Ақпарат

Дистрофияланған праймердің концентрациясын сұйылту керек пе?

Дистрофияланған праймердің концентрациясын сұйылту керек пе?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Мен сұрауға ұялып тұрмын, бірақ егер сізде, мысалы, төрт деградацияланған праймер болса және соңғы хаттамада, праймердің соңғы концентрациясы 10 мкм жұмыс қоры болуы керек деп айтылады, егер сіз праймерлерді жалпы көлемі 10 мкм (әрқайсысы 2,5 мкм) немесе 10 мкм болса әрбір дегенеративті праймер?


20 мкл ПТР қоспасына әрбір жұмыс қорынан (10 мкМ) 2 мкл қосуға болады.

Бұл протоколды тексеруге болады.
Абайлаңыз: Автор $ mu l $ орнына $ l $ қолданды

Ол 50 мкл реакцияда әр праймерден 5 мкл (20 мкм) пайдаланады. Бұл мен айтқан екі есе көп. IMO ең жақсы концентрациямен тырысқан дұрыс, содан кейін оны жоғарылату керек. Примерлердің шамадан тыс концентрациясы, егер праймерлер жақсы жобаланбаған болса, кейбір спецификалық емес байланыстыруға және күшейтуге әкелуі мүмкін.

Бұл сайттан:

Деградацияланған праймерлерді қолдану

Дистрофияланған праймер шын мәнінде әр түрлі праймерлердің қоспасы болғандықтан, ПТР -де азғындаған «праймердің» бір бөлігі ғана жұмыс істейді. Сондықтан ПТР-дағы праймер концентрациясын жоғарылату қажет, реттілік реакциялары және т. Дегенмен, жоғары дегенерациялар үшін, мысалы, 64 есе, праймер концентрациясын 64 есе арттыру мүмкін емес және тек 5-10 есе арттыру арқылы өз сәттіліктерін сынап көру керек.


Дистрофияланған праймердің концентрациясын сұйылту керек пе? - Биология

Курстар мен ғылыми суреттер

Джек Хеслоп-Харрисон
1920-1998

1. Қазіргі уақытта праймерлерге бағаға байланысты SIGMA GENOSYS немесе басқалардан тапсырыс беріледі (жеткізу ақысын және артық шығындармен айырмашылық шығындарын ескеруді ұмытпаңыз).

2. Қол жетімді таразылар туралы дұрыс ақпаратты қамтитын веб -сайтқа тапсырыс беру жүйесін пайдаланыңыз - егер сіз c -ден көп тапсырыс берсеңіз. 6 праймер, жаппай жіберу оңайырақ.

3. Шағын масштабқа тапсырыс беріңіз: 0,05 um немесе (кем) 3 OD (бірақ Sigma-Genosys компаниясынан ескеріңіз, ең төменгі шкала келесі өлшеммен бірдей баға болып табылады, сондықтан үлкенірек тапсырыс беріңіз, кейде артықшылықтары бар олиголар үшін минималды шкала қол жетімді емес. модификациялар).

4. Олиго келген кезде, деректер кестесі мен гельдің түпнұсқасын Oligo Master Book -ке салыңыз. Өзіңіз үшін көшірме жасаңыз.

5. Ламинарлы сорғышта (мысалы, SIGMA) молекулалық биологиялық сортты судағы кептірілген олигоды қалпына келтіріп, бастапқы түтікке қосымша 100 м (микро-молярлы) ерітінді дайындау үшін екі 20 мл (микро литрлік) жасаңыз. ) қор аликвоты. (Олиголар аздап буферленген тұздарда тұрақтырақ болады, мысалы, TE, бірақ бұл фермент реакцияларын тежей алады.) Деректер парағы осы сұйылтуды жасау үшін қажет судың ul санын береді - әдетте 300-ден 800 &микролға дейін. (Олар сондай -ақ синтезде наномол береді - мысалы, 46,6 нмол. 100 uM қорын жасау үшін, оны 10 -ға көбейтіп, көптеген ультрадыбыстық суға қосыңыз (мысалы, 236 & микрол 46,6 нмол = 200 & микроМ ерітіндісі).

6. Қойма түтігінің қақпағына олигоның атын жазыңыз. Содан кейін түпнұсқа қорды кәдімгі олиго қорапқа салыңыз (әдетте Trude's немесе Pat's тартпасындағы биік мұздатқыштардағы үлкен флуоресцентті қораптар).

7. Арнайы олиго қорларының шағын аликвоттарын мұздатқыш камераңызда жеке қораптарда сақтауға болады.

8. Молекулярлық биология деңгейіндегі сумен бөлінген 100 & microM қоспасын (ламинарлық қалпақшада) сұйылту арқылы жұмыс ерітіндісінің аз мөлшерін дайындаңыз.

- 1:10 геномдық ПТР үшін 10 μМ ерітінді беру. Егер сіз осы қордың 1 & микрон 20 & микрол ПТР қоспасында қолдансаңыз, соңғы қоспада 0,4 & микроМ праймерді пайдаланасыз.

- 1:20 плазмидті ПТР үшін 5°M береді

9. YorkBio немесе Promega Taq полимеразасының көмегімен ПТР орнату (бұрын біз Bioline қолдандық, қазір қымбатырақ):

· 1,5 ±1/50 мМ MgCl (соңғы конц. 1,5 мМ)

& middot 5 PCl ПТР буфері (Taq жеткізіледі)

& middot 1 µl 10 mM dNTPmix немесе 2,5 мМ dNTPmix -тің 4 1 (соңғы конс. 200 μM төменде қараңыз)

& middot 0.1-0.5 l Taq полимераза (= 1 бірлік-5 бірлік)

· Маркерді теру және сынау үшін ПТР орнатуды 20-30ºл дейін кішірейту (тіпті 7ºл дейін мүмкін). Кесу және клондау қажет болғанда ғана 50 &микролды пайдаланыңыз

· dNTP қоспасы: бұрын біз Tris-HCI жүйесінде 2,5 мм жұмыс ерітіндісін дайындайтынбыз, бірақ ROCHE 30 l-ге 5 1 dATP, dCTP, TTP және dGTC (ROCHE қамтамасыз ететін 100 мм) қосу арқылы 10 мм ерітінді жасауды ұсынады. стерильді қос дистилденген су.

СҰЙЫТҚАН ОЛИГО БІРНЕШЕ РЕТ ЖІБІТКЕН КЕЗДЕ ШЫҒЫП КЕТЕТІНІН БІЛІҢІЗ.

ОЛИГОСҚА ҚОЛ ЖЕТКІЗГЕНДЕ ӘРҚАШАН ЖҰЛДЫҚ КИІМ.

M13 праймер ҚҰРАМЫ ЖӘНЕ СҰЙЫТЫЛҒАН АЛИКВОТТАР ЖАЛПЫ ПТР ЖӘБІГІНДЕ САҚТАУЛАДЫ.


Праймерді қалай сұйылту керек - (06/06/2014)

Егер мен форвардқа 667ul суды, ал кері праймерге 714ул қоссам, мен 100uM қорын аламын ба?

Маған 25ul   реакциясында әр праймердің 100 пмоль соңғы концентрациясы қажет, сондықтан менің 100uM қорымды сұйылту үшін қанша қажет?

Кез келген көмекті бағалайтын болар еді!

сондықтан сізде 100 x 10^-6 моль/литр бар және 25 µл-де 100 x 10^-12 моль/литр (концентрация ретінде) болуы керек.

осылайша 10^6 рет сұйылту керек, бірақ 25 µl факторы.

1 литр үшін 100 x 10^-12 моль, 25 µl = & gt үшін?

мұны өзіңіз есептей алуыңыз керек.

Бірақ сізге 100 pM қажет екеніне сенімдісіз бе? Маған сәл төмен сияқты.

Иә, маған 100 пмоль мөлшеріндегі праймердің соңғы концентрациясы қажет

Сондықтан мен 100uM 1 -ді 1 000 000 -да сұйылтуым керек пе?

ПТР үшін 100pM праймерлердің соңғы концентрациясы? Бұл әдеттегі диапазонға қарағанда реакцияда 1000 есе төмен соңғы концентрацияны пайдаланатын біртүрлі ПТР түрі ме? (0,1 - 0,5 µМ)

Әлде солай ма pmol/µл немесе басқа молярлық концентрациядан басқа нәрсе литріне (сондықтан 100 µM праймері 100пмоль/µл праймеріне тең).

Қалай болғанда да, сіз праймерлерді соңғы концентрацияға дейін сұйылтқыңыз келмейді, бірақ мақсатты концентрациядан 10-20-50x немесе одан жоғары жұмыс концентрациясына дейін, реакцияға басқа заттарды да қосу керек. Қолданылатын праймер көлемі пипеткаға дәл түсу үшін тиісінше төмен, бірақ тым төмен болмауы керек.

Мысалға:

Әрбір праймердің қор ерітіндісі әдетте 100'M (100pmol/'181l). 

Сіз одан 10-181М жұмыс ерітіндісін жасайсыз (10x сұйылтыңыз).

20 µл ПТР реакциясы үшін сіз әрбір праймердің 1 µ л жұмыс ерітіндісін қолданасыз (сондықтан басқа реагенттерді қосуға бос орын бар) 0,5 µМ реакциясында соңғы концентрацияға жету үшін.  

Жауап пен есептеу үлгісі үшін рахмет.

Мен оқыған  a қағазынан   көлемін алдым, онда 25 л реакцияға әр праймердің 100 пмолын қосады деп айтылды, сондықтан мен   бұл праймердің соңғы концентрациясы немесе оны дұрыс түсіндірмеймін деп ойладым ?

Егер сіз 100pmol/25 µl немесе 4pmol/µl немесе 4 x 10^-12mol/10^-6liter немесе 4 x 10^-6mol/литр немесе 4 µM-ге қарағанда 25 µl-ге 100pmol қосу керек десе.

Сонымен, 4 мкм алу үшін 100 мкм қорымның бір бөлігін сұйылтуым керек және реакцияға оның қанша бөлігін қосу керек?

Сізге реакция үшін 100пмол қажет, оны түзетіңіз (бұл өте көп, керісінше, бірақ бәрібір ..).

Сізде 100uM қоры бар. Сіз бұл концентрацияны 100pmol/ul (бұл 100uM -ге тең) түрінде көрсете аласыз.

Бұл бір 1ул қоймада сізде 100пмол праймер болады дегенді білдіреді.

Сонымен, сіздің реакцияңызға қаншалықты қолданылатынын білесіз бе?

Маған 2500 пмоль қажет, сондықтан оны 25ул реакцияға 1ул қоссам, ол 100пмольге дейін сұйылтылады ма?

caroloconnor20 Дүйсенбіде 7 Сәуір 07:08:27 2014 былай деді:

Маған 2500 pmol керек егер мен 25ul реакцияға оның 1улін қоссам, ол 100пмольге дейін сұйылтылады ма?

жоқ Сізге жалпы реакцияда 100 пмоль қажет. бұл 100 ум қорының 1 улін қосу керек дегенді білдіреді.


Генетикалық анализ әдістері мен технологиясы

Полимеразды тізбекті реакция немесе ПТР - бұл молекулалық биологияда үлгідегі ДНҚ -ның шағын мақсатты аймағының көшірмелерін алудың негізгі әдісі. ПТР негіздері бұрын осы жерде талқыланды. ПТР арқылы жасалған ДНҚ көшірмелері зерттеушілерге автоматтандырылған Сангер секвенциясын қоса, зерттеулердегі басқа қолданбалар үшін жеткілікті көшірмелерді береді. ПТР әдістерінің көпшілігінің негізгі әдістемесі бар болғанымен, әр реакция әр түрлі және оңтайландыруды қажет етеді, айнымалыларды реттеу және бір ғана қажетті өнім шығару процесі. ПТР оңтайландыру кезінде мақсатты ДНҚ -ның жалпы көшірмелері, праймер концентрациясы, MgCl2 және дезоксинуклеотидтер немесе дНТП сияқты бірнеше факторларды ескеру қажет. Бұл айнымалылардың кейбірі ПТР реакциясының жалпы көлеміне байланысты, өйткені ПТР-дағы компоненттердің соңғы концентрациясы реакцияның 25 ul, 50 ul немесе 100 ul болуына байланысты тұрақты болуы керек. Бұл мақалада біз екі айнымалыға, мақсатты ДНҚ көшірмелерінің санына және праймер концентрациясына тоқталамыз.

Үлгі: Нысаналы ДНҚ

ПТР қолданбаларын пайдаланып мақсатты ДНҚ аймағының көшірмелерін жасау Сэнгер секвенциясымен салыстырғанда үлгі ДНҚ сапасына сезімтал емес. Дегенмен, тұздар мен басқа ластаушы заттар жоқ салыстырмалы түрде таза ДНҚ үлгісін қолданған жөн. Таза шаблон ДНҚ -ның таза ПТР өнімін шығару ықтималдығы жоғары. Мақсатты ДНҚ-ның соңғы сұйылтылған үлгісі буферден гөрі суда жақсы сұйылтылған, өйткені буферлер ПТР күрделі күшейтулеріне кедергі келтіруі мүмкін.

Қарастырылатын мақсатты ДНҚ-ның ең маңызды аспектісі - күшейту үшін қолжетімді реакциядағы көшірмелердің жалпы саны. Мақсатты ДНҚ күшейтілген өнімдердің бірінші жинағын күшейту үшін бастапқы үлгіні қамтамасыз етеді және қалған циклдар үшін үлгіні қамтамасыз етуді жалғастырады. ПТР өнімдері жасалатындықтан, олар күшейту үшін үлгі ретінде пайдаланылатын мақсатты ДНҚ көшірмелерін де қамтамасыз етеді. Бұл ПТР мақсатты аймақтың миллиондаған көшірмесін жасауға мүмкіндік береді. Сондықтан реакцияда бастапқы ДНҚ -ның жеткілікті көшірмелері болуы маңызды. Түпнұсқаның тым көп көшірмелері ДНҚ үлгісі ретінде әрекет ететін ПТР -дің жалған өнімдерінің пайда болуына әкелуі мүмкін. Бактериялардан бөлінген ДНҚ үлгісі тек 2 миллион негізді геномнан тұруы мүмкін, ал адам геномында 3 миллиард негіз бар. Демек, бактериалды геномдық ДНҚ -да адам ДНҚ -сына қарағанда 50 нг үлгідегі нысана көшірмесі әлдеқайда көп болады. Бактериалды ДНҚ үшін 10E5 көшірмеге тек 300 пикограмм ДНҚ қажет болады. Адам ДНҚ 10E5 үшін 300 нанограммнан астам ДНҚ қажет, бұл бір миллион есе айырмашылық.

ПТР шарттары жалпы көлемге тәуелсіз реакцияда мақсатты ДНҚ -ның 10E4 -тен 10E5 көшірмесін ұсынады. Мақсатты тізбектің көшірме нөмірінде кейбір икемділік бар. Алайда, мақсатты ДНҚ көшірмелерінің көп болуы ПТР реакциясының ерекшелігін төмендетеді және жалған өнімдердің көбірек санын шығарады. Реакцияда мақсатты ДНҚ жоғары концентрациясы болған кезде ПТР циклдарының жалпы санын азайту керек.

Праймерлердің концентрациясы

Праймерлер ПТР көмегімен ДНҚ -ның қай аймағын күшейтетінін анықтайтын фактор болып табылады. Тура және кері праймер мақсатты аймақтың басы мен аяғына дәл негізге сәйкес келуі керек. Шамадан тыс праймер концентрациясы ПТР-да жиі жалған өнімдердің пайда болуын тудыратын маңызды факторлардың бірі болуы мүмкін. Праймердің тым көп болуы ерекшелікті төмендетеді, бұл мақсатты аймақ болып табылмайтын шаблон аймақтарында праймерлердің жұтуына мүмкіндік береді. Шамадан тыс праймерлердің нәтижелері Сангердің таза емес реттелу нәтижелерінде жиі кездеседі, себебі жалған өнімдерді қалаған мақсатпен қатар реттеуге болады. Ықтимал жалған толтыруды азайту үшін тура және кері праймердің мөлшерін шектеу керек. Тура және кері праймерлердің шамадан тыс концентрациясы, сонымен қатар, праймерлер мақсатты ДНҚ-дан тәуелсіз күйдірілген және күшейтілген кезде праймер димерінің пайда болуына себеп болуы мүмкін.

Праймер концентрациясы ПТР реакциясының жалпы көлеміне тәуелді бір айнымалы болып табылады, сондықтан праймердің жеткілікті көшірмелері мақсатты күйдіру орындарын табады. Жалпы мақсатты аймақтарды көбейту үшін 0,5 микро-молярдан (uM) 1 uM-ге дейінгі жалпы концентрация жеткілікті, дегенмен кейбір қосымшаларда аз концентрация жұмыс істеуі мүмкін. Әдетте біздің зертханада ПТР реакцияларының көпшілігі үшін 0,8 УМ соңғы концентрациясы қолданылады. Праймер концентрациясы туралы соңғы пікір күшейтілген өнімдердің санын көрсету үшін агарозды гельде өнімдер электрофорезденгеннен кейін қаралады.

Біз праймерлерді 10 мкм соңғы концентрациясына дейін сұйылту үшін салыстырмалы түрде қарапайым есептеулерді қолданамыз. Ол үшін праймердің молекулалық салмағы (МВт) белгілі болуы керек және оны праймермен бірге қамтамасыз ету қажет.

1 мг/ул *1умоль/МВт (уг) *10Э6 ул/л = концентрация uMоль/л, ол uM-ге тең

Ақырғы концентрациясы 200 uM болатын праймерді 10 ул -ге дейін соңғы концентрацияға дейін 19 ул суға 1 ул праймер қосу арқылы сұйылтады. Бұл ПТР үшін жұмыс концентрациясы. Соңғы концентрациясы 0,8 uM үшін 25 ул реакциясына 2 ул тура және кері праймер қосылады, ал 100 ультр ПТР реакциясына әрқайсысының 8 ул қосылады.

Праймер концентрациясы ПТР реакциясын оңтайландыру кезінде ескерілетін маңызды айнымалылардың бірі болып табылады. 1 мкм-ден асатын концентрациялар көбінесе мақсатты емес аймақтарда праймерлердің күйдірілуіне және жалған өнімдердің пайда болуына әкелуі мүмкін. Праймердің концентрациясының жеткіліксіз болуы күшейтуге әкелуі мүмкін.


Олигонуклеотидтерді қайта суспензиялауға және сұйылтуға арналған кеңестер

Сіз өзіңіздің жеке олигонуклеотидтеріңізді алдыңыз, енді оларды қайтадан тоқтатып, сұйылту керек. Мұнда тәжірибелеріңізде олиголарды пайдалануды жеңілдетуге көмектесетін ғалымдарымыздың бірнеше кеңестері берілген.

Олиго қайта суспензиясы

Олиголарды құрғақ түрде алсаңыз, қолданар алдында оларды су ерітіндісінде қайта суспензиялауыңыз керек. Олигостардың көпшілігін қалпына келтіру оңай, дегенмен фторофорлармен немесе гидрофобты молекулалармен өзгертілгендер толық еруі үшін көп уақыт қажет болуы мүмкін.

Төменде біздің ғалымдардың пайдалы кеңестері берілген. Олигонуклеотидтерді сақтау бойынша нұсқаулықты мақаланы қараңыз: Олиголарды сақтау: білу керек 7 нәрсе.

  • Кептіру процесінде олигос түтіктің түбінде ақ қабыршақты түйіршікті құрайды. Түйіршік жөнелту кезінде орнынан кетуі мүмкін болғандықтан, түтікті ашпас бұрын әрбір олигоны қысқаша центрифугалау өте маңызды. Олай болмаған жағдайда өнімділік жоғалуы мүмкін, себебі түтік түбінде жоқ олиго түйіршіктері қақпақ ашылған кезде түтіктен ұшып кетуі мүмкін.
  • Қайта суспензия қиын болса, олигоны 55°C температурада 1&ndash5 минут қыздырып көріңіз, содан кейін мұқият құйыңыз. Егер қандай да бір тұнба қалса, ол тригилді топтар (үлпек тәрізді) немесе олиго синтезделген бақыланатын кеуекті шыны (түтік түбіндегі түйіршікті CPG) болуы мүмкін. Ешқайсысы да олиго өнімділігіне әсер етпеуі керек және екеуін де алып тастауға болады&mdashтек қайта суспензияланған олигоны Sephadex ® G-50 бағаны (GE Healthcare) арқылы іске қосыңыз немесе супернатанды (олиго бар) жаңа түтікке тасымалдаңыз.
  • IDT олигонуклеотидтері (ДНҚ да, РНҚ да) әдетте құрғақ түрде жеткізіледі. Алайда, сіз жөнелту алдында ДНҚ олигосының жұмысын тоқтатуды сұрай аласыз. Қайта суспензияланған олиголарды алу үшін пайдаланыңыз Нормализация Oligo Entry тапсырыс құралындағы ашылмалы мәзір (1-суретті қараңыз). Мұнда сіз таңдай аласыз LabReady (IDTE ішінде 100 µM, pH 8,0), немесе спецификацияларыңызға сәйкес реттелетін тұжырым жасаңыз.
  • Қайта суспензия кезінде олиголарыңызды жоғары қышқылдық немесе негізгі жағдайларға ұшыратпаңыз. Олиго тұрақтылығын қолдайтын тұрақты рН деңгейін сақтау үшін IDTE сияқты TE буферінің ерітіндісінде олиголарды қайта суспензиялауды ұсынамыз (IDTE рН 7,5 және рН 8,0 кезінде IDT-ден қол жетімді). Немесе олигоды нуклеазасыз, стерильді суға рН 7.0-де қайта құяды (HPLC сыныбы IDT-ден қол жетімді).

Ескертпе: Ұзақ мерзімді сақтау үшін DEPC тазартылған суда немесе ионсыздандыру жүйелеріндегі суда олиголарды қайта суспензиялаудан аулақ болыңыз. Олар көбінесе қышқыл (рН 5 -тен төмен) және уақыт өте келе ДНҚ деградациясын тудыруы мүмкін.


100 & microM сақтау шешімін жасау үшін:

  1. Олиго шығымы туралы ақпаратты (nmol бойынша) түтік жапсырмасынан немесе техникалық сипаттамалар парағынан табыңыз.
  2. Бұл санды 10-ға көбейтіңіз.
  3. Алынған өнім 100 & microM ерітіндісін дайындау үшін & microL -де қажет буфердің мөлшері болып табылады. (Егер кірістілік 9 нмоль болса, 100 & microM ерітіндісін дайындау үшін 90 & microL буфер қажет.)

Ескертпе: 100 & microM концентрациясында 1 & microL ерітіндісінде 100 pmol олиго бар. ПТР әдетте реакцияға әрбір праймерден 10&ndash50 pmol қажет етеді.

Басқа концентрацияларда сақтау ерітінділерін жасау үшін:

  1. Олиго шығымы туралы ақпаратты түтік жапсырмасынан немесе техникалық ақпарат парағынан табыңыз. Бұл 3 формада тізімделеді & mdashoptical тығыздығы (OD), наномолдар (nmol) және массасы (мг).
  2. Осы кірістілік өлшемдерінің бірін енгізіңіз Саны Қалпына келтіру калькуляторының жолағын таңдап, сәйкес бірліктерді таңдаңыз.
  3. Ішінде Соңғы концентрация қорапшасында қордың қажетті концентрациясын енгізіп, сәйкес бірліктерді қайтадан таңдаңыз.
  4. басыңыз Есептеу. Құрал қажетті қорды жасау үшін қажетті буферлік/су көлемін анықтайды.

Баламалы сақтау және жұмыс ерітіндісінің концентрациясын біздің ресуспензия калькуляторы арқылы оңай жасауға болады.

Ескертпе: таңдалған бірліктерге сүйене отырып, молярлық жойылу коэффициентін және/немесе олигоның молекулалық салмағын енгізу қажет болуы мүмкін. Бұл ақпаратты олиго спецификация парағында табуға болады.

Қоймалық қордан жұмыс қорын жасау үшін:

Жұмыс қорларын сақтау қорларынан біздің сұйылту калькуляторы арқылы оңай жасауға болады.

  1. Бастапқы концентрация мен көлемді енгізіңіз, содан кейін сәйкес бірліктерді таңдаңыз.
  2. Соңғы (қажетті) концентрация мен көлемді енгізіп, сәйкес бірліктерді таңдаңыз.
  3. басыңыз Есептеу. Құрал қойма қорын қажетті жұмыс қоры концентрациясына дейін сұйылту үшін қажетті буфер/су көлемін анықтайды.

Ескертпе: Таңдалған бірліктердің негізінде олигоның молекулалық салмағын енгізу қажет болуы мүмкін. Бұл ақпаратты олиго спецификация парағында табуға болады.


Стандартты ПТР протоколы

Буфер: меншікті немесе үйде 10x rxn қоспасын қолданыңыз, мысалы: Cetus, Promega. Ол мыналарды қамтуы керек: кем дегенде 1,5мм Mg2+, әдетте жуғыш зат, мүмкін желатин немесе ВСА. Promega қазір 25 мМ MgCl2 береді, бұл праймерлердің және нысаналардың әртүрлі комбинацияларымен реакцияны оңтайландыру үшін пайдаланушы көрсеткен [Mg2+] мүмкіндік береді.

ДНҚ болмаған кезде реагенттердің таза қоспасын жасаңыз ДНҚсыз тамшуырды қолданып, содан кейін жеке түтіктерге таратыңыз (ДНҚсыз пипеткамен) және жеке реакцияларға ДНҚ қосыңыз ҚОСЫЛҒАН КЕҢЕСТЕРДІ ПАЙДАЛАНУ.

50УЛ ЖОҒАРЫ САПАЛЫ СҰЙЫҚ ПАРАФИНМЕН НЕМЕСЕ МИНЕРАЛДЫ МАЙМЕН ҚАБЫЛДАУ РЕАКЦИЯСЫ буланудың болмауын қамтамасыз ету үшін: бұл әрекеттесуші заттардың концентрациясын өзгертеді. ЕСКЕРТУ: соңғы даналықты қолдануға болады ВАЗЕЛЬ - бұл да мүмкіндік береді & quotҚЫЗЫҚ БАСТАУ & quot; ПТР.

ҚОСЫЛҒАН ПИПЕТТІК КЕҢЕСТЕРДІ ПАЙДАЛАНЫҢЫЗ: тамшуырлардың аэрозольмен ластануын болдырмайды.

Жуғыш заттарды қолдану тек Promega-дан Taq үшін ұсынылады (0,1% көлеміне дейін, Triton X-100 немесе Tween-20 дейін). DMSO ұзақ мақсатты тізбектерді (>1kb) және одан да көп өнімді жақсырақ денатурациялауға мүмкіндік береді.

ЯДРОЛЫҚ ҚЫШҚЫЛДАРДЫ БЕРУ ҮШІН ДА ПИПЕТТІ ҚОЛДАНБАҢЫЗ.

Есіңізде болсын, сынаманың көлемі 1/10 реакция көлемінен аспауы керек, ал ДНҚ/НТП/праймер концентрациясы тым жоғары болмауы керек, әйтпесе барлық қол жетімді Mg2+ ерітіндіден шелатталған және ферменттің реактивтілігі теріс әсер етеді. 200uM-ден асатын dNTPs кез келген жоғарылауы [Mg2+] қайта оңтайландыру керек дегенді білдіреді.

ҚҰРАМЫНДА ЭДТА бар БУФЕРЛЕРДІ ЭДТА ХЕЛАТТАРЫ Мg 2 +

Праймердің, мақсатты, тактың және нуклеотидтердің төмен концентрациясын таңдаған жөн, өйткені олар, әдетте, таза өнім мен төменгі фонды қамтамасыз етеді, мүмкін анықтау сезімталдығына байланысты.

Ұсынылатын реакция шарттары:

Бастапқы шарттар:

Бастапқы денатурация: 92 - 97oС 3 - 5 мин. Егер денатурация 97oС кезінде денатурация үлгісі күйдіру температурасына реакция соқтығысқаннан кейін ғана қосылады.

Бастапқы күйдіру температурасы: мүмкіндігінше 3 минут ішінде (мысалы: 50 - 75oC). Қатаң бастапқы шарттар, әсіресе эукариоттық геномдық ДНҚ-дан күшейту кезінде спецификалық емес өнімді білдіреді.

Созылудың бастапқы температурасы: 72oC 3 - 5 мин. Бұл сирек кездесетін шаблондарда өнімді толық ұзартуға мүмкіндік береді.

Температуралық велосипед:

  • 92 - 94 o C 30 - 60 сек (денатура)
  • 37 - 72 o C 30 - 60 сек (жылу)
  • 72 o C 30 - 60 секундқа (ұзартылған) (кб үшін 60 секунд)
  • 25 - 35 цикл ғана (әйтпесе ферменттің ыдырауы артефакттерді тудырады)
  • 72 o C 5 минут ішінде барлық өнім ДНҚ -ның толық созылуына мүмкіндік береді

"Quickie" ПТР әбден мүмкін: мысалы, [94 o C 30 sec / 45 o C 30 sec / 72 o C 30 sec] x 30, қысқа өнімдер үшін (200 - 500 bp).

ЖАҚСЫ ТЕРМИЯЛЫҚ БАЙЛАНЫСТАРДЫ ҚАМТАМАСЫЗ ЕТУ ҮШІН ТЕРМАЛДЫҚ ЦИКЛЕР РЕАКЦИЯСЫ ТҮБЕГІ саңылауларында ГЛИЦЕРОЛДЫ ПАЙДАЛАНУҒА БОЛАДЫ.

Тым КӨП ЦИКЛДЫ ЖҮРГІЗМЕҢІЗ: егер сіз 30 циклі бар жолақты көрмесеңіз, реакция қоспасынан аликвотты алып, жаңа реагенттермен қайта ПТР жүргізгеннен кейін 40 циклден кейін болмайды. Қараңыз Мұнда.

& QuotHot Start & quot ПТР:

Белгілі бір жағдайларда адам қалайды Taq қатысуымен төмен температурада праймерлер мен мақсатты ДНҚ араластырудан аулақ болыңыз полимераза: Taq pol 37 жастағы Klenow pol сияқты тиімді о C демек, егер праймерлер шаблонның бастапқы денатурациясына дейін төмен температурада қате күйдірілсе, "неспецификалық" күшейту орын алуы мүмкін. Бұған реакция таңдалған күйдіру температурасына дейін салқындағанға дейін бастапқы денатурациядан кейін фермент қосу арқылы ғана жол бермеуге болады. Бұл балауызды & quotgems & quot TM қою арқылы ең ыңғайлы түрде жасалады ферменттен басқасының барлығын қосқаннан кейін реакция түтігіне құйыңыз, содан кейін ферментті асыл тастың үстіне қояды: температура +/-80 o C жеткенде балауыз ериді, ал балқытылған балауыз қалқып тұрғанда фермент реакцияның қалған бөлігімен араласады. үстіне минералды майдың орнын алып, қоспаны тығыздайды. Ақпарат бойынша & quotgems & quot вазелинмен алмастырылуы мүмкін.

SsDNA өндірісі үшін асимметриялық ПТР:

Екі праймердің 100: 1 молярлық қатынасын қолданыңыз (мысалы: пример 1 0,5uM, праймер 2 0,005uM). Бұл, негізінен, ssDNA -ді алуан түрлі праймер сезімінде жасауға мүмкіндік береді, ол ssDNA зондтарын реттеуге немесе жасауға пайдалы.

Өнімдерді анықтау:

Реакция қоспасының 1/10 - 1/3 бөлігін алыңыз АБАЙ БОЛЫҢЫЗ майдың астынан немесе вазелиннің немесе қатайтылған балауыздың астынан, бітелген ұшы бар микропипетканы қолданып, ПТР ДАЙЫНДЫҚ АУДАРЫҢЫЗДАН АУДАНДА!

Мұны кейбір гельді жүктеу буферімен (1:1 - 1:5 араластыру: жүктеу буферімен) араластырыңыз: бұл 10 - 20% глицерин немесе сахароза және бромфенол көк (BPB) бақылау бояуы бар TBE.

Үлгіні 5 - 30ul TBE -де жасалған 0,8 - 3,0% суасты агарозды гелінің ұңғымаларына салыңыз, құрамында 50гг/мл этидиум бромиді бар.

BPB гельдің (үлкен өнімдер) немесе 2/3 төмен гельдің (ұсақ өнімдер) соңына жеткенше 80 -120 вольтпен жұмыс жасаңыз (тым баяу емес немесе кішкене өнімдер тез таралмайды немесе жолақтар жағылады). 2кб -тан 100 -ге дейін немесе одан төмен ДНҚ маркерлерін қолданыңыз (BMR ПТР маркерлерін ұсынамыз).

254 - 300 нм УК-жарық қорабында көру, фото 1 - 5 сек.

Ұсақ өнімдер 3% агарозды гельдерде жақсы көрінеді болды жылдам жүгіру (мысалы: 100 вольт), BPB гельден ½ - 2/3 төмен қарай жүгіреді. EthBr -ді гельге ЖӘНЕ гель буферіне қосқан дұрыс , өйткені электрофорезден кейінгі бояу диффузияға байланысты жолақты жағуға әкелуі мүмкін, ал егер буферде EthBr жоқ болса, бояу гельден артқа қарай ағып кетеді, ал кіші жолақтар бояғыштан тазартылады және көрінбейді.

NUSIEVE TM гелі (FMC Corp) ұсақ өнімдерге де қолдануға болады - агарозаға қарағанда жақсы ажыратымдылық.

Полиакриламид гельдер анықталудың аса сезімталдығы үшін қарапайым хаттамалармен боялған күміс болуы мүмкін.

Гельдерді кетіруге болады 0,5-20 NaOH / 1,5M NaCl-да 10-20 мин сіңдіргеннен кейін: & quot құрғақ дақ түсіру & quot; жақсы жұмыс істейді (мысалы: гель қағаз сүлгілермен қапталған және астыңғы қабатпен қапталған және қысылған жолақтар жоғары және төмен тасымалданады), сонымен қатар классикалық & quot; Оңтүстік & quot; . Осылайша тазартылған жолақтар нейлон мембраналарына ковалентті түрде бекітілген және алдын ала гибридизациядан бұрын 5xSSPE арқылы шаю қажет.

Көрсетілген мысал - анықтау Адам папилломавирусы 16 типті (HPV-16) жатыр мойны биопсиясы үлгілерінен күшейтілген ДНҚ (Williamson A-L, Rybicki EP (1991) Дегенерацияланған кірістірілген праймерлермен полимеразды тізбекті реакция күшейту арқылы адамның жыныс мүшелерінің папилломавирустарын анықтау. J Med Virol 33: 165-171). Сол жақ панельде EthBR бояуы бар 2% агарозды гельдің фотосуреті, оң жақта 32 Р таңбалы HPV-16 ДНҚ бар зерттелген оңтүстік блоттың авторадиографы бар. Блоттаудың қаншалықты сезімтал екеніне және анықтаудың қаншалықты нақты екеніне назар аударыңыз.

ПТР өнімдерін дигоксигенинмен таңбалау

ПТР өнімдері реактивті 50-100uM dNTPs соңғы концентрациясының нуклеотидтер қоспасына 10-35% соңғы тиімді dTTP концентрациясына қосу арқылы дигоксигенин-11-ДУТП (Boehringer-Mannheim) арқылы таңбалануы мүмкін (Emanual, 1991 Nucleic Acids Res 19) : 2790). Бұл дәл анықталған ұзындықтағы зондтарды белгілі дәрежеде алмастыруға мүмкіндік береді, бұл өз кезегінде нақты анықтау шарттарымен мүмкіндік береді. Бұл сонымен қатар ПТР өнімдерін таңбалаудың ең тиімді құралы болып табылады, себебі 32P-dNTP-мен дәл осылай әрекет ету қауіпті және өте қымбат, ал лақап аударма немесе кездейсоқ астарлы жапсырманы енгізу жарамсыз, себебі үлгілер тиімді болу үшін тым кішкентай. таңбалау.

Төмендегідей ПТР үшін DIG-dNTP қоспасын жасаңыз:

НИКЛЕОТИД МИКСІНІҢ КОНЦЕНТРАЦИЯЛАРЫН ДИГРЕ

  • Dig-11-dUTP 350 uM
  • dTTP 650 uM
  • DATP 1 мм
  • dCTP 1 мм
  • dGTP 1 мм

Синтезделген әрбір 50 ул зонд үшін жоғарыда сипатталғандай басқа реактивтерге қосылған кезде DIG-нуклеотид қоспасынан 1/10 разбавление жүргізіледі. Өнімдерді агарозагельді электрофорез көмегімен талдауға болады - ЕСКЕРТПЕ: ӨНІМДЕР АЛМАСТЫРЫЛМАЙТЫН ӨНІМДЕРДЕН КӨП - және иммунды түрде тікелей дақтарда анықталады. Зондтарды гибридизация қоспасымен араласқан және денатурацияланған ПТР өнімдерінің қоспаларынан 5-10 ул аликвот ретінде қолдануға болады. Зондтарды 10 есеге дейін қайта қолдануға болады, эксперименттер арасында мұздатылған күйде сақтайды және денатураға дейін қайнатады.

ПТР өнімдерін тазалау

  • Минералды майдан арылу: жай ғана реакция құтысына 50ул хлороформ қосып, құйынды және центрифуганы қысқа уақытқа өткізіңіз де, "салмалы тамшыны" алып тастаңыз. СУ микопипеткамен ерітінді.
  • Балауыздан немесе вазелиннен құтылу: жай ғана & quot; найза & quot; балауыз асыл тастарын алып тастаңыз, майды немесе түбінен тесілген түтікті жасаңыз және вазелиннің сулы тамшысын үрлеңіз.
  • ДНҚ тазарту: 3 нұсқа
    • ДНҚ -ны дәйектілік үшін беретін протокол келесідей: сумен 100улге дейін ұлғайту, 10М аммоний ацетаты ерітіндісін қосу. 0,2М соңғы концентрацияға дейін (1/5 көлем), изопропанолдың тең мөлшерін (пропан-2-ол) қосыңыз, 5 минуттық скамейкада қалдырыңыз, 20 минут ішінде 15 000 айн/мин центрифугалаңыз, тамшуырды қолданып сұйықтықты алыңыз, 100ul суға немесе ТЭ-ге қайта құю. , жауын-шашынды қайталау.
    • Фенол-CHCl3 экстракциясын жасаңыз (сулы фазаға 20ul фенол қосыңыз, құйын, 50ul CHCl3 қосыңыз, құйынды, центрифуганы алыңыз, алып тастаңыз) ЖОҒАРЫ сулы фаза, CHCl3 экстракциясын қайталаңыз).
    • 400ul-ге дейін сулы фазаны жасаңыз және Millipore Ultrafree-MC NMWL 30 000 патрондарымен айналдырыңыз (микроцентрифугада 6000 айн/мин), 2x400ul сумен жуыңыз, +/- 20ul сынамасын жинаңыз: бұл реттілік үшін жеткілікті таза.

    Өнім реакциядан кейін бірден қорытуды шектеу үшін жеткілікті таза, бірақ ең аз дегенде фенол-хлороформды тазалау ұсынылады.

    ПТР өнімдерінің тізбектелуі:

    Бұл ассиметриялық ПТР арқылы жасалған ssDNA және реттілікке арналған & quotlimiting & quot праймері көмегімен жақсы. Дегенмен, қалыпты ПТР арқылы генерацияланған dsDNA-ның тиімді реттілігі Бахман жариялаған SequenaseTM протоколының модификациясы арқылы мүмкін болады. т.б. (1990) (NAR 18: 1309). ДНҚ ТАЗАЛАУ құрамында 0,5% Nonidet P-40 және 0,5% Tween-20 бар реттегіш праймері бар 5 сек 95оС дейін қыздыру арқылы денатурацияланған, дымқыл мұзда тез салқындатылған және & quotccprose to primer & quot протоколымен реттелген (мысалы, : сұйылтылған қоспалар).

    ПТР өнімдерін клондау

    T-A клондау стратегиясы: Taq және басқа полимеразалар ПТР өнімдерінің 3-ші ұштарына бір нуклеотидті шаблонсыз қосуға әкелетін терминальды трансферазалық белсенділікке ие сияқты. Барлық 4 дНТП болған жағдайда, дА қосылады, алайда реакция қоспасында бір дНТП қолдану сол нуклеотидті қосады (салыстырмалы түрде тиімсіз). Бұл клондауды қиындатады, өйткені ПТР-дің үзіліссіз өнімі жиі болмайды және клондаудың үзіліс хаттамалары көбінесе жұмыс істемейді немесе өте тиімсіз. Мұны ПТР өнімдерін T4 DNA pol немесе Klenow pol көмегімен инкубациялау арқылы түзетуге болады, олар 3'->5' экзонуклеаза белсенділігіне байланысты ұштарын "жақсытады" (Lui және Schwartz, 1992 BioTechniques, 20: 28-30). Дегенмен, бұл терминал трансферазалық белсенділік ақылды клондау стратегиясының негізі болып табылады: бұл Taq pol көмегімен pUC немесе pBluescript ™ сияқты қарапайым кесілген клондау векторының 3 ' ұштарына бір дТ қосу үшін қарапайым тақтаны қосады. ПТР өнімін қазір "жабысқақ ұшы" плазмидаға енгізіңіз (Марчук және т.б., 1990 NAR 19: 1156).

    Праймерлерге шектеу сайттарын енгізу: Бұл ПТР праймерлерінің 5 және 39 шетіндегі бір немесе басқа шектеу тораптарын қосу арқылы қарапайым болып көрінуі мүмкін, бұл жабысқақ ұштарды шығаруға және тиісті векторларға тікелей клондеуге мүмкіндік береді. ШЕКТЕН АСҚАНДА ферменттер іс жүзінде дәйектілікті танитынына көз жеткізу үшін тану ретіне қосымша екі негіз 5' - және бұл орындалғанның өзінде жаңа өнімді кесу тиімділігі нөлге жақын болатыны жиі кездеседі. Мұны кейде жаңа өнімді Proteinase K көмегімен инкубациялау арқылы түзетуге болады (тығыз бекітілген Taq polды сіңіру үшін), бірақ көбінесе олай емес. Мәселені шешу үшін "Klenow-Kinase-Ligase" (KKL) әдісін қолдану болып табылады: бұл өнімдерді Klenow көмегімен "жылтырату", 5'-фосфорлану алу үшін киназдау (Айрықша ескертпе: ОЛИГОНУКЛЕОТИДТІ ПРАЙМЕРЛЕРДІҢ НОРМАЛДА 5-ФОСФАТЫ ЖОҚ. ), фрагменттерді біріктіргіштерді алу үшін біріктіреді, содан кейін оларды клондау үшін жарамды жабысқақ фрагменттерді алу үшін оларды тиісті рестриктивті ферменттермен шектейді (Лоренс, 1991 ПТР әдістері мен қосымшалары, 1: 140-141).


    Біз кем дегенде таптық 10 арқылы іздеу кезінде төменде көрсетілген веб-сайттар тізімі pcr үшін сұйылту праймерлер іздеу жүйесінде

    Хаттама: ПТР праймерлерін қайта суспензиялау

    • Праймерлер лиофилденген күйде жиі жеткізіледі және қабылданады
    • Алдымен 100 және#215 шебер қорын жасаңыз (әрқайсысы үшін праймер содан соң сұйылту ол 10 × жұмыс қорына
    • Бұл шебер жасайтын мұздату/еріту циклдарының санын азайтады праймер қор өтеді

    Қорлар мен олигонуклеотидтерге арналған ПТР праймерді сұйылту

    Le.ac.uk DA: 12 PA: 24 MOZ рейтингі: 37

    • ОЛИГОНУКЛЕотидтер және сұйылту ның ПТР үшін праймер 1
    • Қазіргі уақытта праймерлер бағаға байланысты SIGMA GENOSYS немесе басқалардан тапсырыс беріледі (жеткізу ақысы мен айырмашылық шығындарын ескеруді ұмытпаңыз артықшылықтар). 2.

    Зертханалық математикалық праймерді дайындау және сұйылту

    Aphl.org DA: 12 PA: 50 MOZ рейтингі: 64

    Праймер хабарланған Сома: 155,5 нМоль = 0,96 мг = 960 мкг 1 мкг/мкл қор ерітіндісін алғыңыз келсе, олигоны 960 мкл ddH 2 O немесе TE буферінде қайта суспензиялаңыз: 960 мкг / 960 мкЛ = 1,0 мклг/мк0 мкл Егер 100 нг/мкл жұмыс шешімін алғыңыз келсе, 1:10 жасаңыз сұйылту қордан: - Қордан 1,0 мкл (1 мкг/мкл) 9,0 мкл ddH 2 O немесе TE буферіне (1:10) қосыңыз.

    Праймерді сұйылту және есептеу

    • Біз алып жатырмыз праймерлер лиофилизденген соң, біз запас соль жасау үшін қажетті мөлшерде ТЭ/су қосамыз
    • Сонымен, әр түпкі көлемі праймерлер қор көлемі өзгереді
    • Мен үшін 10pmol пайдаланамын ПТР солай болар едім сұйылту қор 10x

    Олигонуклеотидтерді қайта суспензиялау және сұйылту бойынша кеңестер

    Idtdna.com DA: 14 PA: 50 MOZ рейтингі: 68

    • Ескерту: 100 µM концентрациясында 1 µL ерітіндісінде 100 пмол олиго бар
    • ПТР әдетте әрқайсысының 10-50 пмольді қажет етеді праймер реакцияға қарай
    • Басқа концентрацияларда сақтау ерітінділерін дайындау үшін: түтік жапсырмасынан немесе спецификация парағынан олиго шығымы туралы ақпаратты табыңыз
    • Бұл 3 түрде болады - оптикалық тығыздық (OD), наномолдар (nmol) және

    Полимеразды тізбекті реакция: Basic Protocol Plus

    • Сәйкес дизайн праймерлер сәтті нәтиже үшін маңызды болып табылады ПТР эксперимент
    • Жиынтығын жобалау кезінде праймерлер ДНҚ -ның белгілі бір аймағына күшейту үшін қажет праймер конвенция бойынша 5 '→ 3' бағытында (сонымен қатар сезімтал немесе өрнектелмеген деп аталады) және басқа праймер толықтыруы керек...

    Олиго разбавление калькуляторы LGC Biosearch Technologies

    • Нәтижелерді тездететін молекулярлық диагностикалық сынақты жасаңыз
    • Қолдану ПТР Молекулалық диагностикалық талдауды жасау
    • Келесі ұрпақты реттілікке (NGS) арналған арнайы және OEM ферменттері мен реагенттері MDx ресурстары
    • Молекулалық диагностикалық жеткізушіні таңдау

    Мен ПТР өнімін тікелей реттей аламын ба?

    • Өзіңізді бағалаңыз ПТР аналитикалық гельдегі өнімнің концентрациясы және сұйылту оларды ұсыныстарға сәйкес
    • Тиімсіз праймерлер кейде жақсы ПТР, бірақ бірдей праймерлер реттілікте сәтсіздікке ұшырауы мүмкін
    • Өйткені ПТР бұл экспоненциалды процесс, және ол әдетте аяқталмағаннан кейін, тіпті нашар праймерлер

    Праймер мен зондтың концентрациясын есептеу Термо

    Қымбат бағаны ысырап етпеу үшін праймер, зерттеуші сұйылтылған 1 мл TE 1: 100 буферінде 1 мл (10 & 181 л) соңғы көлемге жету үшін праймер шешім және 990 µL 1X TE - бұл а сұйылту 100 коэффициенті).


    Сайки, Р.К. т.б. Бета-глобиннің геномдық тізбегінің ферментативті күшейтілуі және орақ тәрізді жасушалық анемияны диагностикалау үшін шектеу алаңының талдауы. Ғылым 230, 1350–1354 (1985).

    Сайки, Р.К. т.б. Термостабельді ДНҚ полимеразамен ДНҚ-ны праймерге бағытталған ферментативті күшейту. Ғылым 239, 487–491 (1988).

    Mullis, K. et al. ДНҚ спецификалық ферментативті күшейту in vitro: полимеразды тізбекті реакция. Суық көктемгі арб. Symp. Саны. Биол. 51 (1-бөлім): 263–273 (1986).

    Колмодин, Л.А. және Берч, Д.Э. Полимеразды тізбекті реакция. Негізгі принциптер мен күнделікті тәжірибе. Мол әдістері. Биол. 192, 3–18 (2002).

    Крамер, М.Ф. & amp; Коэн, Д.М. ПТР көмегімен ДНҚ -ның ферментативті күшейтілуі: стандартты процедуралар және оңтайландыру. Ақша Проток. Мол. Биол. 15 тарау, 15 1 бөлім (2001).

    Дон, РХ, Кокс, П.Т., Уэйнрайт, Б.Ж., Бейкер, К. & Мэтик, Дж. Генді күшейту кезінде жалған праймерлеуді айналып өту үшін «Точдау» ПТР. Нуклеин қышқылдары. 19, 4008 (1991).

    Ву, В.М. т.б. Қондырылған термоцикл бағдарламасы нақты уақыттағы аллельге тән полимеразды тізбекті реакцияға негізделген жалғыз нуклеотидті полиморфизмді теру әдісіне мүмкіндік береді. Анал. Биохимия. 339, 290–296 (2005).

    Нолан, Т., Қолдар, Р.Е. & Bustin, S.A. Нақты уақыттағы RT-ПТР көмегімен мРНҚ мөлшерін анықтау. Нат. Проток. 1, 1559–1582 (2006).

    Panjkovich, A. & Melo, F. Қысқа ДНҚ тізбегі үшін әртүрлі балқу температурасын есептеу әдістерін салыстыру. Биоинформатика 21, 711–722 (2005).

    Kibbe, W.A. OligoCalc: онлайндағы олигонуклеотидтердің қасиеттері калькуляторы. Нуклеин қышқылдары. 35, W43 – W46 (2007).

    Борер, П.Н., Денглер, Б., Тиноко кіші I. & Ухленбек, О. Рибонуклеин қышқылының қос тізбекті спиральдарының тұрақтылығы. Ж.Мол. Биол. 86, 843–853 (1974).

    Стегер, Г. Екі тізбекті нуклеин қышқылдарының термиялық денатурациясы: градиентті гель электрофорезі мен полимеразды тізбекті реакция үшін өте маңызды температураларды болжау. Нуклеин қышқылдары. 22, 2760–2768 (1994).

    SantaLucia Jr. J. Полимер, гантель және олигонуклеотидті ДНҚ-ның жақын көрші термодинамиканың біртұтас көрінісі. Проц. Натл. Акад. Ғылым. АҚШ 95, 1460–1465 (1998).

    Санта Люсия кіші Дж., Аллави, Х.Т. & Seneviratne, P.A. ДНҚ дуплексті тұрақтылығын болжау үшін жақын көршінің параметрлері жақсарды. Биохимия 35, 3555–3562 (1996).

    Sugimoto, N., Nakano, S., Yoneyama, M. & Honda, K. ДНҚ дуплекстерінің тұрақтылығын болжау үшін жақсартылған термодинамикалық параметрлер мен спиралді бастау факторы. Нуклеин қышқылдары. 24, 4501–4505 (1996).

    Хеккер, К.Х. & amp; Рух, К.Х. Жоғары және төмен күйдіретін температура ПТР -ді төмендету мен түсірудің ерекшеліктерін арттырады. Биотехника 20, 478–485 (1996).

    Чжан, З. және Мартино, Д. Уолли дермальды саркома вирусының env генін талдауға арналған бір түтіктегі геминестірілген ПТР және «тұжырым» ПТР. Дж. Вирол. Әдістері 60, 29–37 (1996).

    Руби, C. және т.б. ПТР-көп сатылы әсер ету. Биотехника 27, 414–416, 418 (1999).

    Дакворт, А.В. & amp; Rule, SA Бр. Дж. Гематол. 121, 952–953 (2003).

    Де ла Хорра, C. және т.б. Өкпе тінінің парафинді үлгілерінде Pneumocystis jirovecii ДНҚ-ны анықтауға арналған ПТР хаттамаларын салыстыру. Дж. Эукариот. Микробиол. 53 (1 -қосымша): S98 – S99 (2006).

    Fietto, J.L., DeMarco, R. & Verjovski-Almeida, S. CDNA кітапханаларын құру үшін азғындалған праймерлерді және тиюді ПТР пайдалану. Биотехника 32, 1404–1408, 1410–1411 (2002).

    Пирей, М. және Вининг, Л.К. Streptomyces venezuelae ISP5230 галогеназа генінің фрагментін күшейту үшін деградацияланған праймерлер мен ПТР қолдану. J. Ind. Microbiol. Биотехнология. 29, 1–5 (2002).

    Левано-Гарсиа, Дж., Вержовски-Альмейда, С. және да Силва, А.С. ПТР және гибридті дегенеративті праймерлерді тигізу арқылы транспозонды енгізу орындарын картаға түсіру. Биотехника 38, 225–229 (2005).

    Kornmann, B., Preitner, N., Rifat, D., Fleury-Olela, F. & amp Schibler, U. ADDER арқылы циркадтық бауыр генінің экспрессиясын талдау, әр түрлі өрнектелген мРНҚ-ны көрсетудің жоғары сезімтал әдісі. Нуклеин қышқылдары. 29, E51–E51 (2001).

    Ding, W., Zou, H., Dai, J. & Duan, Z. Реттеу ас қорыту және тиюді біріктіру ПТР гистамин H3 рецепторының іздік изоформаларын анықтауға мүмкіндік береді. Биотехника 39, 841–845 (2005).

    Li, J., Kuang, K., Nielsen, S. & amp Fischbarg, J. CBCEC -те аквапорин 1 су арнасының ақуызының молекулалық идентификациясы мен иммунолокализациясы. Инвестициялау. Офтальмол. Vis. Ғылым. 40, 1288–1292 (1999).

    Ault, G.S., Ryschkewitsch, C.F. & amp; Stoner, G.L. Вирустық ДНҚ-ны түрту және ПТР-ды ыстық іске қосу арқылы типті спецификалық күшейту. Дж. Вирол. Әдістері 46, 145–156 (1994).

    Ру, К.Х. Бір сатылы ПТР оңтайландыруы тию және төмендету ПТР бағдарламалауы арқылы. Мол әдістері. Биол. 192, 31–36 (2002).

    Штраус, В.М. Сүтқоректілер тінінен геномдық ДНҚ дайындау. Ақша Проток. Мол. Биол., 2 тарау, 2.2 бірлік (2001).

    Chomczynski, P. & amp Sacchi, N. Гуанидиний тиоцианаты-фенол-хлороформ қышқылы арқылы РНҚ оқшаулаудың бір сатылы әдісі: жиырма жылдан кейін. Нат. Проток. 1, 581–585 (2006).

    Rozen, S. & amp Скалецкий, H. Primer3 WWW бойынша жалпы пайдаланушыларға және биолог бағдарламашыларға арналған. Мол әдістері. Биол. 132, 365–386 (2000).

    Юрьев, А.Е. ПТР праймер дизайны (ред. Юрьев, А.) (Humana Press, Totowa, NJ, 2007).

    Brody, J.R., Calhoun, E.S., Gallmeier, E., Creavalle, T.D. & Kern, S.E. ДНҚ мен РНҚ-ның ультра жылдам жоғары ажыратымдылықтағы агарозды электрофорезі төмен молярлы өткізгіш ортаны қолданады. Биотехника 37, 598, 600, 602 (2004).

    Броди, Дж.Р. және Керн, С.Э. Стандартты ДНҚ электрофорезіне арналған өткізгіш ортаның тарихы мен принциптері. Анал. Биохимия. 333, 1–13 (2004).

    Мокаддас, Е., Ахмад, С. & amp Абал, А.Т. Изониазидке төзімді молекулалық саусақ ізі Туберкулез микобактериясы Кувейттегі кеуде аурулары ауруханасынан оқшауланған. Микробиол. Иммунол. 46, 767–771 (2002).

    Ахмад, С., Мокаддас, Э. & Джабер, А.А. Этамбутолға төзімділікті жылдам анықтау Туберкулез микобактериясы embB кодондары 306 және 497 және iniA кодон 501 мутацияларына бағытталған ПТР-RFLP штаммдары. Мол. Ұяшық Зондтар 18, 299–306 (2004).

    Ахмад, С. & Мокаддас, E. Рифампицинге төзімді клиникада сирек кездесетін rpoB мутациясының пайда болуы Туберкулез микобактериясы Кувейттен оқшауланған. Int. J. Антимикроб. Агенттер 26, 205–212 (2005).

    Mokaddas, E. & Ahmad, S. Кувейттегі клиникалық үлгілерден бөлінген туберкулезсіз микобактериялардың түрлер спектрі. Ақша Микробиол. 56, 413–417 (2008).

    Harboe, M. et al. Ақуыздардың сүтқоректілер жасушасына енуі (Mce) арасындағы өзара реакция Туберкулез микобактериясы. Scand. J. Иммунол. 56, 580–587 (2002).

    Ахмад, С., Ел-Шазлы, С., Мұстафа, А.С. & amp Al-Attiyah, R. mce3 опероны кодталған сүтқоректілердің жасушалық кіру ақуыздары Туберкулез микобактериясы адамдарда табиғи инфекция кезінде көрінеді. Scand. J. Иммунол. 60, 382–391 (2004).


    КІРІСПЕ

    Кеміргіштердің генотиптеуінің көптеген хаттамалары гендердің немесе генетикалық маркерлердің полимеразды тізбекті реакциясының (ПТР) күшеюіне негізделген, себебі ПТР оңай, жылдам, сезімтал және үнемді. Дұрыс емес, ПТР генотипін анықтау көбінесе шындықтағы қарапайым және оңай қадам ретінде қарастырылады, бірақ сенімді, дәл және жылдам нәтижелерді қамтамасыз ету жиі көрінетіндей қиынырақ. ПТР жоғары сезімталдыққа байланысты жиі жалған оң нәтижелерге ұшырайды (яғни, ластаушының күшеюі). Керісінше, ингибиторларға төзімділігі төмен болғандықтан, жиі жалған теріс нәтижелер де кездеседі (яғни, күшейту жоқ Bacich, Sobek, Cummings, Atwood, & O'Keefe, 2011 Schrader, Shielke, Ellerbroek, & Johne, 2012). ПТР сонымен қатар GC-ге бай реттіліктер немесе қайталама құрылымдар сияқты кейбір үлгілерді күшейте алмайды. Бұл тышқанды зерттеу зертханаларында әдеттегі әдіс болса да, әр мутация үшін сенімді, жылдам және үнемді генотиптік хаттамаларды құру ғылыми зерттеушілер үшін басымдықтар тізімінде әдетте төмен. Зерттеушілер өздерінің тәжірибелік хаттамаларынан алынған деректердің сенімділігіне өте мұқият қарайды, бірақ пайдаланылатын жануарлардың генотипі әрқашан тексерілмейді.

    5 жылдық кезеңдегі біздің генотиптеуімізді талдау екі рет сынама алынған және генотиптелген жануарлардың ~6% әртүрлі генотип нәтижелеріне ие болғанын көрсетті (1-кесте). Сонымен қатар, фенотиптеу когорталары (генотипі мен жынысы бойынша алты-сегіз жануардан тұратын топтар) екі рет, фенотипке дейін және одан кейін іріктеу және генотиптеу кезінде 30% сәйкес келмейтін генотипі бар кем дегенде бір жануарды қамтитыны анықталды (деректер көрсетілмеген). Бұл деректер мутант тінтуірінің ресурстық және зерттеу орталықтары (MMRRCs) және Джексон зертханасы (JAX) сияқты қоғамдық репозиторийлерге сақталған желілердің 15%-дан астамы салымшы көрсеткен мутацияны (Ллойд, Франклин, Лутц және Магнусон, 2015). Қорытындысыз генотиптеу-клиникаға дейінгі зерттеулер мен негізгі зерттеулердің репродуктивтілігіне әсер ететін факторлардың бірі, ол «репродуктивтілік дағдарысына» ықпал етеді (Cinelli, Rettich, Seifert, Bürki, & Arras, 2007 Picazo & García-Olmo, 2015). Сонымен қатар, генотиптеу қателері қорлардың генетикалық ластануына және тіпті генетикалық бірегей тінтуір желісінің жойылуына әкелуі мүмкін (Lloyd et al., 2015). Сондықтан мутантты ұрықтарды немесе эмбриондарды криоконсервациялау және сақталған қорлардың ПТР сапасын бақылау өте маңызды (Scavizzi et al., 2015). Ақырында, CRISPR/Cas9 технологиясының дамуы тышқандарда мутацияға жету мүмкіндігін арттырды (Birling, Herault, & Pavlovic, 2017 Birling, Schaeffer және т.б., 2017), бірақ сонымен қатар тінтуірдің модельдерін одан әрі генотиптендіру қажет болды (Birling, Schaeffer, et al., 2017 Mianné et al., 2017). Генотиптік қателіктер мен жануарлардың сәйкестендірудің салдарын бағаламауға болмайды және оларды ПТР тиімді және сенімді генотиптендіру арқылы бақылау қажет (Бонапарт және т.б., 2013).

    Екі нәтижені салыстыру
    Жыл Жануарлардың жалпы санына талдау жасалды Екі тәуелсіз биопсиямен генотиптелген жануарлар b б Талдауға екі генотиптің де нәтижелері түсіндірілетін жануарлар ғана кірді (ПТР тежелуі немесе ПТР ластануы байқалмады).
    Расталған генотиптер Ерекше генотиптер Қорытындысыз генотиптер (%)
    2013 56,331 4140 3867 273 6.6
    2014 51,309 4588 4328 260 5.7
    2015 58,250 7166 6673 493 6.9
    2016 50,267 4411 4152 259 5.9
    2017 51,272 6900 6576 324 4.7
    • а Біз әр түрлі себептерге байланысты кемінде екі рет сынама алынған және генотиптенген жануарлардың генотип нәтижелерін талдадық: мысалы, фенотиптік эксперименттерге дейін немесе кейін немесе мутантты жолдың қатуы немесе жөнелтілуіне дейін генотипті тексеру.
    • б Талдауға екі генотиптің нәтижелері түсіндірілетін жануарлар ғана кірді (ПТР тежелуі немесе ПТР ластануы байқалмады).

    Стандартталған және жоғары өнімді генотиптеу (жүздеген әртүрлі генетикалық маркерлер немесе гендік мутациялар үшін жылына 60 000 жануар) бойынша біздің тәжірибемізге сүйене отырып, біз осы жерде қайталанатын ПТР генотипіне қатысты кейбір ұсыныстар мен хаттамаларды сипаттаймыз. Сенімді генотиптеу стратегиясын құру сынама алынатын тіндерді таңдаудан, тікелей ДНҚ лизисіне дейін үлгілерді тексеруден және соңында сенімді, жылдам және үнемді сынақтан басталады. Бұл мақаланың соңғы бөлімінде процедураны миниатюризациялау мен автоматтандыру бойынша ұсыныстарды қоса алғанда, жоғары өткізу қабілетті ПТР процедурасын қалай аудару керектігі айтылады. Осы құжатта ұсынылған төрт протокол трансгендік тышқандарды генотиптеу үшін пайдаланылатын ең көп таралған үлгілер үшін оңтайландырылған: құйрық, құлақ немесе саусақ тінінен алынған шикі ДНҚ, жергілікті этикалық ережелерге сәйкес арнайы рұқсаттары бар.

    1: ұлпаларды іріктеу әдістері мен тәртібі

    Тінтуірдің генотипін алу үшін ДНҚ алудың бірнеше әдісі бар: құйрық биопсиясы, құлақ немесе саусақ қырқу, шаш, қан немесе нәжіс немесе ауызша үлгілер. Таңдалған әдіс бірнеше параметрлерге, соның ішінде зертханада немесе институтта орнатылған тәжірибеге және талдауға қажетті ДНҚ мөлшеріне байланысты. 2 кестеде әдетте генотиптеу үшін үлгі ретінде пайдаланылатын әр түрлі ұлпалар және іріктеудің ең қолайлы әдісін таңдаудағы негізгі ойлар сипатталған.

    • Құлақтың түйіршіктері негізінен шеміршектен тұрады.
    • 2 Құлақ үлгісін алу идентификация әдісі ретінде де пайдаланылса, екінші биопсия жасау мүмкін болмайды.
    • 3 Емшектен шығару жасынан (3 апта) кіші тышқандардан нәжіс жинау олардың сүт рационына байланысты қиын, және сынама мөлшерінің аздығына байланысты ДНҚ -ның нашар шығуына әкеледі.
    • 4 4 апталық тышқанның нәжіс салмағы (~10 мг) ересек адамға қарағанда әлдеқайда аз (~35 мг)
    • Дұрыс емес пункцияны және/немесе қан кетуді болдырмау үшін тиісті жаттығулар қажет.
    • 5 ≤10% жалпы қан көлемін кез келген уақытта қабылдау керек.
    • 28 күн ішінде жалпы қан көлемінің 6 ≤15%.
    • Әр түрлі жануарлардан алынған үлгілердің өзара ластану қаупі жоғары, себебі түктер аспаптарға электростатикалық түрде жабысады.
    • 7 Шаш әдетте ~10 күндік жаста өседі.
    • 8 Бір түйір шаш ∼3-30 түкті білдіреді.
    • 9 Инвазивті емес болса да, бұл құйрықтан немесе құлақтан сынама алу сияқты стресс сияқты.
    • Үлгіде шырышты қабықтың жасушалары болуы керек. тіл емес.

    Материал

    • 70% э/а этанол
    • 0,75 мл бұрандалы қақпақ түтіктері (мысалы, матрицалық түтіктер, бос кат. № 446015, Dutscher) және қақпақтар (мысалы, Matrix түтіктеріне арналған Sepra тығыздағыш қақпақ төсеніштері, № 446045, Dutscher)
    • Стерильді компресс
    • Тіндерді жинауға арналған жануарлар
    • II класты микробиологиялық қауіпсіздік шкафы немесе ауыстыратын станция
    • Жеке қорғаныс құралдары: зертханалық пальто, қолғап
    • Тышқандарға арналған құлақ тескіш (мысалы, мысық. AT7020, Agnthos) немесе өткір хирургиялық қайшы (мысалы, мысық. № 14106-09, Fine Science Tools)
    • Таза торлар

    Материалдарды дайындау

    1. Процедураны бастамас бұрын бес минут бұрын қауіпсіздік шкафын немесе ауыстыру станциясын қосыңыз.

    2. Жұмыс бетін 70% этанолмен тазалаңыз.

    3. Келесі жабдықты жұмыс бетіне қойыңыз: бұрандалы қақпақшалы құбырлар, таза тор, 70% сұйылтылған этанолға малынған компресс және қайшы немесе құлаққап.

    4. Үлгі алынатын жануарлар бар торды қауіпсіздік шкафының немесе ауыстыру станциясының астына қойып, ашыңыз.

    5. Ата -ананы (бар болса) таза торға ауыстырыңыз. Генотипке жататын жануарлар әр биопсиядан кейін торға жеке орналастырылады.

    Идентификациялау қажет жануарлардың (саны, жынысы) генотиптік сұрауда көрсетілгендерге сәйкес келетінін тексеріңіз.

    Биопсия процедурасына стерильді құралдарды дайындау

    Биопсия процедурасы үшін стерильді құралдарды пайдалану өте маңызды («Критикалық параметрлерді» қараңыз). Құлақ тескіш немесе қайшы тиісті әдіспен (мысалы, 70% этанолмен) зарарсыздандырылуы керек.

    6. Қайшы немесе құлақ тескішті 70% этанолға малынған компресспен дезинфекциялаңыз.

    7. Үлгінің ластануын болдырмау үшін тышқандар арасындағы қайшыны немесе құлаққапты тазалаңыз.

    Әр жануардан кейін аспаптардан барлық тіндерді алып тастайтындығыңызға назар аударыңыз (Ақауларды жою бөлімін қараңыз).

    Сынама алу процедурасы

    8. Үлгі салынатын түтіктің таза және дұрыс таңбаланғанын тексеріңіз.

    9. Тінтуірді бас бармақ пен сұқ саусақтың арасына қолмен бекітіңіз.

    Жануарларға араласудың кернеуін азайту үшін жұмсақ өңдеудің маңызы зор (Cinelli және т.б., 2007).

    10. Дезинфекцияланған өткір қайшыны немесе құлақ тескішті қолдана отырып, басқа үлгілерге қатысты біртекті өлшемдегі тіннің бір бөлігін дәл кесіңіз (тиісті өлшемдер: құйрықтың биопсиясы, 5 мм құлақ тесу, 2 мм саусақ ұшының қиылуы, бір дистальды фаланг. «Маңызды параметрлер» бөлімін қараңыз) ).

    11. Үлгі алынған күшікті ата-анасымен бірге таза торға салыңыз.

    12. Әрбір тінтуір үшін үлгіні сәйкес түтікке салыңыз.

    13. Түтікшені жабыңыз және биопсия түтіктің түбінде екенін тексеріңіз.

    14. Барлық тышқандардан үлгі алынғаннан кейін түтіктерді кейінірек генотиптеу үшін -20°C температурада сақтауға болады.

    2: ҮЛГІЛЕРДІ ТЕКСЕРУ ЖӘНЕ ДНҚ ЛИЗИЗІ

    ПТР үшін үлгілерді дайындау үшін қолдануға болатын көптеген балама хаттамалар бар. Олар шикі лизатты қолданудан бастап ластаушы заттар мен ингибиторларды кетіруге арналған әртүрлі тазарту протоколдарына дейін (мысалы, фенол/хлороформ немесе кремний диоксиді бағанасы бар органикалық экстракция) дейін созылады. Тазарту хаттамалары өте қымбат, өнімділігі төмен болуы мүмкін кемшіліктерге ұшырайды (Миллер, Брайант, Мадсен және Гиорсе, 1999) және оларды жұмыс станциясында енгізу өте қиын. Керісінше, тікелей лизис әдістері жылдам, оңай және арзан, бірақ ингибиторларды жоймайды, сондықтан барлық қолданбалар үшін қолданыла алмайды. Мұнда біз әдеттегі ДНҚ оқшаулау үшін протеиназа К қосылған DirectPCR лизис реагенттерін пайдалануды сипаттаймыз. Біздің қолымызда бұл тәсіл стандартты ПТР генотипін анықтау үшін ПТР сәтсіздігінің төмен деңгейін (3-кесте, сәтсіз генотиптің пайызы) және жақсы ДНҚ шығымдылығын (3-кесте, алынған ДНҚ орташа саны) қамтамасыз етеді.

    Бұл тіндердің биопсиясының үш түрі ПТР генотипін жасау үшін жеткілікті ДНҚ береді. Олардың ПТР-дағы көрсеткіштері өте ұқсас, өйткені сәтсіз генотиптеу пайызы өте ұқсас, бұл шикі сығындыларда ингибиторлардың ұқсас деңгейлері бар екенін көрсетеді. Генотиптік сәтсіздікті бағалау үшін 27070 құйрық, 8470 құлақ және 2900 саусақ биопсиясынан деректер жиналды.


    Экстракция әдісі Алынған ДНҚ-ның орташа саны b б

    Оқшауланған ДНҚ мөлшері NanoDrop ND-1000 жүйесімен спектрофотометрия көмегімен анықталды.Н. = 5).


    Сәтсіз генотиптеу пайызы c)

    Генотиптендіруге болмайтын биопсиялардың пайызы (2018 жылғы деректер), себебі нәтижелері түсіндірілмеген. Себептер көп факторлы болып табылады және калибрленбеген биопсия, тиімсіз лизис және шикі сығындыда ингибиторлардың болуын қамтиды.

    Тіндік биопсияның осы үш түрі ПТР генотипін анықтау үшін жеткілікті ДНҚ береді. Олардың ПТР-дағы көрсеткіштері өте ұқсас, өйткені сәтсіз генотиптеу пайызы өте ұқсас, бұл шикі сығындыларда ингибиторлардың ұқсас деңгейлері бар екенін көрсетеді. Генотиптік сәтсіздікті бағалау үшін 27070 құйрық, 8470 құлақ және 2900 саусақ биопсиясынан деректер жиналды.

    Оқшауланған ДНҚ мөлшері NanoDrop ND-1000 жүйесімен спектрофотометрия арқылы анықталды (Н. = 5).

    Генотиптеу мүмкін емес биопсиялардың пайызы (2018 жылғы деректер), себебі нәтижелер түсіндірілмеді. Себептер көп факторлы болып табылады және калибрленбеген биопсия, тиімсіз лизис және шикі сығындыда ингибиторлардың болуын қамтиды.

    Материалдар

    • Тінтуір тінінің үлгілері бар түтіктер (Негізгі хаттама 1)
    • DirectPCR лизис реагенті (тышқан құйрығы 102-T, Viagen)
    • 10 мг/мл протеиназа К (қажет болған жағдайда мөлдір ерітінді алу үшін 100 мл суда 1 г лиофилизденген протеиназа К ұнтағын [кат. P6556, Merck] ерітіңіз, аликвоттарды 1,5 мл түтіктерде сақтаңыз (мысалы, кат. 72.690001 -20 ° C температурада)
    • Қолмен пипеткалар
    • Центрифуга (мысалы, Beckmann Coulter Allegra 25R центрифугасы)
    • Қыздырылған су ваннасы (мысалы, GLF 1083), 85°C
    • Қыздыратын пеш (мысалы, Меммерт), 55°C
    • Жеке қорғаныс құралдары: зертханалық халат, қолғап

    Өңделетін әрбір түтікті көзбен тексеріңіз

    1. Түтікте тек бір үлгі бар екенін тексеріңіз.

    Түтіктегі биопсия үлгінің күтілетін түріне (яғни, құйрық, құлақ ойығы және т.б.) сәйкес келетінін тексеріңіз. Құлақ пен құйрықтың биопсиясын көрсететін 1 -суретті қараңыз.

    2. Тіндердің мөлшері ұсынылған мөлшерге сәйкес келетінін көзбен тексеріңіз (ұсынылған өлшемдер үшін 2 кестені қараңыз). Олай болмаса, лизис буферінің көлемін кейінірек реттеу үшін түтікті белгілеңіз.

    Буферлерді дайындаңыз

    3. Алдын ала лизис буферін дайындаңыз: реакцияға 200 мкл DirectPCR лизис реагентін (тінтуірдің құйрығы) және 6 мкл 10 мг/мл протеиназа K ерітіндісін (10 мг/мл) қосыңыз.

    Мұндай премикс 4 ° C температурада кемінде 24 сағат бойы тұрақты болады.

    Үлгіні инкубациялаңыз және лизиске салыңыз

    4. Әрбір үлгіге 0,5 см құйрық биопсиясы үшін 200 мкл премикс лизис буферін немесе 0,2 см құлақ тесігі немесе саусақ биопсиясы үшін 100 мкл қосыңыз.

    Калибрленбеген биопсия үшін алдын ала лизис буферінің көлемін пропорционалды түрде азайтыңыз немесе көбейтіңіз.

    5. Түтіктерді герметикалық түрде жабыңыз.

    6. Центрифуга түтіктері 2 мин 4000 × g, бөлме температурасы.

    7. Биопсиялардың түтіктің түбінде екенін және ерітіндімен жабылғанын тексеріңіз.

    8. Қыздыратын пеште 55°C температурада түнде инкубациялаңыз.

    9. Түтіктерді алып тастаңыз және олардың әлі де герметикалық жабылғанын тексеріңіз.

    10. Аудару арқылы қатты шайқаңыз.

    Биопсия түтікте диссоциациялануы керек, бұл лизис жұмыс істегенін көрсетеді. Егер биопсия диссоциацияланбаса (тиімсіз лизистің көрсеткіші), лизис буферін алып тастаңыз және 4-10 қадамдарды қайталаңыз (яғни, жаңа премикс буферімен үлгі инкубациясын орындаңыз).

    Протеиназаны К.

    11. Протеиназа К-ны инактивациялау үшін түтіктерді 85°C температурада қыздырылған су моншасында 45 минуттан 1 сағатқа дейін инкубациялаңыз.

    12. Центрифуга түтіктері 2 мин 4000 × g, бөлме температурасы.

    Бұл шикі сығындылар 4 ° C температурада 2 апта бойы тұрақты болады.

    3: ГЕНОТИПТЕУ СТРАТЕГИЯСЫН ЖОБАУ

    Генотиптік талдау жануарларды идентификациялаудың жылдам және үнемді әдісін қамтамасыз етуі керек. Ол сондай -ақ сенімді және берік болуы керек, өйткені ол эксперимент үшін мутантты жануарларды таңдау үшін және бірегей генетикалық ресурстың тұтастығын қамтамасыз ету үшін пайдаланылады (яғни, болашақ өндіріске арналған жануарлар, криоконсервация үшін немесе серіктестің немесе ресурстың қабылдауы үшін). ).

    Неомицинді іріктеу маркері, GFP немесе Cre сияқты көптеген трансгендік желілерде кездесетін маркерлердің айналасында генотиптік талдауларды жобалау ұсынылмайды, себебі ол сіз күтілетін мутантты сызықты қолданғаныңызды растамайды және қос трансгенді штаммдарды генотиптеуге жарамайды. құрамында жалпы трансгендік маркерлер бар. Оның орнына, ПТР талдауында әрбір мутациялы сызықтан алынған әрбір жолды және мүмкін болатын аллельді нақты анықтау ұсынылады. Мысалы, Халықаралық нокаут тышқандар консорциумы сүтқоректілер генінің функциясының каталогын жасайды (Meehan et al., 2017) және 5000 -нан астам жаңа тышқан мутантты штаммдары туралы хабарлайды. lacZ репортер кассетасы және шартты инактивация әлеуетін қамтамасыз етеді. Оңтайландырылған хаттама зерттеушілерге мүмкін болатын барлық генотиптерді және мақсатты оқиғаның тұтастығын бағалауға мүмкіндік береді (2А -сурет).

    Барлық протоколдарға қолдануға болатын ПТР жобалау ережелерін анықтау ұсынылады (Ақаулықтарды жою бөлімін қараңыз). Бұл генотиптеуді жеңілдетеді, себебі қандай да бір жоба үшін арнайы шарттар (реакция қоспасы, термоциклдық бағдарлама, агарозды гельді талдау) қажет емес, сондықтан ол бір экспериментте бірнеше мутантты сызықтарды талдауға мүмкіндік береді. Бұл стратегия әсіресе үлкен көлемде және/немесе жоғары өткізу қабілеттілігі кезінде ұсынылады.

    Материалдар

    • Биологиялық материал: шикі сынама лизатының аликвоты, ПТР теру үшін үлгі ретінде пайдаланылады
    • Тінтуірге арналған қызығушылыққа арналған праймерлер
    • Негізгі микс: мысалы, FastStart PCR Master (50 мл кат. № 4710452001, Merck)
    • Бор қышқылы (кат. 5935, Euromedex), натрий гидроксиді (кат. 06203, Мерк) және этидиум бромиді (мысық) көмегімен Чжан, Ван және Ванг (2011) сипаттағандай 20 × жылдамдықтағы буфер (SB) № EU0170, Euromedex)
    • Су, ПТР дәрежесі (праймерді сұйылту және реакцияны толтыру үшін)
    • Адъюванттар (міндетті емес): 5% (көлем/көлем) диметилсульфоксид (DMSO, мысалы, кат.D8418-100ML, Merck), 5% (көлем/көлем) глицерин (мысалы, кат. №., 15524-1L-R, Merck) немесе 0,5 мкг/мкл сиыр сарысуындағы альбумин (BSA, мысалы, кат. B9001S, New England Biolabs) соңғы реакция көлемінде
    • Агароза, ДНҚ сыныбы (мысалы, D5, D5, Euromedex)
    • Үйде қолданылатын бояғыштар қоры (3 мл глицерин мен 8 мг бромофенолды көк ерітіндіде 7 мл сағ.2О)
    • ДНҚ молекулалық салмағының маркері: мысалы, GeneRuler 50-bp DNA Ladder (кат. № SM0372, Thermo Fisher Scientific)
    • Жеткізушілер ұсынған буферлері бар тиісті шектеу ферменттері
    • 0,75 мл бұрандалы қақпақ түтіктері (мысалы, матрицалық түтіктер, бос кат. № 446015, Dutscher) және қақпақтар (мысалы, Sepra Seal Cap Mats cat. № 446045, Dutscher)
    • 1,5 мл микротүтіктер (мысалы, хат. № 72.690001, Сарстедт)
    • Дәйектілікті талдауға арналған бағдарламалық жасақтамасы бар және коммерциялық (мысалы, Vector NTI, SnapGene, Geneious) немесе тегін (мысалы, U-GENE, BioEdit, SeaView) праймер дизайнына арналған құралдар бар компьютер
    • 4 биіктігі FrameStar 96 ұңғымалы пластиналар (кат. № 44760, Дутчер) немесе 0,2 мл ПТР түтіктері
    • Микроцентрифуга түтіктеріне арналған центрифуга (кат. № 016000, Dutscher), қосымша
    • ПТР аппараты (мысалы, Эппендорф термиялық циклі)
    • Агарозды гельді электрофорезге арналған жабдық: электрофорезге арналған резервуар, гель құйылатын тірек, ұңғымаларды қалыптастыруға арналған тарақтар (үлгілер тұндырылатын жерде)
    • Қозу көзі ретінде ультракүлгін сәулені пайдаланатын түсіру кескіні (мысалы, U:Genius, Syngene)
    • Жеке қорғаныс құралдары: зертханалық халат, қолғап, қорғаныс көзілдірігі
    • Қолмен пипеткалар

    Мақсатты және жабайы түрдегі реттілік карталарын іздеңіз

    1. Тінтуір провайдерінен жабайы типті және мутант аллельдерінің тізбегін алыңыз.

    ПТР генотиптеудің тиімді стратегиясын құру үшін, кем дегенде, мутантты аллельдің ДНҚ тізбегіне қол жеткізу маңызды. Бұл ақпаратсыз нақты дизайнды жасау мүмкін емес. Осылайша, егер сіз провайдерден рекомбинантты дәйектілікті ала алмасаңыз, сәйкес жарияланған мақалада бар ақпаратты қолдана отырып, теориялық реттілікті өзіңіз құруға кеңес береміз. Егер рекомбинантты тізбекті жарияланған қағаздан жасау мүмкін болмаса, Критикалық параметрлерде берілген қосымша ұсыныстарды қараңыз.

    2. Сізде бар жабайы түрдегі тізбектің соңғы шығарылымға сәйкес келетінін тексеріңіз Бұлшық ет бұлшықеті NCBI -де C57BL/6J анықтамалық геномдық жинақ (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome?term=mus%20musculus) немесе Ensembl (https://www.ensembl.org/Mus_musculus/). Егер олай болмаса, сіз жабайы түрдегі реттілікті мұқият тексеруіңіз керек.

    Генді қайта белгілеу сіздің ген құрылымыңызды өзгертуі мүмкін. C57BL/6J-тен басқа фон да https://www.sanger.ac.uk/science/data/mouse-genomes-project сайтында жабайы типтегі сілтемелер ретінде қолжетімді.

    3. Генотипке қажет аллельдердің әрқайсысы үшін барлық реттілік карталарын құру үшін геномдық реттілікті талдау бағдарламалық жасақтамасын (мысалы, коммерциялық Vector NTI, SnapGene, Geneious немесе тегін U-GENE, BioEdit немесе SeaView бағдарламалық жасақтамасы) қолданыңыз.

    Бұл бағдарламалық пакеттер ДНҚ манипуляцияларын жоспарлауға және модельдеуге, ашық оқу жақтауларын және праймерді байланыстыру орындарын визуализациялауға және басқа зерттеушілермен аннотацияланған реттілік файлдарын ортақ пайдалануға мүмкіндік береді.

    Генотипті праймерлердің дизайны

    Праймерлер мақсатты реттіліктерге сай болуы керек. Праймерлерді әр түрлі құралдарды (геномдық реттілікті талдау бағдарламалық жасақтамасы) немесе тіпті төмендегі ережелерді сақтай отырып, көзбен жобалауға болады.

    3′ ұшындағы G немесе C негіздері ДНҚ полимеразасының бастапқы байланысу орны ретінде қызмет етеді.

    Салыстырмалы балқу температурасы (Т.м) екі праймер үшін.

    Салыстырмалы Т.м (бір -біріне 5 ° C шегінде) праймер мен матрица арасындағы сәйкестікке қол жеткізілгеннен кейін будандардың тұрақтылығын анықтайды.

    Тиісті геномдық ДНҚ тізбегіне тән.

    Әрбір праймердің тек Mus musculus геномындағы NCBI Nucleotide blastn бар геномдық ДНҚ-ға қатысты ерекшелігін тексеріңіз (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Сізге алгоритмнің параметрлерін немесе бағдарламаны таңдаудың қажеті жоқ (мысалы, мегабластты қолданыңыз).

    Праймер жиынтығының ерекшелігі праймерлердің тек біз анықтағымыз келетін реттілікке немесе қосымша реттіліктерге ғана байланыстырылатындығына байланысты.

    ЕСКЕРТУ: ПТР спецификалық емес күшейту үшін праймерлер мен геномдық реттілік арасында 100% гомология болуы міндетті емес. Бірнеше сәйкес келмейтін немесе спецификалық емес 5 'ұштары бар праймерлер спецификалық емес күшейтулерді тудыруы мүмкін.

    Ішкі қайталама немесе праймер-праймер жасыту құрылымдары жоқ.

    Ішкі қайталама құрылымды дуплексті қалыптастыруды талдау үшін праймерді жобалау бағдарламалық құралын (мысалы, Sigma-Oldrich компаниясынан OligoArchitect) пайдалану арқылы тексеруге болады.

    Бастапқы жұптардың ішкі бүктелуін болдырмау үшін маңызды ішкі қосалқы құрылым болмауы керек. Праймерлік жұптағы гомологиядан туындаған праймер-праймерді күйдіру праймер димерлерін жасайды және күшейту процесін бұзады, сондықтан оны болдырмау керек.

    4b. Ампликон құрылымы: ампликон өлшемі 100-500 bp.

    100% 500 ампликон өлшемі ПТР фрагменттерін агарозагельді гельдің 2% электрофорезін қолдану арқылы визуализациялау үшін оңтайлы болып табылады. 100 нүктеден төмен ПТР фрагменттерін ажырату және елестету қиын. 500 бит жоғары, ПТР тиімділігі төмен, өйткені шикі сығынды әдетте тазартылған ДНҚ-ға қарағанда нашарлайды. Сонымен қатар, классикалық Taq полимераза өлшемі >1 кб ампликондарды жақсы өңдемейді.

    Егер ампликон тізбегінде >60% GC болса, ПТР орнатуды адъюванттармен және онсыз (Ақаулықтарды жою бөлімінде сипатталғандай) немесе тіпті арнайы GC-қа бай полимеразамен (жеткізушілер GC сияқты арнайы қажеттіліктерге арналған арнайы ДНҚ полимераза массивін қамтамасыз етеді) орындаңыз. -бай күшейту).

    Мүмкін болса, күшейтілген дәйектілікпен динуклеотидтердің қайталануын (мысалы, GCGC немесе ATAT) және бір негізді жүгірістерді (мысалы, AAA немесе CCC) болдырмаңыз, өйткені олар шаш қыстырғыштарының құрылымын тудыруы мүмкін.

    5. Жабайы түрдегі немесе мутант(тар) аллельдеріндегі ең жақсы праймер орнын таңдаңыз.

    Ең дұрысы, праймердің орналасуы оңтайландырылған, сондықтан праймерді әр түрлі ПТР талдаулары үшін бір праймер жұбы ретінде пайдалануға болады. Бұл стратегияның көмегімен қарапайым праймерлерді әр түрлі, бірегей праймерлермен біріктіру барлық мүмкін болатын аллельдерді табуға мүмкіндік береді. 2-суретте Халықаралық тінтуірдің фенотиптік консорциумы (IMPC https://www.mousephenotype.org Meehan және т.б., 2017) жасаған генотиптеу мутанттық үлгілері үшін праймер дизайнын оңтайландырудың мысалы келтірілген. Праймерлер жабайы типті аллель мен мутантты аллель (лер) арасында айырмашылығы бар ДНҚ аймағындағы жабайы типтегі тізбекте орналасқан. Бұл тәсілмен мақсатты ген үшін кез келген тиісті аллель комбинациясын генотиптеу үшін тек төрт түрлі праймер қажет. Мутанттық қатарда үш қосымша праймер құрастырылған. Бұл үш праймерді кез келген нокаутқа ұшыраған IMPC мутантты моделі үшін қолдануға болады.

    Анықталатын аллельге екі тәуелсіз праймер жинағын жобалауды ұсынамыз, бұл тіпті бір праймер жинағы жұмыс істемесе де, тінтуірдің генотипін анықтауға мүмкіндік береді.

    6. Қосымша: Бір нуклеотидті полиморфизм (SNP) мутациялары бар мутантты аллельдерді анықтау.

    Егер сіздің мутантты аллеліңіз жабайы түрдегі аллеліңізден бір немесе бірнеше нүктелік мутациямен ерекшеленсе, жабайы типті және SNP мутантты ПТР ампликонының өлшемі бірдей болады. Бұл, әсіресе, CRISPR/Cas9 геномын өңдеу немесе ENU мутагенезі мутант линиясын құру үшін қолданылған жағдайда болады (Birling, Herault және т.б., 2017). Бұл жағдайда ПТР өнімдерін Sanger секвенциясы (Dorit, Ohara, Hwang, Kim, & Blackshaw, 2001) немесе қолданылған белгілі бір SNP анықтау әдісі (мысалы, TaqMan, пиросеквенирлеу және т.

    ПТР өнімінің секвенциясы қымбат және көп уақытты қажет ететіндіктен, әсіресе көптеген мутанттарды тексеру қажет болса, гендік ақуыз тізбегін (үшінші нуклеотидтік триплет) өзгертпейтін шектеу аймағын енгізу үшін CRISPR/Cas9 тінтуір үлгісін жасау кезінде пайдалы болуы мүмкін. кодталған амин қышқылын өзгертпейтін синонимдік алмастыру). Содан кейін бұл шектеу алаңын ПТР өнімінің диагностикалық дайджесті үшін пайдалануға болады (25-қадам).

    7. Әрбір ПТР ампликоны 2% агарозды гельде оңай бөлінетін өлшемді шығаратынын тексеріңіз.

    Кейбір праймер жұптары әртүрлі аллельдерді анықтау үшін пайдаланылуы мүмкін (2В-суретті қараңыз), бірақ әрбір ампликонды дұрыс ажырату үшін ПТР ампликонының өлшемі кемінде 50 бит/п айырмашылығы болуы керек.

    8. Кез келген провайдерден праймерлерге тапсырыс беріңіз.

    Стандартты ПТР жоғары сапалы праймер синтезін қажет етпейді. Сіз кез келген провайдерді таңдап, тұзсыздандырылған тазартуды қолдана аласыз.

    9. Праймерлерді ПТР-дәрежелі Н-де 100 мкм дейін сұйылтыңыз2O және -20°C температурада сақтаңыз.

    Полимеразды тізбекті реакцияны орнату

    Төменде сипатталған ПТР стратегиясын үштен бес үлгіге дейін сынау керек. Ең дұрысы, ПТР сынағы үшін мутантты жануарлардан алынған биопсия қолданылады. Егер биопсия болмаса, эмбриональды бағаналы жасушаның ДНҚ шикі сығындысында сұйылтылған, шикі сығындыда сұйылтылған векторлы вектор немесе химера биопсиясы қолданылуы мүмкін. Жабайы жануарлардан алынған тіндердің биопсиясы әрқашан бақылау ретінде қосылуы керек. Сол сияқты, үлгісі жоқ ПТР реакциялары ПТР ластануының жоқтығын растау үшін теріс (немесе су) бақылау ретінде әрекет етеді.

    10. Биологиялық үлгілері бар түтіктерді 4000 × 2 минут ішінде центрифугалау g, бөлме температурасы, шөгінді қалдықтарына дейін.

    11. ПТР реакцияларын төменде сипатталғандай дайындаңыз, немесе бірнеше үлгілер үшін стерильді 1,5 мл түтікке немесе үлкен үлгі нөмірлері үшін 96 ұңғымалы табаққа салыңыз.

    Бұл хаттамада қолданылатын фермент ыстық басталатын полимераза болғандықтан, ПТР реакция қоспасын бөлме температурасында (18°C-25°C) дайындауға болады. Алайда, егер кез келген реагенттер кейінірек қолдану үшін мұздатылған болса (мысалы, реакция қоспасы немесе праймерлер), түтіктерді мұзда баяу еріту керек.

    Негізгі қоспаға қосылған әрбір реагенттің мөлшері көлемдік реакциялардың жалпы санына және ең жақын бүтін реакцияға дейін дөңгелектенген 10% (тамшуырларды тасымалдаудың жоғалуын қамтамасыз ету үшін) баламалы.

    Түтікке немесе ұңғымаға 14 мкл негізгі қоспаны (FastStart PCR Master, Roche) қосыңыз.

    FastStart ПТР шебері сияқты ферменттің, dNTP мен реагенттердің алдын ала дайындалған қоспасын қолдану қателіктер мен ластану қаупін азайтады және ПТР дайындау уақытын қысқартады.

    12. Әр 0,2 мл ПТР түтігіне немесе 96 ұңғымалы пластинаның әрбір ұңғымасына 3 мкл шикі сығындысын, сосын 22 мкл ПТР реакция қоспасын қосыңыз.

    13. Микро тамшуырдың поршенін екі-үш рет жоғары-төмен ақырын айдау арқылы мұқият араластырыңыз.

    14. Теріс бақылауды дайындаңыз: ДНҚ үлгісінен басқа барлық реагенттерді қосыңыз (жетіспейтін көлемді өтеу үшін суды көбейтіңіз).

    15. Түтіктерді немесе пластинаны жабыңыз.

    16. Реакция қоспасын түтіктің немесе табақтың түбіне түсетін етіп қысқаша центрифугалаңыз.

    17. ПТР түтіктерін немесе пластиналарды термиялық циклерге салыңыз және 4-кестеде сипатталған параметрлерге сәйкес ПТР бағдарламасын бастаңыз.

    Барлық мутант үлгілеріне қолданылатын стандартты шарттарды әзірлеу жобаға қарамастан барлық үлгілерді бірге өңдеуге мүмкіндік береді.

    Бұл велосипед шарттары біздің хаттамалармен жақсы жұмыс істейді (Негізгі хаттамалар 3 және 4), бірақ егер басқа шарттар (мысалы, басқа Taq полимеразасы) қолданылса, өзгертуді талап етуі мүмкін.

    Температура Уақыт Циклдар саны
    95 ° C 4 мин 1 94 ° C 30 с 62°C 30 с 34 72°C 1 мин 72°C 7 мин 1 20 ° C 5 мин 1

    Бұл велосипед шарттары біздің хаттамалармен жақсы жұмыс істейді (Негізгі хаттамалар 3 және 4), бірақ егер басқа шарттар (мысалы, басқа Taq полимеразасы) қолданылса, өзгертуді талап етуі мүмкін.

    Суретті алу және талдау

    ПТР ампликондары 2% агарозды гель көмегімен бөлінеді және нәтижелері цифрлық камераның көмегімен бейнеленеді.

    18. Гельді дайындау және іске қосу үшін 20 × концентрацияланған СБ қорын 1 × дейін сұйылтыңыз.

    Бұл буфер гельді қызып кетпей және балқытпай жоғары кернеуде ДНҚ гелін іске қосуға мүмкіндік береді.

    19. Құрамында 1 × СБ бар 2% (д/в) гель агарозасын дайындаңыз. Полимерлеу алдында қолғап пен қауіпсіздік көзілдірігін киіп, ерітіндідегі 600 мл агароз геліне 15 мкл 10 мг/мл этидий бромиді қоспасын қосыңыз. Көпіршіктер жасамай баяу шайқаңыз.

    Агарозаның концентрациясы неғұрлым көп болса, гель матрицасында тесіктер азаяды және матрицадан ДНҚ -ның үлкен сызықты молекулаларының қозғалуы қиындайды. Агароза концентрациясын өзгерту гельдің елеуіш матрицасының өлшемін өзгертеді. 2% гель 100-ден 500-ге дейінгі ПТР өнімдеріне жақсы бейімделген.

    20. ПТР үлгілерін көші -қонға дайындау үшін 15 мкл ПТР реакциясына 5 мкл үйдегі бояғышты қосыңыз.

    21. Үлгілерді гельдің ұңғымаларына мұқият жүктеңіз.

    Ампликондардың мөлшерін анықтау үшін қатардың әр шетіне коммерциялық түрде қол жетімді ДНҚ молекулалық салмақ маркері қосылады (ұңғымаға 3,5 мкл).

    22. Гельді 280 В (400 мА, 100 Вт) кернеуде, бояу сызығы ∼80% төмен түсетінге дейін жүргізіңіз.

    Әдеттегі жұмыс уақыты - гельдің мөлшеріне байланысты ∼45 мин.

    23. ДНҚ фрагменттерін визуализациялау үшін сандық камераны (U:Genius) пайдаланыңыз.

    Егер ПТР өнімі болса, этидиум бромиді ДНҚ тізбектерінің негіздері арасында интеркалациялайды, бұл жолақтарды ультракүлгін сәулелендіргішпен көруге мүмкіндік береді.

    Әрқашан алынған кескінді сақтап, мұрағаттаңыз. Мысалы, сізге генотиптік қателерді тексеру немесе осы суретті жариялау үшін беру қажет болуы мүмкін.

    Талдау валидациясы

    24. Әрбір ампликон жолағы әрбір талдау үшін күтілетін өлшемге сәйкес келетінін тексеріңіз. Қосымша жолақтардың жоқтығын тексеріңіз.

    Егер иә болса, ПТР параметрі расталған, ал генотиптеу үшін праймер жұптарын таңдау керек.

    Сіз жасаған соңғы хаттаманы қазір жануарларыңыздың генотипін жасау үшін қолдануға болады.

    Олай болмаған жағдайда, жаңа праймер жинағын сынау керек.

    ПТР орнатуға арналған қосымша шешімдер үшін Критикалық параметрлер бөлімін қараңыз.

    Диагностикалық дайджест арқылы SNP мутациясын анықтауға арналған қосымша қадамдар

    Жабайы типтегі және мутантты ПТР ампликонының өлшемі бірдей болса (6-қадамды қараңыз), екі ампликонды саралау үшін шектеу ферменті бар ПТР өнімін бөлуге болады.

    25. 18-23-қадамдарда егжей-тегжейлі сипатталғандай, бірақ 20-қадамда тек 5 мкл ПТР реакциясын қолдана отырып, электрофорез арқылы ПТР кейін ДНҚ ампликондарының болуын тексеріңіз.

    Компоненттерді келесі ретпен қосыңыз: ферментпен бірге жеткізілетін 10 × буферден 2,5 мкл, 1 мкл рестрикция ферменті және 11,5 мкл су.

    Берілген ас қорыту үшін пайдаланатын шектеу ферментінің мөлшері кескіңіз келетін ДНҚ мөлшеріне байланысты болады. Анықтау бойынша, бір фермент бірлігі 1 мкг ДНҚ-ны 50 мкл реакцияда 1 сағатта кеседі. Реакциялар жиі 0,5-1 мкл ферментпен жүргізіледі.

    27. Түтіктерді ас қорыту температурасында (әдетте 37 ° C) 1 сағат бойы инкубациялаңыз.

    Инкубация уақыты 45 минуттан түнге дейін болуы мүмкін. Диагностика үшін 1-2 сағат жеткілікті.

    28. 18-23-қадамдарда сипатталғандай агарозды гельде миграция арқылы қорытылған ПТР өнімдерін елестетіңіз.

    4: жоғары деңгейдегі генотипке көшу

    Барлық классикалық генотиптік әдістер салыстырмалы түрде төмен өткізу қабілетіне ие. Жұмыс станциясын пайдалану арқылы генотиптеуді автоматтандыру көптеген адамдарда көптеген генетикалық локустарда көптеген генетикалық модификацияларды параллельді генотиптеуге мүмкіндік береді. Өткізу қабілетін жақсартумен қатар, автоматтандыру тамшуырлау қадамдарын шектеу және түтіктерді ауыстыруды болдырмау арқылы ластану мен қателік ықтималдығын азайтады. Кәдімгі соңғы нүктелік ПТР әдісі автоматтандыруға оңай бейімделген және шын мәнінде жоғары өнімді скрининг үшін тиімді, дәлелденген және қолжетімді әдіс болып табылады. Сонымен қатар, ПТР талдауларын жұмыс станциясындағы 384 ұңғымалы пластинкаларда миниатюризациялауға болады, бұл жануарлардың генотипін жасау құнын төмендетеді.

    Жұмыс станцияларын, үлгілерді және байланысты деректерді тиімді басқару үшін зертханалық ақпаратты басқару жүйесін (LIMS) әзірлеу де маңызды (Cурет 3 Критикалық параметрлер).

    Материалдар

    • Биологиялық материал: лизаттардың шикі үлгісі 96 түтікшелі сөрелерде
    • Тінтуірге арналған қызығушылыққа арналған праймерлер
    • Су, ПТР дәрежесі (праймерді сұйылту және реакцияны толтыру үшін)
    • FastStart PCR Master (50 мл кот. № 4710452001, Merck)
    • Адъювант: 5% (көлем/көлем) DMSO (кат. № D8418-100ML, Merck), 5% (көлемдік/в) глицерин (кат. № 15524-1L-R, Merck), немесе 0,5 мкг/мкл BSA (кат. № B9001S, New England Biolabs)
    • Жұмыс станциясы немесе сұйықтық өңдеуші (мысалы, Freedom EVO200, Tecan немесе STARplus, Hamilton Microlab)
    • 4titude FrameStar 384 шұңқырлы ПТР тақталары (қат. № 384 44751, 4titude)
    • Қақпақтары бар 8 жолақты ПТР түтіктері (мысалы, № 016000, Dutscher)
    • 15 мл конустық түтік (мысалы, № 352097, Корнинг)
    • Біріктірілген центрифуга (мысалы, Sias)
    • Біріктірілген жылу тығыздағышы (мысалы, PlateLoc, Agilent
    • Тығыздалатын пленка мөлдір тығыздағыш (қат. № 4Ti-0542, 4titude)
    • Моторлы қыздырылған қақпағы бар ПТР термоциклдері (мысалы, T-robot, Biometra)
    • Қолмен пипеткалар

    Генотиптеу стратегиясын жобалау және талдаудың валидациясы

    1. Өнімділігі жоғары генотиптік стратегияны құру үшін 3-негізгі хаттаманың 1-9 қадамдарын орындаңыз.

    Біз сондай-ақ табысты жоғары өнімді автоматтандыруды қамтамасыз ету үшін Critical Parameters (жоғары өнімділік жұмыс үрдісі үшін генотиптеу стратегиясын жобалау бойынша маңызды ұсыныстар туралы бөлім) берілген ұсыныстарды орындауға кеңес береміз.

    2. Талдауды тексеру үшін негізгі хаттаманың 10-24 қадамдарын орындаңыз. 384 ұңғымалы пластиналар үшін 5-кестеде сипатталған шарттарды қолданыңыз.

    Жоғары өнімді генотиптеу стратегиясының валидациясы 384 ұңғымалық пластина пішімінде жасалуы керек, өйткені 96 ұңғымалық пластиналардың ПТР шарттары 384 ұңғымада әрқашан пропорционалды түрде қолданыла бермейді.

    Реагент 384 шұңқырлы тақтаға арналған көлем 96 шұңқырлы тақтаға арналған көлем
    FastStart PCR Master (Roche) 7,5 мл 14 мл
    Шикі экстракт 1,5 мкл 3 мкл
    5 ′ праймер (100 мм) 0,06 мкл 0,2 мкл
    3 ′ праймер (100 мм) 0,06 мкл 0,2 мкл
    Стерильді Х2О 15 мкл дейін 25 мкл дейін

    ПТР автоматтандырылған жүгіруді дайындаңыз

    Біз мұнда біздің екі жұмыс станциясында (Tecan Freedom EVO 200/8 және Hamilton Microlab STARplus) қолданылатын хаттаманы ұсынамыз. Бұл хаттама сіздің жұмыс станцияңыздың ерекшеліктеріне сәйкес әр қондырғыға бейімделуі керек.

    3. Жұмыс станциясын, байланысты компьютерді және барлық біріктірілген құралдарды қосыңыз.

    4. Жұмыс станциясын басқаратын бағдарламалық құралды ашыңыз (мысалы, Freedom EVOware for Freedom EVO 200/8 Tecan немесе STARplus Hamilton үшін VENUS бағдарламалық құралы).

    5. Құралды инициализациялау.

    Инициализация реттілігі робот қолының қозғалысын калибрлеу үшін, яғни x, y және z осьтері бойынша сілтеме (нөл) позицияларын анықтау үшін қолданылады.

    Бұл функция сұйылтқыштар мен түтікшені шаю (жүйелік сұйықтықпен толтыру) және тамшуыр тұтқасындағы бекітілген болат жууға болатын инелерді (немесе ұштарды) жуу үшін жуу станциясын пайдаланады.

    7. Жұмыс тізімін жүктеңіз немесе жасаңыз.

    Жұмыс тізімі - бұл құралға не және қай жерде тамшуыр керек екенін көрсететін пәрмендерден тұратын файл. Файлда бастапқы және тағайындалған орындар және тамшуырланатын көлемдер туралы ақпарат бар.

    1. Үлгіні басқару үшін LIMS әзірлеген болсаңыз (Критикалық параметрлерді қараңыз), жұмыс станциясын басқаратын бағдарламалық құралды пайдаланып жұмыс тізімін жүктеңіз.
    2. Олай болмаса, жұмыс станциясының провайдері көрсеткендей жұмыс тізімін жасаңыз.

    Реагенттерді, түтіктерді және пластиналарды роботтың жұмыс үстеліне салыңыз

    Жұмыс үстелінің визуализациясы (жұмыс үстелінің терезелерінде) 7 -қадамнан кейінгі жұмыс станциясын басқаратын бағдарламалық жасақтама арқылы жасалады. Бұл терезелер құралдың жұмыс бетін (палубасын) білдіреді. Барлық реагенттерді, түтіктерді және пластиналарды орналастыру үшін экрандағы нұсқауларды орындаңыз.

    8.Құрамында шикі сығындысы бар барлық 96 түтік сөрелерін жұмыс үстелінің терезелері көрсеткендей жұмыс станциясына қойыңыз.

    9. Праймер жинағын жұмыс үстелінің терезелерінде сипатталғандай орналастырыңыз.

    Праймер жинақтарын 8 түтік жолағында дайындауды ұсынамыз (Критикалық параметрлерді қараңыз).

    1. Мутантты сызыққа 12-24 түтік жолағын дайындаңыз және оларды -20 ° C температурада сақтаңыз.
      1. Әр микротүтікке 100 мм -ден 6,5 мкл алға және кері праймерді қосыңыз.
      2. Әр микротүтікке 187 мкл стерильді сумен толықтырыңыз.
      3. Бұл қадамды мутантты сызықтардың генотипін жасау үшін қолданылатын барлық ПТР жиынтығы үшін қайталаңыз (тінтуірдің бір жолына сегіз ПТР дейін).
        Жүгіру кезінде түзілетін әрбір 384 ұңғымалы ПТР пластинасына 3,3 мл FastStart ПТР шебері мен 1,7 мл стерильді суды 15 мл конустық түтікке қосыңыз. Пипеткалық жоғалтуды жою үшін қосымша 15% реакция қоспасы қосылады.

      15 мл түтікті жұмыс үстелінің терезелерінде көрсетілгендей салыңыз.

      Реакция қоспасының көлемі сынамалардың жалпы санына, бір үлгіде жүргізілетін ПТР күшейтулерінің санына және реагенттердің өлген көлемдеріне негізделген.

      11. 384 ұңғымалы ПТР пластиналарын көрсетілген орындарға қойыңыз.

      Автоматтандырылған жұмыс станциясында ПТР орындауын орнатыңыз

      12. Тиісті пипетинг сценарийін іске қосыңыз (мысалы, ПТР әдісі 384-ұңғымалы плиталар мен пломбалау әдісі).

      13. Жұмыс станциясынан шықпас бұрын тамшуыр процесінің дұрыс басталғанын көзбен тексеріңіз.

      1,5 мкл тиісті үлгі шикі сығындысы.

      Бұл тамшуырлау тәртібі (реакция қоспасы, содан кейін праймерлер мен үлгі шикі сығындылары) тамшуырлау қадамдары мен ұзақтығын, зарарсыздандыру қадамдарын (ағарту), шаюды және ластану қаупін азайту үшін оңтайландырылған.

      Орындаудан кейінгі процесс

      14. Әрбір 384 шұңқырлы пластина автоматты түрде жабылады, содан кейін центрифугаланады (4000 × 2 мин. g) және термоциклге ұстағыштың қолымен орналастырылады. Сұйықтық өңдеуші бағдарламалық қамтамасыз ету жылу циклін басқарады және термиялық цикл бағдарламасын бастайды (бағдарлама параметрлері 4 -кестеде сипатталған).

      15. Жүгіру аяқталғаннан кейін пластинаның барлық ұңғымалары бірдей және күтілетін көлемге ие екендігін тексеру үшін визуалды тексеру жүргізуге болады.

      Суретті алу және талдау

      16. 3-негізгі хаттаманың 18-23 қадамдарын орындаңыз.

      Залалсыздандыру

      Біз әр аптаның соңында 10% сұйылтылған ағартқыш ерітіндісін тамызу арқылы немесе ультракүлгін шамды қолдану арқылы құралды мұқият зарарсыздандыруды ұсынамыз.


      Эксперименттік процедура

      Диджест және тазарту векторы:

      Олиголарыңыздың келуін күтіп тұрғанда, EcoRI және SalI көмегімен 1 мкг вектордың шектеу дайджестін жүргізіңіз.

      Агарозды гельді іске қосыңыз және сіздің векторлық ДНҚ бар жолақты кесіңіз

      Гель сатылымда бар жинақты немесе стандартты протоколды пайдаланып ДНҚ-ны агарозадан тазартады.

      Аналық олиго:

      Олигостарды күйдіру буферінде (10мМ Трис, рН7.5-8.0, 50мМ NaCL, 1мМ EDTA) қайта суспензиялап, эквимолярлық концентрацияларда араластыру керек. 50 мкл жалпы көлемде әрқайсысына 2 мкг араластыруды ұсынамыз - қажет болса, 50 мкл-ге жету үшін қосымша күйдіру буферін қосыңыз. Тиімді күйдіруге екі әдіспен қол жеткізуге болады:

      Аралас олиголарды 1,5 мл микрофуга түтігіне салыңыз.

      Түтікті 90-95 ° C ыстық блокқа салып, 3-5 минутқа қалдырыңыз.

      Бөлме температурасына дейін баяу салқындатуға мүмкіндік беретін ыстық блокты жылу көзінен алыңыз (блокты өшіріңіз немесе орындыққа жылжытыңыз)

      ПТР түтігіне аралас олиго салыңыз.

      Түтікшені 95°C температурада 2 минутқа бастауға бағдарламаланған термоциклге салыңыз.

      Содан кейін біртіндеп 45 минут ішінде 25 ° C дейін суытыңыз.

      Лига:

      5 мкл күйдірілген олигоны 45 мкл нуклеазасыз сумен сұйылтыңыз және концентрациясын мөлшерлеңіз (шамамен 8 нг/мкл болуы керек).

      Күйдірілген олиголарды 4: 3 пен 1: 6 арасындағы молярлық қатынаста кесілген вектормен араластырыңыз (вектор: кірістіру) стандартты лигация реакциясында (мысалы, ұзындығы 50 а.п болатын күйдірілген олиго кірістіруді 5кб векторға байланыстыру үшін 100нг 0,75-6 нг күйдірілген олигосы бар вектор).

      2-3 мкл сүйікті құзыретті бактериялар мен табаққа айналдырыңыз.

      Кішігірім дайындау үшін бірнеше колония таңдап, кірістіруді реттілікпен тексеріңіз.