Ақпарат

Эпитопты аннотацияланған ақуыз

Эпитопты аннотацияланған ақуыз


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Эпитоппен аннотацияланған ақуыз дегеніміз не?
Мен осы терминді алған кітап:
http://www.springer.com/biomed/immunology/book/978-1-4939-1114-1


Біріншіден, белгілі бір шағын термин туралы сұрағанда, емлеңізді тексерген дұрыс. Егер сіз шынымен сезімге қарасаңыз, сіз өте маңызды дефис қалдырғаныңызды байқайсыз:

Пеллекер 14 -тің деректер жиынтығын қолдана отырып, бейімділік шкаласының бірнеше әдістерін салыстырды эпитоппен аннотацияланған ақуыздар. [екпін қосылды]

Бұл фраза ақуыз тізбегінің (аминқышқылдарының реттілігі) оларда белгіленген эпитоптары бар екенін білдіреді. Егер сіз келтірілген қағазға қарасаңыз, сіз әр түрлі кестелерді және анықталған эпитоптардың бұзылуын көресіз. Пеллекер тобы адамдар көптеген жұмыстарды әлі де эпитоптардың орналасуын «картаға түсіру» әдістерімен жұмыс жасап жатқан кезде жасады (олар ақуыз құрылымына байланысты белок тізбегінің сызықтық сегменттерінде жиі болмайды).


12.2: Антигендер және эпитоптар

  • Гари Кайзер үлес қосты
  • Балтимор елінің қоғамдық колледжінің профессоры (микробиология) (Кантонсвилль)
  1. Антиген мен иммуногенді анықтау.
  2. Антигендердің химиялық құрамы қандай екенін айтыңыз.
  3. Антиген иммуногенді болуы керек 3 сипаттаманы көрсетіңіз.
  4. Эпитопты анықтаңыз.
  5. Ағзаның антигенді бөтен деп танитынын қысқаша сипаттаңыз.
  6. В-жасушалы рецепторлар мен Т-жасушалық рецепторларды эпитоптарды қалай танитыны тұрғысынан салыстырыңыз.
  7. Жұқпалы аурулар бойынша антиген ретінде әрекет ете алатын микробтық материалдардың 2 санатын көрсетіңіз.
  8. Антиген рөлін атқаратын инфекциялық емес материалдардың 3 тобын келтіріңіз.
  9. Төмендегілерді анықтаңыз:
    1. эндогенді антиген
    2. экзогенді антиген
    3. аутоантиген
    4. гаптен

    Антиген антидене молекулаларымен және лимфоциттердегі антиген рецепторларымен әрекеттесетін зат ретінде анықталады. Иммуноген-бұл организм өзін-өзі емес деп таныған және бейімделген иммундық жауапты ынталандыратын антиген. Қарапайымдық үшін антигендер де, иммуногендер де әдетте антигендер деп аталады.

    Иммуногенді болу үшін антиген үш қасиетке ие болуы керек:

    • молекулалық массасы жоғары,
    • химиялық күрделілігін көрсетеді, және
    • бөтендікті көрсетіңіз (дене өзін-өзі емес деп таниды).

    Химиялық жағынан антигендер үлкен молекулалық салмақты ақуыздар (соның ішінде гликопротеидтер, липопротеидтер және нуклеопротеидтер сияқты конъюгацияланған белоктар) және полисахаридтер (соның ішінде липополисахаридтер). Бұл ақуыз және полисахарид антигендері вирустар мен жасушалардың, оның ішінде микробтық жасушалардың (бактериялар, саңырауқұлақтар, протозойлар) және адам жасушаларының беттерінде кездеседі.


    SARS-CoV протеиніндегі екі антигендік эпитопты анықтау

    Коронавирустың (SARS-CoV) өткір респираторлық синдромының (S) ақуызы-негізгі вириондық құрылымдық ақуыз. Ол рецепторлармен әрекеттесуде және бейтараптандыратын антиденелерді индукциялауда маңызды рөл атқарады. Зерттеуде SARS-CoV ақуызының алты алдын ала антигендік эпитопы (S1 S2 S3 S4 S5 S6) биоинформатика анализі арқылы, ал S1-S2-S3-S4-S5- мультипитопты химерикалық генмен болжалды. S6 синтезделді және pGEX-6p-1-де төмендегі GST геніне қосылды. Western blotting көрсеткендей, SARS пациенттерінің қалпына келетін сарысуы рекомбинантты синтездік ақуызды тани алады. Біріктірілген ақуызға қарсы бірқатар моноклоналды антиденелер жасалды. Әрі қарай алты болжамды эпитоп гендері pGEX-6p-1 GST-ге жеке біріктірілді және тиісінше Escherichia coli BL21-де экспрессияланды. Алты термиялық пептидтердің ішінде S5 моноклоналды D3C5 антиденесімен және S2 моноклоналды антиденемен D3D1 SARS-CoV ақуызына қарсы әрекеттеседі. D3C5 және D3D1 моноклональды антиденелермен танылған эпитоптар сызықты болып табылады және сәйкесінше SARS-CoV ақуызының 447-458 және 789-799 амин қышқылдарына сәйкес келеді. SARS-CoV масақ протеинінің антигендік эпитопын анықтау ауыр жедел респираторлық синдромды бақылаудың иммунитетке негізделген профилактикалық, емдік және диагностикалық әдістерін жасауға негіз бола алады.

    Фигуралар

    Салыстырмалы орналасудың схемасы ...

    Таңдалған масақ ақуыз сегменттерінің салыстырмалы орналасуының схемалық диаграммасы. Қорап… білдіреді

    Мультипитоптың батыстық блотингтік талдауы…

    Көп эпитопты синтез пептидінің және S2 және S5 эпитоптарының батыстық блотингтік талдауы. GST…

    Рекомбинантты Western Blotting талдауы…

    Моноклоналды антиденелері бар рекомбинантты синтез пептидтерінің батыстық блотингтік талдауы. E. coli бар…

    Рекомбинантты синтез пептидтерін анықтау…

    ELISA әдісімен McAbs көмегімен рекомбинантты синтездік пептидтерді анықтау. Тоқсан алты жасушалық микротитрлік пластиналар…

    Western blotting арқылы S2 немесе S5 және олардың туындыларын McAbs көмегімен анықтау.…


    Нәтижелер

    Толық метражды С моделі

    Ықтимал эпитоптарды іздеу үшін біз гликозилденген толық ұзындықты S-ның егжей-тегжейлі құрылымдық моделін жасадық. S басының жоғары ажыратымдылықтағы құрылымдары бар [6, 7], сабақ пен мембраналық якорь әлі күнге дейін атомда шешілмеген. деңгейі.

    Біз эксперименттік құрылымдық деректер мен биоақпараттық болжамдарды біріктіру арқылы толық S моделін құрдық. Біздің S тримерінің толық ұзындық моделі басын құрайтын үлкен эктодоменнен (қалдықтар 1-1137), CC1 (қалдықтар 1138-1158) деп белгіленген екі орам (CC) доменінен және 2 реттік қайталаудан (HR2, қалдықтар 1167-) тұрады. 1204), сабақты қалыптастырады, α-амфипатикалық спиральды (AH, 1243-1255) және бірнеше пальмитоилирленген цистеиндермен және қысқа C-терминалды доменмен (CTD, 1256-1273 қалдықтары) бар спиральды TMD (1212-1237 қалдықтары), S1 (A) суретті қараңыз. . Біз гликозилдену үлгісін жақында ашылған S [30] үшін анықтадық (S1 (B) суретті қараңыз). Зақымдалмаған Гольджи арқылы өтуіне қарамастан, экспрессияланған гликандар жергілікті SARS-CoV S [31] гликандарына қатты ұқсайды.

    Көрсетілгендей [23], модель жұқтырған жасушалар культурасынан алынған вириондар бетіндегі S ақуыздарының электронды тығыздығы жоғары криоЭТ тығыздығына сәйкес келеді. Ол сонымен қатар S басы мен CC1, CC1 және HR2, HR2 және TMD арасындағы үш икемді топсалары бар сабақ доменін басып алады. Томографиялық карталар да модельдің кең гликозилденуін растады [23].

    Көп микросекундтық атомдық MD модельдеулері S динамикасын және оның гликандық қалқанын ашады.

    Біз шамамен 15 нм [32, 33] ендірілген төрт икемді S ақуызы бар вирустық мембраналық патчтың 2,5 мс ұзындықтағы атомдық MD симуляциясын жасадық (1 -сурет). Симуляция кезінде төрт S ақуызы бүктелген күйде қалды (S2 (G) –S2 (J) сурет) және жақсы бөлінген ТМД-мен мембранаға тұрақты түрде бекітілді.

    Үш белок жасыл таяқшалар түрінде ұсынылған гликандармен беткі көріністе көрсетілген. Бір белок мультфильмде көрсетілген, үш тізбек жеке боялған және анық болу үшін гликандар көрсетілмеген. Су мөлдір көк бет ретінде көрсетілген және анық болу үшін иондар жоқ. Жақсырақ көріну үшін симуляциялық қораптың екі жиегі тартылмаған.

    S бастары динамикалық еңкейіп, көршілерімен әрекеттесті (S1 фильмі). Жоғары ажыратымдылықтағы криоЭТ кескіндері [23] және жақында жүргізілген MD зерттеулері [26] біздің бақылауларымызды қолдай отырып, сабақтағы буындардың бүгілуіне байланысты бастың қисаюын дербес анықтады. Жоғары қозғалғыш болғандықтан, гликандар S бетінің көп бөлігін жабады (2А–2С-сурет).

    Уақыт бойынша орташаланған гликанның электрон тығыздығының изобеттері жоғары (A), орташа (Б) және төмен (C) сәйкесінше контур деңгейлері. Ақ-көк түстің ақуыз беті сәулелік анализде жоғарыдан төменге қол жетімділікті көрсетеді. (Кірістіру) МД траекториясының бойында 1098 позициядағы биантеннары, фукозилденген және сиалилденген гликанның суреттері.

    Антиденелерді байланыстыратын сайттар қол жетімділіктен, қаттылықтан, дәйектілік сақталудан және реттілік қолтаңбасынан болжанған

    S эктодоменнің қол жетімділігі.

    Антиденелердің байланысуы эпитоптарға кем дегенде уақытша қол жеткізуді талап етеді. Қапталған вирустардың беткі ақуыздарын жабатын гликан қалқаны SARS-CoV-2-ге берік иммундық жауаптан аулақ болуға көмектесіп, осы байланыстырушы жерлерге қол жеткізуге кедергі келтіруі мүмкін [34]. Біз вирустық мембранадағы S-тің қол жетімділігін және гликандармен беттің қапталуын (i) сәулелік және (ii) антигенді байланыстырушы фрагменттің (Fab) қондыру талдауларымен бағалаймыз. Сәулелік анализде біз ақуыз моделін Fab қондыру анализінде диффузиялық жарықпен жарықтандырдық, біз SARS-CoV-2 антиденесі CR3022 Fab-пен бірге SD конфигурациясынан алынған S-конфигурациясының қатаң денелі Монте-Карло модельдеуін жасадық. Fab антиденесі S бетіне қол жеткізе алды. Протеин мен гликанның қозғалғыштығын есепке алу үшін біз төрт гликозилденген S протеинімен 2,5 мкс MD модельдеуінен 10 нс уақыт интервалында түсірілген 4 × 250 сурет үшін екі талдауды жеке орындадық.

    Динамикалық гликандық қалқан S бетін тиімді жабады (3A және 3B-сурет). Гликандар кез келген сәтте ақуыз бетінің аз ғана бөлігін жабады (1 -сурет), олардың жоғары қозғалғыштығы S -тің күшті стерикалық экрандауына әкеледі (2 -сурет). Сәулені (S3 (A) –S3 (C) сурет) және Fab қондыру нәтижелерін (S3 (D) –S3 (I) сурет) гликозилденген және гликозилденбеген S үшін салыстыру осы әсерді көрсетеді. Біз сәулелік және қондыру талдауларын қосымша деп санаймыз: сәулелік талдау қол жетімділіктің жоғарғы шекарасын қамтамасыз етеді, себебі жіңішке сәулелер антиденелерге қарағанда гликан қалқаны арқылы оңай енеді, ал қатты денеге қондыру төменгі шекараны береді, себебі ол қажет емес. гликандар мен антиденелер арасындағы өзара әрекеттесудің кез келген индукциялық сәйкестігін ескереді. Маңыздысы, екі әдіс қол жетімділігі жоғары және төмен аймақтарды анықтауда сәйкес келеді (4А және 4В-сурет). Сәулелік және қондыру талдаулары гликандар қол жетімділіктің сәйкесінше шамамен 34% және 80% -ға төмендеуіне әкелетінін көрсетеді (S1 мәтініндегі B кестесі). Ең айқын әсер мембранаға жақын орналасқан HR2 орама катушкасында болады. Гликозилизация болмаса, HR2 гликозилденуімен толық қол жетімді болады, HR2 Fab қондыру үшін қол жетімсіз болады. Кішкентай молекулалар HR2 ақуыз сабағымен әрекеттесе алатын болса, антиденелер соңғы тәуелсіз симуляциялармен келісе отырып, жер бетіне кіруге тыйым салынады [26].

    Қол жетімділік ұпайлары (Aсәулелік талдау жәнеБҚатты денелі қондырғы ()C) қаттылық ұпайлары, барлығы орташа 4 × 2,5 мкз S протеині MD симуляциясынан асады. Сонымен қатар (D) бірізділікті сақтау ұпайы [35], және (Е) BepiPred-2.0 эпитопының дәйектілік-қолтаңбасын болжау. (F) Біріктірілген эпитоптық көрсеткіш. (Г.) Белгілі бейтараптандыратын антиденелердің байланысу орындары. Түс қарқындылығы жоғарырақ A-F жоғары балл мен жоғары түс қарқындылығын көрсетеді Г. әр түрлі антиденелермен байланысатын жерлерді көрсетеді.

    Панельдер (A-F) және түстер 3-суреттегідей. Барлық мәндер сүзіледі және қалыпқа келтіріледі (Әдістерді қараңыз). (F) ішіндегі E1 – E9 жапсырмалары кандидат эпитоптарын бөліп көрсетеді. Жасыл сызықтар гликозилдену орындарын көрсетеді. Қара тіктөртбұрыштар антиденелерді байланыстыратын белгілі орындарды көрсетеді, сонымен қатар төменгі қораптағы S реті бойынша қара түспен көрсетілген.

    SARS-CoV-2 вириондарында S протеиндері мезгіл-мезгіл тығыз кластерлер түзеді, бұл адамның негізгі жасушаларымен өзара әрекеттесу қабілетін арттыруы мүмкін [23]. Тығыздаудың әсерін анықтау үшін біз тығыз имитациялық жүйеде (S3 (C) және S3 (I) суретте) және оқшауланған жағдайда (S3 (B) және S3 (H) сәуленің және қондыру талдауларының S эпитоптық қол жетімділігін салыстырдық. күріш), яғни MD жүйесінен жойылған басқа ақуыздармен. Тұтастай алғанда, ақуыздың толып кетуі сәулелік талдауда S қол жетімділігін тағы ~ 5%-ға және Fab қондыру талдауында ~ 6%-ға төмендетті, нәтижесінде гликандар мен толып кеткен ақуыздар арқылы қол жетімділікті тиісінше ~ 39% және ~ 86% қысқартты.

    С қаттылығы.

    Құрылымдық эпитоптар антиденелерге күшті және арнайы байланысады деп күтілуде. Керісінше, мобильді аймақтар энтропияның жоғалуына әкелетін байланыстырылған күйде құрылымдалады және вакциналық конструкцияда ұсынылған кезде өз құрылымын сақтай алмайды. Күшті иммундық жауап алу үшін біз қаттылықты эпитоптық көрсеткішке қосуды жөн көрдік. Мұнда біз шамамен 1 нм масштабтағы домендердің қозғалысына назар аударамыз. Біз басқа жұмыста сабақтың және мембраналық якорьдің икемді ілмектерімен байланысты ауқымды конформациялық динамиканы талдадық [23]. Біз «Әдістемелерде» сипатталғандай, протеин құрылымдарын қабаттастыру және RMSF-ны қаттылық көрсеткішіне түрлендіру арқылы орташа квадраттық ауытқуларды (RMSF) анықтадық.

    S беті динамикалық және қатаң аймақтарды көрсетеді (4С -сурет). Бір қызығы, RBD және оның айналасы салыстырмалы түрде икемді, ашық және жабық күйлердегі үш пептидтік тізбектің құрылымындағы үлкен айырмашылықтарды эксперименталды анықтауға сәйкес келеді [7]. Керісінше, синтез машиналарын жабатын S2 доменінің ақуыз беті салыстырмалы түрде қатаң (4С -сурет), мүмкін, бұл функционалды маңызды доменді метастабильді префузиялық конформацияда қорғау үшін.

    Кезектілікті сақтау.

    Бірізділігі жоғары сақталған эпитопаларға бағытталған штаммдардың тиімділігін қамтамасыз етеді және вирустың иммундық қысымнан мутация арқылы минималды фитнес жазасы арқылы кетуіне жол бермейді. Біз GISAID бастамасы (https://www.gisaid.org/) жинаған және таңдаған тізбектердегі әрбір аминқышқыл позициясындағы табиғи түрде болатын вариациялардан реттілік сақталуын бағаладық. 30 426 аминқышқылдарының тізбегінің талдауы S жалпы сақталатындығын көрсетті, амин қышқылдарының позициясының 52% -ында ешқандай мутация тіркелмеген. Сақталу бағасы ретінде біз әр позициядағы энтропияны нөл мен бір арасындағы интервалға картаға түсірдік (әдістерді қараңыз). Тіпті беткі аймақтар да негізінен жақсы сақталған (4D -сурет).

    Иммуногенділіктің реттілігіне негізделген болжаушы.

    Консервіленген, қатаң және қол жетімді аймақтар жалпы ақуыз серіктестерін байланыстыруға жақсы үміткерлер ұсынады. Бұл ақпаратты толықтыру үшін біз антиденелерге бағытталған дәйекті қолтаңбаларға негізделген иммуногендік потенциалды бағаладық. BepiPred 2.0 сервері [36] көмегімен анықталған S реттілігіндегі эпитопқа ұқсас мотивтер S эктодоменінде шашыраңқы орналасқан және белгілі эпитоптарды қамтиды (3Е және 4Е суреттер), сонымен қатар антиденелерге қол жетпейтін жерленген аймақтарды қамтиды.

    Консенсус эпитопының бағасы.

    Біз қол жетімділікті, қаттылықты, сақталуды және иммуногенділікті бағалауды консенсус эпитопының бір ұпайына біріктірдік (3F және 4F суреттері). Барлық жеке ұпайлардың өнімін алу арқылы біз эпитопқа үміткерлердің барлық мүмкіндіктер бойынша жоғары ұпайларға ие болуын қамтамасыз еттік. Бұл қатаң талап көптеген үміткер сайттарды болдырмайды, себебі қол жетімділік ұпайлары (4А және 4В-сурет) және қаттылық көрсеткіші (4С-сурет) S бетіндегі икемді ілмектердің көп пайда болуына сәйкес қарама-қарсы тенденцияларды көрсетеді.

    Біздің консенсус баллды пайдалана отырып, біз тоғыз эпитопқа үміткерді анықтадық (E1 – E9 5 -сурет және 1 -кесте). E3 – E6 эпитопына үміткерлер белгілі эпитоптарды қалпына келтіреді (3F, 3G және 4F суреттері), кейбір жағдайларда қалдық деңгейінің дәлдігіне қол жеткізеді (S4 сурет), сонымен қатар біз E1, E2 және E7 – E9 эпитоптарына үміткерлерді анықтаймыз. Барлық эпитопқа үміткерлер S. құрылымдық бөлімінде тұрады. Керісінше, ілмектердің төмен қолжетімділігі мен жоғары икемділігі [23] сабаққа эпитоптың жалпы ұпайының төмен болуын береді.

    (A) S суретінің жоғарғы көрінісі 3F-суреттегідей көрсетілген. Эпитопаға үміткерлер 1 -кестеге сәйкес таңбаланған.Б) А-дағыдай бояғыштары мен жапсырмалары бар бүйірлік көрініс.C) Мультфильм кескініндегі эпитопқа үміткерлерді үлкейту (E1, E2, E7–E9) және А-дағыдай боялған. Эпитоп консенсус ұпайы >0,2 болатын қалдықтар сары мия көрінісінде көрсетілген.

    Біздің модельдеуімізде RBD домендерінің екеуі жабық конформацияда және біреуі ашық конформацияда таңдалды. Ашық және жабық күйлердің әсерін бағалау үшін біз жабық RBD конформациясы бар барлық сегіз ақуыз тізбегі үшін қол жетімділік пен консенсус ұпайларын есептедік (S10 сурет). 4-суретпен салыстыру қол жетімділіктегі жалғыз елеулі айырмашылықтар RBD аймағында болатынын көрсетеді.

    S топтамасы E1 және E2 эпитоп кандидаттарының ұпайларының айтарлықтай төмендеуіне әкеледі, ал бұл E3–E4 және E7–E8 үміткерлеріне аз ғана әсер етеді және E5–E6 және E9 кандидаттарына әсер етпейді (S5 сурет).

    Ұжымдық мінез-құлық С.

    Вириондар бетінде S -тің керемет кездейсоқ таралуына қарамастан, тығыз қоныстанған жерлер өте сирек емес (5G суретін қараңыз [23]). Бірнеше S бір уақытта бір ACE2 димерімен байланысқанда немесе антиденелер арқылы айқаспалы байланысқан кезде жанасуы мүмкін. Біздің модельдеуді қолдана отырып, біз S арасындағы өзара әрекеттесуді талдадық. 2.5 мкц ішінде біз гликандар мен ақуыз беттерінің қатысатын бірқатар байланыстарды байқадық, нәтижесінде S -тің үшбұрышының S үшбұрышты орналасуында ішінара кептелуіне әкелді. төртінші S тек екі көршісімен әлсіз өзара әрекеттеседі (S9 (A) сурет). Кептеліп қалған күйде гликандар S9(B)-суретте көрінетіндей кең өзара әрекеттесу желісін құрады. Белгілі бір қалдық пен гликан бөліктерінің салыстырмалы рөлдерін сандық анықтау үшін S аралық әрекеттесулердің (S9(C) және S9) байланыс картасын есептедік. (D) Сурет). Біз протеинмен байланысатын контактілердің көпшілігі NTD аймақтарындағы құрылымдалмаған ілмектерде болатынын анықтадық. Гликанмен байланысқан контактілер NTD және RBD аймақтарында және S бастың төменгі жағында орналасқан секвенттерде шоғырланған. Олардың мөлшеріне қарамастан, сабақта орналасқан гликандар S аралық байланыстарға қатыспаған. Оның орнына, олар әлдеқайда кең бас домендері арқылы қорғалған күйінде қалды.


    3. Нәтижелер және талқылау

    3.1. Белоктарды таңдау және бағалау

    Антигендердің ұзақ тізімінің бірігуі вакциналардың тиімділігін арттыруы мүмкін екендігі дәлелденді (Росси және т.б., 2004). Malfertheiner және т.б. (2008) ерікті еріктілерде көп компонентті вакцинаны бағалады, олар вакцинаның антигендерге гуморальды және жасушалық реакцияларды тудыратын қауіпсіз және жоғары иммуногенді екенін байқады. Сондықтан біздің вакцина үшін 11 ақуыз таңдалды. UreB көптеген зерттеулерде антигендік VacA, CagA, GGT, NapA және OipA патогенді механизмдерге қатысатын негізгі белоктар болып табылатыны туралы хабарланды. Адгезия мен колонизация механизмдеріне қатысу үшін HpaA, FlaA, FecA, BabA және SabA таңдалды.

    Таңдалған протеиндер келесі қадамда қосымша параметрлерге, соның ішінде субклеткалық локализацияға, маңыздылыққа, вируленттілікке, адамдық емес гомологияға, TM спиральдарына және молекулалық салмаққа тексерілді. Біздің болжамдарымыз көрсеткендей, UreB және NapA цитоплазмалық орналасуы CagA, FlaA, VacA және BabA жасушадан тыс, ал OipA, SabA, HpaA және FecA сыртқы мембрана ақуыздары ретінде болжанған. Сонымен қатар, GGT 1-кестеде көрсетілгендей периплазмалық ақуыз ретінде жіктелді. Беткі және жасушадан тыс ақуыздар бактериялық инфекциялар мен аурулардың алдын алуға бағытталған вакцинаны әзірлеу үшін жақсы мақсат болып табылады (Dwivedi және т.б., 2016).

    Кесте 1.Жасушаішілік локализация, гендік маңыздылық, вируленттілік, адам гомологиясы, трансмембраналық спираль, изоэлектрлік нүкте және молекулалық салмақ болжамы Хеликобактериялар Таңдалған ақуыздар

    аа, амин қышқылы С, цитоплазмалық Е, негізгі ЭС, жасушадан тыс N-ES, маңызды емес N-H, гомологиялық емес N-V, вирустық емес ОМ, сыртқы мембрана Р, периплазмалық ТМ, трансмембраналық V, вирулентті.

    OGEE маңызды гендерді талдау кезінде HP1118 (GGT) және HP0807 (FecA) гендері анықталды. Маңызды гендер - бұл тірі қалу үшін маңызды организмдердің гендері, олардың биологиялық жүйенің беріктігін зерттеу, минималды геном/организмді анықтау және қоздырғыштардағы тиімді емдік мақсатты анықтау сияқты теориялық және практикалық қолданылуының арқасында ерекше маңызы бар гендер. (Чен және басқалар, 2017). Сонымен қатар, PATRIC FecA вируленттілік факторларының дерекқорында табылған 11 ақуыздың 9-ы және GGT бұл категорияда анықталмаған. BLASTp көмегімен басым 11 ақуыздың гомологиялық талдауы ≤30% сәйкестікті анықтады, бұл реттілікті адамгершілік емес гомологтар ретінде жариялауда маңызды болды. TMHMM арқылы ақуыздардың топологиясын болжау VacA және GGT бір TM спиральға ие екенін көрсетті, ал басқа белоктар мұндай топологияның болуын ашпайды. VacA және GGT сәйкесінше 35-57 және 5-27 амин қышқылы позицияларында орналасқан ТМ спиральының болуын көрсетті. Ақырында тоғыз протеиннен тұратын Compute pI/Mw құралымен есептелген молекулалық салмақтардың салмағы & lt110 кДа болды, ал VacA мен CagA сәйкесінше 139,3 және 132,4 кДа молекулалық салмаққа ие болды (1 -кесте).

    Жақсы вакцина үміткерлері потенциалды аутоиммундық реакцияның пайда болуын болдырмау үшін адам ақуыздарымен гомологияны көрсетпейтіндер ретінде қарастырылады, бұл кандидаттарда олардың экспрессиясын жеңілдету үшін ТМ аймақтары болмауы керек. Жақсы вакцинаға үміткер болуы керек тағы бір сипаттама - бұл микроорганизмнің патогенезі және аурудан қорғау үшін маңызды болып табылатын жақсы антигендік қасиеттерге ие болу (Монтеррубио-Лопез және т.б., 2015). Кейбір авторлар силико -конструкцияға ақуыздарды таңдауда осы тәсілдерді қолданған H. pylori вакциналар (Наз және т.б., 2015 Незафат және т.б., 2017).

    3.2. Консенсус антигені

    Әмбебапты дамыту H. pylori вакцина, таңдалған антигендерге консервациялық талдау жасалды. Әр ақуыздың аминқышқылдарының тізбегі салыстырылған және толық аннотацияланған геномдарға сәйкес келетін 85 тізбекпен тураланған H. pylori зерттеу кезінде әртүрлі географиялық аймақтардан. 1 -суретте көрсетілгендей CagA, VacA, FecA, BabA және SabA ақуыздарының жоғары өзгергіштігі байқалды. H. pylori штаммдар, консенсус реттілігі алынды. Бұл әдіс ВИЧ сияқты жоғары өзгергіштігі бар инфекциялық агенттерге қарсы қолданылды (Томсон және т.б., 2005 Гримм мен Аккерман, 2013). Керісінше, консервілеудің ең жоғары пайызы (≥95%) бар белоктар UreB, NapA, GGT, FlaA, HpaA және OipA болды (2 -сурет).

    ІНЖІР. 1. Таңдалған ақуыздардың сақталуын талдау. 85 аннотацияланған геномдардың арасында ақуыздың барлық тізбегі Хеликобактериялар CLC Main жұмыс үстелі арқылы теңестірілді және сақтау ұпайлары 2D сызықтық диаграммада ұсынылды. (а) CagA, (b) СабА, (с) БабА, (d) VacA және (е) FecA. 2D, екі өлшемді.

    ІНЖІР. 2. Таңдалған ақуыздардың сақталуын талдау. 85 аннотацияланған геномының ішіндегі бүкіл ақуыз тізбегі Хеликобактериялар CLC Main жұмыс үстелі арқылы теңестірілді және сақтау ұпайлары 2D сызықтық диаграммада ұсынылды. (а) UreB, (b) GGT, (с) NapA, (d) FlaA, (е) OipA, және (f) HpaA.

    3.3. Т және В жасушаларының эпитоптары

    Т және В жасушалары үшін әртүрлі биоинформатикалық серверлердің болжамды талдауы (адам мен тышқан BALB/c үшін MHC-I/-II аллельдерін қолдана отырып) 11 эпитопты олардың баллына, аллельдер санына және қолданылатын серверлер арасындағы келісімге сәйкес таңдауға мүмкіндік берді. . Алынған эпитоптар NapA болды30–49, CagA1103–1122, FlaA487–506, OipA211–230, GGT106–126, HpaA33–52, БабА129–149, FecA437–456, СабА540–559, VacA459–478, және UreB170–189 (2 -кесте). HpaA33–52 эпитоп туралы Ху және басқалар бұрын хабарлаған. (2016) олар 101-ден рекомбинантты HpaA-мен ынталандырылған антигенге тән CD4 + Т лимфоциттерінің жауабын бағалады. H. pylori-инфекцияланған субъектілерде интерферон-γ өндіретін жасушалардың айтарлықтай жоғарылауы байқалды. Сонымен қатар, UreB тоғыз қалдықтары170–189 Осы зерттеуде болжанған эпитоп UreB-мен сәйкес келеді181–195 эпитоп Цю және т.б. олар сарысумен оң реактивтілікті байқады H. pylori- глутатион S-трансфераза-UreB иммунизацияланған тышқандармен ферменттік иммуносорбентті талдау арқылы жұқтырған науқастар181–195 синтездік пептид эпитопқа тән антиденелердің уреаза ферментативті белсенділігін тежеуге қабілетті екенін көрсетті. Басқа зерттеуде Гуо және т.б. (2017) құрамында UreB бар мультивалентті эпитопқа негізделген вакцина (CWAE деп аталады) ойлап шығарылды және бағаланды.181–195 эпитоп CWAE көмегімен ауызша емдік иммунизация олардың санын едәуір азайтты H. pylori асқазандағы колониялар Моңғол гербиі. CWAE -ны қорғау CD4 + T жасушаларының аралас реакциясының жоғары деңгейімен, G иммуноглобулинімен және А секреторлық иммуноглобулинімен байланысты болды (Guo және т.б., 2017).


    Эпитопты аннотацияланған ақуыз - Биология

    Антиденелер ресурсының беті (ARP) сілтемелері.
    Bio-Rad антиденесі (бұрынғы AbD Serotec) ресурстары-Антиденеге қатысты шағын шолулар, білім туралы қысқаша мәліметтер, қосымшалар мен блог.
    IHCWorld.

    Антиденелер локаторларының ресурстары

    AbMiner - фокус ретінде антидене валидациясы бар антиденелерді іздеу (Genomics and Bioinformatics Group, LMP, CCR, National Cancer Institute).
    Antibodypedia - адам протеинінің нысанасына қарсы коммерциялық қол жетімді антиденелердің ашық қол жетімді дерекқоры (HUPO-ның Табиғат баспасы тобымен бірлесе отырып, адам антиденелер бастамасының (HAI) бөлігі).
    Antibody Explorer - олардың үлкен антиденелер жинағын іздеуге арналған Sigma-Oldrich қондырғысы.
    Антиденелердің тізілімі - 200 -ге жуық жеткізушілердің коммерциялық антиденелерін қоса алғанда, бірегей анықталған антиденелердің тізілімі.
    Антиденелердің ресурстық беті (ARP).
    Bioz - Ғылыми агрегатор, олардың басты бетінен антиденелерді іздеу мен олардың рейтингісінің кешенді қондырғысын, антиденелердің ізделетін тізімін және осыған байланысты категорияларды ұсынады.
    Антиденелерді анықтау қызметі.
    Адам протеині атласы - адам протеомын жүйелі түрде зерттеуге арналған антиденелер протеомикасы.
    IHCWorld.
    Линскотттың иммунологиялық және биологиялық реагенттерінің анықтамалығы.

    Эпитопалық мәліметтер базасы және онымен байланысты құралдар

    AntiJen - кинетикалық, термодинамикалық және ұялы дерекқор v2.0 (T және B жасуша эпитоптары)
    Bcipep - В жасуша эпитоптарының деректер базасы (Биоинформатика орталығы, Микробтық технология институты, Үндістан).
    HLA пептидтерін байланыстыратын болжамдар Биоинформатика мен молекулалық талдау бөлімінің (BIMAS), NIH онлайн -қондырғысы.
    IEDB - Иммундық эпитоптың деректер базасы мен талдаудың ресурсы (T және B жасушаларының эпитоптары NIAID/NIH).
    IMGT - ImMunoGeneTics ақпараттық жүйесі омыртқалылардың барлық түрлерінен MHC, Ig және TcR молекулаларына маманданған.
    MHCBN v4.0-MHC/TAP байланыстыратын, байланыстырылмайтын пептидтер мен Т-жасушалы эпитоптардың кураторлық базасы (Биоинформатика орталығы, Микробтық технологиялар институты, Үндістан).
    MHCPred - жасанды нейрондық желілерді қолдану арқылы пептид -MHC I класының байланысын болжау (Биологиялық реттілікті талдау орталығы (CBS), Дания техникалық университеті).
    NetMHC 4.0 - сервер жасанды нейрондық желілерді қолдана отырып, 500 -ден астам HLA -DR аллельдеріне пептидтердің қосылуын болжайды (Биологиялық реттілікті талдау орталығы (CBS), Дания техникалық университеті).
    NetMHCIIpan 2.0 - сервер жасанды нейрондық желілерді пайдалана отырып, пептидтердің 500-ден астам HLA-DR аллельдерімен байланысуын болжайды (Center for Biological Sequence Analysis (CBS), Данияның техникалық университеті).
    ProPred - MHC класс II эпитопты болжау сервері (Биоинформатика орталығы, Микробтық технологиялар институты, Чандигарх, Үндістан).
    ProPred I - пептидтерді болжайтын MHC I сыныпты онлайн -қондырғы (Биоинформатика орталығы, Микробтық технологиялар институты, Үндістан).
    SDAP - аллергенді ақуыздардың құрылымдық дерекқоры (Биохимия және молекулалық биология кафедрасы, Техас университетінің медициналық филиалы).
    SYFPEITHI - MHC лигандтары мен пептидтік мотивтердің деректер базасы (Биомедициналық информатика (BMI), Гейдельберг/Тюбинген университетінің иммунология бөлімі).

    Ақуыздың 3-D құрылымын болжау

    3D-JIGSAW-Сервер Ұлыбританиядағы қатерлі ісік зерттеулері биомолекулалық модельдеу зертханасының белгілі құрылымының гомологтарына негізделген 3-D протеиндік модельдерді құрастырады.
    3D құрылымын болжау - VLS3D.com сайтындағы толық сілтемелер ресурсы (Виртуалды лиганд скринингі).
    Молекулалық модельдеу орталығы (CMM) (NIH).
    CPHmodels -Протеиндердің гомологиясын модельдеу сервері (Биологиялық жүйелілікті талдау орталығы, (CBS), Дания техникалық университеті).
    ESyPred3D - ақуыз 3 -D құрылымын құру үшін MODELLER (төменде қараңыз) қолданатын гомология модельдеу сервері (Намур университеті, Бельгия).
    EVA - «нақты уақытта» ақуыз құрылымын болжау серверлерін үздіксіз автоматты бақылау.
    Interactome3D-кез келген ақуыздық-ақуызды өзара әрекеттесу жиынтығына құрылымдық ақпаратты динамикалық түрде нақты уақыт режимінде салыстыруға арналған бірегей гомологиялық модельдеу ресурсы (Биомедицинадағы зерттеулер институты, Барселона).
    MMDB (Molecular Modeling DataBase) - молекулалық модельдеуге арналған 3-D құрылымдық деректер базасы (NCBI).
    MODELLER - Кеңістіктік шектеулерді қанағаттандыру арқылы ақуызды модельдеу (Network Science - NetSci).
    Phyre2 - Phyre2 (Protein Homology/analogY Recognition Engine) гомологияны қашықтан модельдеу сервері (Structural Bioinformatics Group, Imperial College, London).
    Ақуыздар моделі порталы (PMP) - модель құруға және сапаны бағалауға арналған әр түрлі интерактивті қызметтерге шлюз (Computational Structural Biology Group, SIB).
    Протеин құрылымын болжау орталығы (Калифорния университеті, Дэвис).
    ROBETTA - Rosetta бағдарламалық қамтамасыз ету провайдерлерінің толық тізбекті ақуыз құрылымын болжау сервері (Бейкер зертханасы, Вашингтон университеті).
    SWISS -MODEL - толық автоматтандырылған ExPASy протеин құрылымының гомологиясын модельдеу сервері (жаңадан бастаушылар үшін жақсы сайт). Бұл серверге DeepView (Swiss-PDBViewer) жүктеп алынатын бағдарламасынан да қол жеткізуге болады.
    TINKER - Молекулярлық дизайнға арналған бағдарламалық құралдар.

    Аллостериялық деректер базасы (ASD) - аллостериялық белоктар мен модуляторлардың деректер базасы (Молекулалық дизайн зертханасы, Шанхай Джайотонг университеті, Қытай).
    Ақуыздық бүйірлік тізбектік өзара әрекеттесу атласы-ақуыз-ақуыз және ақуыз-ДНҚ. Биомолекулалық құрылым және модельдеу тобы, Лондон университетінің колледжі).
    Көк гендік жоба - ақуыз құрылымына қолданылатын суперкомпьютер (IBM)
    CLICK - Биомолекулалық 3-D құрылымдарын топологиядан тәуелсіз салыстыру (A*STAR биоинформатика институты, Сингапур).
    Dali сервері - ақуыздық 3 -D құрылымдарын салыстыруға арналған онлайн қондырғы (Биотехнология институты, Хельсинки университеті).
    Макромолекулалық қозғалыстардың мәліметтер базасы - икемділік пен геометриялық анализге байланысты құралдармен (Герштейн зертханасы, Йель университеті).
    ДНҚ байланыстыратын ақуыздың құрылымдық отбасылары - ДНҚ тану мотиві бойынша топтастырылған гиперсілтеме ақпараты (The University of College College, The Biomolecular Structure and Modeling Group, London College College).
    EDS - Electron Density Server (Уппсала университеті, Швеция).
    ELM - кіріс тізбегінен ақуыздың функционалды торабын болжауға арналған эукариоттық сызықтық мотив ресурсы (ELM консорциумы).
    Ферменттер құрылымының мәліметтер базасы - EC Ақуыздар деректер банкінде (PDB) сақталған белгілі ферменттік құрылымдардың PDB мәліметтер базасы.
    Эпитом - ақуыздардағы құрылымдық анықталған антигендік эпитоптардың мәліметтер базасы.
    iELM - Эукариоттық сызықтық мотив ресурсының өзара әрекеттесуі ақуыз -ақуызды өзара әрекеттесу интерфейсімен (EMBL) байланысты қысқа сызықты мотивтерді (SLiMs) болжайды.
    Interactome3D - ақуыз -ақуыз өзара әрекеттесу желілерінің құрылымдық аннотациясына арналған веб -қызмет (Биомедицинадағы зерттеулер институты, Барселона).
    JenaLib Jena биологиялық макромолекулалар кітапханасы. Ақуыз атласын визуализациялау және талдау ресурсы (Молекулалық биология институты (IMB), Йена, Германия).
    MMDB (Molecular Modeling DataBase) - молекулалық модельдеуге арналған 3 -D құрылымдық мәліметтер базасы (NCBI).
    ModBase - протеин құрылымының салыстырмалы модельдерінің мәліметтер базасы (Sali Lab, Калифорния университеті, Сан -Франциско).
    PartsList - ақуыз қатпарларын талдауға арналған ресурс (Герштейн зертханасы, Йель университеті).
    PDBsum - ақуыздық құрылымдық ақпаратқа арналған негізгі интернет -ресурс (EMBL -EBI).
    PDBWiki - Биологиялық молекулалық құрылымдардың аннотацияланған қауымдастығы.
    PISA (PDBePISA) - Протеин интерфейстері, беттер және жинақтар құралы және ықтимал төрттік құрылымдарды болжау (EMBL-EBI).
    PRINTS - ақуыздың саусақ іздерінің жиынтығы, ақуыздар тобын сипаттау үшін сақталған мотивтер тобы.
    Motif Scan - ProSite профилі мен өрнектерінің мотивтері және Pfam ақуыздар тобы (SIB - ISREC).
    Протеиндік домендердің, отбасылардың және функционалды сайттардың PROSITE мәліметтер базасы (ExPASy - SIB).
    Протеин деректерінің банкі (PDB) - Құрылымдық биоинформатика бойынша ғылыми-зерттеу серіктестігінен (RCSB).
    Еуропадағы ақуыз деректерінің банкі (PDBe) - биологиялық макромолекулярлық құрылымдар (EMBL-EBI) туралы деректерді жинауға, ұйымдастыруға және таратуға арналған еуропалық ресурс.
    Protein Data Bank Japan (PDBj) – макромолекулярлық құрылымдар мен интеграцияланған құралдардың деректер базасы (Ұлттық биоғылым деректер базасының орталығы және Осака университеті).
    Протеин моделінің порталы (PMP бұрынғы PSI протеин құрылымы туралы білім қоры) - әртүрлі салыстырмалы модельдеу әдістерімен есептелген белгілі бір ақуыздың үлгілеріне арналған шлюз (Есептік құрылымдық биология тобы, SIB).
    Рамачандран сюжеті - Белгілі құрылымның кіріс ақуызынан негізгі тізбектің бұралу бұрыштарын көрсететін сервер (Суперкомпьютерлік білім және зерттеу орталығы, Бангалор).
    SALIGN - MODELLER (алдыңғы бөлімді қараңыз) (Sali Lab, Калифорния университеті, Сан-Франциско) пайдалануға негізделген бірнеше ақуыз тізбегін/құрылымын теңестіру сервері.
    SWISS-MODEL репозиторийі-SWISS-MODEL ExPASy модельдеу құбырынан алынған аннотацияланған 3-D протеин құрылымының үлгілерінің мәліметтер базасы (алдыңғы тарауды қараңыз).
    Тесейлер - максималды ықтималдығы бар суппозицияның жаңа әдісін қолданып, бірнеше макромолекулярлық құрылымдардың бір мезгілде қосылуы (Брэндейс университеті, Массачусетс штаты).

    Ақуыздық топтар мен домендер

    CATH протеин құрылымын жіктеу дерекқоры - домен құрылымы және суперфамилия бойынша жіктелген PDB ішіндегі ақуыз құрылымдарының іздеуге болатын дерекқоры (Orengo Group, University College, London).
    Протеин құрылымдарын салыстыруға және теңестіруге арналған комбинаторлық кеңейтім (CE) құралы (RCSB PDB).
    Сақталған домен деректер базасы (CDD) және ақуызды іздеу құралы (NCBI).
    Дали ақуызының құрылымын басқа ақуыз құрылымына сәйкестендіру (жұптық салыстыру) немесе PDB (Хельсинки университеті, Финляндия) барлық жазбаларына. Dali жұптық құрылымды туралау EMBL-EBI-де осында қол жетімді.
    DBAli Ақуыз құрылымын теңестіру деректер базасы (Sali Lab, Калифорния университеті, Сан-Франциско).
    FATCAT - Fлексикалық құрылым AлигнмендерТ. бойынша Cхайнинг Aмүмкіндік беретін сызықты фрагмент жұптары Т.білектер (Санфорд-Бернхэм медициналық зерттеу институты, АҚШ).
    InterPro ақуыздарды отбасыларға жіктеу және домендер мен функционалдық тораптарды болжау үшін (EMBL-EBI) болжау үшін PROSITE, PRINTS, PFAM, PRODOM, SMART және басқа мәліметтер базасынан алынған мәліметтерді біріктіреді.
    PASS2 - Ақуызды теңестіру құрылымдық суперфамилиялар ретінде ұйымдастырылған (Ұлттық биологиялық ғылымдар орталығы (NCBS), Бангалор, Үндістан).
    3-D (EMBL-EBI) форматындағы ақуыз құрылымдарын интерактивті салыстыруға, теңестіруге және суперпозицияға арналған PDBeFold екінші құрылымды сәйкестендіру (SSM) қызметі.
    PeCoP - іздейтін сервер Peтабанды түрде Coқызмет көрсетілді Пжақын және алыс ақуыздар отбасы мүшелерінің тізбектелуі.
    Pfam - Протеиндер тұқымдасының және жасырын Марков модельдерінің мәліметтер базасы (EMBL -EBI).
    POSA (Partial Order Structure Alignment). Ішінара тапсырыс графиктерін қолдана отырып, құрылымның бірнеше икемділігі.
    ProDom - UniProt білім базасынан автоматты түрде жасалынатын ақуыздық домендік отбасылардың мәліметтер базасы.
    SCOP (Белоктардың құрылымдық жіктелуі) - Белгілі ақуыз қатпарларының кең шолуын және кез келген белгілі бір ақуыздың жақын туыстары туралы егжей-тегжейлі ақпаратты қамтамасыз ететін ақуыз доменінің дерекқоры (MRC Молекулярлық биология зертханасы, Кембридж, Ұлыбритания).
    SMART (Қарапайым молекулалық архитектураны зерттеу құралы) - Ақуыздар доменінің дерекқоры және жүйелілікті талдау құралы (EMBL).
    TOPSCAN Ақуыз құрылымдарын олардың қосалқы құрылымдары негізінде салыстырудың жылдам әдісі (Лондон колледжі, Ұлыбритания).
    VAST Вэктор Aлигнировка С.құлақ Т.3-D протеинінің ұқсас протеинін анықтауға арналған оол және жүйелік салыстыру арқылы анықталудан қашатын алыстағы гомологтар (NCBI).

    Белок сигналы/сұрыптау ретін болжау

    PSORT - ақуызды сұрыптау сигналдарын және аминқышқылдарының тізбегіндегі локализация орындарын болжау.
    SignalP - белоктар тізбегіндегі сигналдық пептидтердің бөліну орындарын болжау (Биологиялық тізбекті талдау орталығы, (CBS), Дания техникалық университеті).
    SOSUIsignal Signal пептидтерін болжау сервері (Биотехнология кафедрасы, Токио ауыл шаруашылығы және технология университеті).
    TargetP - эукариоттық белоктардың субклеткалық орналасуын болжайды (Center for Biological Sequence Analysis, (CBS), Данияның техникалық университеті).

    Мембраналық ақуыздар және топологияны болжау

    DAS - DAS (Dens Alignment Surface әдісі) Трансмембраналық болжау сервері (Стокгольм биоақпараттық орталығы).
    HMMTOP - трансмембраналық спиралдар мен ақуыз топологиясын болжауға арналған сервер (Венгрия Ғылым Академиясы орналастырған).
    Мембраналық протеиндер туралы мәліметтер банкі (MPDB) - мембраналық ақуыздар мен пептидтер туралы таңдаулы құрылымдық және функционалдық ақпаратты қамтитын мәліметтер базасы (Дублиндегі Тринити колледжі).
    Мембраналық ақуыз ресурстары (Стивен Уайт зертханасы, Калифорния университеті, Ирвин).
    Белгілі 3D құрылымының мембраналық ақуыздары - Калифорния университетінің Стивен Уайт зертханасының үздіксіз жаңартылған тізімі, Ирвин.
    Мембраналардағы ақуыздардың бағдары (OPM) - көмірсутек ядросының липидті екі қабатты қабатына қатысты мембраналық ақуыздардың топологиясын қамтамасыз ететін мәліметтер базасы (Мосберг зертханасы, Мичиган университеті, АҚШ).
    orienTM - реттіліктен трансмембраналық ақуыздардың бағдарын (топологиясын) болжайды (Афина университетінде орналасқан).
    Ақуыздар трансмембраналық ақуыздар банкі (PDBTM) ПДБ трансмембраналық ақуыздардың толық және жаңартылған дерекқоры (Венгрия Ғылым Академиясы, Ферментология институты).
    SOSUI - мембраналық ақуыздардың жіктелуі мен қайталама құрылымын болжау (Қолданбалы физика кафедрасы, Нагоя университеті, Жапония).
    TMHMM - ақуыздардағы трансмембраналық спиралдарды болжау (Биологиялық реттілікті талдау орталығы, (CBS), Дания техникалық университеті).
    TMpred - трансмембраналық аймақтар мен бағдарды болжау (Швейцария биоинформатика институты).
    TopPred - мембраналық ақуыздардың топологиясын болжау (Institut Pasteur).

    COILS - ақуызды катушкалар аймағын болжау (Швейцария биоинформатика институты).
    MARCOIL - Протеин орамының домендерін болжауға арналған жасырын Марков үлгісіне негізделген бағдарлама. (Биоинформатика, Уолтер және Элиза Холл медициналық зерттеулер институты, Австралия).
    MultiCoil - ақуызды димерлік және тримерлік катушкаларды болжау (MIT информатика және жасанды интеллект зертханасы (CSAIL)).
    PairCoil2 - мультимерикалық емес ақуыздар (MIT - CSAIL) бойынша оралған катушкалар аймақтарын болжау.

    Ақуыздың ыдырауының ресурсы (Уилкинсон зертханасы, Эмори университетінің медицина мектебі, Атланта, АҚШ).
    AAA - әр түрлі жасушалық белсенділіктермен байланысқан ATPases ақуыздың супер отбасы - ақпарат пен сілтемелер (Молекулалық биология ғылымдары институты, Грац, Австрия).
    CutDB - нақты және болжанатын жеке протеолитикалық оқиғалардың аннотациясына бағытталған мәліметтер қорының ресурсы (Sanford -Burnham Medical Research Institute, US).
    EC-IUBMB пептидазалық номенклатура: a және b тізімдері.
    АҚТҚ протеазының дерекқоры (Ұлттық стандарттар және технологиялар институты (NIST), АҚШ).
    Халықаралық протеолиз қоғамы (IPS).
    MEROPS - Пептидаза деректер базасы (Wellcome Trust Sanger институты, Ұлыбритания).
    NetChop - нейрондық желіге негізделген протеазомалық бөліну торабын болжау сервері (Биологиялық реттілікті талдау орталығы, (CBS), Дания техникалық университеті).
    PAProC - протеазомалық бөліну орнын болжау қондырғысы (Иммунология және биоматематика кафедралары, университет Тюбинген.
    PeptideCutter - протеазаның бөліну орнын болжаушы (ExPASy- SIB).
    PoPS - протеаз спецификалығын болжауға және модельдеуге арналған есептеу құралдары (Виктория Биоинформатика Консорциумы -Монаш университеті, Австралия).

    Таңдалған басқа арнайы протеиндік отбасылар

    Есептеу биологиясы/Биоинформатика

    Биоинформатика @ Манчестер Манчестер университеті (Ұлыбритания).
    Биоинформатика және молекулалық талдау бөлімі (BIMAS) - Ақпараттық технологиялар орталығы (CIT), NIH.
    Bioinformatics.ca (канадалық биоақпараттық порталы).
    Биоинформатика орталығы (Сингапур Ұлттық университеті).
    Үндістан биоинформатика институты - коммерциялық емес білім беру, ғылыми -зерттеу орталығы.
    Canadian Bioinformatics.ca сілтемелер каталогы - биоинформатика ресурстарының динамикалық мүмкіндіктері бар тізімі, сонымен қатар NAR Webserver шығарылымындағы барлық сілтемелердің тізімі.
    Биоинформатика ұйымы – зерттеулер, әзірлемелер және білім беру үшін тегін, ашық ресурстарды ұсынады.
    Молекулярлық және биомолекулалық информатика орталығы (CMBI) – Ниймеген университеті, Нидерланды.
    Есептік биология орталығы (IBM).
    Швейцария биоинформатика институтының (SIB) есептік қатерлі ісік геномикасы (CCG) тобы - Молекулалық реттілік пен биологиялық функцияларға қатысты талдау құралдары мен мәліметтер базасын әзірлеу.
    Db Browser - (Биоинформатика, Манчестер университеті).
    Еуропалық биоинформатика институты (EMBL-EBI).
    Bioinformatics Learning, Education & amp Training жаһандық ұйымы (GOBLET) порталы.
    Биоинформатика және биотехнология институты (IBB) – Пуна университеті, Үндістан).
    Халықаралық есептеу биологиясы қоғамы (ISCB).
    Математикалық, есептеу және жүйелік биология (MCSB Калифорния университеті, Ирвин).
    Ұлттық биотехнологиялық ақпарат орталығы (NCBI) - АҚШ Ұлттық медицина кітапханасы (NLM).
    Шанхай биоақпараттық технологиялар орталығы (SCBIT)
    Оңтүстік Африка ұлттық биоинформатика институты (SANBI) - Батыс Кейп университеті.
    Швейцария биоинформатика институты (SIB).
    Open Bioinformatics Foundation (O|B|F) – биоинформатикадағы ашық бастапқы бағдарламалауды қолдауға бағытталған коммерциялық емес, ерікті ұйым.

    Авторлық құқық 2020 ePitope Informatics


    Консенсус e питоптың болжамы
    (Адам ДНҚ
    ақуызды қалпына келтіру,
    MGMT - шыңы
    эпитоп қалдықтары
    алтынмен көрсетілген).


    Реферат

    Біз протеин-антиденелерді тану туралы молекулалық түсінікті ақуызға негізделген аналитикалық және диагностикалық құралдардың конструкциясына айналдыруға бағытталған жоғары биіктіктегі микроореологиялық анализі бар есептеу биологиясын кіріктіретін жаңа көпсалалы стратегияны ұсынамыз. Жақында жасалған MLCE есептеу әдісін қолдана отырып, потенциалды антиденелерді байланыстыратын эпитоптарды болжау мен жобалау үшін әр түрлі қатпарлы және қосалқы құрылымы бар екі ақуыздың құрылымы, атап айтқанда, бета-баррельді FABP және α-спиральды S100B, негіз болды. . Белок-антигеннің құрылымы, динамикасы және тұрақтылығы антиденелермен әрекеттесуде шешуші рөл атқарады деген идеядан бастап, MLCE оптимизацияланбаған, төмен қарқынды энергетикалық өзара әрекеттесу желілерін анықтау үшін ақуыздардың динамикалық және энергетикалық қасиеттерін талдауды біріктіреді. оқшауланған антигендердің бетінде, олар байланыстырушы серіктеспен орынды түрде танылуы мүмкін қосалқы құрылымдарға сәйкес келеді. Анықталған эпитоптар кейін бос пептидтер ретінде синтезделді және қояндарда арнайы антиденелерді шығару үшін қолданылды. Маңыздысы, алынған антиденелер микромассив негізіндегі сынақтарда түпнұсқа, толық ұзындықтағы ақуыздарды арнайы және таңдамалы түрде танитыны дәлелденді. Бәсекелестік эксперименттер бұдан әрі мақсатты иммобилизацияланған ақуыздар мен түзілген антиденелер арасындағы молекулалық танудың ерекшелігін көрсетті. Біздің біріктірілген есептеу және микромассив негізіндегі нәтижелер мақсаттағы үш өлшемді құрылымдық ақпараттан бастап толық ұзындықтағы ақуыздарға тән антиденелерді алуға қабілетті синтетикалық эпитоптарды ұтымды ашу және жобалау мүмкіндігін көрсетеді. Біз вакцина жасау мен диагностикалаудың салдарын талқылаймыз.


    Қосымша Ақпарат

    Авторлардың қосқан үлесі

    HL клондау процедураларын, Cbf1 мен Tbf1 -ді HA, MYC және TAP белгілеу процедураларын жүргізді. C. albicans, иммуноблоттар, NOP1-TAP, Cbf1-TAP және Tbf1-TAP ChIP-CHIP, сонымен қатар lacZ репортер талдауы. AS және CA Mcm1-TAP құрды C. albicans штамм және Mcm1-TAP ChIP-CHIP ашытқы күйінде де, гипал күйінде де орындалды. AN және MW бұл жұмысты бақылады. Мақаланың бірінші жобасын HL және AS жазған. Барлық авторлар соңғы қолжазбаны оқып, бекітті.


    Нәтижелер

    Ақуыздарды N немесе C терминалында белгілеуге болады. GCE негізіндегі таңбалау үшін біз ncAA тиімсіз енгізілуінен болатын ақуыздың үзілуін болдырмау үшін N-терминалды тегті жобалауды таңдадық [5, 6, 16, 17]. Бұрынғы жұмысымыздың негізінде әлеуетті тегтер биотиксин-конъюгацияланған Fl-бояғыштармен биорогорогональды түрде әрекеттесетін ncAA висикло-нонизилизинінің (BCN-Lys) қосылуын кодтауға арналған бір экспрессия векторына клондалған (сурет 1b және 1-қосымша файл: S1a суреті) [6, 18, 19]. Таңбалау потенциалы бастапқыда α-тубулинді эталон ретінде және кремний-родамин-тетразин (SiR-Tet) қатысуымен тірі сүтқоректілер жасушаларында микротүтікшені (MT) таңбалауды бағалау арқылы бағаланды [6, 20]. BCN-Lys-ті 45-позициядағы α-тубулинге (α-тубулин 45TAG) енгізгеннен кейін алынған MT таңбалауы осы сайтта MT таңбалауының тиімділігін бұрынғы демонстрациямызды ескере отырып, сілтеме ретінде пайдаланылды [6].

    Ең төменгі N-терминалы GCE-тегінде BCN-Lys-ті қосуды кодтайтын TAG коды болуы керек. Өкінішке орай, тірі жасушалық бейнелеу немесе гельдік флуоресценцияны қолдана отырып, SiR-Tet қатысуымен өзінің N-терминалында (бірінші қалдықтың алдында) TAG кодонын алып жүретін α-тубулинді көрсеткенде арнайы таңбалау алынбады (Қосымша файл 1: S1b және S2 суреті). Бұл белокты кодтау тізбегінің жоғарғы жағындағы TAG кодонының жалғыз қосылуы таңбалау үшін жеткіліксіз екенін көрсетеді, мүмкін рибосоманың ақуыздың ең N-терминалында ncAA-ны біріктіре алмауына байланысты. Әр түрлі ұзындықтағы потенциалды N-терминалды тегтер омыртқа сүйегі ретінде жиі қолданылатын тоғыз амин қышқылының (АА) ұзын гемагглютининнің (HA) эпитопы негізінде жасалған [21] (2а-сурет және Қосымша файл 1: Сурет S1c- f) TAG кодоны HA тізбегіне енгізілді (эпитопадағы соңғы кодонның орнына) (1), HA тізбегінен кейін (2), немесе глицин-серинді (GS 3) қамтитын қысқа қолданылатын жиі қолданылатын икемді байланыстырушыдан кейін. глицин-глицин-серин-глицин (GGSG 4). Осы тегтердің кез келгенін қолдану арқылы α-тубулиннің төмен, бірақ елеулі деңгейі байқалды, бұл N-терминалды тегтелген α-тубулиннің жасушаларда көрсетілгенін көрсетеді (2б-сурет). SiR-Tet көмегімен тірі жасушаларды таңбалау эксперименттерінде 1 немесе 2 зондтармен белгіленген α-тубулинді қолдана отырып, MT безендірулері аз алынды (2с, 1-2 сур.), Ал 3 және 4 белгілерінің көмегімен айқын және нақты таңбалау байқалды. (Cурет 2c, 3-4), бұл 3 және 4 зондтардың α-тубулин үшін GCE-тегтері ретінде қызмет ете алатынын көрсетеді.

    α-тубулинді пайдалана отырып, генетикалық кодты кеңейтуге (GCE) негізделген флуоресцентті таңбалау үшін минималды тегті оңтайландыру. а Қолданылған және тексерілген тегтердің схемалық көрінісі бд. Тегтердің толық реттілігі 1-қосымша файлда көрсетілген: S1c-f суреті. бд GCE-тегтері (а-да көрсетілген) pBUD-Pyl-RS-tub плазмидасының көмегімен α-тубулиннің N-терминалына субклонданды (Қосымша файл 1: Сурет S1a). HEK293T (б) немесе COS7 (вд) жасушалар әр түрлі тегтері бар pBUD-Pyl-RS-ванна плазмидаларымен, α-тубулиннің WT нұсқасымен немесе мақсатты ақуызсыз трансфекцияланды және ncAA BCN-Lys қатысуымен 48 сағат бойы инкубацияланды. Содан кейін жасушалар батыстық блот талдауына ұшырады (б) немесе 1 сағат бойы SiR-Tet белгісімен және тікелей бейнеленген (вд). Суреттер в өкілдік ұяшықтардан алынған 3D z-стектерінің максималды қарқындылық проекциялары. d Сары квадраттармен белгіленген аймақтардың үлкейтілген кескіндері в. Суреттерде сызылған қызыл сызықтар бойындағы қарқындылық мәндері төменде көрсетілген, бұл SNR жақсарғанын көрсетеді. д G45 позициясына немесе N-терминалға 3 немесе 4 тегтері арқылы енгізілген BCN-Lys бар α-тубулинді білдіретін жасушаларда өлшенген SNR мәндері. WT тубулинін білдіретін ұяшықтарда өлшенген орташа SNR 1,2 (қызыл сызықша) болды. Бұрын GFP көмегімен өлшенген орташа SNR 1,75 (жасыл үзік сызық) болды. n = 25. Нәтижелер көрсетілген бд кем дегенде 3 тәуелсіз экспериментте алынды. f Оңтайландырылған GCE-тегінің схемалық көрінісі әрі қарай таңбалау үшін пайдаланылады. Масштаб жолақтары: в 10 мкм, d 2 мкм

    Потенциалды GCE-тегтерін қолдану арқылы алынған таңбалаудың тиімділігін бағалау үшін 2d суретте көрсетілгендей, сызықтың қарқындылығының профиліне негізделген таңбаланған ұяшықтарда сигналдың шуылға қатынасы (SNRs) өлшенді. α-тубулин нұсқаларының кез келгенін білдіретін ұяшықтарда өлшенген SNR мәндері ncAA қосуға қабілетсіз α-тубулиннің жабайы типті (WT) нұсқасын көрсететін ұяшықтарда өлшенген орташа фондық деңгейлерден айтарлықтай жоғары болды, бұл таңбалаудың ерекше екенін растайды ( 2е -сурет). 4-зондпен белгіленген α-тубулинді білдіретін жасушалар 3-ші зондпен салыстырғанда айтарлықтай жоғары SNR көрсетті, бұл MT таңбалау үшін HA-GGSG-ncAA артық екенін көрсетеді. Атап айтқанда, 4-зонд көмегімен алынған экспрессияның салыстырмалы төмен деңгейіне қарамастан, 4-зондпен белгіленген α-тубулинді білдіретін жасушаларда алынған орташа SNR мәндері α-тубулин 45TAG экспрессивті жасушаларда немесе α-тубулин-GFP ( 2d, e) суреті [6]. Төменгі α-тубулиндік экспресс деңгейінде SNR-дің жоғарылауы жасушаларда цитозоликалық (полимерленбеген) таңбаланған тубулин фракциясының төмендеуінен болуы мүмкін және жасуша физиологиясы үшін артықшылықты болып табылады. Сондықтан біз HA-GGSG-ncAA-таңбаланған α-тубулин MT таңбалау үшін арнайы ncAA қосылған а-тубулиннен жоғары деген қорытындыға келдік. Осы нәтижелерге сүйене отырып, біз N 'HA-GGSG-ncAA тірі сүтқоректілер жасушаларында белоктарды GCE негізіндегі биоортогональды таңбалаудың минималды белгісі ретінде анықтадық (2ф-сурет).

    Әр түрлі ұялы бөліктерді таңбалау үшін GCE-тегінің (HA-GGSG-ncAA, 2ф-сурет және 1-қосымша: S1f-сурет) қолданылуы мен ерекшеліктерін тексеру үшін біз оны алдымен GFP-ге конъюгацияланған ұялы маркерлерге қолдандық, яғни, плазмалық мембрананың (PM) маркері GFP-CAAX және пероксисомалық GFP-SKL маркері (3 және 4-сурет). GCE-тегтелген GFP-CAAX GFP-CAAX-қа қарағанда жоғары деңгейдегі жасушаларда көрсетілген, ол GFP-те оңтайландырылған күйде TAG кодонын алып жүреді (GFP 150TAG -CAAX, 3а-сурет) [19]. Жүйелі түрде, GCE тегі бар GFP-CAAX немесе GFP 150TAG -CAAX экспрессиясы бар және SNR мәндері салыстырмалы түрде ұқсас GFP және SiR арналарында SiR-Tet белгісімен таңбаланған ұяшықтарда PM безендіру байқалды (сурет 3b, c). GCE-taged GFP-CAAX немесе GFP 150TAG CAAX үшін SiR арнасы арқылы PM таңбалауы үшін өлшенетін SNR мәндері ncAA (WT GFP-CAAX) енгізе алмайтын GFP-CAAX білдіретін ұяшықтармен өлшенетін деңгейлерге ұқсас және айтарлықтай жоғары болды, таңбалаудың спецификалық екенін және GCE-тегімен бұзылмағанын көрсетеді (3d, e-сурет).

    Минималды GCE-тегі арқылы алынған плазмалық мембрананың (ПМ) таңбалануы GFP және сайтқа тән таңбалаумен салыстырылады. HEK293T (а) немесе COS7 (бд) жасушалар GCE-tag-GFP-CAAX, GFP-CAAX 150 позициясында TAG немесе GFP-CAAX WT нұсқасында мутацияланған pBUD-Pyl-RS плазмидаларымен трансфекцияланды және BCN-Lys қатысуымен 48 сағат бойы инкубацияланды. . Содан кейін жасушалар батыстық блот талдауына ұшырады (а) немесе 1 сағат бойы SiR-Tet белгісімен және тікелей бейнеленген (бд). Суреттер репрезентативті жасушалардың бірыңғай конфокальды тілімдерін білдіреді. d Көрсетілген конструкцияларды білдіретін және SiR-Tet белгісімен белгіленген ұяшықтарда алынған сызық қарқындылығы профильдері. Жоғарғы панель: конфокальды тілімдердің үлкейтілген суреттері. Төменгі панель: суреттерде сызылған сызық бойындағы қарқындылық мәндері. д GFP-CAAX әр түрлі нұсқаларын білдіретін ұяшықтардағы GFP және SiR үшін өлшенетін SNR мәндері. n = 30. Нәтиже кем дегенде 3 тәуелсіз экспериментте алынды. Масштабты жолақтар: б, в 10 мкм, d 2 мкм

    GCE белгісімен белгіленген GFP-SKL пероксисомаларында таңбалаудың ерекшелігі мен тиімділігін көрсету. HEK293T (а, б) немесе COS7 (вf) жасушалар көрсетілген GFP-SKL конструкцияларын тасымалдайтын pBUD-Pyl-RS плазмидаларымен трансфекцияланды және ncAA BCN-Lys қатысуымен 48 сағат бойы инкубацияланды (1 және 3 жолдарды қоспағанда) б). Содан кейін жасушалар вестерн-блот талдауына ұшырады (а) немесе SiR-Tet белгісімен 1 сағат бойы таңбаланған және гельдік флуоресценцияға ұшыраған (б) немесе тікелей бейнеленген (вg). б Жасушалар лизиденді және SDS-PAGE-ге бірдей жалпы ақуыз мөлшері жүктелді. Нәтижелер SiR флуоресценциясының көмегімен жазылды. Вестерн блотта алынған өлшемге ұқсас өлшемді алатын арнайы жолақ тек GCE-тег-GFP-SKL экспрессиясы бар және BCN-Lys көмегімен инкубацияланған жасушаларда ғана байқалды, бұл арнайы таңбалауды көрсетеді. в, d Өкіл жасушалардың максималды қарқындылық проекциялары. Солдан оңға қарай: әрбір арнада алынған флуоресценция, біріктірілген кескін және ядроны жоққа шығаратын ұяшықтың үлкен жиынындағы 640 (SiR) және 488 (GFP) қарқындылық мәндері арасындағы бірлескен локализация талдауы (біріктірілген кескіндегі ақ тіктөртбұрыш): Пирсонның корреляциялық мәндері: в 0.86, d 0.07. д Солдан оңға қарай: ұяшықтың үлкейтілген суреті в, үлкейтілген суреттегі үзік сызық үшін өлшенетін сызықтың қарқындылығы профилі және GFP-SKL әр түрлі нұсқаларын білдіретін ұяшықтардағы GFP және SiR үшін өлшенген SNR мәндерінің қысқаша мазмұны. n = 40. f, g Көрсетілген конструкцияларды білдіретін ұяшықтар SiR-Tet белгісімен белгіленді және ұқсас кескін параметрлері (экспозиция уақыты мен лазер қарқындылығы) арқылы суретке түсірілді. f GFP позитивті пероксисомалары қарқындылығына қарай сегменттелген. Әрбір пероксисома үшін GFP арнасындағы орташа қарқындылық SiR арнасындағы орташа қарқындылыққа қарсы сызылған.

    GFP таңбаланған пероксисомалардың 95% -ы фоннан жоғары SiR қарқындылығын көрсетті. g SiR-оң нүктелер қарқындылық негізінде сегменттелген. Әр нүкте үшін SiR арнасындағы орташа қарқындылық GFP арнасындағы орташа қарқындылыққа қарсы сызылған.

    SiR-оң нүктелердің 5% -ы GFP теріс болды. GCE-tag-GFP-SKL білдіретін жасушалардағы SiR нүктелері үшін өлшенетін орташа қарқындылық деңгейі, арнайы таңбалауды көрсететін, WT GFP-SKL экспрессивті ұяшықтарда сегменттелген SiR нүктелері үшін өлшенетін деңгейлерден кемінде екі есе жоғары болды. Нәтижелер кем дегенде 3 тәуелсіз экспериментте алынды. Масштаб жолақтары 10 мкм

    GCE-таңбаланған GFP-SKL HEK293 жасушаларында көрсетілді және BCN-Lys қатысуымен жасушаларды SiR-Tet таңбалауымен гельдегі флуоресцентті талдау кезінде осындай мөлшердегі белгілі бір жолақ байқалды (4а-сурет, б) Атап айтқанда, WT GFP-SKL GCE-тегтелген GFP-SKL-мен салыстырғанда жоғары деңгейде көрсетілгенімен, WT GFP-SKL үшін гель ішіндегі флуоресценцияны пайдаланатын арнайы таңбалау байқалмады, бұл таңбалаудың Fl-мен байланысуы арқылы арнайы индукцияланғанын қатты көрсетеді. GCE белгісі бар GFP-SKL ішіндегі ncAA-ға бояу. Тірі жасушаларда GFP мен SiR-дің кішкентай нүктелерде керемет бірлесе орналасуы ұқсас SNR-де бүкіл жасушада (ядродан басқа) байқалды (4c-сурет, Пирсон корреляциясы = 0,86). Бұл WT GFP-SKL экспрессиясы бар және GFP мен SiR нүктелері арасындағы антикорреляцияны көрсететін SiR белгісімен белгіленген жасушаларда болған жоқ (4d, e, Пирсон корреляциясы = 0,07). Бұл ұяшықтарда SiR нүктелерінің аз популяциясы байқалды, бірақ бұл нүктелер жасушаның барлық жерінде байқалған GFP нүктелерімен бірге локализацияланбады. Бұл нәтижелер GCE таңбаланған GFP-SKL жасушаларында байқалатын бірлескен локализация ақуыздың арнайы SiR таңбалауынан туындағанын көрсетеді.

    Флуоресценция сигналының SKL таңбаланған ұяшықтарындағы дискретті нүктелерге ұйымдастырылуы бір арнадағы нүктелердің популяциясын сегменттеу және басқа арнадағы олардың қарқындылығын сандық анықтау арқылы салыстырмалы таңбалау шығымдылығын бағалауға мүмкіндік берді (сурет 4f, g). WT GFP-SKL экспрессиясын көрсететін және SiR-Tet белгісімен белгіленген жасушалардан бөлінген GFP нүктелері GFP қарқындылық деңгейлерімен масштабталмаған төмен қарқынды SiR деңгейлерін көрсетті (4f-сурет). Біз осы жасушаларда алынған SiR деңгейлері фондық SiR флуоресценциясын көрсетеді деп ойладық. GCE-тегтелген GFP-SKL білдіретін ұяшықтарда сегменттелген GFP пунктуасының көпшілігі (

    95%) WR GFP-SKL білдіретін жасушаларда өлшенетіндерге қарағанда SiR қарқындылығының жоғары деңгейіне ие болды. Сонымен қатар, SiR арнасындағы қарқындылық деңгейлері GFP интенсивтілігімен шкалаланады, бұл SiR флуоресценциясын бір пероксисомалардағы GFP-SKL салыстырмалы деңгейлерін сандық анықтау үшін пайдалануға болатындығын көрсетеді. GCE-тегтелген GFP-SKL білдіретін жасушалардағы SiR-оң нүктелерді сегменттеу ұқсас мінез-құлыққа әкелді, GFP теріс болып көрінетін SiR пунктатасының аз популяциясы (5%-дан аз) (4г-сурет). WT GFP-SKL экспрессиясы бар жасушаларда SiR нүктелерінің шағын популяциясы сегменттелген. Бұл нүктелердің GCE-белгіленген GFP-SKL экспрессивті жасушаларында сегменттелген SiR нүктелерімен салыстырғанда GFP және SiR арналарында қарқындылық деңгейі төмен болды, бұл олардың шуды бейнелейтінін көрсетеді. Бұл құрылымдарды суретті өңдеуді қолдана отырып, қарқындылығына қарай оңай сүзуге болады. Бұл деректер GCE-тегінің SiR негізіндегі таңбалауы бар екенін көрсетеді

    GFP-мен салыстырғанда 95% өнімділік және оны пероксисомалардың тірі жасушаларының сандық кескіні үшін пайдалануға болады.

    Содан кейін біз тегтің беріктігін оны әр түрлі жасушалық органеллаларға қолдану арқылы тексердік. Ол үшін біз лизосомалық маркер ретінде Lamp1, мультивезикулярлы денелердің (MVBs) маркері ретінде CD63, эндоплазмалық ретикулум (ER) маркері ретінде ER cb5 TM, экзосомалық маркер ретінде Exo70 және Mito cb5 TM (мито) немесе мито- DsRed митохондриялық маркер ретінде (реттілік үшін Қосымша файл 1 қараңыз: кесте S1). Ядролық таңбалау GCE негізіндегі таңбалау арқылы байқалған ядроның белгілі спецификалық емес таңбалауына байланысты болдырылмады (2c 3b, c және 4c, d суреттері) [4, 6, 16]. Тиімді лизосомалық таңбалау SiCE-Tet қатысуымен GCE-тегтелген Lamp1 көмегімен алынды (5а, б-сурет). Жалпы алғанда, таңбалау Lamp1-mVenus көмегімен алынғанмен салыстыруға болатын. Тегтердің кез келгені арқылы таңбаланған лизосомалар (яғни, GCE-тегі немесе mVenus) хлорохинмен емдеуге ұқсас жауап берді және ұқсас SNR деңгейлері болды (5a–c-сурет) [22]. Біз Lamp1-mVenus көмегімен лизосома таңбалауы толтырылған және қуыс құрылымдарды ерекшелегенімен, GCE-тег-SiR-Lamp1 таңбаланған ұяшықтарда тек толтырылған құрылымдар байқалғанын байқадық. Бұл айырмашылық mVenus тегінің цитозолға, тегінің орналасуына байланысты болуы мүмкін, ал GCE-лизосомалық люменге қарайды. Кәдімгі флуоресцентті ақуыздарды пайдаланып лизосомалық люмен белоктарын таңбалау соңғысының рН сезімталдығына байланысты қиын [23]. Біздің деректер GCE-тегіне негізделген таңбалау қышқыл жасушалық құрылымдарды таңбалауға сәйкес келетінін көрсетеді.

    Тиімді лизосомалық таңбалау SiR-Tet көмегімен алынады, ал MVB таңбалауында TAMRA-Tet ​​қажет. ав GCE-tag-Lamp1 білдіретін ұяшықтар SiR-Tet (а) немесе Шам1-mVenus (б). Сол жақ панельдер: емделмеген. Оң жақ панельдер: лизосома ингибиторы хлорохинмен өңдеу (3 сағат, 120 мкм). Ұяшықтардың кіші жиынтығының суреттері (жоғарғы панельдердегі квадраттарға сәйкес келеді) төменгі панельдерде көрсетіледі. Көрсеткілер лизосоманың толтырылғанына қарсы толтырылғанын көрсетеді. в Солдан оңға қарай: қызыл сызық үшін өлшенген сызық қарқындылығы профильдері а, жасыл үзік сызық кірді б, және көрсетілген плазмидаларды білдіретін жасушаларда өлшенген SNR мәндерінің қысқаша мазмұны (n = 50). d GCE-тегіне конъюгацияланған CD63 MVB маркерін білдіретін COS7 жасушалары бекітілген және анти-HA және анти-CD63 антиденелерімен боялған. д, f TAMRA-Tet ​​таңбаланған GCE-тег-CD63 экспрессиясы бар ұяшықтардағы MVB таңбалауы (д) немесе CD63-mCherry (f). g SNR мәндері көрсетілген плазмиданы білдіретін жасушаларда өлшенеді. n = 50. Әрбір панельде ұсынылған нәтижелер кем дегенде 3 тәуелсіз экспериментте алынды. Масштабты жолақтар, 10 мкм үлкейтілген суреттер, 2 мкм

    GCE-тегі мен SiR-Tet көмегімен MVB, ER, митохондриялар мен экзосомаларды таңбалаудың алғашқы әрекеттері нақты бояуға әкелмеді (Қосымша файл 1: сурет S3). Дегенмен, анти-CD63 антиденелерін қолданатын иммунды бояу эксперименттерінде GCE-тегтелген CD63 эндогенді CD63-пен бірге локализацияланған (5d-сурет). Біз осылайша GCE-таңбаланған CD63 жасушаларда дұрыс көрсетілгенін және мақсатқа сай болғанын, бірақ биоортогоналды реакция арқылы Fl-бояғышты байланыстыра алмадық деп ойладық. Бұл түсінікке сәйкес, TAMRA-Tet-ді SiR-Tet-ке алмастыру, сәйкесінше, GCE-тегтелген CD63, ER cb5 TM және Exo70 көмегімен MVB, ER және экзосомалардың арнайы таңбалануына әкелді (5e-g және 6-суреттер). Митохондриялық таңбалау SiR- немесе TAMRA-Tet ​​көмегімен GCE-tag-Mito cb5 TM немесе mito-DsRed зондтарымен бірге алынған жоқ (Қосымша файл 1: S4 сурет). Иммунофлуоресценциялық эксперименттерге сүйенсек, Mito cb5 TM митохондрияға локализациялай алмаса да, GCE белгісі бар мито-DsRed дұрыс локализацияланған, бірақ тетразинмен байланысқан бояғышты байланыстыра алмады (Қосымша файл 1: сурет S4). Сәтті таңбаланған (яғни, MVB, ER және экзосомалар үшін) GCE-тегтелген органелла маркерлерімен алынған экспрессия үлгілері мен SNR мәндері GCE-тегтелген MVB және жақсырақ SNR үшін алынған әдеттегі Fl-белок маркерлерімен алынғандармен жалпы салыстырмалы болды. GCE таңбаланған ER үшін алынған төменгі SNRs (5e – g және 6-суреттер). Барлық жағдайларда (SiR- немесе TAMRA таңбаланған GCE-белгіленген жасушалық құрылымдар) сигнал қарқындылығы деңгейлері тек ортогональды тРНҚ/тРНҚ-синтетаза жұбын кодтайтын плазмиданы білдіретін және сәйкес Tet-конъюгацияланған таңбаланған жасушаларда өлшенген фондық деңгейлерден айтарлықтай жоғары болды. Fl-бояғыштар (Cурет 6g). Бұл нәтижелер органикалық таңбалауға арналған GCE-тегінің таңбалау ерекшелігі мен үйлесімділігін растайды.

    Экзосомалар мен ER TAMRA-Tet ​​болған кезде минималды GCE-тегі арқылы арнайы жасушалық таңбалауды көрсетеді. COS7 жасушалары көрсетілген плазмидалармен трансфекцияланып, көрсетілген кезде таңбаланған және 48 сағаттан кейін тікелей бейнеленген. а, б, d, д Солдан оңға қарай: максималды проекциялық кескіндер, ұяшықтар жиынының үлкейтілген суреттері (сол жақ панельдердегі квадраттарға сәйкес келеді), ортаңғы панельдердегі үзік сызықтар үшін өлшенген сызықтың қарқындылығы профильдері. в, f SNR мәндері көрсетілген плазмиданы білдіретін жасушаларда өлшенеді (n Exo70 = 40, ER cb5 TM = 45). g Жасушалар көрсетілген pBUD-Pyl-RS плазмидаларымен трансфекцияланды және көрсетілгендей SiR-Tet немесе TAMRA-Tetпен белгіленді. Әрбір жағдай үшін орташа қарқындылық деңгейі жасуша ішіндегі қызығушылық аймағы үшін өлшенді және жасушадан тыс өлшенген фондық орташа қарқындылыққа бөлінді. Теріс бақылаулар ретінде қызығушылық танытатын ақуызды кодтамайтын pBUD-Pyl-RS плазмидалары пайдаланылды (белок жоқ). n = 15. Әрбір панельде ұсынылған нәтижелер кем дегенде 3 тәуелсіз экспериментте алынды. Масштаб жолақтары, 10 мкм үлкейтілген кескіндер, 2 мкм

    Сондай-ақ, гель ішіндегі флуоресценция және тірі жасушаларды бейнелеу арқылы көрсетілгендей GCE тегі бар жасушадан тыс ақуыз EGFR және жасушаішілік ESCRT-III ақуызы CHMP4B үшін сәтті және арнайы таңбалау алынды (Қосымша файл 1: S5 сурет). EGFR таңбалауы үшін GCE-тегі сигнал пептиді мен ақуызды кодтау тізбегінің арасына енгізілді (Қосымша файл 1: S5c-сурет, d), бұл GCE-тегінің N-терминалы үшін ерекше емес екенін көрсетеді. Осылайша, органеллалық таңбалауда қолданудан басқа, GCE-тегті тірі жасушаларда жасушаішілік және жасушадан тыс ақуыздарды таңбалау үшін қолдануға болады.

    GCE таңбаланған конструкциялардың флеш-бояуы таңбалануы тірі жасушаларды тіркеуге және таңбаланған ұялы құрылымдардың кез келгенін бақылауға мүмкіндік берді (яғни, MT, PM, пероксисомалар, ER, MVB, экзосомалар. 7-сурет және Қосымша файл 2: Movie S1, Қосымша 3 файл: Movie S2, Қосымша файл 4: Фильм S3, Қосымша файл 5: Фильм S4, Қосымша файл 6: Фильм S5, Қосымша файл 7: Фильм S6, Қосымша файл 8: Фильм S7 және Қосымша файл 9 Фильм S8). Флюоресценциядан кейін флуоресцентті қалпына келтіру GCE-ER cb5 TM ER маркерінің көмегімен сәтті орындалды, VSVG-GFP [24] көмегімен ER-де өлшенген уақытпен салыстырмалы түрде қалпына келтіру уақытымен (7c-сурет және Қосымша 8: Movie S7, Қосымша файл 9: Movie S8). Айта кету керек, GCE-tag-ER cb5 TM ER маркерінің жалпы өлшемі VSVG-GFP (GCE-tag-ER cb5 TM,

    84,5 кДа). Біріктірілген бұл нәтижелер жаңадан жасалған GCE негізіндегі органелла маркерлері осында хабарланған тірі жасушалардағы органеллалар динамикасын әлдеқайда кішірек зондтармен зерттеу үшін пайдаланылуы мүмкін екенін көрсетеді.

    GCE-тегімен және тетразинмен біріктірілген Fl-бояумен белгіленген жасушалық органеллалардың тірі жасушалық жазбалары. а SiR-Tet белгісімен белгіленген GCE-tag-GFP-SKL білдіретін ұяшықтардың тірі жасуша жазбалары. Жоғарғы панель: барлық ұяшықтың максималды проекциялық кескіндері 0 уақытта түсірілген. Төменгі панель: фильм сериясынан алынған ұяшықтың ішкі жиынының (жоғарғы панельдегі шаршыға сәйкес келетін) бірізді үлкейтілген суреттері. Фильм сериясының әрбір төртінші кадры көрсетіледі (Қосымша файл 4: Movie S3). б TAMRA-Tet ​​белгісі бар GCE-тег-CD63 экспрессиясы бар ұяшықтардың тірі ұяшық жазбалары. Сол жақта, 0 уақытында түсірілген бүкіл ұяшықтың максималды проекциялық кескіні. Оң жақта фильмдер сериясынан алынған ұяшықтың ішкі жиынының (сол жақ панельдегі шаршыға сәйкес келеді) ретті үлкейтілген кескіндері көрсетіледі. Фильмдер сериясының әрбір төртінші кадры көрсетіледі (Қосымша файл 6: Movie S5). в TAMRA-Tet ​​белгісі бар GCE-tag-ER cb5 TM экспрессиясын көрсететін жасушалардың FRAP талдауы. Фильмдер сериясынан (8-қосымша файл: Movie S7) алынған өкіл ұяшықтың ішкі жиынының суреттері жоғарғы панельде көрсетіледі. Ағартылған ROI ретті кескіндері төменгі панельде көрсетілген (Қосымша файл 9: Movie S8). Оң жақтағы сызық ROI -де фотоблеуден кейінгі уақытқа флуоресценцияның қарқындылығын қалпына келтірудің экспоненциалды сәйкестігін білдіреді. Қарқындылық мәндері байқаусыз ағарту үшін түзетілді және ағартуға дейін өлшенген қарқындылық деңгейіне дейін қалыпқа келтірілді. Әр панельде ұсынылған нәтижелер кем дегенде 3 тәуелсіз экспериментте алынды. Масштаб жолақтары, 10 мкм үлкейтілген кескіндер, 2 мкм

    Қосымша 2 файл: Фильм S1. GCE-тег-α-тубулинмен белгіленген жасушалардағы микротүтік динамикасы. GCE-tag-α-тубулинді білдіретін және SiR-Tet белгісімен белгіленген COS7 жасушалары 4 секунд аралығында жазылды. Өкілді ұяшықтан алынған 3 z-тілімінің максималды қарқынды проекциясы көрсетілген. Масштаб жолағы: 10 мкм.

    Қосымша файл 4: Movie S3. GCE-тег-GFP-SKL таңбаланған жасушалардағы пероксисома динамикасы. GCE-тегі-GFP-SKL экспрессиясы бар және SiR-Tet таңбаланған COS7 жасушалары 5,3 с аралықпен жазылды. Сол жақ панель: 488 (GFP, жасыл) арна, орта панель: 640 (SiR, қызыл) арна. Репрезентативті жасушадан алынған 30 z-тілімдерінің максималды қарқынды проекциясы көрсетілген. Масштаб жолағы: 10 мкм.

    Қосымша файл 8: Movie S7. ER деп белгіленген GCE-tag-ER cb5 TM үшін FRAP қолдану арқылы ER динамикасын визуализациялау. TAMTA-Tet ​​белгісімен белгіленген GCE-tag-ER cb5 TM экспрессивті COS7 ұяшықтары 2 секундтық интервалмен 2 минут бойы бейнеленген. Фотобайқау 4 бастапқы уақыт нүктесінен (12 с) кейін орындалды. Өкілді ұяшықтан алынған 3 z-тілімінің максималды қарқынды проекциясы көрсетілген. Масштаб жолағы: 10 мкм.

    Мұнда сипатталған 14 қалдықтан тұратын GCE-тегі HA тегінің толық тізбегін қамтиды. Осылайша, HA эпитопын иммуноблот, иммунофлуоресценция және иммунопреципитация сияқты басқа қосымшалар үшін әлі де қолдануға болады (2b және 5d суреттері). Тегтің әмбебаптығын кеңейту үшін біз HA эпитопын FLAG (8 қалдық) немесе Myc (10 қалдық) эпитоптарымен алмастыруға болатынын тексердік (8 -сурет және Қосымша файл 1: сурет S6). HA/FLAG/Myc GCE-тегтері бар GFP-SKL конструкциялары ұяшықтарда сәтті экспрессияланды, SiR-Tet флуоресценциясының GFP-мен бірге локализациясы (Пирсон корреляциясының мәндері: FLAG, 0,87 Myc, 0,67) (Cурет 8a, b жоғарғы панелі, және 1-қосымша файл: S6a, b суреті). Экзосомалардың тиімді таңбалануы тірі жасушалық бейнелеу және гельдік TAMRA флуоресценциясымен көрсетілгендей Exo70-ке біріктірілген FLAG және Myc тегтерінің нұсқаларымен де алынды (8с-сурет жоғарғы панель және 1-қосымша файл: S6c, е-сурет). Алайда MT таңбалауы FLAG/Myc GCE-тегтері арқылы бұзылған сияқты, Myc GCE-тегінің көмегімен MT бояуын көрсететін өте аз жасушалар бар (сурет 8d жоғарғы панель және 1-қосымша файл: S6d сурет). Гельдегі SiR флуоресценциясын қолдану арқылы арнайы таңбалаудың төмендеуі байқалды (Қосымша файл 1: Сурет S6f). Алайда, MT бояуы FLAG GCE-тегінің көмегімен айқынырақ болғанымен, гельдік флуоресценцияны қолдану арқылы Myc GCE-тегінің жоғары таңбалануы байқалды. Бұл деректер кейбір жағдайларда таңбаланған ақуыздың жалпы деңгейі оның белгілі бір жасушалық құрылымды белгілеу қабілетін көрсетпейтінін көрсетеді. Бұл нәтижелер жиынтықта тегте қолданылатын эпитоп тұрғысынан жүйенің әмбебап екендігін көрсетеді. Бірақ, тегтің HA нұсқасы сенімді болып көрінгенімен, басқа эпитоп нұсқаларын пайдаланып таңбалау мұқият бағалануы керек.

    GCE-тегі жан-жақты және кейбір жағдайларда одан әрі азайтуға болады. а GFP-SKL N-терминалды тегімен (солдан оңға қарай) оңтайландырылған GCE-тегімен (HA-GGSG-ncAA) енгізілген pBUD-Pyl-RS плазмидімен трансфекцияланған HEK293T жасушаларының Western Blot талдауы, FLAG- альтернативті қысқа эпитоптары бар тегтер GGSG-ncAA және Myc-GGSG-ncAA және эпитопы жоқ тег (GGSG-ncAA). Жасушалар BCN-Lys қатысуымен 48 сағат бойы инкубацияланды, жиналды және анти-GFP антиденелерінің көмегімен вестерн-блот талдауына ұшырады. бd GFP-SKL конъюгацияланған FLAG-GGSG-ncAA (жоғарғы панельдер) немесе GGSG-ncAA (төменгі панельдер) арқылы трансфекцияланған COS7 жасушаларының тірі жасуша кескіндерінен алынған максималды қарқындылық проекциялары (б), Exo70 (в) немесе α-тубулин (d) және көрсетілген тетразин бояғыштарымен таңбаланған. Сюжеттер б Пирсонның корреляциялық мәндері: жоғарғы панель, 0,87 төменгі панель, ядроны жоққа шығаратын ұяшықтардың үлкен жиынында орындалатын 640 (SiR) және 488 (GFP) арналарының қарқындылық мәндері арасындағы бірлескен талдауды білдіреді. 0,76. в, d Репрессивті жасушалардың солға, максималды қарқынды проекциясы. Оң жақ, сол жақ панельдердегі үзік сызықтар үшін өлшенген сызық қарқындылығы профильдері. Әр панельде ұсынылған нәтижелер кем дегенде 3 тәуелсіз экспериментте алынды. Масштаб жолағы 10 мкм

    Соңында, біз GCE-тегінен эпитоптың реттілігін жою таңбалауға қалай әсер ететінін тексердік (Қосымша файл 1: Сурет S1i). Басқаша айтқанда, белоктарды GCE негізіндегі биоортогональды таңбалау үшін GGSG сілтегішін, содан кейін ТАГ-ты кодтайтын реттілік жеткілікті ме? Гель ішіндегі флуоресценция арқылы да, тірі жасушаларды бейнелеу арқылы да HA тізбегі жоқ α-тубулинді GCE-тегімен белгілеу кезінде нақты таңбалау дерлік алынған жоқ (сурет 8d төменгі панель және 1-қосымша файл: S6f сурет). Пероксисомалар мен экзосомалар үшін төмендетілген деңгейлерде болса да арнайы таңбалау алынды (сурет 8b, с төменгі панельдер). Пероксисомаларда төмендетілген таңбалау western blot арқылы байқалған ақуыздың төмендетілген экспрессиясына сәйкес болды (сурет 8a, b төменгі панель Пирсон корреляциясы, 0,76). Гель ішіндегі флуоресценцияны пайдалану арқылы Exo70 үшін арнайы таңбалаудың төмендегені байқалды (Қосымша файл 1: S6e суреті), ұяшықтарда байқалған таңбалаудың төмендеуі трансляция кезінде ncAA енгізілмеуінің нәтижесі болу мүмкіндігін арттырады. Сондықтан, ақуыздың қызметін сақтау үшін тегтің ұзындығы маңызды болатын нақты жағдайларда, GCE-тегті бес қалдыққа дейін азайтуға болады. Дегенмен, бұл таңбалау тиімділігінің бағасына сәйкес келеді, сондықтан әр жағдайда сынақтан өту керек.


    MGH COVID-19 жинау және өңдеу тобының қатысушылары

    Коллекция командасы: Кендалл Лавин-Парсонс 1, Блэр Парри 1, Брендан Лилли 1, Карл Лоденштейн 1, Бренна МакКейг 1, Николь Чарлэнд 1, Харгун Ханна 1, Джастин Марголин 1

    Өңдеу тобы: Анна Гонье 2 , Ирена Гуштерова 2 , Том Ласалле 2 , Нихаарика Шарма 2 , Брайан К. Руссо 3 , Марикармен Рохас-Лопес 3 , Моше Сад-Фельдман 4 , Касидет Манаконгтричип 4 , Джессика Молома Фишер 4

    Массачусетс патогендік дайындығы бойынша консорциум:Бетелихем А. Абайне 5 , Патрик Аллен 5 , Дайан Антил 5 , Катрина Армстронг 5 , Сиобхан Бойс 5 , Джоан Брейли 5 , Карен Бранч 5 , Кэтрин Бродерик 5 , Джулия Карни 5 , Эндрю Чан 5 , Сюзан Дэвидсон 5 Дэвид Дрю 5, Эшли Эллиман 5, Кит Флахерти 5, Жанна Фланнери 5, Памела Форде 5, Элиз Геттингс 5, Аманда Гриффин 5, Шейла Гриммель 5, Кэтлин Гринке 5, Кэтрин Холл 5, Мег Хили 5, Дебора Хено 5, Грейс Холланд 5, Chantal Kayitesi 5, Vlasta LaValle 5, Yuting Lu 5, Сара Лютерн 5, Джордан Марчевка (Шнайдер) 5, Бриттани Мартино 5, Розанан Макнамара 5, Христиан Намбу 5, Сюзан Нельсон 5, Марджори Ноон 5, Кристин Омберборн 5, Лоис Крис Пачеко 5, Николь Фан 5, Фалиша А. Порто 5, Эдвард Райан 5, Кэтлин Селлек 5, Сю Слаухенгаупт 5, Кимберли Смит Шеппард 5, Элизабет Сушана 5, Вивин Уилсон 5, Галит Альтер 6, Алехандро Балазс 6, Джулия Балс 6 , Max Barbash 6, Yannic Bartsch 6, Julie Boucau 6, Josh Chevalier 6 , Фатема Чоудхури 6, Кевин Эйнкауф 6, Джон Фаллон 6, Лиз Федирко 6, Келси Фин 6, Пилар Гарсиа-Бронкано 6, Ципутра Хартана 6, Ченян Цзян 6, Паулина Каплонек 6, Маршалл Карпелл 6, Эван С.Лам 6, Кристина Лефтери 6 , Сяодун Лиан 6 , Матиас Лихтерфельд 6 , Даниэль Лингвуд 6 , Ханг Лю 6 , Цзинкин Лю 6 , Наташа Ли 6 , Эшлин Мишелл 6 , Илан Миллстром 6 Ноа Миранда 6 , Клэр О'Калл 6 туылған Пиллай 6 , Елизавета Рассадкина 6 , Александра Рейссис 6 , Фрэнсис Рузицка 6 , Кира Сейгер 6 , Либера Сесса 6 , Кристианна Шарр 6 , Салли Шин 6 , Нишант Сингх 6 , Вейвей Сан 6 , Тиджа А Троячя 6- Пиечокка 6 , Дэниел Уоррал 6 , Алекс Жу 6 , Джордж Дейли 7 , Дэвид Голан 7 , Ховард Хеллер 7 , Арлен Шарп 7 , Николаус Джилг 8 , Алекс Розентал 8 , Коллин Вонг 8

    1 Шұғыл медициналық көмек бөлімі, Массачусетс жалпы ауруханасы, Бостон, МА, АҚШ. 2 Массачусетс жалпы ауруханасының онкологиялық орталығы, Бостон, MA, АҚШ. 3 жұқпалы аурулар бөлімі, медицина бөлімі, Массачусетс штатының жалпы ауруханасы, Бостон, МА, АҚШ. 4 Массачусетс жалпы госпиталінің иммунология және қабыну аурулары орталығы, Бостон, MA, АҚШ. 5 Массачусетс жалпы ауруханасы, Бостон, MA, АҚШ. 6 MGH, MIT және Гарвардтың Рагон институты, Кембридж, MA, АҚШ. 7 Гарвард медициналық мектебі, Бостон, МА, АҚШ. 8 Бригам мен әйелдер ауруханасы, Бостон, MA, АҚШ.