілді.

Na + /K + -ATPase тоғының кернеуге тәуелділігі 100 мкмоль l –1 уабаин қосқанға дейін және одан кейін 5 ммоль л –1 К + ерітінділерінде кернеу протоколын орындау арқылы бағаланды. Бұл жазбалар арасындағы айырмашылық убайнға сезімтал сорғы тогын берді. Әрбір кернеуде өндірілген тұрақты ток өлшеніп, графигі салынды. Әрбір Na + /K + -ATPase құрылымы үшін жартылай максималды ток потенциалы (орта нүктедегі орташа ± s.e.m.) IВ әрбір эксперимент үшін сызбасын сызып, содан кейін орташасын алады. Орташа нүкте мәндерінің маңыздылығы екі популяцияны қолдану арқылы тексерілді тα = 0,05 бар тест.

Na + /K + -ATPase айналу жылдамдығының температуралық сезімталдығы

Сорғылардың температуралық сезімталдығы екі микроэлектродты кернеу қысқышы арқылы тұтас ооциттерде зерттелді. Ооциттер 0 мВ температурада Peltier құрылғылары арқылы бақыланатын камерада ұсталды. Сорғылар 30 мм температурада 5 ммоль л –1 К + қосылды. Толық іске қосылғаннан кейін температура ively5 ° C дейін біртіндеп төмендетілді, содан кейін 30 ° C дейін қайтарылды. Бұл хаттама ouabain қатысуымен ағып кету токтарын бағалау үшін қайталанды. Ағымдағы жазбалар кезінде температура термопараны бірден овоцитке жақын орналастыру арқылы бір уақытта жазылды. Термопардың шығысы калибрленді және 1 кГц желіде жиналды. Температураға тәуелді ағып кету сорғы токымен салыстырғанда шамалы болды. Әрбір эксперимент үшін әрбір температурадағы уаабинге сезімтал токтың мөлшері 22 ° C мәніне дейін қалыпқа келтірілді. Жеке тәжірибелерден алынған қалыпқа келтірілген мәндер бірнеше ооциттер үшін орташа алынған. Әрбір температурадағы эндогендік сорғы токының шамасын бағалау 22°С-та инъекцияланбаған ооциттердегі эндогендік токтың шамасын және эндогендік токтың температуралық сезімталдығын пайдалана отырып жасалды (қосымша материалды қараңыз. S1 сурет). Эндогендік мәндер клон инъекцияланған ооциттердің деректерінен алынып тасталды. Бұл мәндер (± с.е.м. білдіреді) 22 ° C температурада анықталған айналым нормаларына негізделген айналым нормаларына айналдырылды. Кейбір жағдайларда деректер 28 ° C температурада ағымдағы мәнге дейін қалыпқа келтірілді.


S1 сурет. ΔB'-психофильді серин протеазасының мәндері (ПДБ:

Қосымша 1 файл: 1ELT) және мезофильді серин протеазасы (ПДБ:1ЭАИ) жұптық түзудегі әрбір аминқышқылының позициясында. 1ELT және 1EAI жұпталған ақуыздан ΔB'-мәндерінің графигі. Жоғарғы жағында психрофильді ферменттің екінші реттік құрылымы орналасқан. (Амин қышқылдары 1-110) және бір икемді аймақ (111-235 аминқышқылдары) бір көрінетін қатаң аймақ ΔB'-мәні әдістемесін қолдана отырып алынуда. S2 суреті. Психро/мезофильді жұптағы әрбір қайталама құрылымда табылған позициялар санының кестесі. 20 психр/мезофильді жұптағы әрбір қайталама құрылымда табылған позициялар санының кестесі. Сурет S3. Әр психро/мезофильді жұптың көмілген, кристаллографиялық суларының графигі. Психро/мезофильді 20 жұптан көмілген кристаллографиялық сулардың учаскесі. Кристалл құрылымында бірнеше тізбектер болған жағдайларда мәндер орташа есепке алынды. Ескерту: 1а59 тармағында хабарланған кристаллографиялық сулар жоқ. (PDF 1 МБ)