Ақпарат

Белоктардың айналу радиусының қандай айырмашылығын маңызды деп санауға болады?

Белоктардың айналу радиусының қандай айырмашылығын маңызды деп санауға болады?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Белоктардың молекулярлық динамикасын модельдеуде ақуыздың жинақылығын бағалау үшін жиі айналу радиусы қолданылады.
Гирацияның екі белок радиусын салыстыру кезінде қандай айырмашылықты маңызды 1 ангстром, 5 ангстром, 10 ангстром деп санауға болады? Маңызды мағына: иә, бұл неғұрлым ықшам немесе жоқ, ол ықшам емес. Мен іздедім, бірақ осыған байланысты сілтеме таба алмадым.


Ақуыздардың гирация радиусындағы қандай айырмашылығын маңызды деп санауға болады? - Биология

Төңкерілген папиллома (ІР) - беттік эпителий жасушалары төмен қарай тірек ұлпасына дейін өсетін ісіктің түрі. Қуық, бүйрек жамбасы, несепағар, уретра, мұрын және параназальды синус - бұл IP пайда болуының барлық мүмкін аймақтары [1]. Мұрынның немесе мұрын қуысының шырышты қабаты ИП көтергенде мұрынның бітелуі немесе бет ауруы немесе бас ауруы. Тыныс алу мембранасынан шығатын IP жақсы эпителиалды ісікке жататынына қарамастан, жергілікті инвазивтілік, қайталану жылдамдығының жоғарылауы және қатерлі трансформация емдеуді қиындатады [3]. Қатерлі трансформация жылдамдығы 5 � % және олардың көпшілігі қабыршақты жасушалы карциномамен синхронды түрде өтеді [4]. ПКНА (жасушалық ядролық антигеннің көбеюі) жасуша циклі кезінде ДНҚ синтезінің фазасында жасуша ядроларында антигенді білдіру қызметін атқарады және қатерлі ісік ауруының болжамын қарастырады, бірақ IP -пен байланыс әлі де даулы болып табылады [5].

Циклин мен циклинге тәуелді киназа (ЦДК) көбею кезінде жасуша циклінде маңызды рөл атқарады және жасушалық циклдің әр түрлі фазаларына әсер етеді [6 – 9]. CDK1 жасуша пролиферациясы мен қатерлі трансформация факторының өте маңызды бастамашысы болып табылады [10]. Керісінше, p21, P27 және CDK ингибиторлары CDK-ларды шектейді және жасушалық циклді тоқтатады [8]. p21 жасушалардың S фазасына енуін тежейтін G1 жасуша фазасының CDK тежегіші болып табылады. p27 сонымен қатар CDK-ге қосылып, p21 ретінде CDKI ретінде әрекет ете алады. P27 жасуша пролиферациясы мен апоптозға әсер ететін циклин E-CDK2, циклин А-CDK2 және циклин D1-CDK4 кешендерімен әрекеттеседі [6, 7].

MIB-1 моноклональды антиденесімен анықталған Ki-67 антигенінің пролиферация маркері G0-ден басқа G1, S, G2 және M жасушаларының барлық фазаларында көрініс табады [8]. Ki-67 өрнегі ісіктің мінез-құлқымен, ісіктің патологиялық дәрежесімен және әр түрлі карциномаларда ерте қайталануымен байланысты болды [11 – 15].

Қатерлі ісіктермен трансформацияланған немесе синхронды IP-ге қатысты біз сонымен қатар p16, p53, Ki-67 және PLUNC (таңдай, өкпе және мұрын эпителийінің клон ақуызы) IHC зерттеуін жасаймыз. p16 - G1-ден S жасушалық фазасына дейін баяулататын және қатерлі трансформацияның алдын алатын ісіктерді басатын ақуыз [8]. PLUNC - мұрын -жұтқыншақ қатерлі ісігіне қарсы ісікке қарсы әсері бар туа біткен иммундық материал, бірақ оның синоназальды IP -ге қатыстылығы анықталған жоқ [16].

PCNA, p53, p21, p27 және Ki-67 сауалнамалары олардың ісік көлеміне және синоназальды ИП емдеу нәтижесіне байланысты екенін анықтау үшін жасалды [8].

Бұл зерттеудің мақсаты-p53, p21, p27 жасуша циклінің реттегіштерінің, Ki-67, p16, PCNA пролиферация маркерінің және PLUNC туа біткен иммундық материалдың синоназальды АЖ-нің қайталануы мен қатерлі трансформациясындағы рөлін зерттеу. Сондай-ақ, біз Ki-67, PCNA және p27 ықтимал болжамды факторлары CDK-ге есептеу модельдеу арқылы сәйкес келетін-келмейтінін зерттедік.

Қытай медициналық университеті ауруханасының бөлімшесінен 2000 жылдың қаңтарынан 2010 жылдың маусымына дейін синоназальды ИП-ның 60 жағдайы және скамозды жасушалық карциноманың трансформациясы бар ИП-ның 10 жағдайы ретроспективті түрде медициналық жазбалардан жиналды және қаралды. 10 % формалинде бекітілген және парафинде дайындалған барлық тіндер IHC зерттеулеріне авидин-биотин-пероксидаза кешенді әдісімен қолданылды. Тінтуірдің моноклонды антиденелері (mAb), анти-p16 (Neomarkers, DCS-50, 200  mg/L), anti-p21 (Neomarkers, MS 387-P, 200  mg/L), anti-p27 (Neomarkers, MS 256) -P, 200 mg/L), анти-p53 (Neomarkers, RM 9105-S), Ki-67 (Neomarkers RM 9106-S) PCNA және PLUNC (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) пайдаланылды. стрептавидин-биотин пероксидаза әдісі арқылы иммуногистохимия үшін [11]. Ксилол тіндердің барлық бөліктерін депарафинизациялау үшін қолданылды, содан кейін спирт сериясымен қайта гидратталды, соңында тазартылған суға қанық болды. Содан кейін тін фосфат буферлі тұзды ерітіндіге ауыстырылды, оған 0,3  сутегі пероксидазасының ерітіндісі қосылып, бөлме температурасында эндоген пероксидазаның белсенділігін 10 минутқа дейін тежеді, содан кейін Трис буфері жуылады. Содан кейін бөліктерді микротолқынды пеште цитрат буферлі ерітіндіде 15 минут қайнатады (рН 10, 6,0). P53, p21, p27, p16, PCNA, Ki-67 және PLUNC бастапқы антиденелері бөлме температурасында 60   минут ішінде бірінен соң бірі қолданылды [11].

Содан кейін біз байланыстырушы антиденелер мен стрептавидин пероксидаза кешенін қосамыз (DAKO LSAB жинағы, K-0675 Carpinteria, CA) бөлме температурасында 15 мин. 0,05 º25 диаминобензидин тетрагидрохлориді (DAB) тіндерді бояу үшін 15 минут қолданылды және соңында Tris буферімен екі рет жуылды [8, 11].

Бөлімдерді ионсыздандырылған сумен жуғаннан кейін Майер гематоксилинімен боялған. Әрбір жағдайда иммундық боялған ядролардың саны анықталды. Барлық санау оң ядроларды/жасушалардың жалпы санын бағалау үшін 1000x өрісінде стандартты жарық микроскопында орындалды. Әр бөлімде он өріс немесе кемінде 500 ұяшық есептелген. Егер ісік жасушаларында бояу болмаса немесе бар болса, ісік бөліктері теріс деп саналды. 1+ ұпай 10 � % ұяшықтары реакцияға оң болған кезде қойылды. 2+ ұпай 30 � % ұяшықтары реакцияға оң болған кезде қойылды. Ұяшықтардың > 50 % сәйкесінше реакцияға оң болған кезде 3+ бағасы қойылды (1 және 2 кестелер) [17]. Статистикалық маңыздылық Пирсонның хи-квадрат сынағы немесе бір айнымалы талдау үшін Фишер нақты сынағы және көп айнымалы талдау үшін көп логистикалық регрессия сынағы қолданылды. P мәні < 0,05 болғанда нәтижелер статистикалық маңызды деп саналды.

IHC нәтижелерінің корреляциясы Pearson Xi квадраты бойынша бір инвариантты қайталанумен және логистикалық мультивариантты регрессиялық анализбен.

IHC нәтижелерінің корреляциясы Pearson Xi квадраты бойынша бір инвариантты қатерлі трансформациямен және логистикалық мультивариантты регрессиялық анализбен.

Ақуызды-ақуызды қондыру ZDOCK бағдарламасымен [18] CDK1-ге байланысты қатерлі трансформацияның үш ықтимал болжау факторын талдау үшін жүргізілді. Бұл зерттеуде табылған мүмкін механизмді көрсету үшін біз Ki-67, p27 және PCNA-ның CDK1-мен өзара әрекеттесуін есептеу биологиясы арқылы есептейміз. Біз ZDOCK байланыстырушы болжамынан кейін кешендердің тұрақтылығын бақылау үшін GROMACS 4.5.5 бағдарламасын [19] қолдандық. MD жүйесінің ортасы жүйені бейтараптандыру үшін 0,145  M NaCl концентрациясында Na және Cl иондары бар 1,2  nm су қорапшасы бар TIP3P су модельдеуінде орнатылған. Біріншіден, біз энергияны азайту үшін ең тік түсу алгоритмінде 5000 циклдік қадамдарды орнаттық. Екіншіден, тепе -теңдік үшін МД симуляциясын қамтамасыз ету үшін температураның тұрақты динамикасы (NVT типті) шарттары қолданылды және уақыт аралығында орындалды. Соңғы қадамда тұрақты қысым мен температура динамикасы (NPT түрі) 5000 сек уақыт аралығындағы өндіріс үшін орнатылды. Модельдеу процесінде жүйенің температурасы 310  K ретінде орнатылды. Траекторияны талдау үшін біз сәйкесінше орташа квадраттық ауытқуды (RMSD) және гирация радиусын (Rg) есептеу үшін GROMACS 4.5.5 бағдарламалық жасақтамасын қолдандық. МД сәйкестендіру деректерінің сериялары барлық өндіріс кезеңдерінде 20  ps сайын зерттелді.

Бұл зерттеуге барлығы 55 еркек пен 15 әйел қатысты. Олардың 60-ы IP, ал қалған 10-ы қатерлі трансформациямен жиналған синоназальды IP. Жасы 45.64 ± 14.45 жас аралығында, 25 пен 78 жас аралығында. Дақтар PLUNC деңгейінің едәуір жоғарылағанын көрсетті, бірақ IP қайталануы бар науқастарда Ki-67, p53, p21 және p27 деңгейлерінің төмендеуі анықталды (1-кесте). Біз сондай-ақ синхронды қатерлі ісіксіз жалғыз синоназальды IP-мен салыстырғанда скамозды жасушалық карциноманың трансформациясы бар синоназальды IP-де жоғары PCNA, Ki-67 және p27 таптық (2-кесте). Жоғары PLUNC экспрессиясы синоназальды IP бар емделушілерде көптеген синус хирургиясымен байланысты. Дегенмен, PLUNC өрнек деңгейі IP-нің SCC-ге қатерлі трансформациясымен корреляцияланбайды. Біз сонымен қатар 1, 2, 3 және 4 суреттерде PCNA, Ki-67, p27 және PLUNC үшін әр түрлі деңгейдегі IHC өрнегін көрсеттік. Операция алдындағы МРТ немесе КТ барлық пациенттер үшін 5 және 6-суреттердегідей орындалды.

IPNA -да PCNA IHC (a) +++ және (b) 0 өрнегі.

Ki67 IHC (a) өрнегі +++ және (b) IP мекенжайларында 0.

p27 IHC (a) өрнегі +++ және (b) IP мекенжайларында 0.

PLUNC IHC (a) өрнегі +++ және (b) IP-де 0.

Қатерлі трансформациясы бар синоназальды инвертті папилломаның синоскопиялық көрінісі.

Қатерлі трансформациямен синоназальды инверттелген папилломаның МРТ (коронарлық көрініс) және синустық томография (осьтік көрініс).

Ki-67 жоғары иммуногистохимиялық бояу 1 және 2-кестеде және 2-суретте көрсетілгендей Пирсонның хи-квадрат сынағы және көп логистикалық регрессия сынағы арқылы біздің унивариантты және көпвариантты талдауымызда көптеген қайталанулары және қатерлі трансформациясы бар синоназальды IP-де де табылды. ). Сондықтан жоғары Ki-67 индексі болжам мен қатерлі болжамды маркерлер үшін маңызды фактор болып саналуы мүмкін. Біз тіпті Ki-67 және PCNA IHC экспрессиясының айтарлықтай жоғарылаған деңгейін және төменгі p27 деңгейін зерттеуді біріктіріп, біздің сауалнамада синоназальды IP бар науқастарда қатерлі трансформацияның жоғары тенденциясын болжауға болады.

Нәтижесінде біз PCNA мен CDK1, Ki-67 және CDK1, p27 және CDK1 болжамдық факторларын анықтаған арасындағы соңғы молекулалық динамикалық зерттеулермен бірнеше қондыру талдауларын жүргіздік, олардың барлығы 7-суретте тұрақты қондыруды көрсетті және олардың қондыру көрсеткіші де ZDOCK бағдарламасы. ZDOCK CDK1 мен Ki-67, CDK1-p27 және CDK1-PCNA ең жақсы 10 қондыру позасын құрды. Біз ақуыз-ақуыз әрекеттесуінің тұрақтылығын талдау үшін ең жақсы қондыру ұпайын таңдадық. CDK1 байланыстыру баллына Ki-67, p27 және PCNA мәндері ZDOCK бағдарламасы бойынша тиісінше 20,92, 21,72 және 24,32 болып табылады. Негізгі қалдықтар Gly9, Ser10, Ile11, Leu12, Lys13, Lys14 және Val15 болып табылады, олар Ki-67 және p27 үшін қызыл таспада көрсетілген CDK1 үшін негізгі байланыстырушы домендер болды (7-сурет). Біз осы үш ақуыздың CDK1 -мен өзара әрекеттесуін көру үшін осы негізгі қалдықтар үшін МД талдауын жасадық. Ki-67, p27 және PCNA бар CDK1 кешенінің MD модельдеуінен кейін біз 5000  ps модельдеу уақытында RMSD талдауын жүргіздік. Барлық үш ақуыздың (Ki-67, p27 және PCNA) 1000 сек модельдеу уақытынан кейін тұрақты ауытқуы бар екені анықталды (8-сурет).

Мақсатты ақуызы бар (көк) CDK1 (жасыл) ең жақсы қондыру позалары: (a) Ki-67, (b) p27 және (c) PCNA. ZDOCK ұпайлары бар белок-ақуыздық онды кешен ZDOCK бағдарламасы бойынша жасалды. Ki-67, p27 және PCNA бойынша ZDOCK бойынша ең жоғары балл сәйкесінше 20,92, 21,72 және 24,32 болып табылады. Ki-67 және p27 негізгі байланыстыру қалдықтары қызыл түске боялған, ал негізгі қалдықтарға Gly9, Ser10, Ile11, Leu12, Lys13, Lys14 және Val15 жатады.

(a) Ki-67, (b) p27 және (c) PCNA бар CDK1 кешендерінің барлық атомдарының RMSD талдауы 5000 сек симуляция уақытында. Барлық кешендер симуляция уақытынан кейін 1000   пс тұрақты тұрақтылыққа бейім.

9 -суретте біз 5000  ps модельдеу кезеңі үшін ақуыздардың радиустық гиряциясын есептедік. Үш кешен айналу радиусының төмен мәндеріне және барлық MD модельдеуіндегі тұрақты ауытқуларға бейім, бұл ақуыз құрылымының әрқайсысы арасындағы тығыздалған кешендерді көрсетеді. Үш кешеннің гидрофобты табиғаты үшін SASA (еріткіш ауданы) әдісі қолданылды, бұл үшеуі тұрақты флуктуацияға айналды және сонымен бірге әрбір ақуыз-белок әрекеттесуі арасындағы тұрақты гидрофобты өзгерісті көрсетті (10-сурет). 5000  ps модельдеу уақытында үш кешеннің әрқайсысы үшін MD жүйелерінің жалпы энергиясын есептеуден басқа, олардың барлығы 𢄩.27 × 10 5, 𢄩.30 × диапазонында энергияның тұрақты өзгеруіне ие болды. 10 5, және 𢄡.66 × 10 6 сәйкесінше (11 -сурет). Энергия талдауының нәтижесі барлық модельдеу жүйелерінің 5000 сек ішінде тұрақты екенін көрсетеді. Қалдықтардың ауытқуын талдау кезінде біз үш кешен бойынша барлық қалдықтардың RMSF мәнін өлшейміз (12 -сурет). CDK1-Ki67 кешенінің RMSF валидациясында МД симуляциясы кезінде үлкен өзгеріске ұшыраған CDK1-дің 38-ден 43-ке дейінгі қалдықтарында айтарлықтай ауытқулар байқалады (12-сурет (а)). MD симуляциясы кезінде p27 ақуыз құрылымы бойынша 25 -тен 40 -қа дейінгі қалдықтарда айтарлықтай өзгеріс байқалды, бұл осы аймақтағы үлкен өзгерістерді білдіреді. Керісінше, MD симуляциясы кезінде PCNA протеинінің құрылымында 100 -ден 200 -ге дейінгі қалдықтарда RMSF вариациясы аз болады. Сондықтан, PCNA-да MD симуляциясы кезінде Ki-67 және p27-ге қарағанда RMSF өзгеруі аз болды.

(A) Ki-67, (b) p27 және (c) PCNA бар CDK1 комплекстерінің айналу радиусы 5000  ps модельдеу уақытында. Гирация радиусының төмен мәндері екі ақуыз құрылымының арасындағы тығыздалған комплекстерді көрсетеді.

SASA (еріткіштің ауданы) 5000  ps жылдамдығында гидрофобты анықтауға арналған барлық кешендердің конформациясының анализі ақуыз-ақуыздық өзара әрекеттесу арасында айқын өзгерісті көрсетпеді.

(A) Ki-67, (b) p27 және (c) PCNA МД жүйелерінің энергияның жалпы есебі 5000  ps симуляция уақытында орташа ауытқулардың әрқайсысы 𢄩.27 × 10 5, 𢄩. Сәйкесінше 30 × 10 5 және 𢄡.66 × 10 5.

(a) CDK1 және Ki-67, (b) CDK1 және p27 және (c) CDK1 және PCNA 5000 ≥ 2009 сек модельдеу уақытында ақуыз қалдықтарының RMSF талдауы. RMSF ауытқуының жоғары мәні барлық МД симуляциясында белок құрылымының қатты өзгеруін білдіреді.

Алайда, миграциялық талдау көрсеткендей, PCNA 5000  ps MD модельдеу сауалнамасы кезінде CDK1 арасында Ki-67 мен p27 салыстырғанда үлкен қашықтыққа ие болды. Біз PCNA мен CDK1 арасындағы ең үлкен қашықтықты тапқанымызға қарамастан (13 -сурет (а)), бірақ олардың тұрақты байланысы 12 -суретте RMSF талдауы арқылы көрсетілген. Сонымен қатар, PCNA орташа квадраттық орын ауыстыруы (MSD) азырақ миграцияға ие (13(b)-сурет). Біз одан әрі Ki-67 және p27 байланысуы үшін CDK1 негізгі қалдықтарын талдаймыз. Негізгі байланыстырушы қалдыққа Gly9, Ser10, Ile11, Leu12, Lys13, Lys14 және Val15 Ki67-CDK1 протеинінің құрылымы 5000  ps модельдеу уақытында диедральды бұрыштан тұрады. Барлық байланыстыру қалдықтары бүкіл MD модельдеу кезінде тұрақты. Алайда, барлық MD модельдеу уақытында p27-CDK1 ақуыздық кешендерінде Gly9, Ser10, Leu12 және Val15-те тұрақты екібұрышты бұрыштар болды. Ақырында, біз PCNA-CDK1 ақуыз құрылымындағы Gly9, Ser10, Ile11, Leu12, Lys13, Lys14 және Val15 сияқты барлық негізгі байланыстыратын қалдықтардың бүкіл MD модельдеу кезінде тұрақты байланыстыру бұрышына ие екенін анықтадық. PCNA CDK1 -мен байланысуы (14 -сурет). Кластерлік талдаулар барлық MD жақтауларының арасындағы өкілдік құрылымды таңдау үшін қолданылды. Суретті салыстыру талдауы үшін Ki67, P27 және PCNA CDK1 кешендерінің барлық MD кадрлары үшін соңғы кластерлеу топтарынан таңдалған ұсынылған құрылым сәйкесінше 4860 & # x2009 ps, 2740 # x2009 ps және 3880 & # x2009 сек, симуляция уақытында ығысты. #x2009ps (15-сурет). CDK1 және Ki-67, p27 және PCNA үшін мақсатты ақуыздар үшін суретті салыстыруды зерттеу 16-суретте көрсетілген. CDK1-дегі 38-ден 43-ке дейінгі CDK1 қалдықтары 0-ден 4860-ға дейін Ki-67-ге жақындайтынын анықтадық (16(а)-сурет). Нәтиже Ki-67 үшін CDK1 байланысының 38-ден 43-ке дейінгі қалдықтарының жоғары ауытқуына байланысты RMSF талдауымен корреляцияланады. CDK1-p27 суретін талдау үшін p27 CDK1-ге 0  ps-ден 2740  ps-ге дейін жақындайды. Нәтижелер, сонымен қатар, CDK1 үшін p27 байланысының 25 -тен 40 -қа дейінгі қалдықтардың жоғары өзгеруіне байланысты RMSF талдауымен байланысты (16 -сурет (б)). Біз PCNA мен CDK1 өзара әрекеттесуі кезінде 100 -ден 200 -ге дейінгі қалдықтарда 3880  ps кезінде CDK1 -ден (жасыл) бір PCNA (көк) циклінің аз ғана өзгерісін таба алдық (16 -сурет (с)). Бұл нәтиже CDK1 үшін PCNA байланысының 100 -ден 200 -ге дейінгі қалдықтардағы шағын ауытқулар үшін RMSF талдауымен де байланысты.

5000 ps модельдеу уақытындағы кешендердің миграциялық талдауы: (а) CDK1 мен қондырылған ақуыздар арасындағы барлық MD уақытындағы қашықтық және (b) барлық CDK1 кешендері үшін орташа квадраттық орын ауыстыру (MSD) талдауы MSD жоғары мәнін білдіреді. ақуыз миграциясының жоғары қашықтығы бастапқы позицияны құрайды.

Негізгі байланыстыру қалдықтарының диэдрлік бұрышы: (a) Gly9, (b) Ser10, (c) Ile11, (d) Leu12, (e) Lys13, (f) Lys14 және (g) Val15 CDK1 протеинінің құрылымында симуляция уақытында 5000  ps. Диэдрлік бұрыштар мақсатты байланыстыратын ақуыздары бар CDK1 кешендері үшін есептелді: Ki-67, p27 және PCNA барлық MD модельдеу уақытында.

Барлық CDK1 және байланыстырушы ақуыздардың кластерлік талдаулары: (a) Ki-67, (b) p27 және (c) PCNA 5000 сек симуляция уақытында ұсынылған құрылымдар CDK1 барлық MD кадрлары үшін соңғы кластерлеу топтарынан таңдалды. кешендер. Ki-67, p27 және PCNA кешенінің ұсынылған құрылымы сәйкесінше 4860 сек, 2740 сек және 3880 сек ығысқан.

Бастапқы суретті (0  ps) салыстыру және барлық CDK1 кешендері үшін ұсынылған конформация. (a) CDK1 (жасыл) контурының бірі Ki-67 (көк) 4860 сек жылдамдықпен жақындады. (b) p27 (көк) ақуыз құрылымы CDK1 (жасыл) 2740 ps-те тығызырақ байланысады. (c) PCNA (көк) контурының бірі CDK1 (жасыл) 3880 сек-тен алыстады.

Зерттеулеріміз бен әдебиеттерге шолулардағы нәтижелерді қорытындылау үшін синоназальды IP бар науқастарда жасушалардың пролиферациясы және қатерлі трансформациясы үшін CDK1-мен әрекеттесетін Ki-67, p27 және PCNA молекулалық механизмі 17-суретте көрсетілген.

Жасуша цикліндегі Ki-67, p27 және PCNA молекулалық механизмі.

Төңкерілген папилломалар синоназальды трактта сирек кездесетініне қарамастан, жеңіл қайталанатын сипаты мен қатерлі трансформациясы пациенттер мен дәрігерлерді жиі алаңдатады.Қайталануды немесе қатерлі өзгерістерді ерте анықтау үшін өмір бойы жүйелі бақылау қажет және бұл ИП пациенттері үшін ауруды бақылауды жақсартуға әкелуі мүмкін [9, 20].

Ki-67 IP жасушаларында G0 фазасынан G1 фазасының басталуына ықпал етті және ол пролиферация фазасындағы жасушалық цикл үшін өрнекті сақтады. Ки-67-ақуыз, ол G0 фазасынан басқа G1-S-G2-M таралу фазасындағы жасушалық циклге әсер етеді [8, 11, 14]. P53, p63, p21 және p27 мутациялары туралы хабарланған әдебиеттерде SCC трансформациясымен синоназальды IP туындады, әлі де пікірталастар болды [6, 11, 14]. Ки-67 жақында синоназальды неоплазманың пайда болуы туралы хабарланды [21] агрессивті ісік әрекеті Ки-67 индексінің жоғарылығына байланысты және мұрын эпителийінің ауыр дисплазияға және тіпті қабыршақты жасушалық карциномаға әкелді [22]. Көтерілген Ки-67 тіпті синхронды сквамозды жасушалы карциномалар бар АЖ-де де кездеседі. Ki-67 p21, p27 және CDK-ке де әсер етеді [8, 11, 12, 14]. Алайда, p27 төмендеуі синоназальды IP-тіндерде Ки-67 экспрессиясының жоғарылауынан туындады ма деген қорытындыға келе алмадық. Қосымша зерттеулер Ки-67 мен Р27 арасындағы байланысты түсіндіруге кепілдік береді.

P53 ісігін басу функциясы Katori et al хабарлаған көптеген қатерлі ісіктермен байланысты. және Гудратхи және басқалар. [22, 23]. Олар p53 үшін тестілеу дисплазия немесе карцинома ықтималдығы бар папилломалық зақымдануларды скринингке көмектесуі мүмкін деп ұсынды, бірақ біз оны көп нұсқалы талдауда маңызды деп таппадық. Бұл біздің зерттеудегі пациенттердің шектеулі болуына байланысты. Алайда, p53 ғана емес, сонымен қатар p63 де IP -де қатерлі трансформациямен өрнектеледі [11].

Ісік жасушаларының Ki-67 экспрессиясының жоғарылауымен пролиферативті белсенділіктің жоғарылауы көптеген адам ісіктері үшін маңызды болжамдық маркер ретінде хабарланды, бұл сонымен қатар IP қайталануында және қатерлі ісік ауруында маңызды. Әсіресе, Ki-67 күдікті пролиферация кезеңінде жасушалық циклге тікелей әсер етеді және p53, p21 және p27 ісіктерді басатын гендермен өзара әрекеттесе алады және G1 фазасының бақылау нүктесіне әсер ету арқылы жасушалық циклді модуляциялайды [8, 24, 25]. Жақында Ki-67 табиғат құрылымы мен молекулалық биологиядағы CDK1 арасындағы өзара әрекеттесу [26] және CDK1 жасуша пролиферациясында және тіпті қатерлі трансформацияда негізгі рөл атқарады [10]. Біз Ki-67 жасуша циклінің G1 фазасына IPs жасушаларының енуін ғана емес, сонымен қатар CDK1-ге әсер ету арқылы жасуша ядроларында қатерлі трансформацияны тудырды деп күдіктенеміз.

Бас пен мойынның SCC қатерлі ісігіне p21 және p27 клиникалық рөлдері әлі де талқылануда, бірақ біз р27 -нің төменгі деңгейі біздің зерттеуде қатерлі трансформациясы бар синоназальды IP -де анықталғанын анықтадық. P21 және p27 зерттеулері аз болғанымен, қатерлі ісік ауруымен адамдық IP -ге қатысты. Кейбіреулер Ончел және басқалармен бірге болды. [11, 27] және кейбіреулер қарсы [25, 28] байқалды.

Ki-67-ден басқа, біз CDK1-мен ынтымақтастықта IP-тің қатерлі трансформациясын болжаушы PCNA-ны да таптық. Қатерлі трансформациясы бар IP-лерімізде PCNA да, Ki-67 де IHC дақтары арқылы жоғарылады.

Біздің сауалнамамызда қатерлі трансформациясы бар IP-де жоғары PCNA экспрессиясы көрсетілгендей, біз PCNA-ны синоназальды IP бар пациенттер үшін қатерлі ісік туғызатын маңызды фактор деп күдіктендік. Жақында Mumbuc және басқалардың синоназальды полиптермен салыстырғанда IP -де жоғары PCNA анықталды. [3]. PCNA CDK1-мен әрекеттесе алады және жасуша цикліне жасушаның енуіне ықпал ете алады, нәтижесінде пролиферация мен қатерлі ісік пайда болады.

Соңында, біз PLUNC-ты қатерлі ісікке шалдыққан синоназальды IP-ге зерттейміз, өйткені ол мұрын-жұтқыншақ ісігінің пайда болуын тудырады деп жиі хабарланады. Біздің алдыңғы зерттеуімізде созылмалы ауру жағдайында псевдомонас синуситінде PLUNC экспрессиясы төмендеді [29]. PLUNC сонымен қатар көптеген бактериялардың колонизациясы бар созылмалы риносинуситпен байланысты болды [17]. Сонымен қатар, PLUNC инфекцияға қарсы және антибиофильді функцияға ие болуы керек еді [30, 31]. Өйткені ол мұрын-жұтқыншақ карциномасының ісікке қарсы [32] болуы керек еді, бірақ біз SCC трансформациясымен синоназальды IP-тің корреляциясын таппадық. Керісінше, біз жоғарылаған PLUNC экспрессиясын тек бірнеше рецидивтері және ревизиялық синусын хирургиясы бар синоназальды IP бар науқастарда таба алдық. Болашақта PLUNC экспрессиясының жоғарылауының және бірнеше қайталануының келесі механизмі мен себептерін қосымша зерттеу керек.

Компьютерлік дәрі-дәрмектер дизайны (CADD) клиникалық немесе ауруды зерттеуді одан әрі зерттеу үшін пайдаланылуы мүмкін, оның ішінде ауруларды зерттеу [33], қауіп факторларын зерттеу [34], жағдай туралы есептер мен молекулалық механизм. PCNA, Ki-67 және p27-нің CDK1-ге қондыру және молекулалық динамикалық нәтижелерінде біз олардың үшеуінің де CDK1-ге тұрақты қондырылғанын анықтадық. P27 CDK1 -мен қатерлі ісік ауруымен синоназальды АЖ ингибиторы ретінде жұмыс істеу үшін тұрақты өзара әрекеттесуге тиіс еді. PCNA және Ki67 промоутерлер болып саналды және синоназальды IP -де жасушалардың пролиферациясы мен қатерлі ісігіне ықпал етеді.

Қорытындылай келе, бұл Ki-67, PCNA және p27 IPK қайталануы мен CDK1 арқылы қатерлі ісік ауруында маңызды екенін көрсететін алғашқы зерттеу. Біз сонымен қатар бірнеше рет қайталанатын синоназальды IP -де PLUNC өрнегінің жоғарылауын бірінші болып табамыз. Дегенмен, болашақта қосымша механизмді зерттеу әлі де қажет. Ағымдағы есептеу зерттеулерінің барлығы біздің дымқыл зертханалық зерттеулерімізбен үйлеседі, бұл біздің зерттеуімізді сенімдірек етеді және мұндай аурумен ауыратын науқастарды болашақ емдеуге қолдануға болады. Сондықтан синоназальды IP бар және Ki-67, PCNA жоғарылаған және p27 төмендеген емделушілерде қатерлі трансформацияның жоғары мүмкіндіктері бар деп санау керек және клиникалық тәжірибеде мұқият бақылау керек [35].


(Lys) молекулалық клондау және сипаттамасы6-Белгіленген сульфидті-реактивті гемоглобин I Lucina pectinata

Poly-Lys тегі біріктірілген Люцин пектината гемоглобин I (HbI) кодтау реттілігі және тиімді және жылдам процестің көмегімен тазартылған. HbI - күкіртті сутегін (H2S) жоғары аффиналдылықпен және ол осы сигнал молекуласының физиологиялық маңызды реакцияларын түсіну үшін қолданылған. (Lys)6-tegged rHbI конструкциясы өрнектелді E. coli және катион алмасу матрицасында иммобилизациялау арқылы тазартылады, содан кейін өлшемді алып тастау хроматографиясы. (Lys) сәйкестігі, құрылымы және қызметі6-белгіленген rHbI масс-спектрометрия, кіші және кең рентгендік шашырау, оптикалық спектроскопия және кинетикалық талдау арқылы бағаланды. Шашыраңқы және спектроскопиялық нәтижелер көрсеткендей, (Lys)6-белгіленетін rHbI құрылымдық және функционалдық жағынан жергілікті ақуызға, сондай -ақ [His]6-белгіленген rHbI. Х. -мен кинетикалық зерттеулер2S бірлестіктің (k қосулы) және диссоциация (k өшірулі) жылдамдық константалары сәйкесінше 1,4 × 10 5 /М/с және 0,1 × 10 −3 /с болды. Бұл нәтижелер (Lys) екенін растады.6-белгіленген rHbI H байланыстырады2S оның гомологы сияқты жоғары жақындығы бар.

Бұл жазылу мазмұнының алдын ала қаралуы, сіздің мекеме арқылы кіру.


Нәтижелер

Трипсиннің қорытылуы барлық конглутин изоформалары үшін тұрақты, ас қорытуға төзімді пептидтерді (DRPs) береді.

Жержаңғақ конглютин изоформалары, Ara h 2.02, Ara h 2.01 және Ara h 6 трипсинмен инкубациялау арқылы қорытылды. Қосымша S1 суреті қалпына келтіру жағдайында натрий додецил сульфаты полиакриламидті гель электрофорезі (SDS-PAGE) арқылы бейнеленген ас қорыту уақытын көрсетеді. Асқорыту нәтижесінде пайда болған пептидтер конглютиннің барлық изоформалары үшін зерттеуіміздің 180 минуттық соңғы нүктесіне дейін тұрақты болып қалады. Ara h 2.02 изоформасының DRP-тері екі топтан тұрады, олардың көрінетін молекулалық массалары шамамен 12 кДа және 10 кДа. Ara h 2.01-ден алынған DRP-лер шамамен 10 кДа молекулалық салмағын көрсетеді және бұл аймақты мұқият зерттегенде екі қоныс аударатын диапазон анықталады. Ara h 6-дан алынған DRPs шамамен 9 кДа және 5 кДа жолақтары ретінде тасымалданады. Әрі қарай сипаттау үшін 90 минут бойы ас қорыту жолымен дайындалған ДРҚ қолданылды. РН төмен болғанда пепсинді қолданып, бейтарап рН кезінде трипсин/химотрипсинді қолданатын физиологиялық жағдайларда жержаңғақ конглутиндері протеолизге де төзімді. Алынған DRPs біздің зерттеуде талданғандар сияқты ұқсас молекулалық салмаққа ие және басқа зерттеулерге сәйкес IgE (деректер көрсетілмеген) әлі де байланыстыра алады 13,22 .

Жержаңғақ конглутинінің изоформаларынан DRP тізбектерін анықтау

Ажыратымдылығы жоғары масс-спектрлер Ara h 2 изоформаларынан, Ara h 2.02 және Ara h 2.01 және Ara h 6-дан алынған тотықсызданбаған және төмендетілген және алкилирленген DRP үшін жазылды. Тотықсызданбаған және азайған және алкилирленген DRP-лердің ESI-MS спектрлері тиісінше 1 және 2-суреттерде көрсетілген. Редукцияланбаған DRP үшін молекулалық массасы & gt13 кДа болатын массаларды білдіретін зарядталу жағдайы жоғары (+8 ден +17 дейін) м/з иондарының кең диапазоны байқалады. Бұл төмендетілмеген DRP үшін массалық спектрлерде, сонымен қатар, & lt5 кДа массасын білдіретін, зарядталу жағдайы төмен (+2-ден +6 дейін) м/з иондары бар. Қысқартылған және алкилирленген DRP заряд күйінің диапазонын +4-тен +12-ге дейін береді, бұл 2,2–10 кДа массасын білдіреді. Тотықсыздандырылған және алкилирленген ДРП спектрлерінде бір заряд күйінің ионы бір-бірінен 57 Да ауытқып, бірнеше м/ц массалар беретінін байқауға болады. Бұл цистеиндердің ішінара алкилизациясына қатысты. Қосымша кесте S1 қысқартылмаған да, тотықсыздандырылған да, алкилденген де DRP үшін табылған массаларды жинақтайды. Ara h 2.02 және 2.01 трипсинолизі 16,2–17,6 кДа молекулалық массалардың DRP -іне, сонымен қатар 2–4 кДа -ға дейінгі кейбір ұсақ пептидтерге әкелді (S1 қосымша кестесін қараңыз). Ara h 6 13,5–14,1 кДа аралығындағы молекулалық массалардың DRP-терін көрсетті. Белгілі пост-трансляциялық модификацияны, пост-трансляциялық өңдеуді және дисульфидтік байланыстардың 19 картасын қолдана отырып, бұзылмайтын және тотықсыздандырылған және алкилденген DRP массаларын біріктіруді ескере отырып, тәжірибелік массалар теориялық массалармен байланыстырылды (қосымша кестені қараңыз S1).

Жекелеген пептидтердің массасын анықтау үшін төмендетілмеген DRP ESI-MS-ке ұшырады. Пептидтер дисульфидті байланыстар арқылы байланысуы мүмкін. a панелі: Ara h 2.02 панелі b: Ara h 2.01 DRP c: Ara h 6 DRPs.

Жеке пептидтердің массасын анықтау үшін қысқартылған және алкилатты DRPs ESI-MS жүргізілді. Панель a: Ara h 2.02 DRPs Panel b: Ara h 2.01 DRPs Panel c: Ara h 6 DRPs.

Дақтарды тағайындау үшін жеке конглютин изоформаларынан алынған DRP екі өлшемді электрофорез (2-DE) профильдері (Қосымша S2 суретін қараңыз) пайдаланылды, мұнда DRPs әртүрлі pI мәндері пептидті тексеру үшін қосымша бағыттарды қамтамасыз етті. 3-сурет үш жержаңғақ конглютинінің DRP-де табылған пептидтік тізбектерге шолу жасайды. Асқорытудан кейін біз Аргда гидролизденетін бір пептидтік байланыс бар ақуыздарды анықтадық59/71 Ara h 2 және Arg үшін50 Ara h 6 үшін (3 -сурет. Панель a - Ara h 2.02, пептидтер а, және b Панель b - Ara h 2.01, пептидтер b, c, d және e Panel c - Ara h 6, пептидтер а және б) , ол төмендетілгеннен кейін Ara h 2 үшін 7,2–9,7 кДа және Ara h үшін 4,8-9,4 кДа молекулалық салмағы бар екі пептид береді. байқалды 29 , сонымен қатар трипсиннің бөліну орнында Arg149/137-Асп150/138. Сонымен қатар, жойылған ішкі қысқа сегменттері бар пептидтер (S48TR50 Ara 6 мен D -де61PYSPSPYDRR71 Ара h 2.02) анықталды. Ara h 2 DRP-де ішкі сегменттер Asp-тен бастап анықталды35 немесе Asp42 (Cурет 3. панель a - Ara h 2.02 пептидтері f, g және h, панель b - Ara h 2.01 пептид f). Бұл қысқа пептидтерде цистеин қалдықтары болмайды және тұрақты ақуыз ядросымен байланыспайды. Ас қорытудан кейінгі Ara h 6 N-соңғылары N-терминустардың кейбір әртүрлілігін көрсетті (Арг-да протеолиз5 немесе Арг7, 3 -сурет. Панель c - Ara h 6 пептидтері a – d). Барлық үш конглутиндер үшін ас қорытуға ең сезімтал бөліктер N- және С-терминалы, ал аз дәрежеде ішкі бөлігі. Барлық үш конглютин изоформасында трипсин шабуылының негізгі ішкі орны құрылымдық жағынан бірдей екені анық (R)59| R60| D61PYSPSPYDRR7172 Арада 2.02, R58| R59| Г.60 Арада 2.01 және R47| С.48TR50| С.51 Ара h 6), анықталған жергілікті құрылымы жоқ циклде орналасқан. Қосымша S3 суретте екіншілік құрылымдық элементтерді тағайындаумен конглутин изоформаларының реттік туралануы және дисульфидті көпірлерді көрсететін 2D топология диаграммасы бар.

Зақымдалмаған конглютиндердің тізбегін пайдалана отырып (әр панельдің жоғарғы сызығы) анықталған пептидтер келесі жолдармен (әріптермен көрсетілген) көрсетіледі. Әрбір жол табылған бірегей пептидті білдіреді. 'R' таңбасы бар сызықтар ас қорыту кезінде белок өзегінен бөлінетін пептидтерді білдіреді. Панель а: Ара h 2.02 ақуыз түрінен DRPs тізбектері b Panel: Ara h 2.01 ақуыз түрінен DRPs тізбегі c Panel: Ara h 6 ақуыз түрінен DRPs тізбегі.

Жержаңғақ конглютин изоформаларының қайталама құрылымы ас қорытуға әсер етпейді және молекулалық динамикалық модельдеу ДРП конформациялық тұрақты құрылымдарын көрсетеді.

Ara h 2.02, Ara h 2.01 және Ara h 6 DRP құрылымдық қасиеттерін жақсырақ түсіну үшін алыс ультракүлгін Дөңгелек дихризм (CD) спектрлері рН 8 және рН 1,2, 37 °C температурада алынды. үш жергілікті изоформа 200-ден 190 нм-ге дейінгі күшті оң эллиптикалықты көрсетеді, әдетте α-спиральді құрылымдардың болуын көрсетеді (4-суреттегі сызықтық графиктер). DRPs алыс УК CD спектрлерінің пішіні нативті ақуыздарға ұқсас (4-суреттегі сызықшалар). Нөлдік қиылысу, яғни 0 mdeg эллипстік кезіндегі толқын ұзындығы DRP және нативті изоформалар үшін бірдей, бұл интактілі ақуыздың кішірек фрагменттерге ыдырауы нәтижесінде қайталама құрылымда айтарлықтай өзгеріс болмағанын растайды. Нәтижелі конглютиндер және олардың ДРП-лары бейтарап рН және төмен рН кезінде салыстырмалы алыс УК CD спектрлеріне ие, бұл асқазанда денатурация болмайтынын көрсетеді.

Асқазан мен он екі елі ішектің жағдайын қайталау үшін бейтарап рН -де де, төмен рН -да да құрылымның екіншілік мазмұнын зерттеу үшін жергілікті конглутиндер мен олардың ДРП ультракүлгін ультракүлгін спектроскопиясымен талданды. Қатты сызықтар жергілікті жержаңғақ конглютиндерін білдіреді нүктелі сызықтар тиісті конглютиндердің DRP-терін білдіреді. Жоғарғы панельдер (a,b,c) pH = 8,0, төменгі панельдер (d,e,f) pH=1,2. Сол жақ панельдер (a,d): Ara h 2.02 Ортаңғы панельдер (b,e): Ara h 2.01 Оң жақ панельдер (c,f): Ara h 6.

Үш изоформаның протеолитикалық әсерінің салдарын талдау үшін бұзылмайтын және сіңірілген ақуыздарда Ara h 2 үшін 500 ns және Ara h 6 үшін 800 ns молекулалық динамикалық модельдеу жүргізілді. ), Ара h 2 изоформасының екеуінде де жоғары қозғалғыштығы бар үш аймақ бар екенін байқауға болады: бірінші Cys-ке дейінгі қапталдағы N-терминал бөлігі, соңғы Cys қалдығынан тізбектің соңына дейінгі С-терминал бөлігі және. екінші және үшінші Cys қалдықтары арасындағы құрылымдалмаған тұтас дерлік цикл болып табылатын аймақ (Cурет 5а, б). Ara h 6 аймақтарының қозғалғыштығы ұқсас, тек С-терминал бөлігі ақуыздың С-терминалында орналасқан дисульфидке байланысты қозғалмайды (5c-сурет). Трипсиннің бөліну учаскелері 5 суретте ЖРТ үшін көрсеткімен белгіленген және олар әрі қарай молекулалық динамиканы талдау үшін қарастырылады. Сонымен қатар, 5d – f суретте осы зерттеуде анықталған барлық DRP үшін трипсинге сезімтал бөліну орындары көрсетілген (3-сурет). Байқауға болады, бұл зерттеуде табылған барлық трипсинге сезімтал учаскелердің RMSF мәндері 0,60 Å жоғары, (5d – f-сурет), ал трипсинге төзімді сайттар іс жүзінде барлығы 0,70 Å-тан кіші RMSF мәндерін көрсетеді. Шын мәнінде, жержаңғақ конглютиндеріндегі мақсатты кесілген учаскелердің трипсинолизге бейімділігінің оң болжамды мәні 83%, протеолитикалық әсерге төзімділік үшін 87%, егер кесілген RMSF мәні 0,65 Å мәніне орнатылған болса.

Жоғарғы панельдер (a, b, c): бұзылмайтын конглутиндер, төменгі панельдер (d, e, f): DRP -тегі трипсин әсер ететін сайттар. Сол жақ панельдер (a,d): Ara h 2.02 Ортаңғы панельдер (b,e): Ara h 2.01 Оң жақ панельдер (c,f): Ara h 6. Көрсеткілер трипсин әсер ететін орынды көрсетеді Көк сызық ақуыз тізбегін білдіреді Жасыл сызықтар α-спиралы бар белок тізбегінің бөліктерін білдіреді, екінші реттік құрылым С дисульфидті байланыстың түзілуіне қатысатын цистеинді білдіреді.

Α-спиральды аймақтарға сәйкес келетін & lt0.5 with бар төрт жергілікті минимумды көруге болады (6-сурет), яғни жоғары құрылымды ақуыз ядросы. 6-суретке сәйкес, сәйкес келетін ДРП-мен зақымдалмаған ақуыздың RMSF қабаттасқан мәндерін көрсететін, DRP-тің жергілікті ұтқырлығы ұқсас үлгіні көрсетеді, оның ішінде RMSF минимумдары бар α-спиральды аймақтар. 7-сурет сәйкес DRP-мен қабаттасқан интактілі ақуыздың 3D құрылымын көрсетеді. DRP-де тек шамалы конформациялық өзгеріс байқалды, Ara h 2 үшін құрылымсыз циклде және С-терминал аймағында, ал Ara h үшін 6 ауытқу құрылымсыз циклде және N-терминал аймағында байқалады. , ал α-спиральді аймақтар барлық конглютин изоформалары үшін ешқандай бұрандалы қозғалыссыз және қайта орналасусыз өздерінің бұрандалы құрылымында қалды (сурет 7), тіпті біршама аз динамикалық болады. Бұл нәтижелер протеолиздің белоктардың конформациялық тұрақтылығын айтарлықтай өзгертпейтінін көрсетеді.

a панелі: Ara h 2.02 және оның DRP салыстыруы (3a-сурет, пептид d) b панелі: Ara h 6 және оның DRP салыстыруы (3c-сурет, пептид d). Көрсеткілер ақуыздың α-спиральды аймағында орналасқан RMSF минимумын білдіреді. Жасыл сызықтар қосалқы құрылым ретінде α-спиральды қамтитын белок тізбегінің бөліктерін білдіреді.

Панель a: Ara h 2.02 Панель b: Ara h 6. Қызыл түсті құрылым өзгермеген ақуыздардың конформациясын білдіреді, ал көк түс - DRP (3а, в суретінен пептид d). Көрсеткілер құрылымды емес бөліктерге әсер ететінін көрсететін бөлшектерді көрсетеді.

Құрылымдағы кеңістіктік ауытқуларды бағалау арқылы орташа квадраттық ауытқу (RMSD) және DRPs айналу радиусы есептелді. Бұл талдау DRP-тің жинақылығын одан әрі растады (Қосымша S4 және S5 суретін қараңыз). Бүкіл модельдеу уақыты ішінде Ara h 2 және Ara h 6 екеуінің де DRPs төменірек RMSD профилін көрсетеді, бұл олардың сәйкес интактілі белоктарға қарағанда тұрақтырақ екенін көрсетеді.

Гирация радиусы (Rg) мәндері барлық модельдеу уақытында DRP-тің төменгі сызбасын көрсетеді және DRP-тердің бүлінбеген протеинмен салыстырғанда айтарлықтай ықшам конформациясы бар екенін білдіреді. Сәйкес интактілі белоктарға қарағанда DRP құрылымының неғұрлым ықшам болуы (Ara h 2 жағдайында анағұрлым айқын әсері бар), сондай-ақ Ara h 6-ның Ara h 2-ге қарағанда жоғары ықшамдығы протеиннің қайталама құрылымының элементтерінің өзгеруіне сәйкес келеді. модельдеу (S6 Қосымша суретті қараңыз) мысалы Ara h 2 ақуыздарына қарағанда DRP -дегі спиральдың мөлшері айтарлықтай жоғары және Ara h 6 -да спиральдың мазмұны Ara h 2 -ге қарағанда жоғары.Бұны құрылымдалмаған аминқышқылдарының тізбегінің жоғалуымен түсіндіруге болады, нәтижесінде ас қорыту өнімдерінде құрылымдық элементтердің жоғары үлесі пайда болады.

Ас қорытуға төзімді пептидтер конглютиннің табиғи изоформалары сияқты IgE-байланыстырушы қасиеттерін көрсетеді.

Ara h 2 және Ara h 6 DRP-дің IgE-байланысы иммуноблотингпен біріктірілген 2D гель электрофорезімен бағаланды. 8а-суретте үш изоформаның IgE-байланыстырушы дақтардың пайда болғаны көрсетілген. Ara h 6 DRP -лары Ara h 2 изоформаларының DRP -леріне қарағанда қышқыл рН -ға ие. IgE-иммуноблотинг сонымен қатар жоғары молекулалық салмағы бар қосымша дақтарды анықтайды. Бұл SDS-PAGE және 2-DE-де атап өтілгендей, 90 минут ас қорытудан кейін қалатын бүлінбеген Ara h 6-ның шағын бөлігін білдіреді. IgE байланыстырмайтын дақтар (& lt10 кДа және қышқыл pI бар) Ara h 6 -дан пайда болды (8а -сурет және қосымша сурет S2).

Panel a: 2-D электрофорез (сол жақта) және 2-D электрофорезі IgE иммуноблоты арқылы Ara h 2/ h 6 қоспасынан алынған DRPs. М: Молекулалық маркерлер b-d тақтасы: ас қорытуға төзімді пептидтер (үзік сызықтар) мен нокальды конглутиннің (қатты сызықтар) IgE-ELISA анықтайтын IgE-байланыстырушы потенциалы. Әдеттегі мысал көрсетілген (б панелі: Ara h 2.02 панелі c: Ara h 2.01 d панелі: Ara h 6). DRP -дің IgE байланыстыру потенциалы бұзылмайтын конглутиндерге ұқсас.

Қосымша IgE-ELISA көмегімен жержаңғақ конглутиніне қарағанда DRPs-тің IgE-байланыстыру күші сандық деңгейде бағаланды. 8 -суретте (b – d панельдері) Ara h 2.02, Ara h 2.01 және Ara h 6 ингибирлеу сызбалары мен олардың ДРП көрсетілген. Ara h 2.02 және Ara h 6 үшін DRP -тің ингибирующие сюжеттері ақуыздармен іс жүзінде сәйкес келеді. Ara h 2.01 үшін жоғары концентрацияға аздап ығысу бар, бұл IgE-байланыстырушы потенциалдың сәл төмен екенін көрсетеді. Үш тәуелсіз эксперименттен орташа IC50 мәндері (сигналдың 50% тежеу ​​үшін қажетті концентрация) және IC еселенген ұлғаюы алынды50 DRP мен зақымдалмаған ақуыздар арасындағы мән анықталды. Ara h 2.02, Ara h 2.01 және Ara h 6 үшін бұл еселену сәйкесінше 0,8 (± 0,4), 1,4 (± 1,4) және 1,5 (± 0,6) болды. Бұл сандар 1-ге жақын болғандықтан, жержаңғақ конглютинінің барлық үш изоформасының IgE-байланыстыратын потенциалы трипсинолизге әсер етпейді деген қорытынды жасауға болады.


Нәтижелер

Перифериялық мембраналық ақуыздардың динамикасын түсіндіру үшін біз мезоскопиялық шкалада мембраналарды имитациялау үшін жиі қолданылатын ірі түйіршікті модельдеу әдісі болып табылатын диссипативті бөлшектер динамикасын (DPD) қолдандық [30]. Бұл тәсілде атомдар тобы күрделі конструкциялардың құрылыс материалы болып табылатын тиімді моншақтарға біріктіріледі, мысалы. липидтер мен белоктар. Моншақтар тиімді потенциалдар арқылы өзара әрекеттеседі және термостатқа бағынады (егжей -тегжейлі әдістерді қараңыз).

(a) Жалғыз гидрофильді басы (сұр) және үш гидрофобты құйрық моншақтары (сары) бар L липидінің үлгісі. (b) Радиусы бар ақуыз гидрофильді моншақтардан (қызыл) алтыбұрышты бір қабаттан (диаметрлі шарлар) және гидрофобты құйрық моншақтарының үш қабатынан (көк) тұрады. (c) L липидтерінің мембранасының суреті және бес енгізілген көшірмелері (жақсы көріну үшін су көрсетілмеген).

Су, липидтер мен перифериялық мембраналық ақуыздар жүйесін модельдеу үшін біз гидрофильді топтарды, гидрофобты топтарды және суды білдіретін бисердің үш түрін қолдандық. Липидтер (деп белгіленеді) бір гидрофильді бас тобынан және гидрофобты құйрық түйіршіктерінен тұратын сызықты полимерлер ретінде тұрғызылды (1 а-сурет). Стандартты липид ретінде біз қолдандық. Перифериялық мембраналық ақуыздар (ретінде белгіленеді) алтыбұрышты қимасы бар цилиндрлер ретінде модельденген, олар мембраналық якорьді құрайтын гидрофильді және гидрофобты моншақтардың бір қабатынан тұрады (сурет 1 б). Цилиндр ішіндегі моншақтар гармоникалық серіппелермен байланыстырылып, полипептидтік тізбектің коваленттік және коваленттік емес өзара әрекеттесуінің нәтижесінде табиғатта кездесетінге ұқсас өте қатаң, ықшам ақуыз құрылымдарын алды. Ақуыздардың радиусы ақуыздың алтыбұрышты қимасы бойындағы бисер санымен анықталды. Біз ұзындығы мембраналық якорьмен PMP -ге шоғырланғанбыз. Барлық симуляцияларда белоктар патч мөлшері бар алдын ала құрастырылған липидті қос қабаттарға енгізілді (1-сурет в). Мұнда ішкі DPD ұзындық шкаласы сәйкес келеді. Уақыт функциясы ретінде барлық моншақтардың позицияларын жазбас бұрын, жүйелер кернеусіз күйге дейін баростатпен теңестірілді (Әдістерді қараңыз).

Липидтердің қос қабаттарының перифериялық мембрана ақуыздарымен бұзылуы

Біз алдымен ендірілген белоктары жоқ липидтерден тұратын липидті қос қабатты сипаттадық. Бұл екі қабатты қалыңдығы (қарама -қарсы жапырақтардың липидті басы тобының орталықтары арасындағы орташа қашықтық, 2 -суретті қараңыз). Бір жапырақшаның қалыңдығы болды (парақша ішіндегі бас тобы орталықтары мен түйіршікті түйіршіктер орталары арасындағы орташа қашықтық. 2 -сурет). Парақшалар арасындағы қашықтық (қарама -қарсы парақшалардағы түпкі түйіршіктердің орталықтары арасындағы орташа қашықтық, 2 -суретті қараңыз). Липидтердің бағдарлану тәртібінің параметрі липидтер мен екі қабатты қалыпты орташа бұрыш бола отырып, мәнді қабылдады. Төтенше мәндерді ескере отырып (липидтер екіқабатты қалыптыға параллель бағытталған кезде, кездейсоқ бағдар үшін), байқалған мән жеткілікті реттелген, бірақ сұйық липидті қос қабатты көрсетеді.

ПМП-ны липидті қос қабатты ендіру кезінде екі парақшалар тән түрде бұзылады. Екі листовкадағы липидті бас пен ұштық түйіршіктердің орташа орналасуы арасындағы аймақтар түрлі түсті жолақтар түрінде көрсетілген. Бейтарап, бейтарап орта жазықтық үзік сызық ретінде көрсетілген. Төменгі парақшаға бір PMP енгізілді (пішіні аймақта көрсетілген). Қабықша мен жапырақшаның қалыңдығы ақуыздан алыста көрсетілген. а) қысқа ақуыздарды енгізгенде (яғни және) жоғарғы жапырақша бұзылмайтын ортаңғы жазықтыққа қарай иілген, ал төменгі жапырақшасы дерлік бұзылмай қалған. (b) ұзағырақ мембраналық анкерлер үшін ( ) жоғарғы жапырақша липидтердің протеиннің қарама-қарсы гидрофобты бөлігімен стерикалық интерференциясына байланысты ортаңғы жазықтықтан бүгілген. Төменгі жапырақша ішке қарай аздап бүгілген, демек, қабықтың жергілікті қалыңдауы пайда болады. Сондай -ақ, жоғарғы жапырақшаның қалыңдығы стерикалық қысылуына байланысты аздап қысқарды.

Мембранаға перифериялық мембраналық ақуызды енгізу кезінде қос қабаттың пішіні мен липидтердің конфигурациясының өзгеруін зерттеу үшін біз қос қабатқа радиусы және гидрофобты ұзындығы ( ) ұлғаюы бар жалғызды енгіздік. Тепе -теңдіктен кейін ақуыздың екі қабатты қалыптыға қарай қисаюы өте қарапайым болды (). Тек ең қысқа ақуыз,, жақсартылған флуктуациясы бар, жақсартылған қисаюды көрсетті. Соңғысы сонымен қатар барлық басқа PMP-лерге қарағанда біршама кеңірек болатын протеиннің иілу бұрыштарының таралуында көрінеді (деректер көрсетілмеген). Бұл байқау гидрофобты бөлшектері ұзын белоктармен салыстырғанда мембрананың ішінде біршама тұрақсыз конфигурацияны болжайды.

Әрі қарай, біз мембрананың көлденең қимасының бұзылған профилін бақыладық, яғни липидті бас тобы орталықтары мен терминальды липидті түйіршікті орталықтардың орташа орналасуы. Жалпы алғанда, ақуызға жақын мембраналық аймақтарда айқын бұзылулар байқалды (2 а-сурет). Ақуыздың гидрофобты бөлігі қарама -қарсы жапырақшаға жетпегенде (және, а 2 -сурет), қарама -қарсы жапырақша бұзылмайтын ортаңғы жазықтыққа жартылай бүгілген. Ақуыз ендірілген парақша дерлік бұзылмай қалды, сондықтан мембрана ақуызға жақынырақ жұқа болды, яғни. Ең аз толқулар байқалды, олар үшін гидрофобты бөліктің ұзындығы () парақшаның қалыңдығына () сәйкес келеді. Ұзын гидрофобты бөлігі бар ПМҚ үшін () қарама -қарсы парақша ортаңғы жазықтықтан иілген (2 -сурет b). PMP шекарасындағы ортаңғы жазықтықтан абсолютті ауытқулар гидрофобты бөліктің ұзындығымен дерлік сызықты түрде өсті, яғни . PMP енгізілген парақша тек сол жаққа қарай сәл ғана қисайған (2 -сурет b), яғни ақуызға жақын мембрананың қалыңдығының () жоғарылауы пайда болды.

Содан кейін біз мембраналық жапырақтардың қалыңдығын анықтадық, яғни жапырақшаның ішінде липидті бастар мен құйрықтардың орташа қашықтығы. PMP ендірілген парақша қандай ақуыз енгізілген болса да, оның қалыңдығын біршама өзгертті (деректер көрсетілмеген). PMP -ге қарама -қарсы парақша гидрофобты бөлігінің ұзындығына байланысты елеулі өзгерістерді көрсетті (3 а сурет). Атап айтқанда, гидрофобты бөліктің ұзындығы елеусіз әсер еткен кезде, парақшаның күшті қысылуы пайда болды, өйткені гидрофобты бөлік қарама-қарсы парақшаға қатты ену үшін тым қысқа болды. Бұл тұжырым липидтердің бағдарлау параметрінің төмендегенін, яғни осы белоктарға тура қарама-қарсы орналасқанда қосқабатты нормаға азырақ тураланғанын байқау арқылы расталады (3 b-сурет). Сонымен қатар, қысқа протеиндер қарама -қарсы парақта липидті бағдарлаудың өзгеруіне әкелді: мұнда липидтер екі қабатты қалыптыға сәйкес келеді, яғни жоғарылайды. Ақуыз ендірілген парақшада PMP -ге жақын жерде липидті бағдар да әсер етті. -ға жақын липидтер қаттырақ қисайған, ал олар гидрофобты бөлігі ұзағырақ белоктар үшін қалыпты бет бойымен жақсырақ тураланған. Осылайша, барлық жағдайда липидтердің еркіндігі шектеледі, яғни энтропикалық тұрғыдан қолайсыз болып табылатын бұзылмаған мәннен ауытқиды.

(а) Конструкцияны енгізгенде, қарама -қарсы парақшаның қалыңдығы ақуыздың жанында бұзылмаған мәнге байланысты айтарлықтай өзгереді. Гидрофобты бөліктің ұзындығы ұлғайған кезде парақшаның қысылуы артады. (b) Жоғарғы және төменгі жапырақшадағы липидтердің бағдарлану ретінің параметрі (липидтердің екі қабатты қалыптыға орташа бұрышы бола отырып) PMP маңында да әсер етеді. Ақуыздан алыс жерде ғана бұзылмаған мәнге жақындау байқалады. Жоғарғы жапырақшаның жергілікті қысылуымен келісе отырып, ПМП -ға қарама -қарсы липидтердің күшті қисаюы байқалады. Аңыздағыдай аңыз.

Жоғарыда келтірілген нәтижелерді толықтыру үшін біз парақшалар арасындағы орташа қашықтықты, яғни әр парақтағы липидті түйіндердің орталықтарының орташа қашықтығын талдадық (2 -суретті қараңыз). Нәтижесінде біз ең қысқа ақуызға жақын қашықтықты () таптық, алайда ешқандай өзгеріс байқалмады. Ұзынырақ белоктар үшін ( ) қашықтық сәйкесінше , , және , артады.

Қорыта айтқанда, липидтердің қисаюы мен екі қабатты қалыңдығы бойынша біздің нәтижелеріміз алдыңғы бақылаулармен сәйкес келеді [31]. Бұл нәтижелерден асып түсе отырып, бізде әр моноқабаттың сандық бұзылыстары мен бір қабатты қосылыстардың ұзындығы өзгерді.

Перифериялық мембрана ақуыздарының диффузиясы

Липидті қос қабатқа перифериялық мембраналық ақуызды енгізу арқылы туындаған жергілікті мембраналық бұзылулардың мөлшерін анықтай отырып, біз келесіде бұл ақуыздардың мембрананың ішінде қалай таралатынын сұрадық. Трансмембраналық ақуыздар үшін әйгілі Саффман-Дельбрук қатынасы [32] кіші радиустар үшін логарифмдік өлшемге тәуелділікті болжайды ( ) (1) Мұндағы мембрананың қалыңдығы мен тұтқырлығы, ақуыз радиусы, Эйлер тұрақтысы және мембрананың үстіндегі ( ) және астындағы ( ) сұйықтықтың тұтқырлықтарының қосындысы [33]. Теңдеудің жарамдылығы. (1) модельдеу [34] және эксперименттер [35] - [37] арқылы расталды.

Перифериялық мембрана ақуыздарының мөлшерге тәуелді диффузиясы да теңдеуде сипатталғанын анықтау үшін. (1) , біз радиустары әртүрлі ( ) жалғыз PMPs ( ) липидті қос қабатқа ( ) ендірдік. DPD-де жұмсақ ядролық потенциалды қолданудың арқасында импульс пен жаппай тасымалдау бір уақытта жүзеге асады, бұл өте кіші жүйелерде де көлік қасиеттерінің сенімді санына мүмкіндік береді. Тепе-теңдік орнатқаннан кейін белоктың орны қадамдар үшін бақыланды. Бұл кезеңде белоктар орташа қашықтыққа жылжиды. Позициялардың уақыттық қатарынан біз ақуыздың (уақыт бойынша орташа) квадраттық орын ауыстыруын анықтадық. Кейіннен диффузиялық коэффициент орташа квадраттық ығысуды сәйкестендіру арқылы алынды. Диффузия коэффициентін анықтаудағы белгісіздік бір параметр параметрлері үшін бірнеше жүгіруден қарағанда төмен болды. Анықтама ретінде біз 5 гидрофобты моншақ қабаты бар трансмембраналық ақуыздың диффузиялық коэффициенттерін және бір липидті анықтадық. Соңғысы белоктардың барлық диффузиялық коэффициенттері салыстырылатын диффузия коэффициентін берді.

Тұтқырлығы әртүрлі екі сұйықтықты бөлетін мембрана жағдайына ұқсас, біз PMP үшін алдын ала ойластырдық, өйткені белоктың үстіңгі жағы қоршаған суды сезінеді, ал оның түбі қос қабаттың өзегіне көмілген. Сондықтан ақуыздың ену тереңдігіне байланысты өзгереді деп күтілді. Демек, теңдестіруде ашық сәйкестік параметрі ретінде пайдаланылды. (1) . Екінші сәйкестік параметрі болды.

Нәтижесінде біз мына теңдеуді таптық. (1) барлық симуляцияланған ақуыздардың өлшемге тәуелді диффузия коэффициенттеріне тамаша сәйкестікті қамтамасыз етеді (4 а-сурет). Біздің күткенімізден айырмашылығы, гидрофобты бөліктің ұзындығын ұзарту арқылы ақуыздың ену тереңдігі жоғарылаған кезде айтарлықтай өзгеріс байқалмады (4 -б сурет). Алайда, өзгеріс ақуыздың гидрофобты бөлігінің ұзындығына пропорционалды болды, (сурет 4 б). Бұл нәтиже ақуыз трансмембраналық ақуыздың тұтқыр тұтқырлығын () сезбейтінін көрсетеді, бірақ ену тереңдігінің аз болуына байланысты аз ғана бөлігі. Диффузия коэффициенті трансмембраналық ақуызбен сәйкес келді. Біздің модельдеуімізде ақуызбен бірге жүретін липидтердің айтарлықтай сақталуын байқамадық. Мүмкін, ірі түйіршіктеу және жұмсақ потенциалдарды қолдану (яғни импульстің массалық таралуға төмен қатынасы) бұл күтілетін қысқа мерзімді динамикалық жиындардың пайда болуын жұмсартады.

(а) Перифериялық мембрана ақуызының диффузиялық коэффициентінің оның радиусына тәуелділігі теңдеуде жақсы сипатталған. (1) липидтің диффузиялық коэффициентін білдіреді, симуляциялық моншақтың өлшемі. Белоктар толтырылған шеңберлермен, алмаздармен, квадраттармен және сәйкесінше ашық шеңберлермен, квадраттармен белгіленеді. Қате жолақтары символ өлшемінен кіші. Назар аударыңыз: жақсы көріну үшін, сәйкесінше қисықтардың жылжытылмаған коэффициентімен жылжытылған қисықтар ең жоғарғы қисықпен сәйкес келеді. (b) Теңдеудегі тұтқырлық. (1) (мұнда өлшемсіз шама ретінде көрсетілген) ақуыздың ену тереңдігін жоғарылатқанда жүйелі түрде өзгермейді. Керісінше, бетінің тұтқырлығы (өлшемсіз мөлшерде көрсетілген) ену тереңдігімен сызықтық өсуді көрсетеді.

Дезекция кезінде, яғни мембрананың үлесін алу кезінде, екеуі де липидтермен үйкелістен туындайтынын атап өткен жөн. Біз бұл айырмашылықты PMP липидтермен жасайтын әртүрлі контактілерге жатқызамыз: ақуыздың түбі негізінен липидті құйрық моншақтарымен байланыста болса, бүйір беті ұзартылған липидті тізбектерге батырылады. PMP диффузиялық коэффициенттерін салыстыра отырып, біз олардың ең төменгі ( ) және ең үлкен ену тереңдігі ( ) арасында максимум өзгеретінін көреміз. Демек, гидрофобты сәйкес келмеуі бар трансмембраналық ақуыздар сияқты [38], [39] диффузиялық қозғалғыштықтың өзгеруі өте қалыпты.

Бір парақшада перифериялық мембраналық ақуыздардың кластерленуі

Перифериялық мембраналық ақуыздар липидті қос қабатты бұзатынын және липидтердің еркіндік дәрежесін төмендететінін ескере отырып, трансмембраналық ақуыздарға жүргізілген бақылауларға ұқсас ақуыздардың динамикалық, энтропиялық кластерленуін күтуге болады [10]. Біз бірінші парақшада орналасқан екі перифериялық мембраналық ақуыздың кластерлік әрекетін бірінші қадам ретінде зерттедік.

Перифериялық мембраналық ақуыздардың мембраналық өзара әрекеттесуін зерттеу және сипаттау үшін біз екі ПМП арасындағы ассоциацияның еркін энергиясын анықтадық. Осы мақсатта біз ақуызаралық қашықтықты қолшатырмен іріктеу арқылы орташа күштің (ПҚҚ) әлеуетін анықтадық (егжей-тегжейлі кіріспе үшін [40], [41] қараңыз). Мұнда біз талдауды біркелкі ақуыздар жұптарымен шектедік және ақуыздардың радиустары () мен гидрофобты бөлігінің ұзындықтары ().

Нәтижесінде, біз бір парақшадағы барлық PMP жұптары үшін PMF аз белок аралық қашықтықта терең минимумға ие екенін анықтадық (5 а-сурет), яғни белоктар қатар орналасқан кезде. Бұл функция байланыстырылған күйді, яғни (өтпелі) димердің пайда болуын көрсетеді. PMF-тегі минимумнан жоғары 2-3 әлсіз жағы минимум пайда болды, бұл PMP арасындағы 1-2 липидтері бар метатұрақты конфигурацияларды көрсетуі мүмкін. Ақуыз аралық үлкен қашықтықтар үшін ПМФ тұрақтыға айналады, яғни ПМР үлкен қашықтықта өзара әрекеттеспейді.

(а) Бір парақшада орналасқан екі PMP () орташа күшінің өкілдік потенциалдары. Минимум ақуыздар бір -біріне тиетін қашықтықта орналасқан (үзік сызық). Ақуыздың гидрофобты ұзындығының өсуімен байланыс энергиясы артады (сәйкесінше қара, қызыл және жасыл түспен көрсетілген). Өкілдік суреттер ақуыздың конфигурацияланған және шектелмеген күйін көрсетеді. Гидрофильді және гидрофобты топтар сәйкесінше қызыл/сұр және көк/сары түстермен көрсетілген. (b) байланыс энергиясы гидрофобты бөліктің ұзындығына қарай артады, . Кіші радиустар үшін ( ) димерлену энергиясының өте аз ғана өсуі байқалса, үлкен радиустар үшін ( ) күшті өсу байқалады.

Негізгі минимумның тереңдігі ақуыздан алыстағы PMF мәнімен салыстырғанда, яғни байланыстың беріктігін көрсетеді және демердің тұрақтылығын анықтайды. Гидрофобты бөліктің ұзындығына және ақуыз радиусына байланысты біз диапазондағы мәндерді байқадық (5 б-сурет). Трансмембраналық спиральдардың мембраналық байланысы үшін салыстырмалы эксперименттік мәндер хабарланды [42]. Біз үшін ең әлсіз байланыс энергиясын және ең күшті байланыстыруды байқадық (5-сурет б). Гидрофобты бөліктің берілген ұзындығы үшін ақуыз радиустары көбейеді. Бір қызығы, негізгі минимумның ені PMP өте қысқа болған кезде ақуыз радиусымен әрең өзгерді ( : ені ). Ұзын гидрофобты бөліктер үшін () радиуспен ені біртіндеп өсті (дейін).

PMF димерлердің нақты тұрақтылығымен байланыстыру үшін, біз энергияның минимумынан байланыссыз күйге дейінгі бірінші өту уақытын есептедік. Квадратты потенциалды ұңғымаға арналған Крамерс мәселесін шеше отырып, болжам квадраттық түрде потенциалдың еніне және экспоненциалды потенциалдық тереңдікке байланысты болады (). Демек, димер тұрақтылығы үшін басым үлес . Толық интеграция нәтижесінде s ms таптық (S1,S2 кестелерін қараңыз).Салыстыру үшін біз диффузиялық қозғалыстың әсерінен диссоциациялануы мүмкін алдын ала құрылған димерлердің қызмет ету мерзімін бақыладық. Бұл тәсілдің қол жетімді өмір сүру кезеңдері жоғарыда есептелген бірінші өтудің орташа уақыттарымен өте жақсы келісілді.

Қысқаша айтқанда, біз гидрофобты бөліктің ұзындығы мен радиусын ұлғайту үшін күшейтілген бір парақта ПМР арасындағы мембраналық делдалдық тартымдылықты таптық. Атап айтқанда, ақуыздардың гидрофобты зәкірі қарама -қарсы парақшаға енбеген кезде потенциалды тереңдік өте аз болатынын байқадық. Гидрофобты ұзындықтары мен радиустары бар белоктар үшін біз белоктардың димеризациялануының маңызды үрдісін көрсететін үлкен мәндерді таптық. Айта кету керек, бір парақшадағы ПМР кластерленуі ұқсас модельдеу зерттеулерінде де зерттелген [31], бірақ ПМФ анықталмады. Авторлар ақуыздар бір -біріне қарама -қарсы жапыраққа енген кезде кластерлер көлемінің ұлғаюын байқады, ал бір жапырақшамен шектелген ақуыздар үшін кластерлеу байқалмады. Бұл бақылаулар мұнда табылған энергия мәндеріне сәйкес келеді.

Қарама -қарсы парақшаларда перифериялық мембраналық ақуыздардың шоғырлануы

Перифериялық мембрана белоктары қос қабаттың қарама-қарсы жапырақшаларында орналасқанда өзара әрекеттесетінін және потенциалды димеризацияланатынын анықтау үшін біз екі парақшаның (және ) әрқайсысына бір белокты енгізіп, орташа күш потенциалын (PMF) қайтадан анықтадық. Жоғарыда айтылғандай, біз белок радиустары () мен гидрофобты бөліктердің ұзындығын () жүйелі түрде өзгерттік.

Жоғарыда келтірілген нәтижелерге ұқсас, барлық ПМФ ақуыз аралық қашықтықта метастабильді димерленген күйді көрсететін терең минимумды көрсетті (6 а сурет). Бір парақтағы PMP-ден айырмашылығы, PMF минимумы әдетте өте аз қашықтықта орналасқан (), яғни ПМП-лар жеке протеиндер жинақталған конфигурацияны қабылдаған парақша димерлерін құрады (6 а суреттегі суреттерді қараңыз). . Дүниежүзілік минимум кейде аралық қашықтықта кішкене итермелейтін тосқауылмен жүрді, оны димерленген күйге жету үшін еңсеру керек. Байланыс энергиясы, , белок радиусына және гидрофобты ұзындықтардың қосындысына , (сурет 6 б). Ең күшті байланыс өте қысқа және ұзын PMP ( және ) комбинациялары үшін табылды. Бір моноқабатқа () жақсы сәйкес келетін PMP қатысатын комбинациялар (бірге) орташа мәндерін көрсетті. Ең әлсіз байланыстыру үшін, және және комбинациялары үшін көрінді. Ақуыз радиустарын ұлғайту үшін ПМФ тән пішіні сақталды, алайда потенциалды ұңғыманың тереңдігі () өсті, яғни димерлер тұрақты болды. Бұл жерде ең үлкен радиуста (яғни ақуыздың диаметрі 3-4 нм) ерекше күшті байланыстың пайда болғанын атап өткен жөн. Модельдің қарапайымдылығын және тиісті толқындардың бір бөлігін және перистальтикалық қос қабатты режимдерді басуы мүмкін шекті өлшемді әсерлерді ескере отырып, бұл мән артық бағалау болуы мүмкін. Осы төтенше жағдайларды болжауға болатын кейбір сандық түзетулерге қарамастан, радиустарды ұлғайту үшін димерлерді тұрақтандырудың жалпы үрдісі біздің модельдеулердің дәйекті нәтижесі болып табылады.

(a) Қарама-қарсы парақшаларда орналасқан екі PMP ( ) орташа күшінің репрезентативті потенциалдары. Жеткілікті қысқа ақуыздардың комбинациясы үшін (, қара қисық, қызыл қисық) жоғалатын қашықтықта минимум пайда болады. Шамалы моншақтар арқылы ПМП құрылысы нәтижесінде шамалы ұлғаю байқалады, яғни (i) конфигурациясы (ii) қондырғысынан энергия жағынан тиімсіз. Ұзын ақуыздар үшін (жасыл қисық) PMP-тің қатар орналасуы байқалады, сондықтан минимумы үлкен қашықтыққа ауысады. Өкілдік суреттер талқыланған гидрофильді және гидрофобты топтардың сәйкесінше қызыл/сұр және көк/сары түспен көрсетілгенін көрсетеді. (b) мембраналық анкерлік ұзындықтарды және PMP жұбын өзгерту кезіндегі димеризация қабілетінің фазалық диаграммасы. Түспен кодталған мәндері байланыстыру күшін көрсетеді. Түсті кодтау мәндерінің логарифмдік шкаласы қара түспен белгіленген.

Димердің пішіні тартылған PMPs гидрофобты бөліктерінің ұзындығына айтарлықтай тәуелді болды (6 а-суреттегі суреттерді қараңыз). Екі PMP гидрофобты ұзындығы жеткілікті аз болған кезде (немесе ), белоктар стек тәрізді димерді (төменнен төменге орналасу) құрады және PMF-тегі жаһандық минимумның ені шамамен ақуыздардың диаметріне тең болды. Демек, ақуыздар бір -бірімен қабаттасқанша тартылады. Үлкенірек қашықтықтар үшін PMF-де димер пайда болғанға дейін липидтер мен ақуыздарды қайта реттеу үшін жасалуы керек жұмысты көрсететін шағын итеруші бөлік пайда болды. Бұл итермелейтін тосқауылдың биіктігі ақуыздардың екеуі де өте қысқа болғанда (,) немесе аз дәрежеде біреуі өте ұзын болғанда (,) үлкен болды. Атап айтқанда, екі өте қысқа ақуыздың () комбинациясы энергия тосқауылын берді, сондықтан бұл ақуыздардың өздігінен димерленуі өте мүмкін емес. Екі ақуыздың гидрофобты якорлары қарама -қарсы параққа енгенде (және), димерлеу серіктестері қатар орналасқан (6 а суреттегі суретті қараңыз). Бұл жағдайда PMF тартымды бассейні бір парақтағы PMPs нәтижелеріне өте ұқсас болды, яғни ақуыз аралық қашықтықтан тыс жерде іс жүзінде ешқандай тартымдылық байқалмады.

Бұрынғыдай біз димердің қызмет ету мерзімінің өлшемі ретінде орташа бірінші өту уақыттарын да есептедік (S3,S4 кестелерін қараңыз). Бір парақшада орналасқан PMP-мен салыстырғанда, PMF-тегі тереңірек және кеңірек минимумдарға байланысты көлденең парақ димерлері әдетте тұрақты болды. Шығу уақыттары s-ден 100 мс-ге дейін және одан да көп болды, бұл жеткілікті тұрақты көлденең жапырақ димерлерінің кең ауқымы түзілуі мүмкін екенін көрсетеді. Тағы да, белоктардың диффузиялық диссоциациясын бақылау арқылы алдын ала құрылған димердің тұрақтылығын тексеру ұқсас өмір сүруге мүмкіндік берді.

Нәтижелерімізді қорытындылай келе, біз жұп перифериялық мембраналық ақуыздың радиусы мен/немесе гидрофобты ұзындығының өзгеруі бастапқы тәуелсіз ақуыздардың парақаралық кластерленуін туғызатын құрал екенін анықтадық. Мұндай димеризация оқиғасын тиімді, метастабилді трансмембраналық ақуыздың түзілуі ретінде қарастыруға болады. Біздің байқаулар бұдан әрі екі ақуыздың мембранадан тұратын димер түзуге бейімділігі екі параметрге тәуелді екенін көрсетеді: (а) ақуыз иесінің қалыңдығынан ұзын немесе қысқа болған кезде әрбір жеке белоктың мембрананың бұзылуынан. бір қабатты және (b) парақша димерінің трансмембраналық тиімді доменінің гидрофобты сәйкестігі туралы. Осы мәлімдемемен келісе отырып, біз белоктардың комбинациясы ең кішкентай радиустарда күшті димеризацияны көрсеткенін анықтадық ( ). Осы белоктардың әрқайсысының ұзындығы моноқабаттың қалыңдығына нашар сәйкес келетінімен, нәтижесінде алынған димер өте аз ғана гидрофобты сәйкессіздікке ие (тиісінше және ). Керісінше, ақуыз комбинациялары үлкен радиустар () үшін ұзағырақ қашу уақытын көрсетті, өйткені бір қабатты қалыңдыққа ең жақсы сәйкес келеді. Димердің () өте сәйкес келмеуі жағдайында, қашудың ұзақ уақыттары бар елеулі димерация тек өте үлкен радиустар үшін байқалады.

Ақуыздың үлкен жиынтықтарын құру

Қарама-қарсы парақшалардағы перифериялық мембраналық ақуыздардың үлкен саны жоғары ретті олигомеризацияны көрсете алатынын тексеру үшін біз әр жапыраққа 5 PMP радиусын кездейсоқ позицияда енгіздік. Белоктар еркін диффузиялық және өздігінен агрегацияланатын болды. Үлкен радиустар () үшін біз әр параққа тек 3 ақуызды енгіздік, бұл шектеулі өлшемдердің әсерін болдырмайды. Тағы да, гидрофобты бөліктердің, PMPs ұзындығы жүйелі түрде өзгерді.

Нәтижесінде біз бірінші кезекте біз бұрын байқаған ПМП парақша димерлерінің өздігінен түзілуін таптық (6-суретті қараңыз). Кейіннен, алайда, бұл димерлердің диффузия арқылы бір-бірімен кездесуі үшін жеткілікті ұзақ өмір сүрген кезде бұл димерлер одан да үлкен жинақтарды құру мүмкіндігін көрсетті (сурет 7 а). Атап айтқанда, және комбинациясы үшін алдын ала құрастырылған димерлердің тримерлерінің түзілуін байқадық. Уақытты модельдеу курсынан біз бұл тримерлердің қызмет ету мерзімін анықтадық. Олар радиустары () -дан () -ға және () -ке дейін ұлғайған сайын өсті.

Кросс-парақ димерлері (6-суретті қараңыз) үлкенірек олигомерлерді қалыптастыру мүмкіндігін көрсетті, мысалы. димерлердің тримерлері (сол жақта) немесе үлкен жанама кластерлер үшін (оң жақта).

Және комбинациясы үшін біз ең кіші радиуста () кез келген кластерленбестен парақшалы димерлердің пайда болуын байқадық. Үлкен радиустар үшін ( ), алайда, тұрақтылығы жоғарылайтын көлденең жапырақты димерлердің қайтадан тримерлері пайда болды. Сипатталған жағдайларда парақша димерлерінің ұзындығы болды (жоғарғы және төменгі ақуыздағы бас топтарының орташа қашықтығы). Кросс-парақ димерінің тиімді трансмембраналық бөлігі, демек, бұзылмаған қос қабатпен шағын, жинақтауды жүргізетін гидрофобты сәйкессіздікті ( ) тудырады.

Біз сондай-ақ, үлкен радиустар () үшін димерлердің димерленуін/тримерленуін байқадық, егер алдын ала құрылған димерлерде теріс гидрофобты сәйкессіздік болса, яғни және () үшін және () үшін және (). Димерлердің жоғары олигомеризациясы байқалмады, және мұнда алдын ала дайындалған димерлер жоғалып бара жатқан сәйкессіздікке ие болды (). Біз бұл нәтижелерден екі PMP-тің (мета) тұрақты димерінің абсолютті гидрофобты сәйкес келмеуі димерлердің жоғары олигомеризациясын тудыруы мүмкін мембраналық делдалдық тартымдылық береді деп тұжырымдаймыз. Бұл нәтиже трансмембраналық ақуыздың аздаған гидрофобты сәйкессіздігінің өзінде өтпелі кластерлеуді тудыруы мүмкін тартымды, мембраналық өзара әрекеттесу пайда болады деген түсінікке сәйкес келеді [10], [14]. Парақшалы димерлер осыған байланысты трансмембраналық ақуыздарға ұқсас әрекет етеді.

Үлкен кластерлердің вариантты түрінің пайда болуы әр түрлі парақшалардағы ПМП қарама -қарсы парақшаға (,) еніп жатқанда байқалды (7 б сурет). Бұл кластерлер бұрынғыдай тиімді трансмембраналық құрылымдардан тұрмады, керісінше белоктардың жанама жиыны болды. Кластерлердегі ақуыздардың орташа саны 3-6 болды және кластерлердің өмір сүру ұзақтығы (имитациялық уақыт курсынан анықталғандай). Қосылған PMPs гидрофобты ұзындығы мен радиусының ұлғаюымен кластердің өлшемі мен тұрақтылығы қайтадан артты. Ең күшті кластерлену ең үлкен радиуста ( ) байқалды. Мұнда мембранадағы барлық ақуыздар бір ғана үлкен кластерге жиналды, олар бүкіл модельдеу үшін тұрақты болды ().

Нәтижелерімізді толықтыру үшін біз сондай-ақ үлкен радиусы бар бір ақуыз ( ) төменгі жарғақшаға енгізілген, ал жоғарғы парақшада шағын радиусы бар 5 ақуыз ( ) орналасқан модельдеулерді орындадық. Нәтижесінде біз ұсақ ақуыздар қарама -қарсы парақта орналасқан үлкен ақуыздың үстіне жиналу үрдісін көрсеткенін байқадық (8 а сурет). Құрастыру дәрежесі, яғни үлкен белокпен тұрақты олигомеризацияланатын ұсақ белоктардың саны белоктардың гидрофобты бөліктерінің ұзындықтарының қосындысына байланысты. Өмір сүру ұзақтығымен күшті олигомеризация байқалды, мысалы, (үлкен ақуыз) және (ұсақ ақуыздар). Бұл жағдайда, әдетте, бір үлкен ақуыздың үстіне жиналған екі кіші ақуыз. Ең күшті әсер және үшін байқалды: төрт кішкентай ақуыз үлкен протеиннің үстіне жиналып, барлық модельдеу уақыты бойы сонда қалды ( ). Шынында да, стерикалық себептер бойынша бір үлкен ақуыздың астына төрт ұсақ ақуызды () орналастыруға болады. Кішкене және ірі ақуыздардың екеуі де қарама -қарсы параққа ену үшін жеткілікті ұзақ болған кезде, яғни біз ақуыздың жоғарыда орналаспағанын, керісінше үлкен ақуыздың шетінде орналасқанын анықтадық (8 -суретті қараңыз). Біз өте үлкен кластерді таптық, онда төрт ақуызға дейін үлкен ақуыз қоршалған, сондықтан ақуыз ұзындығы бірдей конфигурациялы пентамерлі (өмір бойы) кіші олигомерлерді құру бүкіл модельдеуде тұрақты болды ().

(a) Әртүрлі радиустары бар ақуыздарды пайдалана отырып, қарама-қарсы парақшада үлкен ақуыздың астындағы шағын PMP кластерін жиі байқауға болады. Төменгі параққа радиусы мен гидрофобты бөлігінің ұзындығы бар бір ПМП енгізілген, ал қарама -қарсы парақта радиусы мен гидрофобты бөлігінің ұзындығы бар төрт ПМП орналастырылған. Гидрофобты бөліктердің ұзындығына қарай қарама -қарсы парақта бір үлкен ПМП -нің үстінен тұрақты түрде жиналған төрт кіші ПМП дейін (кіші ПМП санын кодтайтын шеңберлердің толтырылу дәрежесі). Екі репрезентативті сурет репрезентативті фенотиптерді көрсетеді. (b) Біртекті емес мембраналарда ПМП -лар қарама -қарсы парақтағы (қалың) липидті микродоменнің астына немесе қасына жиі жиналады.

Соңында біз белоктардың бірі липидті микродоменмен ауыстырылған кезде жоғарыда сипатталған қарама-қарсы парақшалардағы ақуыздардың жиналуы да орын алғанын зерттедік. Осы мақсатта біз липидтердің екі түрінен тұратын асимметриялық қос қабатты құрдық, ал жоғарғы жапырақтағы липидтердің 10% ұзын липидтерден тұрады. Белгіленген параметрлерге байланысты (Әдістерді қараңыз) ұзын липидтер үстіңгі парақшада қалың микродоменді ( , липидтердің басынан липидтердің құйрығына дейінгі орташа қашықтық) құрады. Содан кейін бір PMP қарама-қарсы, біртекті парақшаға енгізілді. Тағы да, біз белок радиусы () мен гидрофобты ұзындығын () жүйелі түрде өзгерттік. Нәтижесінде белоктың параметрлеріне байланысты дәл конформациямен липидтер мен PMP колокализациясын байқадық. Жалпы алғанда, қысқа және орташа ұзындықтағы ( ) белоктар липидті микродоменнің үстінде жинақталған (сурет 8 б). Керісінше, біз ұзақ липидтердің ақуыздың шетіне локализацияланғанын, кейде оны қоршап алатынын байқадық. Сонымен, қарама -қарсы парақшадағы ПМР мен (қалың) липидті микродомендердің кластерленуі мембраналарда құрылым түзудің құралы болып табылады.


Талқылау

MAPK активациясында өтпелі наноөлшемді цифрлық коммутаторлар ретінде қызмет ететін K-Ras нанокластерлерінің қалыптасуы, Ras сигналын беру үшін өте қажет (5). K-Ras.GTP нанокластерлері қалай құрылады және K-Ras.GTP концентрациясының кең диапазонында K-Ras кластерленген фракциясын тұрақты деңгейде ұстап тұрудың қандай механизмі шешілмеген. Біз бұл мәселені K-Ras және Gal3 цитозолдық пулы арасындағы өзара әрекеттесу K-Ras нанокластерленуін плазмалық мембранада жүргізуде орталық рөл атқаратынын көрсету үшін Silico модельдеу арқылы осы мәселені шешеміз. Біз плазмалық мембранадағы K-Ras нанокластерінің динамикасын модельдеу үшін математикалық модель жасадық. Біз эксперименттік бақылауларды жүзеге асыруға қабілетті ықтимал модель параметрлерін іздеу және соқтығыс механизмдерін көрсететін оңтайлы бағаланған параметрлерді тексеру үшін генетикалық алгоритмді қолдандық. Сонымен қатар, эксперименттік жолмен анықталған ақуыздың таралу жылдамдығы мен диффузия механизмдеріне негізделген ақуыздардың соқтығысу жылдамдығын есептеуге арналған есептеу әдісі әзірленді. Есептелген соқтығысу жылдамдығы ақуыз санының кең диапазонында тұрақты болды, бұл плазмалық мембранадағы екі өлшемді Ras ақуызының таралуын сипаттау үшін біртекті реакция жүйесін қолдануды қолдайды. Модель Gal3 белгілі биохимиясына негізделген кластерленген Ras тұрақты үлесін сәтті жүзеге асырады және бұл тұрақты фракцияның негізгі механизмі плазмалық мембранаға тартылу үшін цитозолдағы Gal3 ақуызының болуын болжайды. Сонымен қатар, біздің модельдеулер ақуыз кешенінің түзілу ықтималдығы эксперименттік деректерді жүзеге асыратын байланыстыру жылдамдығын анықтау үшін тұрақты соқтығыс жылдамдығымен бірге пайдалану үшін пайдалы параметр екенін көрсетеді.

Біздің жарияланған EM және FLIM-FRET сандық бейнелеу нәтижелеріне негізделген [13], in  silico моделі плазмалық мембранаға K-Ras.GTP мономерлерінің еркін таралуымен молекулалық соқтығысу нәтижесінде  Gal3 ақуыздарын жинауды ұсынады. Алынған K-Ras.GTP-Gal3 кешендері Gal3 құрайтын белоктар арасындағы молекулалық өзара әрекеттесуге негізделген пентамералық кешендерге тез жиналады. Пентамералық нанокластерлер қосымша K-Ras.GTP немесе K-Ras.GTP-Gal3 кешендерін жинақтай алады. Дегенмен, біздің модельдеуіміз K-Ras.Gal3 пентамерімен соқтығысқаннан кейін қосымша K-Ras протеиндерінің сәтті қосылу ықтималдығы пентамерді құрастыру кезіндегіден әлдеқайда төмен болуы керек екенін көрсетеді, мүмкін, басқа биофизикалық ұстау механизмін көрсетеді. Мүмкіндіктің бірі-көп негізді домендер мен мембранаға Gal3 пентамері арқылы бекітілген бес K-Ras протеинінің салыстырмалы тұрақты кешені кластердің наноөлшемді липидті ортасын қайта құрады. Плазмалық мембранамен (36) байланысатын миристилденген аланинге бай Скиназа субстратының аналогиясы бойынша, қайта құру PS және PIP қоса алғанда қышқыл фосфолипидтердің жергілікті концентрациясының жоғарылауын қамтиды.2оң зарядталған K-Ras ақуыздарын одан әрі тартуға мүмкіндік береді, бірақ Гал3 ақуызы мен ақуызының тікелей өзара әрекеттесуінен туындайтын аффиненттілігі төмен.

Қандай нақты механизм болса да, біз тұжырымдаған модель бұрын K-Ras стехиометриясымен және нанокластердің қызмет ету мерзімімен (8 �) концентрацияға тәуелсіз K-Ras.GTP нанокластерлерінің маңызды нәтижесін береді. Модель сонымен қатар цитозолдағы Gal3-тің болуы K-Ras.GTP кластерленген фракциясының маңызды детерминанты болып табылатынын көрсететін біздің жақында жарияланған тәжірибе нәтижелерін қайталайды (13). Осылайша, Gal3 өрнегін өзгерту K-Ras арқылы сигнал беруді тікелей модуляциялайды (14,37). Бұл нәтижелер маңызды, себебі Gal3 экспрессиясы мен оның жасушаішілік локализациясы ісік түрлерінің бірқатарында өзгереді [38]. Кластерленген фракция MAPK каскадының (5) EGF тәуелді активациясына жасушаның сезімталдығының маңызды детерминанты болып табылатынын ескере отырып, жаңа деректер Gal3 цитозолалық пулын EGF арқылы MAPK активациясының модуляторы ретінде көрсетеді, сонымен қатар сигнал шығысы.  конкогенді мутантты K-RasG12V. Біріктірілген бұл деректер K-Ras арқылы ісік пайда болған кезде өзгерген Gal3 экспрессиясын көрсетеді.

Тұрақты күйдегі шешімдері бар қарапайым дифференциалдық теңдеу жүйесі үшін модельдегі кинетикалық жылдамдықтар жүйенің тепе-теңдік шарттарымен шектелуі керек. Дегенмен, біздің модельдеуіміз бұл жүйенің толық теңгерілмегендігін көрсетеді, мысалы, біз параметрлер жұбының мәндерін өзгерткен кезде, мысалы, а1 және d1бір мезгілде және пропорционалды түрде жүйенің тепе -теңдік қасиеттері өзгерді. Сонымен қатар, нанокластерлердің имитацияланған үлестірімдері экспоненциалды бола алмады және олардың мөлшері молекулалардың жалпы санына сәйкес келетін үлкен агрегатқа ие болмады.Бұл бақылаулар нанокластердің қалыптасуы белгілі бір негізгі тепе-теңдік емес процестермен реттелетінін көрсетеді. Шынында да, жүйе нанокластерлерді бөлшектеу және нанокластерлер ішінде Ras-Gal3 кешендерін бөлу сияқты бірқатар бір бағытты реакцияларды қамтиды. Сонымен қатар, Gal3 пентамерлерінің жылдам түзілуі қосымша Ras және Ras-Gal3 соқтығысуы нәтижесінде нанокластердің өсуіне қарсы Ras-Gal3 пентамер жинағы үшін өте әртүрлі байланысу жылдамдығына әкеледі. Тұрақты күйдегі шешімдер арқылы теңдестірілген және теңгерілмеген реакциялардың өзара әрекеттесуін егжей-тегжейлі талдау қызықты болар еді. Алайда, бұл қарапайым жаттығулар емес, өйткені біздің модельденген жүйеде 27 теңдеу бар және K-Ras.GTP, Gal3 және Ras-Gal3   түрлерін қамтитын теңдеулер күрделі. Болашақта нанокластерлік кинетиканы талдауға және нанокластерлік түзілудің негізгі физикасына тереңірек түсінік беруге басқа теңдеулер әдісі сияқты негізгі теңдеу әдісі қолданылуы мүмкін.

Бірқатар липидтермен бекітілген ақуыздардың плазмалық мембрананың ішкі және сыртқы жапырақтарында, атап айтқанда басқа Ras изоформалары мен GPI бекітілген ақуыздарда (7 𠄹,39,40) бөлек нанокластерлерде жұмыс істейтіні көрсетілген. Бұл ақуыздардың барлығында концентрацияға тәуелді емес кластерленген фракция және әр нанокластердегі ақуыз саны әр түрлі болса да, мономердің кластерленген ақуыздан асып кетуі байқалады. Біз әзірлеген модель K-Ras нанокластерлеуіне тән болса да, модельдің негізінде мономерлер мен димерлердің өзара әрекеттесуіне жылдам ықпал ететін механизм жатыр. K-Ras үшін бұл ынтымақтастық ақуыз-ақуыздармен байланыс арқылы қамтамасыз етіледі. Модельді жалпылауға тырысқанда, біз ұқсас негізгі механизм ақуыз-белок немесе ақуыз-липидті өзара әрекеттесу арқылы басқа нанокластерленген ақуыздар үшін жұмыс істей алады деп болжаймыз. Мұндай гипотеза модельдеу мен эксперимент арқылы оңай өңделеді және плазмалық мембранада липидтермен бекітілген ақуыздардың кездейсоқ ұйымдастырылуына ортақ биофизикалық принципті анықтауға мүмкіндік береді.


Жасушалық цикл ақуыздарының корреляциясын бағалау және параназальды синустың инверттелген папилломасы мен қабыршақты жасушалық карциноманың трансформациясындағы Ки-67 өзара әрекеттесуі

Қайталанатын синоназальды инвертті папиллома (ИП) синоназальды қабыршақты жасушалық карциномаға айналуы мүмкін. Біз иммуногистохимиялық әдіспен ақуыз экспрессиясының үлгілерін p53, p16, p21 және p27 экспрессиясы жасушалық цикл реттегіштеріне және PCNA (көбеюші жасушалық ядролық антиген) және Ki-67 пролиферация маркерлеріне жататынын анықтау үшін қолданамыз. папиллома және олардың 10-ы жалпақ жасушалы карцинома трансформациясымен. Инверттелген папилломамен салыстырғанда синоназальды тракттің скамозды жасушалық карциномасының трансформациясы бар IP-де Ki-67, p27 және PCNA деңгейлерінің айтарлықтай жоғарылауы анықталды. p16, p21, PLUNC (таңдай, өкпе және мұрын эпителийінің клон белогы) және p53 экспрессиясының вариациясы көп өзгермелі зерттеу арқылы синоназальды IP қатерлі трансформациясымен корреляцияланған жоқ. Алайда, біз бірнеше рет қайталанатын IP -лерде PLUNC өрнегінің жоғарылауын таптық. Ақырында, біз PCNA, p27 IPK жасушаларының көбеюіне ықпал ететін және синоназальды қабыршақты жасушалы карциномамен байланысты CDK1 -мен өзара әрекеттесе алатынын анықтадық. Ки-67 қатерлі трансформацияны тудыруы үшін жасуша циклінде жұмыс істей алады. Қорытындылай келе, бұл Ki-67 корреляциясын көрсететін алғашқы зерттеу, CDK1-мен әрекеттесетін PCNA қатерлі трансформацияға әкелуі мүмкін. Синоназальды IP -де PLUNC өрнегінің жоғарылауы адамның бірнеше рет қайталануына байланысты болды.

1. Кіріспе

Төңкерілген папиллома (ІР) - беттік эпителий жасушалары төмен қарай тірек ұлпасына дейін өсетін ісіктің түрі. Қуық, бүйрек жамбасы, несепағар, уретра, мұрын және параназальды синустардың барлығы ИП пайда болуы мүмкін аймақтар болып табылады [1]. Мұрынның немесе мұрын қуысының шырышты қабаты ИП көтергенде мұрынның бітелуі немесе бет ауруы немесе бас ауруы. Тыныс алу қабығынан шыққан ИП қатерсіз эпителий ісікке жататынына қарамастан, жергілікті инвазивтілік, қайталану жиілігі және қатерлі трансформация емдеуді қиындатады [3]. Қатерлі трансформация жылдамдығы 5-10% құрайды және олардың көпшілігі синхронды түрде скамозды жасушалық карциномамен кездеседі [4]. PCNA (көбейтетін жасушалық ядролық антиген) жасушалық цикл кезінде ДНҚ синтезі фазасында жасуша ядроларында антиген экспрессиясы ретінде әрекет етеді және қатерлі ісік болжамын қарастырады, бірақ IP-мен байланысы әлі де даулы болып табылады [5].

Циклин мен циклинге тәуелді киназа (ЦДК) жасуша циклінде пролиферация кезінде маңызды рөл атқарады және жасушалық циклдің әр түрлі фазаларына әсер етеді [6-9]. CDK1 жасуша пролиферациясының және қатерлі трансформация факторының өте маңызды бастамашысы болып табылады [10]. Керісінше, p21, P27 және CDK ингибиторлары CDK-ларды шектейді және жасушалық циклді тоқтатады [8]. p21 жасушалардың S фазасына енуін тежейтін G1 жасуша фазасының CDK тежегіші болып табылады. p27 сонымен қатар CDK-ге қосылып, p21 ретінде CDKI ретінде әрекет ете алады. p27 циклин E-CDK2, циклин A-CDK2 және циклин D1-CDK4 кешендерімен әрекеттеседі, жасуша пролиферациясына және апоптозға әсер етеді [6, 7].

MIB-1 моноклональды антиденесімен анықталған Ki-67 антигенінің пролиферация маркері G0-ден басқа G1, S, G2 және M жасушаларының барлық фазаларында көрініс табады [8]. Ki-67 экспрессиясы сонымен қатар ісік мінез-құлқына, ісіктің патологиялық дәрежесіне және әртүрлі карциномалардағы ерте қайталануға байланысты болды [11-15].

Қатерлі ісіктермен трансформацияланған немесе синхронды IP-ге қатысты біз сонымен қатар p16, p53, Ki-67 және PLUNC (таңдай, өкпе және мұрын эпителийінің клон ақуызы) IHC зерттеуін жасаймыз. Р16 - G1 -ден S -жасушалық фазаға баяулайтын және қатерлі трансформацияның алдын алатын ісікті басатын ақуыз [8]. PLUNC - мұрын -жұтқыншақ қатерлі ісігіне қарсы ісікке қарсы әсері бар туа біткен иммундық материал, бірақ оның синоназальды IP -ге қатыстылығы анықталған жоқ [16].

PCNA, p53, p21, p27 және Ki-67 зерттеулері олардың ісік ауқымына және синоназальды IPs емдеу нәтижесіне сәйкес келетінін білу үшін жасалды [8].

Бұл зерттеудің мақсаты-p53, p21, p27 жасуша циклінің реттегіштерінің, Ki-67, p16, PCNA пролиферация маркерінің және PLUNC туа біткен иммундық материалдың синоназальды АЖ-нің қайталануы мен қатерлі трансформациясындағы рөлін зерттеу. Сондай-ақ, біз Ki-67, PCNA және p27 ықтимал болжамды факторлары CDK-ге есептеу модельдеу арқылы сәйкес келетін-келмейтінін зерттедік.

2. Материалдар мен әдістер

Қытай медициналық университеті ауруханасының бөлімшесінен 2000 жылдың қаңтарынан 2010 жылдың маусымына дейін синоназальды ИП-ның 60 жағдайы және скамозды жасушалық карциноманың трансформациясы бар ИП-ның 10 жағдайы ретроспективті түрде медициналық жазбалардан жиналды және қаралды. 10% формалинмен бекітілген және парафинде дайындалған барлық тіндер АХК зерттеулеріне авидин-биотин-пероксидаза кешенді әдісімен қолданылды. Тінтуірдің моноклональды антиденелері (mAb), анти-p16 (Neomarkers, DCS-50, 200 мг/L), anti-p21 (Neomarkers, MS 387-P, 200 мг/L), anti-p27 (Neomarkers, MS 256-P) , 200 мг/л), анти-p53 (Neomarkers, RM 9105-S), Ki-67 (Neomarkers RM 9106-S) PCNA және PLUNC (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, АҚШ) арқылы иммуногистохимия үшін қолданылды. стрептавидин-биотин пероксидаза әдісі [11]. Ксилол тіндердің барлық бөліктерін депарафинизациялау үшін қолданылды, содан кейін спирт сериясымен қайта гидратталды, соңында тазартылған суға қанық болды. Содан кейін тін фосфатты буферлі тұзды ерітіндіге ауыстырылды, оған 0,3% сутегі пероксидазасының ерітіндісі қосылып, эндоген пероксидазаның белсенділігін бөлме температурасында 10 минут бойы тежеді, содан кейін Трис буфері жуылады. Содан кейін кесінділер микротолқынды пеште цитрат буферінің ерітіндісінде (10 ммоль/л рН, 6,0) 15 минут бойы қайнатылған. Бастапқы антиденелер p53, p21, p27, p16, PCNA, Ki-67 және PLUNC бөлме температурасында 60 минут бойы бір-бірден қолданылды [11].

Содан кейін бөлме температурасында 15 минут бойы байланыстырушы антидене мен стрептавидин пероксидаза кешенін (DAKO LSAB жинағы, K-0675 Carpinteria, CA) қосамыз. 0,05% диаминобензидин тетрагидрохлориді (DAB) тіндердің бояуы үшін 15 минут бойы қолданылды және ақырында екі рет Трис буферімен жуылды [8, 11].

Бөлімдерді ионсыздандырылған сумен жуғаннан кейін Майер гематоксилинімен боялған. Әрбір жағдайда иммундық боялған ядролардың саны анықталды. Барлық санау оң ядроларды/жасушалардың жалпы санын бағалау үшін 1000x өрісінде стандартты жарық микроскопында орындалды. Әр бөлімде он өріс немесе кемінде 500 ұяшық есептелген. Егер ісік жасушаларының 10% -ында бояу болмаса немесе болмаса, ісік бөлімдері теріс деп саналды. Жасушалардың 10-30% реакцияға оң болған кезде 1+ балл қойылды. Жасушалардың 30-50% реакцияға оң болған кезде 2+ балл қойылды. Қашан 3+ балл қойылды & gtРеакцияға жасушалардың 50% -ы тиісінше оң болды (1 және 2 -кестелер) [17]. Статистикалық маңыздылық Пирсонның хи-квадрат сынағы немесе бір айнымалы талдау үшін Фишер нақты сынағы және көп айнымалы талдау үшін көп логистикалық регрессия сынағы қолданылды. Нәтижелер статистикалық тұрғыдан маңызды болып саналды

Протеин-белок қондыру CDK1-мен байланысқан қатерлі трансформацияның үш ықтимал болжамды факторын талдау үшін ZDOCK бағдарламасы [18] арқылы жүзеге асырылды. Бұл зерттеуде табылған мүмкін механизмді көрсету үшін біз Ki-67, p27 және PCNA-ның CDK1-мен өзара әрекеттесуін есептеу биологиясы арқылы есептейміз. Біз ZDOCK байланыстырушы болжамынан кейін кешендердің тұрақтылығын бақылау үшін GROMACS 4.5.5 бағдарламасын [19] қолдандық. MD жүйесінің ортасы жүйені бейтараптандыру үшін 0,145 М NaCl концентрациясында Na және Cl иондары бар 1,2 нм қашықтықтағы су қорапшасы бар TIP3P су модельдеуінде орнатылған. Біріншіден, біз энергияны азайту үшін ең тік түсу алгоритмінде 5000 циклдік қадамдарды орнаттық. Екіншіден, тепе -теңдік үшін МД симуляциясын қамтамасыз ету үшін температураның тұрақты динамикасы (NVT типті) шарттары қолданылды және 1 секунд уақыт ішінде орындалды. Соңғы қадамда тұрақты қысым мен температура динамикасы (NPT түрі) 5000 ps уақыт аралығындағы өндіріс үшін орнатылды. Модельдеу процесі кезінде жүйенің температурасы 310 К етіп орнатылды. Траекторияны талдау үшін біз сәйкесінше орташа квадраттық ауытқуды (RMSD) және айналу радиусын (Rg) санау үшін GROMACS 4.5.5 бағдарламалық құралын қолдандық. МД сәйкестендіру деректерінің сериялары барлық өндіріс кезеңдерінің әрбір 20 пс зерттелді.

3. Нәтижелер

Бұл зерттеуге барлығы 55 еркек пен 15 әйел қатысты. Олардың 60-ы IP, ал қалған 10-ы қатерлі трансформациямен жиналған синоназальды IP. Жасы - бұл

25 жастан 78 жасқа дейін. Дақтар PLUNC деңгейінің едәуір жоғарылағанын көрсетті, бірақ IP қайталануы бар науқастарда Ki-67, p53, p21 және p27 деңгейлерінің төмендеуі анықталды (1-кесте). Біз сонымен қатар синоназальды жасушалы карциноманың трансформациясы бар синоназальды IP-лерде синхронды қатерлі ісігі жоқ жоғары PCNA, Ki-67 және p27 таптық (2-кесте). Жоғары PLUNC экспрессиясы синоназальды IP бар емделушілерде көптеген синус хирургиясымен байланысты. Дегенмен, PLUNC өрнек деңгейі IP-нің SCC-ге қатерлі трансформациясымен корреляцияланбайды. Біз сондай-ақ 1, 2, 3 және 4 суреттерде PCNA, Ki-67, p27 және PLUNC үшін әр түрлі деңгейдегі IHC өрнегін көрсеттік. 5 және 6 суреттердегідей операцияға дейінгі МРТ немесе КТ сканері барлық науқастар үшін орындалды. .


(а)
(b)
(а)
(b)
(а)
(b)
(а)
(b)
(а)
(b)
(а)
(b)
(а)
(b)
(а)
(b)
(а)
(b)
(а)
(b)
(а)
(b)
(а)
(b) Қатерлі трансформациямен синоназальды инверттелген папилломаның МРТ (коронарлық көрініс) және синустық томография (осьтік көрініс).

Ki-67 жоғарылаған иммуногистохимиялық бояу синоназальды IP-де де қайталануы мен қатерлі трансформациясы бар Пирсонның хи-квадраттық сынағы мен көптеген логистикалық регрессия сынағы бойынша қайталануы мен қатерлі трансформациясы бар, 1 және 2 кестелерде және 2 (а) кестеде көрсетілген. Сондықтан жоғары Ki-67 индексі болжам мен қатерлі болжамды маркерлер үшін маңызды фактор болып саналуы мүмкін. Біз тіпті Ki-67 және PCNA IHC экспрессиясының айтарлықтай жоғарылаған деңгейін және төменгі p27 деңгейін зерттеуді біріктіріп, біздің сауалнамада синоназальды IP бар науқастарда қатерлі трансформацияның жоғары тенденциясын болжауға болады.

Нәтижесінде біз PCNA мен CDK1, Ki-67 және CDK1, p27 және CDK1 болжамдық факторларын анықтаған арасындағы соңғы молекулалық динамикалық зерттеулермен бірнеше қондыру талдауларын жүргіздік, олардың барлығы 7-суретте тұрақты қондыруды көрсетті және олардың қондыру көрсеткіші де ZDOCK бағдарламасы. ZDOCK CDK1 мен Ki-67, CDK1-p27 және CDK1-PCNA ең жақсы 10 қондыру позасын құрды. Біз ақуыз-ақуыз әрекеттесуінің тұрақтылығын талдау үшін ең жақсы қондыру ұпайын таңдадық. CDK1 байланыстыру баллына Ki-67, p27 және PCNA мәндері ZDOCK бағдарламасы бойынша тиісінше 20,92, 21,72 және 24,32 болып табылады. Негізгі қалдықтар Gly9, Ser10, Ile11, Leu12, Lys13, Lys14 және Val15 болып табылады, олар Ki-67 және p27 үшін қызыл таспада көрсетілген CDK1-ге негізгі байланыстырушы домендер болды (7-сурет). Біз осы үш ақуыздың CDK1 -мен өзара әрекеттесуін көру үшін осы негізгі қалдықтар үшін МД талдауын жасадық. Ki-67, p27 және PCNA көмегімен CDK1 кешенінің МД симуляциясынан кейін біз 5000 ps модельдеу ретінде RMSD талдауын жүргіздік. Барлық үш ақуыздың (Ki-67, p27 және PCNA) 1000 ps модельдеу уақытынан кейін тұрақты ауытқуы бар екені анықталды (8-сурет).


(а)
(b)
(с)
(а)
(b)
(с) Мақсатты ақуызы бар (көк) CDK1 (жасыл) ең жақсы қондыру позалары: (a) Ki-67, (b) p27 және (c) PCNA. ZDOCK ұпайлары бар белок-ақуыздық онды кешен ZDOCK бағдарламасы бойынша жасалды. Ki-67, p27 және PCNA бойынша ZDOCK бойынша ең жоғары балл сәйкесінше 20,92, 21,72 және 24,32 болып табылады. Ki-67 және p27 негізгі байланыстыру қалдықтары қызыл түске боялған, ал негізгі қалдықтарға Gly9, Ser10, Ile11, Leu12, Lys13, Lys14 және Val15 жатады.

(а)
(b)
(с)
(а)
(b)
(с) 5000 пс симуляция уақытында (a) Ki-67, (b) p27 және (c) PCNA бар CDK1 кешендерінің барлық атомдарының RMSD талдауы. Барлық кешендер 1000 ps модельдеу уақытынан кейін тұрақты ауытқуға бейім.

9-суретте біз 5000 ps модельдеу уақыт кезеңі үшін белоктардың радиусының айналуын есептедік. Үш кешен айналу радиусының төмен мәндеріне және барлық MD модельдеуіндегі тұрақты ауытқуларға бейім, бұл ақуыз құрылымының әрқайсысы арасындағы тығыздалған кешендерді көрсетеді. Үш кешеннің гидрофобты табиғаты үшін SASA (еріткіш аймағы) әдісі қолданылды, бұл үшеуі тұрақты флуктуацияға айналды және сонымен бірге әрбір ақуыз-белок әрекеттесуі арасында тұрақты гидрофобты өзгерісті көрсетті (10-сурет). 5000 ps симуляция уақытында үш кешеннің әрқайсысы үшін MD жүйелерінің жалпы энергиясын есептеуден басқа, олардың барлығы сәйкесінше −9.27 × 10 5, −9.30 × 10 5 және −1.66 × 10 6 диапазонында тұрақты энергия өзгеруіне ие болды. (11 -сурет). Энергетикалық талдаудың нәтижесі барлық имитациялық жүйелердің 5000 пс кезінде тұрақты екенін көрсетеді. Қалдықтардың ауытқуын талдауда біз үш кешен үшін барлық қалдықтардың RMSF мәнін өлшейміз (12-сурет). CDK1-Ki67 кешенінің RMSF валидациясында МД симуляциясы кезінде үлкен өзгеріске ұшыраған CDK1-дің 38-ден 43-ке дейінгі қалдықтарында айтарлықтай ауытқулар байқалады (12-сурет (а)). MD симуляциясы кезінде p27 ақуыз құрылымы бойынша 25 -тен 40 -қа дейінгі қалдықтарда айтарлықтай өзгеріс байқалды, бұл осы аймақтағы үлкен өзгерістерді білдіреді. Керісінше, MD симуляциясы кезінде PCNA протеинінің құрылымында 100 -ден 200 -ге дейінгі қалдықтарда RMSF вариациясы аз болады. Сондықтан, PCNA-да MD симуляциясы кезінде Ki-67 және p27-ге қарағанда RMSF өзгеруі аз болды.


(а)
(b)
(с)
(а)
(b)
(с) (a) Ki-67, (b) p27 және (c) PCNA бар CDK1 кешендерінің айналу радиусы 5000 ps модельдеу уақытында. Гирация радиусының төмен мәндері екі ақуыз құрылымының арасындағы тығыздалған комплекстерді көрсетеді.


SASA (еріткіштің ауданы) 5000 пс кезінде гидрофобты анықтауға арналған барлық кешендердің конформациясының анализі тұрақты ауытқуы ақуыз-ақуыздық өзара әрекеттесудің айқын өзгерісін көрсетпеді.

(а)
(b)
(с)
(а)
(b)
(с) (a) Ki-67, (b) p27 және (c) PCNA 5000 ps модельдеу уақытындағы MD жүйелерінің жалпы энергиясын есептеу, орташа тербелістердің әрқайсысы −9,27 × 10 5 , −9,30 × 10 5 және −1,66 × Тиісінше 10 5.

(а)
(b)
(с)
(а)
(b)
(с) (a) CDK1 және Ki-67, (b) CDK1 және p27 және (c) CDK1 және PCNA 5000 пс модельдеу уақытында ақуыз қалдықтарының RMSF талдауы. RMSF ауытқуының жоғары мәні барлық МД симуляциясында белок құрылымының қатты өзгеруін білдіреді.

Алайда, миграциялық талдау көрсеткендей, PCNA 5000 ps MD симуляциялық зерттеу кезінде Ki-67 мен p27 салыстырғанда CDK1 арасында үлкен қашықтыққа ие болды. Біз PCNA мен CDK1 арасындағы ең үлкен қашықтықты тапқанымызға қарамастан (13(а)-сурет), бірақ олардың тұрақты байланысуы RMSF талдауы арқылы 12-суретте көрсетілген. Сонымен қатар, PCNA орташа квадраттық орын ауыстыруы (MSD) азырақ миграцияға ие (13(b)-сурет). Біз одан әрі Ki-67 және p27 байланысуы үшін CDK1 негізгі қалдықтарын талдаймыз. Негізгі байланыстырушы қалдыққа 5000 пс имитация кезінде Gi9-CDK1 ақуыз құрылымының екі бұрышты бұрышындағы Gly9, Ser10, Ile11, Leu12, Lys13, Lys14 және Val15 кіреді. Барлық байланыстыру қалдықтары бүкіл MD модельдеу кезінде тұрақты. Алайда, барлық MD модельдеу уақытында p27-CDK1 ақуыздық кешендерінде Gly9, Ser10, Leu12 және Val15-те тұрақты екібұрышты бұрыштар болды. Ақырында, PCNA-CDK1 ақуыз құрылымындағы Gly9, Ser10, Ile11, Leu12, Lys13, Lys14 және Val15, соның ішінде барлық негізгі байланыстырушы қалдықтардың МД симуляциясы кезінде тұрақты байланыс диедральды бұрышы бар екенін анықтадық. PCNA CDK1 -мен байланысуы (14 -сурет). Кластерлік талдаулар барлық MD жақтауларының арасындағы өкілдік құрылымды таңдау үшін қолданылды. Суретті салыстыру талдауы үшін 5000 пс имитация уақытында сәйкесінше 4860 пс, 2740 пс және 3880 пс ауыстырылған Ki67, P27 және PCNA CDK1 кешендерінің барлық MD кадрларының соңғы кластерлік топтарынан таңдалған құрылым ұсынылған (сурет 15). CDK1 және Ki-67, p27 және PCNA үшін мақсатты ақуыздар үшін суретті салыстыруды зерттеу 16-суретте көрсетілген.Біз CDK1-де 38-ден 43-ке дейінгі CDK1 қалдықтары 0-ден 4860 пс-ке дейін Ки-67-ге жақындағанын анықтадық (16-сурет (а)). Нәтиже Ki-67 үшін CDK1 байланысының 38-ден 43-ке дейінгі қалдықтарының жоғары ауытқуына байланысты RMSF талдауымен корреляцияланады. CDK1-p27 суретті талдау үшін p27 CDK1-ге 0 пс-тен 2740 пс-қа дейін жақындайды. Нәтижелер сонымен қатар CDK1 үшін p27 байланысының 25-тен 40-қа дейінгі қалдықтарының жоғары вариациясына байланысты RMSF талдауымен корреляцияланады (16(b)-сурет). Біз PCNA және CDK1 әрекеттесуіндегі 100-ден 200-ге дейінгі қалдықтарда 3880 пс-те CDK1-ден (жасыл) алыстауын бір PCNA (көк) циклінің аз ғана өзгерісін таба алдық (16(c) сурет). Бұл нәтиже CDK1 үшін PCNA байланысының 100 -ден 200 -ге дейінгі қалдықтардағы шағын ауытқулар үшін RMSF талдауымен де байланысты.


(а)
(b)
(а)
(b) 5000 ps модельдеу уақытындағы кешендердің миграциялық талдауы: (а) CDK1 мен қондырылған ақуыздар арасындағы барлық MD уақытындағы қашықтық және (b) барлық CDK1 кешендері үшін орташа квадраттық орын ауыстыру (MSD) талдауы MSD жоғары мәнін білдіреді ақуыз миграциясының жоғары қашықтығы бастапқы позицияны құрайды.


Негізгі байланыстырушы қалдықтардың екі бұрышты бұрышы: (a) Gly9, (b) Ser10, (c) Ile11, (d) Leu12, (e) Lys13, (f) Lys14 және (g) Val15 CDK1 ақуыз құрылымында модельдеу кезінде. 5000 пс. Диэдрлік бұрыштар мақсатты байланыстыратын ақуыздары бар CDK1 кешендері үшін есептелді: Ki-67, p27 және PCNA барлық MD модельдеу уақытында.

(а)
(b)
(с)
(а)
(b)
(с) Барлық CDK1 мен байланыстырушы ақуыздардың кластерлік талдауы: (a) Ki-67, (b) p27 және (c) PCNA 5000 ps модельдеу кезінде ұсынылған құрылымдар CDK1 кешендерінің барлық MD фреймдері үшін соңғы кластерлік топтардан таңдалды. . Ki-67, p27 және PCNA кешенінің ұсынылған құрылымы сәйкесінше 4860 пс, 2740 пс және 3880 пс ауыстырылды.

(а)
(b)
(с)
(а)
(b)
(с) Бастапқы суретті (0 пс) және барлық CDK1 кешендері үшін ұсынылған конформацияны салыстыру. (a) CDK1 (жасыл) контурының бірі 4860 ps жылдамдығымен Ki-67 (көк) жақындады. (b) p27 (көк) ақуыз құрылымы CDK1 (жасыл) 2740 ps-те тығызырақ байланысады. (с) PCNA (көк) циклінің бірі CDK1 -ден (жасыл) 3880 пс -ке жылжиды.

Біздің зерттеулер мен әдеби шолулардағы нәтижелерді қорытындылау үшін синоназальды IP бар науқастарда жасушалардың көбеюі мен қатерлі трансформациясы үшін CDK1-мен өзара әрекеттесетін Ki-67, p27 және PCNA молекулалық механизмі 17-суретте көрсетілген.


4. Талқылау

Төңкерілген папилломалар синоназальды трактта сирек кездесетініне қарамастан, жеңіл қайталанатын сипаты мен қатерлі трансформациясы пациенттер мен дәрігерлерді жиі алаңдатады. Қайталануды немесе қатерлі өзгерістерді ерте анықтау үшін өмір бойы жүйелі бақылау қажет және бұл ИП пациенттері үшін ауруды бақылауды жақсартуға әкелуі мүмкін [9, 20].

Ki-67 IP жасушаларында G0 фазасынан G1 фазасының басталуына ықпал етті және ол пролиферация фазасындағы жасушалық цикл үшін өрнекті сақтады. Ки-67-ақуыз, ол G0 фазасынан басқа G1-S-G2-M таралу фазасындағы жасушалық циклге әсер етеді [8, 11, 14]. P53, p63, p21 және p27 мутациялары туралы хабарланған әдебиеттерде SCC трансформациясымен синоназальды IP туындады, әлі де пікірталастар болды [6, 11, 14]. Ки-67 жақында синоназальды неоплазманың пайда болуы туралы хабарланды [21] агрессивті ісік әрекеті Ки-67 индексінің жоғарылауымен байланысты және мұрын эпителийінің ауыр дисплазияға және тіпті қабыршақты жасушалық карциномаға әкелді [22]. Көтерілген Ки-67 тіпті синхронды сквамозды жасушалы карциномалар бар АЖ-де де кездеседі. Ki-67 сонымен қатар p21, p27 және CDK [8, 11, 12, 14] әсер етеді. Алайда, p27 төмендеуі синоназальды IP-тіндерде Ки-67 экспрессиясының жоғарылауынан туындады ма деген қорытындыға келе алмадық. Қосымша зерттеулер Ки-67 мен Р27 арасындағы байланысты түсіндіруге кепілдік береді.

P53 ісігін басу функциясы Katori et al хабарлаған көптеген қатерлі ісіктермен байланысты. және Гудратхи және басқалар. [22, 23]. Олар p53 үшін тестілеу дисплазия немесе карцинома ықтималдығы бар папилломалық зақымдануларды скринингке көмектесуі мүмкін деп ұсынды, бірақ біз оны көп нұсқалы талдауда маңызды деп таппадық. Бұл біздің зерттеудегі пациенттердің шектеулі болуына байланысты. Алайда, p53 ғана емес, сонымен қатар p63 де IP -де қатерлі трансформациямен өрнектеледі [11].

Ісік жасушаларының Ki-67 экспрессиясының жоғарылауымен пролиферативті белсенділіктің жоғарылауы көптеген адам ісіктері үшін маңызды болжамдық маркер ретінде хабарланды, бұл сонымен қатар IP қайталануында және қатерлі ісік ауруында маңызды. Әсіресе, Ki-67 күдікті пролиферация кезеңінде жасушалық циклге тікелей әсер етеді және p53, p21 және p27 ісіктерді басатын гендермен өзара әрекеттесе алады және G1 фазасының бақылау нүктесіне әсер ету арқылы жасушалық циклді модуляциялайды [8, 24, 25]. Ки-67 жақында табиғат құрылымында CDK1 мен молекулалық биологияда өзара әрекеттесетіні анықталды [26] және CDK1 жасуша пролиферациясында және тіпті қатерлі трансформацияда басты рөл атқарады [10]. Біз Ki-67 жасуша циклінің G1 фазасына IPs жасушаларының енуін ғана емес, сонымен қатар CDK1-ге әсер ету арқылы жасуша ядроларында қатерлі трансформацияны тудырды деп күдіктенеміз.

Бас пен мойынның SCC қатерлі ісігіне p21 және p27 клиникалық рөлдері әлі де талқылануда, бірақ біз р27 -нің төменгі деңгейі біздің зерттеуде қатерлі трансформациясы бар синоназальды IP -де анықталғанын анықтадық. P21 және p27 зерттеулері аз болғанымен, қатерлі ісік ауруымен адамдық IP -ге қатысты. Кейбіреулер Ончел және басқалармен бірге болды. [11, 27] және кейбіреулер қарсы болды [25, 28] байқалды.

Ki-67-ден басқа, біз CDK1-мен ынтымақтастықта IP-тің қатерлі трансформациясын болжаушы PCNA-ны да таптық. Қатерлі трансформациясы бар IP-лерімізде PCNA да, Ki-67 де IHC дақтары арқылы жоғарылады.

Біздің сауалнамамызда қатерлі трансформациясы бар IP-де жоғары PCNA экспрессиясы көрсетілгендей, біз PCNA-ны синоназальды IP бар пациенттер үшін қатерлі ісік туғызатын маңызды фактор деп күдіктендік. Жақында Mumbuc және басқалардың синоназальды полиптермен салыстырғанда IP -де жоғары PCNA анықталды. [3]. PCNA CDK1-мен әрекеттесе алады және жасуша цикліне жасушаның енуіне ықпал ете алады, нәтижесінде пролиферация мен қатерлі ісік пайда болады.

Соңында, біз PLUNC-ты қатерлі ісікке шалдыққан синоназальды IP-ге зерттейміз, өйткені ол мұрын-жұтқыншақ ісігінің пайда болуын тудырады деп жиі хабарланады. Біздің алдыңғы зерттеуімізде созылмалы ауру күйіндегі псевдомонас синуситінде PLUNC экспрессиясы төмендеді [29]. PLUNC сонымен қатар көптеген бактериялар колонизациясымен созылмалы риносинуситке байланысты болды [17]. Сонымен қатар, PLUNC-те инфекцияға қарсы және антибактериалды функция болуы керек еді [30, 31]. Өйткені ол мұрын-жұтқыншақ карциномасының ісікке қарсы [32] болуы керек еді, бірақ біз SCC трансформациясымен синоназальды IP-тің корреляциясын таппадық. Керісінше, біз жоғарылаған PLUNC экспрессиясын тек бірнеше рецидивтері және ревизиялық синусын хирургиясы бар синоназальды IP бар науқастарда таба алдық. Болашақта PLUNC экспрессиясының жоғарылауының және бірнеше қайталануының келесі механизмі мен себептерін қосымша зерттеу керек.

Компьютерлік дәрі-дәрмек дизайны (CADD) клиникалық немесе ауруды зерттеуді әрі қарай зерттеу үшін пайдаланылуы мүмкін, оған ауруды зерттеу [33], қауіп факторларын зерттеу [34], жағдай туралы есептер және молекулалық механизм кіреді. PCNA, Ki-67 және p27-нің CDK1-ге қондыру және молекулалық динамикалық нәтижелерінде біз олардың үшеуінің де CDK1-ге тұрақты қондырылғанын анықтадық. P27 CDK1 -мен қатерлі ісік ауруымен синоназальды АЖ ингибиторы ретінде жұмыс істеу үшін тұрақты өзара әрекеттесуге тиіс еді. PCNA және Ki67 промоутерлер болып саналды және синоназальды IP -де жасушалардың пролиферациясы мен қатерлі ісігіне ықпал етеді.

Қорытындылай келе, бұл Ki-67, PCNA және p27 IPK қайталануы мен CDK1 арқылы қатерлі ісік ауруында маңызды екенін көрсететін алғашқы зерттеу. Біз сонымен қатар бірнеше рет қайталанатын синоназальды IP -де PLUNC өрнегінің жоғарылауын бірінші болып табамыз. Дегенмен, болашақта қосымша механизмді зерттеу әлі де қажет. Ағымдағы есептеу зерттеулерінің барлығы біздің дымқыл зертханалық зерттеулерімізбен үйлеседі, бұл біздің зерттеуімізді сенімдірек етеді және мұндай аурумен ауыратын науқастарды болашақ емдеуге қолдануға болады. Сондықтан синоназальды IP бар және Ki-67, PCNA жоғарылаған және p27 төмендеген емделушілерде қатерлі трансформацияның жоғары мүмкіндіктері бар деп санау керек және клиникалық тәжірибеде мұқият бақылау керек [35].

Мүдделер қақтығысы

Авторлар осы мақаланы жариялауға қатысты мүдделер қайшылығы жоқ деп мәлімдейді.

Алғыс хаттар

Зерттеуге Тайвань Ұлттық Ғылым Кеңесінің (NSC101-2314-B-039-013-MY3, NSC102-2325-B039-001, NSC102-2221-E-468-027), Қытай медицина университетінің гранттары қолдау көрсетті. CMU102-BC-3), Азия университетінен (ASIA100-CMU-2, ASIA101-CMU-2 және 102-ASIA-07) және Қытай медициналық университетінің ауруханасынан (DMR-102-001, DMR-103-025, DMR-103-058, DMR-103-001 және DMR-103-096). Бұл зерттеуге Тайвань Денсаулық сақтау департаментінің клиникалық сынақ және жетілдіру орталығы (DOH102-TD-B-111-004) мен Тайвань денсаулық сақтау ісік ауруларының ғылыми-зерттеу орталығы (MOHW103-TD-B-111-03) қолдау көрсетеді. ) және CMU, Тайвань, Білім Министрлігінің Жоғарғы Университет жоспарына сәйкес.

Әдебиеттер

  1. В.Лоусон және З.М.Пател, «Төңкерілген папилломаны емдеудің эволюциясы: 200 жағдайды талдау», Оториноларингология — Бас пен мойын хирургиясы, том 140, жоқ. 3303-335 бб., 2009. Қарау: Баспагерлер сайты | Google ғалымы
  2. К.К.Чен, С.С.Чан, Х.Дж.Хуан, Т.Лин, Ю.Ву және Ч.Ю.Чен, «ППАР-ға арналған үшеуі бір агонистерα, PPAR-γжәне PPAR-δ дәстүрлі қытай медицинасынан » Биомолекулалық құрылым мен динамика журналы, том 30, жоқ. 6, 662–683 бб., 2012. Қарау: Жариялаушы сайты | Google ғалымы
  3. S. Mumbuc, M. Karakok, T. Baglam, E. Karatas, C. Durucu, and Y. Kibar, «иммуногистохимиялық талдау PCNA, Ki67 және p53 мұрын полипозында және синоназальды инверттелген папилломаларда», Халықаралық медициналық зерттеулер журналы, том 35, жоқ. 2, 237–241 беттер, 2007. Қарау: Google Scholar
  4. P. Strojan, A. Ferlito, V. J. Lund et al., «Қатерлі ісікпен байланысты синоназальды инверттелген папиллома: адам папилломавирустық инфекциясының рөлі және оның сәулелік терапияға әсері», Ауызша онкология, том 48, жоқ. 3, 216–218 бб., 2012. Қарау: Жариялаушы сайты | Google ғалымы
  5. E. Giotakis, I. P. Gomatos, L. Alevizos және т. Жергілікті қайталану және клиникопатологиялық айнымалылармен корреляция, Патологиялық зерттеулер мен практика, том 208, жоқ. 6, 338–343 беттер, 2012. Қарау: Жариялаушы сайты | Google ғалымы
  6. M. Saegusa, H. Nitta, M. Hashimura, and I. Okayasu, «p27 (Kip1) экспрессиясының төмен реттелуі жасуша пролиферациясының жоғарылауымен корреляцияланады, бірақ p21 (waf1) және p53 экспрессиясы емес, және адам папилломавирусының қатерсіз инфекциясы. және синоназальды аймақтардың қатерлі ісіктері » Гистопатология, том 35, жоқ. 1, 55–64 беттер, 1999. Қарау: Жариялаушылардың сайты | Google ғалымы
  7. М.Ж.Шверер, А.Сейлер, К.Крафт, К.Бакзако және Х.Майер, «папилломатозды емес мұрын шырышты қабығындағы p21waf1/cip1 өрнегінің үлгілері, эндофитикалық синоназальды папилломалар және ілеспе карциномалар» Клиникалық патология журналы, том 54, жоқ. 11, 871–876 беттер, 2001. Қарау: Google Scholar
  8. G. Altavilla, A. Staffieri, G. Busatto, A. Canesso, L. Giacomelli және G. Marioni, «p53, p16INK4A, pRb, p21WAF1/CIP1, p27KIP1, циклин D1, Ki-67 және HPV ДНҚ өрнегі синоназальды эндофитикалық шнайдерлік (инвертті) папиллома » Acta Oto-laryngologica, том 129, жоқ. 11, 1242–1249 беттер, 2009. Көру: Publisher сайты | Google ғалымы
  9. G. Buiret, X. Montbarbon, B. Fleury және т. Acta Oto-laryngologica, том 132, жоқ. 1, 80–85 беттер, 2012. Көру: Publisher сайты | Google ғалымы
  10. D. Santamar'sxeda, C. Barri'xe8re, A. Cerqueira et al., "Cdk1 сүтқоректілердің жасушалық циклін жүргізу үшін жеткілікті", Табиғат, том 448, жоқ. 7155, 811–815 беттер, 2007. Қарау: Publisher сайты | Google ғалымы
  11. С.Онкел, Т.Косгул, А.Калли, К.Калли және Э.Пинар, «Параназальды синустық жалпақ жасушалы карцинома және инверттелген папилломадағы P53, P63, P21, P27, Ki-67 бағалауы», Үнді оториноларингология және бас -мойын хирургиясы журналы, том 63, жоқ. 2, 172–177 беттер, 2011. Көру: Publisher сайты | Google ғалымы
  12. Т.Масубучи, Ю.Тада, С.И.Маруя және т.б., «Сілекей жолдарының карциномасындағы андрогендік рецепторлардың, HER2, Ki-67 және EGFR экспрессияларының клиникопатологиялық маңызы», Халықаралық клиникалық онкология журналы, 2014. Көру: Publisher сайты | Google ғалымы
  13. М.Эхолм, С.Беглербегович, Д.Грабау және басқалар, «Бастапқы сүт безі обырында SP6 және MIB1 антиденелері бар Ki67 иммуногистохимиялық бағалау: болжамдық құндылық пен репродуктивтілікті салыстыру» Гистопатология, 2014. Көру: Publisher сайты | Google ғалымы
  14. К.Хеллман, Д.Линдквист, C.Ранхем, Э.Уиландер және С.Андерссон, «Адамдық папилломавирус, p16 және Ki-67 клиникалық-патологиялық айнымалыларға және қынаптың бастапқы карциномасында өмір сүруге қатысты», Британдық қатерлі ісік журналы, том 110, жоқ. 6, 1561–1570 беттер, 2014. Көру: Publisher сайты | Google ғалымы
  15. IY Shin, NY Sung, YS Lee және т.б., «Колоректальды қатерлі ісік ауруының болжамды факторлары ретінде көптеген ақуыздардың экспрессиясы: катепсин D, p53, COX-2, эпидермистің өсу факторы рецепторы, C-erbB-2 және Ki-67, » Ішек бауыр, том 8, жоқ. 1, 13–23 беттер, 2014. Қарау: Жариялаушы сайты | Google ғалымы
  16. Y. He, G. Zhou, Y. Zhai т.б. Медициналық генетика журналы, том 42, жоқ. 2, 172–176 бб., 2005. Қарау кезінде: Баспагерлер сайты | Google ғалымы
  17. Y.A A. Tsou, M. T. Peng, YF F. Wu және т.б., «Мұрын полиптерінде PLUNC экспрессиясының төмендеуі созылмалы риносинуситпен ауыратын науқастарда көп бактериялы колонизациямен байланысты» Ото-рино-ларингологияның Еуропалық мұрағаты, том 271, жоқ. 2, 299–304 беттер, 2014. Қарау кезінде: Баспагерлер сайты | Google ғалымы
  18. Accelerys, Discovery Studio клиенті v2.5, Accelrys, Inc., Сан-Диего, Калифорния, АҚШ, 2009 ж.
  19. S. Pronk, S. P áll, R. Schulz және басқалар, «GROMACS 4.5: жоғары өткізу қабілеттілігі мен параллель ашық бастапқы молекулалық модельдеу құралдар жиынтығы» Биоинформатика, том 29, жоқ. 7, 845–854 беттер, 2013. Қарау: Жариялаушы сайты | Google ғалымы
  20. V. Sciarretta, I. J. Fernandez, P. Farneti және E. Pasquini, «Төңкерілген папилломаны емдеуге арналған эндоскопиялық және аралас сыртқы-трансназальды эндоскопиялық әдіс: 110 жағдайды талдау,» Ото-риноларингологияның Еуропалық мұрағаты, 2013. Көру: Publisher сайты | Google ғалымы
  21. М.Ж.Шверер, А.Сейлер, К.Крафт және Х.Майер, «Эндофитикалық шнайдерлік папилломаларда жасушалардың көбеюі мен p27Kip1 экспрессиясы» Ларингоскоп, том 112, жоқ. 5, 852–857 беттер, 2002. Қарау: Google Scholar
  22. Х.Кати, А.Нозава және М.Цукуда, «p21 мен p53 экспрессиясының арасындағы байланыс, адам папилломавирусының инфекциясы мен синоназальды-инвертті папилломадағы қатерлі трансформация» Клиникалық онкология, том 18, жоқ. 4, 300–305 беттер, 2006. Көру: Publisher сайты | Google ғалымы
  23. C. Gujrathi, I. Pathak, J. Freeman және S. Asa, «p53 -тің инверттелген папилломадағы көрінісі және инверттелген папилломамен байланысты қатерлі ісік», Оториноларингология журналы, том 32, жоқ. 1, 48–50 беттер, 2003. Қарау: Google Scholar
  24. S. Gunia, F. Fritzsche, M. May, D. Liebe және S. Koch, «Жасуша циклын реттеудегі әртүрлі бұзылулар уротелий және синоназальды инверттелген папилломалардың әртүрлі биологиялық мінез-құлқын ескере ме?» Патобиология, том 75, жоқ. 1, 34–41 беттер, 2008. Көру: Publisher сайты | Google ғалымы
  25. А.Аффолтер, С.Гельмбрехт, С.Фингер, К.Х örmann және K.G ötte, «сілекей бездері мен параназальды синустың ісіктерінде жасушалық цикл реттегіштерінің p21, p27 және p53 экспрессиясы», Онкологиялық есептер, том 13, жоқ. 6, 1089–1094 беттер, 2005. Қарау: Google Scholar
  26. I. J. Byeon, H. Li, H. Song, A. M. Gronenborn және M. D. Tsai, «Тізбекті фосфорлану және мультиситтік өзара әрекеттесу Ki67 FHA доменімен арнайы мақсатты тануды сипаттайды», Табиғаттың құрылымдық және молекулалық биологиясы, том 12, жоқ. 11, 987–993 б., 2005. Қарау кезінде: Баспагерлер сайты | Google ғалымы
  27. H. R. Choi, S. A. Tucker, Z. Huang et al., «Циклинге тәуелді киназа ингибиторларының дифференциалды өрнектері (p27 және p21) және олардың р53 пен Ki-67-ге қатыстылығы, ауызша сквамозды ісік кезінде Халықаралық онкология журналы, том 22, жоқ. 2, 409–414 беттер, 2003. Қарау: Google Scholar
  28. Н.Келе ş, Б.Ердамар, А.Каур және К.Де Ṿr, «p21, p53 және p27 Kip1 синоназальды эпителийдің қатерсіз және қатерлі ісіктеріндегі өзгерістер», Оториноларингология—Бас және мойын хирургиясы, том 129, жоқ. 1, 77–84 беттер, 2003. Қарау: Жариялаушылардың сайты | Google ғалымы
  29. Y. A. Tsou, C. M. Chen, T. C. Lin және т. Ларингоскоп, том 123, жоқ. 4, 845–851 беттер, 2013. Көру: Publisher сайты | Google ғалымы
  30. А.Балакришнан, С.А.Марате, М.Джоглекар және Д.Чакравортти, «Бактерицидтік/өткізгіштігін арттыратын ақуыз: LPS бейтараптандырудан тыс функциялары бар көп қырлы ақуыз», Туа біткен иммунитет, том 19, жоқ. 4, 339–347 беттер, 2013. Қарау кезінде: Баспагерлер сайты | Google ғалымы
  31. Л.Гакхар, Дж.А.Бартлет, Дж.Пентерман және т.б., «PLUNC – антибиофильдік белсенділігі бар жаңа тыныс жолдарының беттік-белсенді ақуызы», PLoS ONE, том 5, жоқ. 2, мақала идентификаторы e9098, 2010. Қарау: Жариялаушы сайты | Google ғалымы
  32. Ю.Чжоу, З. Цзэн, В.Чжан және т.б., «Мұрын-жұтқыншақ карциномасының кандидаттық молекулярлық маркерлерін супрессиялық субтрактивтік будандастыру арқылы құрастырылған шегерілген cDNA кітапханаларының микроаррей талдауы арқылы анықтау», Еуропалық қатерлі ісіктің алдын алу журналы, том 17, жоқ. 6, 561–571 беттер, 2008. Қарау: Баспагерлер сайты | Google ғалымы
  33. S.-C. Hsu, J.-H. Лин, С.- В. Вэнг және басқалар, «Rheum palmatum шикі сығындысы металлопротеиназа-2 және -9 матрицасын басу арқылы U-2 OS адам остеосаркома жасушаларының көші-қонын және инвазиясын тежейді» Биомедицина, том 3, жоқ. 3, 120–129 беттер, 2013. Қарау: Жариялаушы сайты | Google ғалымы
  34. W.-Y. Лин, H.-P. Лю, Дж. Чанг және басқалар, «PSORS1 аймағындағы генетикалық өзгерістер Кавасаки ауруының дамуына және коронарлық артерия аневризмасының пайда болуына әсер етеді,» Биомедицина, том 3, жоқ. 2, 73–81 беттер, 2013. Қарау: Баспагерлер сайты | Google ғалымы
  35. В.-Л. Ляо және Ф.-Дж. Цай, «Дараланған медицина: денсаулық сақтаудың парадигмалық ауысуы» Биомедицина, том 3, жоқ. 2, 66-72 беттер, 2013. Қарау: Жариялаушы сайты | Google ғалымы

Авторлық құқық

Авторлық құқық және#xA9 2014 Юн-Ан Цоу және т.б. Бұл Creative Commons Attribution лицензиясы бойынша таратылатын ашық қол жетімді мақала, түпнұсқаға дұрыс сілтеме жасалған жағдайда кез келген ортада шектеусіз пайдалануға, таратуға және қайта шығаруға рұқсат береді.


Бейнені қараңыз: Гены, ДНК и хромосомы (Желтоқсан 2022).