Ақпарат

14.1В: ДНҚ-ның заманауи қолданбалары - биология

14.1В: ДНҚ-ның заманауи қолданбалары - биология


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ДНҚ -ның сот медицинасы мен медицинаны қоса алғанда әр түрлі салаларда көптеген қосымшалары бар.

үйрену мақсаттары

  • ДНҚ неліктен сот сараптамасы және медицина сияқты әртүрлі салаларда практикалық құрал екенін түсіндіріңіз

Негізгі ұпайлар

  • ДНҚ әр адамға тән, сондықтан оны сәйкестендіру мақсатында қолдануға болады.
  • Адам геномы шамамен 20000-нан 25000-ға дейін функционалдық гендерге сәйкес келетін 3 миллиардқа жуық базалық жұптан тұрады.
  • Әрбір адамның ДНҚ-сы ата-анасынан тұқым қуалайды: анасынан 23 хромосома, әкеден 23 хромосома.

Негізгі шарттар

  • генотипЖеке адамның белгілі бір қасиетін анықтайтын сәйкес хромосомаларда орналасқан аллельдердің комбинациясы.
  • зигота: Екі гаметаның қосылуынан пайда болатын бір жасуша; жануарларда ұрық пен жұмыртқаның қосылуынан пайда болатын жасуша.
  • ген: Тұқым қуалаушылық бірлігі; нақты РНҚ немесе белоктарды кодтау арқылы арнайы сипаттамаларды анықтайтын хромосомалардың функционалдық бірліктері.
  • фенотип: Генетикалық белгілер мен сыртқы орта факторларының көп факторлы үйлесіміне негізделген организмнің пайда болуы.

«ДНҚ» аббревиатурасы қылмысты ашу, әке болуды анықтау, адам қалдықтарын анықтау және генетикалық тестілеудің синониміне айналды. ДНҚ шаштан, қаннан немесе сілекейден алынуы мүмкін. Әр адамның ДНҚ тізбегі бірегей және осы бірегей ерекшеліктерге байланысты түрдегі жеке адамдар арасындағы айырмашылықты анықтауға болады. ДНҚ тестілеуді патогендерді анықтау, археологиялық қазбалардағы биологиялық қалдықтарды анықтау, аурудың өршуін анықтау және адамдардың қоныс аудару заңдылықтарын зерттеу үшін де қолдануға болады. Медицина саласында ДНҚ диагностикада, жаңа вакцина жасауда және қатерлі ісік терапиясында қолданылады. Енді кейбір ауруларға бейімділікті гендерге қарап анықтауға болады.

Клондау

Репродуктивті клондау - бұл көп жасушалы организмнің клонын немесе бірдей көшірмесін жасау үшін қолданылатын әдіс.
Клондау кезінде бастапқы организм де, клон да бірдей ДНҚ-ға ие. Бірдей егіздер бір мағынада бір -бірінің клондары; оларда бірдей ДНҚ бар, олар сол ұрықтанған жұмыртқадан дамыған.
Клон 1996 жылы ересек жасушадан клондалған алғашқы сүтқоректілер болған кезде ғылыми этика мәселесіне айналды.
Содан бері жылқылар, бұқалар және ешкілер сияқты бірнеше жануарлар сәтті клондалды, бірақ бұл адамдар жиі бет, аяқ-қол және жүрек ақауларын көрсетеді.

Эмбрионалды дің жасушаларының көзі ретінде клондалған адам эмбриондарын шығару әрекеттері болды, кейде «терапевтік мақсатта клондау» деп аталады. Терапевтік клондау зиянды ауруларды немесе ақауларды жоюға әрекет жасау үшін дің жасушаларын шығарады (ағзаны көбейтуді мақсат ететін репродуктивті клондаудан айырмашылығы). Десе де, клондаудың емдік әрекеттері биоэтикалық факторларға байланысты қарсылыққа тап болды.

CRISPR

CRISPR (кластерленген, тұрақты түрде интерактивті қысқа палиндромдық қайталанулар) ғалымдарға геномдарды өңдеуге мүмкіндік береді, бұл гендерді біріктіру мен өңдеудің ескі әдістерінен әлдеқайда жақсы. CRISPR техникасы өте үлкен әлеуетке ие, оның ішінде адамдардың, жануарлардың және басқа организмдердің ұрықтарын өзгерту және азық -түлік дақылдарының гендерін өзгерту.
Этикалық алаңдаушылықтар осы биотехнологияға және адам ұрықтарын түзетуге және «дизайнерлік нәрестелер» жасау болашағына қатысты туындады.

CRISPR техникасы: Бұл фильм CRISPR процессінен өтеді.

Генетикалық түрлендірілген организмдер

Генетикалық түрлендірілген организм (ГМО) - гендік инженерия әдістерінің көмегімен генетикалық материалы өзгертілген кез келген организм. ГМО дәрі-дәрмектің және генетикалық түрлендірілген тағамдардың көзі болып табылады және басқа да тауарларды өндірумен қатар ғылыми зерттеулерде де кеңінен қолданылады.
Генетикалық модификация гендердің мутациясын, енгізілуін немесе жойылуын қамтиды. Енгізілген гендер, әдетте, көлденең ген трансфері түріндегі басқа түрден келеді.

Бактериялар, өсімдіктер мен жануарлар 1970 жылдардың басынан бастап академиялық, медициналық, ауылшаруашылық және өндірістік мақсатта генетикалық түрленді. АҚШ-та Roundup-Ready соясы мен қарағашқа төзімді жүгері сияқты ГМО көптеген жалпы өңделген тағамдардың бөлігі болып табылады. Бұл биотехнологияның көптеген салаларында болғандай, ГМО -ны қолдануда айтарлықтай қарама -қайшылықтар бар.


Бұл дегеніміз, ДНҚ -ның созылуын реттей отырып, төрт нуклеотидті негіздердің орналасу ретін білуге ​​болады - аденин, гуанин, цитозин және тимин - нуклеин қышқылының молекуласында болады.

ДНҚ секвенциясының қажеттілігі алғаш рет Фрэнсис Криктің ДНҚ молекуласындағы нуклеотидтер тізбегі белоктардың аминқышқылдарының тізбегіне тікелей әсер ететін теориясымен анық болды. Ол кезде толық тізбектелген геном жасушалар мен организмдердің биохимиясын түсінуде кванттық секіріске әкеледі деген сенім болды.

Заманауи ДНҚ секвенциясы бірнеше сағат ішінде бүкіл ДНҚ тізбегін ашуға мүмкіндік беретін жоғары өнімді әдістерден тұрады. Бұл технология көптеген компанияларға үйде ДНҚ тестін ұсына бастауға мүмкіндік берді. Осы сынақтар арқылы табылған “нәтижелердің” көпшілігі тек генетикалық нұсқа мен белгілі бір жағдай арасындағы корреляциялар болып табылады. Дегенмен, технология ғалымдарға эволюциялық қатынастарды жақсы түсіну үшін көптеген организмдердің ДНҚ -сын тексеруге мүмкіндік берді.


Гендердің синтезі: әдістері мен қолданылуы

ДНҚ синтезінің әдістері мен технологиялары тез арада заманауи молекулалық биологияның негізіне айналуда және синтетикалық биология саласында шешуші рөл атқарады. Бүкіл гендерді, жаңа генетикалық жолдарды және тіпті тұтас геномдарды синтездеу мүмкіндігі 30 жыл бұрын болған арман емес. Термоциклді, коммерциялық синтезделген олигонуклеотидтерді және ДНҚ полимеразаларын қолдана отырып, стандартты молекулалық биология зертханасы қолданыстағы әдістерді қолдана отырып, бір апта ішінде бірнеше килобазалық синтетикалық ДНҚ синтездей алады. Мұнда біз синтетикалық ДНҚ-ны генерациялауда қолданылатын әдістерді қарастырамыз, олигонуклеотидтердің химиялық синтезінен бастап олардың ұзын, реттелетін тізбектерге жиналуына дейін. Бұл тәсілдердің орындалуын жеңілдететін бағдарламалық қамтамасыз ету мен веб -сайттар зерттелді, ДНҚ синтезі әдістерінің гендік экспрессия мен синтетикалық биологияға қолданылуы талқыланды. Ақырында, біздің зертханадан автоматтандырылған ген синтезінің мысалы келтірілген.


Гендік инженерия: ДНҚ технологиясын қолдану

Қолдану рекомбинантты ДНҚ Генетикалық өзгерген өсімдіктер, жануарлар мен микробтардың жаңа өнімдері адамдар үшін қол жетімді болғандықтан, технология үйреншікті жағдайға айналды. 1997 жылы Долли бірінші сәтті тақырып ретінде жариялады клондалған ірі сүтқоректілер (қойлар). Содан бері медицинада көптеген ұқсас жетістіктер болды, мысалы, қатерлі ісік ауруын емдеу, ауыл шаруашылығындағы көптеген жетістіктер, мысалы, трансгенді жәндіктерге төзімді дақылдар және өсу гормондары және мал шаруашылығында көптеген жетістіктер. трансгендік жануарлар (рекомбинантты ДНҚ алған жануар).

Көптеген биотехнологтар ДНҚ-ның технологиялық қосымшаларын үлкен өсу мен ашу әлеуеті бар ғылымдағы жаңа шекаралардың бірі ретінде қарастырады.

Дәрі

Гендік инженерия бірқатар медициналық өнімдерді шығарды. Рекомбинантты ДНҚ технологиясынан коммерциялық дайындалған алғашқы екі өнім инсулин мен адамның өсу гормоны болды, олардың екеуі де E. coli бактерияларында өсірілді. Содан бері нарықта көптеген өнімдер пайда болды, оның ішінде қысқартылған тізімі бар, барлығы E. coli -де жасалған:

Бионот

A вакцина әдетте болашақта ұқсас заттарға шабуыл жасау және жою үшін иммундық жүйені белсендіру үшін ағзаға енгізілетін бактерия немесе вирустың зиянсыз нұсқасы.

  • Ісік некрозының факторы. Кейбір ісік жасушаларын емдеу
  • Интерлейкин-2 (ИЛ-2). Қатерлі ісіктерді, иммун тапшылығын және ВИЧ инфекциясын емдеу
  • Прурокиназа. Жүрек шабуылдарын емдеу
  • Таксол. Аналық без ісігін емдеу
  • Интерферон. Қатерлі ісік пен вирустық инфекцияларды емдеу

Сонымен қатар, бірқатар вакциналар енді рекомбинантты хосттардан коммерциялық түрде дайындалады. Бір кездері вакциналар ауруды денатурациялау арқылы жасалды, содан кейін ол адамдарға болашақ шабуылмен күресу үшін олардың иммундық жүйесін белсендіреді деген үмітпен оны енгізді. Өкінішке орай, науқас кейде аурумен аяқталады.

ДНҚ технологиясының көмегімен вакцинаны жасау үшін тек микроорганизмнің анықталатын сыртқы қабығы қажет, көшіріледі және зиянсыз хостқа енгізіледі. Бұл әдіс әлдеқайда қауіпсіз болуы мүмкін, себебі ауру қоздыратын микроб иесіне берілмейді. Иммундық жүйе -е микроорганизмінің бетіндегі арнайы белоктармен белсендіріледі. ДНҚ технологиясы мұны ескереді және тек вакцинаның беткі ерекшеліктерін анықтайды. Қазіргі уақытта В гепатитіне, 2 типті герпеске және безгекке қарсы вакциналар жақын арада сынақ түрінде қолдануға дайындалып жатыр.

Ауыл шаруашылығы

Өсімдік өсімдіктері биотехнологияның назары болды және бола береді, өйткені өсімдіктердің жәндіктер мен кейбір гербицидтерге төзімділігін жоғарылату және пісуін кешіктіру (өнімді тасымалдау мен бүлінуге төзімділікті жоғарылату) арқылы өнімділік пен рентабельділікті жақсартуға тырысады. Басқа организмнен ген алған трансгенді өсімдікті құру жануарларға қарағанда қиынырақ болды. Жануарлардан айырмашылығы, өсімдіктердің векторын табу оқшауланғанға дейін қиын болды Бұл плазмида, топырақта кездесетін ісік тудыратын (Ti) бактериялардан алынған. Плазмида? жасушаға түседі, онда плазмид өсімдіктің ДНҚ-сына оңай қосылады. Жемістер мен көкөністерде сәтті болғанымен, Ti плазмиді дәнді дақылдарда шектеулі табысқа қол жеткізді.

Белгілі бір гербицидке төзімді дақыл жасау сәтті болды, себебі гербицид өсімдік өсімдіктерінен арамшөптер бәсекелестігін жояды. Зерттеушілер гербицидке төзімді бактерияларды тапты, жағдайға жауапты гендерді бөліп алды және ?ат? оларды мәдени өсімдікке айналдырды, содан кейін ол гербицидке төзімді болды. Сол сияқты, зерттеушілер қажетсіз шөпқоректілерді жоятын немесе иммобилизациялайтын бактериялық ферменттерді ашқан сайын, жәндіктерге төзімді өсімдіктер де қолжетімді бола бастады, ал басқалары өсімдіктердің пайдалануы үшін топырақта азоттың фиксациясын арттырады.

Генетиктер ауыл шаруашылығында үлкен серпіліс табалдырығында тұр. Барлық өсімдіктердің өсуі үшін азот қажет. Азот - өсімдікке қажет үш маңызды қоректік заттардың бірі. Атмосфера шамамен 78 % азот болса да, ол өсімдіктерге жарамсыз күйде. Дегенмен, табиғи түрде пайда болады ризобий Бактерия топырақта болады және атмосфералық азотты өсімдіктер қолдана алатын түрге айналдырады. Бұл азотты бекітетін бактериялар соя және жержаңғақ сияқты кейбір өсімдіктердің бұршақ дақылдарында табиғи түрде кездеседі. Олардың құрамында бұл ерекше бактериялар болғандықтан, олар басқа өсімдік өсімдіктерінің өсуіне тыйым салатын азот жетіспейтін топырақта өсе алады. Зерттеушілер бұл бактерияларды оқшаулау арқылы олар азот фиксациясын кодтайтын ДНҚ сегментін анықтай алады, сегментті алып тастайды және оны пайдалы ақшалай дақылдың ДНҚ -сына енгізе алады деп үміттенеді! Осылайша, жаңа трансгенді өсімдіктер жаңа өсіп келе жатқан аумақтарда өмір сүре алады, олар әдетте олардың өсуіне жарамсыз болып табылады және қымбат тыңайтқыштарды қоспастан қазіргі жерлерде өседі!

Мал шаруашылығы

Жануарларға қарсы вакциналарды қолдану да, сүт өндіруді күрт арттыру үшін сиырларға өсу гормондарын қосу да мал шаруашылығындағы нағыз толқуларға: трансгенді жануарлар мен клондарға сәйкес келмейді.

Трансгендік жануарлар өздерінің дамуындағы ДНҚ технологиясындағы жетістіктерді үлгі етеді. Оны құру механизмін үш кезеңмен сипаттауға болады:

  1. Сау жұмыртқа жасушалары иесінің аналығынан алынып, зертханада ұрықтандырылады.
  2. Басқа түрден қажетті ген анықталады, оқшауланады және клондалады.
  3. Клондалған гендер жұмыртқаларға тікелей енгізіледі, содан кейін олар ұрықтың қалыпты даму процесіне ұшырайтын иесі әйелге хирургиялық имплантацияланады.

Бұл процесс қалаған ферменттерді, басқа ақуыздарды шығарудың арзан және жылдам құралымен қамтамасыз етіледі деп үміттенеміз, табиғи, жалпы функциялары арқылы ет, жүн және басқа да жануарлардан алынатын өнімдерді өндіруді ұлғайтады.

Долли клондалған 1997 жылдан бері пайдалы малдарды клондау бойынша зерттеулер мен эксперименттер үздіксіз жалғасын тапты. Клондаудың тартымдылығы - бұл ұрпақтың жыныссыз көбеюдегідей ата -анасымен генетикалық ұқсас болатынын білу. Төрт қадам жалпы процесті сипаттайды:


Қорытындысында

Жоғарыда аталған реттілік әдістерінен басқа, көптеген хаттамаларда белгілі бір модификациялары бар, бірақ бірдей негізгі принциптері бар. Өмірлік ғылымдардың барлық саласында мүмкін болатын қосымшалардың көмегімен геномның реттілігі қазіргі биотехнологияға керемет әсер етеді. Атап айтқанда, жоғары өнімді секвенирлеу технологиялары молекулалық биологиялық зерттеулер салаларында өте пайдалы болды. Келесі гендік әдістердің пайда болуымен жүйелілік процесс, деректер, уақыт және үнемдеу тұрғысынан күрделі емес болды.


ДНҚ лигатурасы

ДНҚ-ны байланыстыру көптеген заманауи молекулярлық биологияның жұмыс процестеріндегі маңызды қадам болып табылады. Қос тізбекті субстраттағы бір тізбекті үзілістің іргелес қалдықтары арасындағы никтардың тығыздалуы мен қос тізбекті үзілістердің қосылуы ДНҚ лигазаларымен ферментативті катализденеді. ДНҚ қалдықтарының 3 'гидроксилі мен 5' фосфаты арасында фосфодиэфирлік байланыстың түзілуі үш сатыда жүреді: Бастапқыда лигаза бос АТФ-пен әрекеттесу арқылы өздігінен аденилденеді. Әрі қарай аденил тобы «донор» жіпшенің 5'-фосфорланған ұшына ауысады. Ақырында, фосфодиэстер байланысының түзілуі аденилденген донордың іргелес 3 'гидроксилді акцептормен әрекеттесуі мен АМФ бөлінуінен кейін жүреді. Тірі организмдерде ДНҚ лигазалары ДНҚ репликациясында және репарациясында маңызды рөл атқаратын маңызды ферменттер болып табылады. Зертханада ДНҚ байланыстыру клондау үшін де, клондау үшін де қолданылады.

ДНҚ лигазасының адалдығы: бұл қашан маңызды?

Жоғары дәлдіктегі полимеразалар барлық жерде бар&mdash, бірақ неге жоғары дәлдіктегі лигаза қажет? Лигация туралы айтқан кезде & ldquofidelity & rdquo дегенді қалай түсінеміз? Бұл вебинарда NEB Scientist және лигаза бойынша сарапшы Грег Лохман ДНҚ лигазаларының сәйкес келмейтін лигациясы мен NEB & rsquos HiFi сияқты жоғары сенімді ДНҚ лигазаларын қолдануға байланысты молекулалық диагностикалық қосымшаларды талқылайды. Taq ДНҚ -ның бірыңғай негіздік айырмашылықтарын анықтау үшін ДНҚ лигазасы.

ДНҚ лигатурасы

Лигация, ДНҚ фрагменттерін ДНҚ лигазасымен біріктіру процесі үш сатыда жүреді. Жылдам оқулық анимация арқылы байлау функциясы туралы көбірек біліңіз.

ДНҚ байланысы үшін қандай молярлық қатынастарды қолдану керек?

Реактивті заттардың оңтайлы коэффициенті төменгі ағынға байланысты.

Неліктен маған ДНҚ лигатурасына ПЭГ қосу керек?

Полиэтиленгликоль (ПЕГ) байлау реакцияларында маңызды реагент болып табылады, себебін анықтаңыз.

ДНҚ байланыстырудың ең жақсы шарттары қандай?

Төменгі ағын қолданбасы байлау үшін ең жақсы реакция шарттарын қалай белгілейтінін біліңіз.

Кейбір байламдар басқаларға қарағанда қиынырақ па?

Өткір ұштар мен бір негізді ілінісу реакцияның оңтайлы жағдайларын талап етеді.


ДНҚ технологиясы

ДНҚ технологиясы қазіргі ғылымда төңкеріс жасады. Дезоксирибонуклеин қышқылы (ДНҚ), немесе организмнің генетикалық материалы&mdash ұрпақтан-ұрпаққа мұра болып қалды&mdashадамның артындағы кейбір жұмбақтардың құлпын ашқан көптеген анықтамаларды сақтайды. мінез -құлық, ауру, эволюция, және қартаю. Технологиялық жетістіктер ДНҚ-ны жақсы түсінуге әкелетіндіктен, ДНҚ-ға негізделген жаңа технологиялар пайда болады. ДНҚ технологиясының соңғы жетістіктері, оның ішінде клондау, ПТР, рекомбинантты ДНҚ технология, ДНҚ саусақ ізі, гендік терапия, ДНҚ -микроореологиялық технологиясы мен ДНҚ -ны профильдеу қазірдің өзінде медицинаны, криминалистикалық, экологиялық ғылымдар мен ұлттық қауіпсіздікті қалыптастыра бастады.

1956 жылы ДНҚ -ның құрылымы мен құрамы анықталды және он жылдан астам уақыт бұрын ДНҚ ұрпақтан ұрпаққа берілетін генетикалық материал екенін көрсететін алдыңғы зерттеулер расталды. ДНҚ ашылғаннан кейін көп ұзамай ПТР (полимеразды тізбекті реакция) деп аталатын жаңа құрал жасалды. ПТР ДНҚ технологиясындағы ең маңызды жаңалықтар мен өнертабыстардың бірі болып табылады және 1993 жылы американдық Кари Муллиске (1949 ж. Ndash) Нобель сыйлығын берді.

ПТР - бұл ғалымдар талдай алатындай ДНҚ -ның белгілі бір тізбегін күшейту. Күшейту маңызды, әсіресе ДНҚ сияқты басқа молекулалық анализдерді орындау үшін жеткілікті мөлшерде ДНҚ -ның шағын тізбегін талдау қажет болғанда. реттілік. ПТР технологиясы жасалғаннан кейін көп ұзамай, генетикалық инженерия рекомбинантты ДНҚ технологиясы арқылы ДНҚ тез мүмкін болды. Рекомбинантты ДНҚ – ДНҚ-ны кесу үшін қайшы сияқты әрекет ететін рестрикциялық эндонуклеазалар деп аталатын бактериялық туынды ферменттердің көмегімен өзгертілген ДНҚ. Кесілген үлгіні ДНҚ -ның басқа тізбегінен сол ферменттермен кесілген үлгіге сәйкестендіруге болады. Жасалған жабысқақ ұштар бір -бірімен байланысады және ДНҚ тізбегін басқа ДНҚ тізбегіне енгізуге болады.

Рестрикциялық эндонуклеазалар да генетикалық саусақ ізін түсіруде маңызды. Бұл жағдайда ДНҚ -ның арнайы тізбегін танитын ферменттер ДНҚ -ның ұзын тізбегінің әр түрлі бөліктерін кесу арқылы ДНҚ фрагменттерін шығара алады. Тұқым қуалайтын вариацияға байланысты дәйектілікте айырмашылықтар болса&mdashбұл қосымша ДНҚ немесе арнайы реттіліктердің бар екенін білдіреді, осылайша шектеу ферменттері сайтты енді танымайтын болса, айнымалы үлгілер жасалуы мүмкін. Егер бұл өрнектер екі түрлі адамды салыстыру үшін қолданылса, олардың фрагменттік үлгісі немесе саусақ ізі болады. Генетикалық саусақ ізін әке болуды анықтау үшін қолдануға болады. Сот сараптамасында генетикалық саусақ ізін қылмыскерді анықтау үшін олардың бірегей ДНҚ тізбегінің қылмыс орнынан алынған ДНҚ -мен сәйкес келуі негізінде анықтауға болады. Бұл технология зерттеушілерге осы шектеулерге негізделген хромосомалардың генетикалық карталарын жасауға мүмкіндік береді фермент саусақ іздері. Көптеген ферменттер бар болғандықтан, саусақ іздерін анықтауға болады.

Рекомбинантты ДНҚ технологиясы гендерді әртүрлі жасушалық бағыттарға тасымалдай алатын молекулалық қондырғыларға біріктіруге де қолданыла алады. Бұл техника деп те аталады ген терапия ауруды тудыратын ақаулы гендері бар адамдарға түзетілген гендерді жеткізу үшін қолданылған. Гендердің қосылуы қоршаған ортаға да қолданылды. Әртүрлі бактериялар өндіру үшін генетикалық түрлендірілген белоктар ДДТ сияқты зиянды химиялық ластаушы заттарды ыдыратады. Қазіргі уақытта ғалымдар осы технологияның гендік инженерияланған өсімдіктерді өндіруге қолданылуын зерттеп жатыр дақылдар өлтіретін заттарды шығара алады жәндіктер. Сол сияқты, жемістер олардың жарамдылық мерзімін ұзарту үшін пісетін процесті бәсеңдететін ақуыздар шығаратын гендер болуы мүмкін.

ДНҚ чипі деп аталатын ДНҚ микроарреясы технологиясы соңғы болып табылады нанотехнология зерттеушілерге зерттеуге мүмкіндік береді геном өткізу қабілеті жоғары. Ол гендердің экспрессиясын профилдеу үшін қолданылуы мүмкін, бұл ғалымдарға қандай гендердің жоғарылауын немесе реттелуін түсінуге мүмкіндік береді. Бағалау үшін әр түрлі генетикалық профильдерді анықтауға болады қатерлі ісік тәуекел немесе аурумен байланысты болуы мүмкін белгілерді анықтау. Оның тек бастапқы деңгейден жоғары анықтауға жеткілікті үлкен ген экспрессиясындағы өзгерістерді анықтау мүмкіндігі бар. Сондықтан ол ауру тудыруы немесе аурудың дамуында рөл атқаруы мүмкін ген экспрессиясының нәзік өзгерістерін анықтамайды. Оны генотиптеу үшін де қолдануға болады, дегенмен клиникалық диагностикалық генотиптеу микроаррей технологиясын қолдана отырып зерттелуде.

Басқа гендер түрлері белгілі бір қасиетке жаңа белгілер қосу үшін де қолдануға болады организм. Мысалы, бактериялар, тышқандар, және өсімдіктердің барлығында люминесцентті болды (жарық жарқыраған) желе балықтарының гендері олардың геномдарына қосылды. Шетелдік организмге ген қосудың тағы бір себебі - әр түрлі тағамдық немесе фармацевтикалық өнімдерді өндіру. Кейбір сиырлар адам шығаратындай етіп өзгертілген инсулин немесе олардың сүтіндегі витаминдер жаппай. Шошқалар шошқалардан адамға шектеулі мүше трансплантациясын жүзеге асыру үшін трансплантацияның көптеген мәселелерін шешу үшін өзгертілді, бұл ксенотрансплация деп те аталады.

ДНҚ технологиясы - үлкен қарама -қайшылықтармен салыстырмалы түрде жаңа зерттеу саласы. Бұл қоғамдық пікірталастың үлкен бөлігі болып қала береді және медициналық диагностика, терапия, криминалистика және генетикалық профильдеудің барлық аспектілеріне әсер етеді.


2) гендік терапия

Егер бала туа біткен кемістікпен туылса, сол кемістікті түзетудің жолы бар ма? Иә, гендік терапия бар! Гендік терапия - бұл баланың немесе эмбрионның гендік ақауын түзететін әдістер жиынтығын қамтитын биотехнологиялық қосымша. Ол функционалды емес геннің орнын толтыру үшін адамның жасушаларына немесе тіндеріне қалыпты генді енгізуді қамтиды. Бұл қалай жұмыс істейтінін түсінейік.

1990 жылы аденозиндеаминаза (ADA) ферментінің тапшылығы бар 4 жасар қызды емдеу үшін алғашқы клиникалық генотерапия қолданылды. Бұл бұзылу иммундық жүйенің қызметі үшін маңызды фермент болып табылатын ADA генінің болмауына байланысты. Сүйек кемігін трансплантациялау кейбір жағдайларда бұл ауруды емдеуге көмектеседі. Науқасқа функционалды АДА енгізуді қамтитын ферментті алмастыру терапиясы да кейбір жағдайларда тиімді. Алайда, бұл екі әдіс те толық емделмейді.

Гендік терапияда науқастың қан лимфоциттері денеден тыс жерде өсіріледі. Кейіннен осы лимфоциттерге функционалды ADA cDNA енгізіледі және пациентке қайта енгізіледі. Бұл аурудың белгілерін жеңілдетеді. Дегенмен, пациент осы гендік-инженерлік лимфоциттердің мерзімді инфузиясын қажет етеді, өйткені бұл жасушалар өлмейтін емес. Бұл аурудың тұрақты емі, эмбриональды өмірдің бастапқы кезеңінде жасушаларға ADA шығаратын генді енгізу болуы мүмкін.


Молекулалық биологияның қолданылуы

Молекулалық биология әдістері тек негізгі ғылыми сұрақтарды зерттеуде ғана емес, сонымен қатар адамның жалпы жағдайына әсер ететін көптеген мәселелерді қолдануда да үлкен маңызға ие. Аурулардың алдын алу және емдеу, жаңа ақуыз өнімдерін өндіру, өсімдіктер мен жануарларды қажетті фенотиптік белгілерге манипуляциялау - бұл молекулалық биология әдістерін қолдану арқылы үнемі қарастырылатын қосымшалар. Бұл әдістердің кең қолданылуына байланысты, олар технологиялық негізделген қоғамымыздың тез таралуына айналады-кейбіреулер инвазивті пікір айтады. Осы әдістерді қолдануды шешетін қоғамдық алаңдаушылықтар қоғамдық пікірталастар мен пікірталастар арқылы шешілуі тиіс. Ғалымдар эксперимент нәтижелерінің сапасына, интерпретациясына және маңыздылығына өте сыни көзқараспен қараса да, олардың ғылыми зерттеулердің көптеген қосымшаларының салыстырмалы әлеуметтік артықшылықтарын бағаламауға бейімділігі бар. Қолданбалы ғылыми зерттеулердің артықшылықтарын сыни тұрғыдан бағалау және жаңа технологияның қоғамға қаншалықты әсер етуіне рұқсат етілетініне қатысты қоғамдық шешім қабылдау процесіне қатысу үшін жеткілікті түрде хабардар болу қоғамдық жауапкершілік болып қала береді.


ДНҚ, РНҚ және ақуызды алу: өткен және қазіргі

ДНҚ, РНҚ және ақуызды алу - молекулалық биологияда қолданылатын негізгі әдіс. Бұл биомолекулаларды кез келген биологиялық материалдан кейінгі ағынды процестерге, аналитикалық немесе препараттық мақсаттарға оқшаулауға болады. Бұрындары нуклеин қышқылдарын алу мен тазарту процесі күрделі, көп уақытты қажет ететін, еңбекті көп қажет ететін және жалпы өткізу қабілеттілігі бойынша шектеулі болатын. Қазіргі уақытта таза биомолекулаларды алу үшін қолдануға болатын көптеген арнайы әдістер бар, мысалы, ерітіндіге негізделген және бағанға негізделген хаттамалар. Қолмен әдіс нуклеин қышқылын оқшаулау үшін қажетті компоненттердің көпшілігін қамтитын толық жинақтарды қамтитын әртүрлі коммерциялық ұсыныстармен уақыт өте ұзақ жолдан өтті, бірақ олардың көпшілігі қайталанатын центрифугалау қадамдарын талап етеді, содан кейін үлгі түріне байланысты үстіңгі қабаттарды алып тастау және қосымша механикалық өңдеу. Орта және үлкен зертханаларға арналған автоматтандырылған жүйелер соңғы жылдары сұранысқа ие болды. Бұл еңбекті көп қажет ететін қолмен әдістерге балама. Технология үлгілердің жоғары өткізу қабілетіне мүмкіндік беруі керек, биомолекулалардың кірістілігі, тазалығы, қайталануы және масштабталуы, сондай-ақ талдаудың жылдамдығы, дәлдігі және сенімділігі максималды болуы керек, сонымен бірге айқас ластану қаупін азайтады.

1. Биомалекулаларды алуды енгізу

Биомолекулаларды, ДНҚ, РНҚ және ақуызды алу молекулалық биологияда қолданылатын ең маңызды әдіс болып табылады [1]. Бұл диагностикалық жиынтықтарды қоса, төмендегі процестер мен өнімді әзірлеудің бастапқы нүктесі. ДНҚ, РНҚ және ақуызды кез келген биологиялық материалдан, мысалы, тірі немесе сақталған ұлпалардан, жасушалардан, вирустың бөлшектерінен немесе аналитикалық немесе дайындық мақсатында басқа үлгілерден бөліп алуға болады [1].

ДНҚ тазартуға қатысатын екі категорияға плазмидалар немесе бактериофагтар сияқты рекомбинантты ДНҚ конструкцияларын оқшаулау және хромосомалық немесе геномдық ДНҚ -ны прокариотты немесе эукариотты организмдерден бөлу жатады [2]. Жалпы алғанда, нуклеин қышқылын сәтті тазарту төрт маңызды қадамды қажет етті: жасушалардың тиімді бұзылуы немесе нуклеопротеидтік кешендердің тіндерінің денатурациясы, мысалы, РНҚ экстракциясы үшін РНаза және ДНҚ экстракциясы үшін ластанудан алыс жерде [2]. Мақсатты нуклеин қышқылы құрамында ақуыз, көмірсу, липидтер немесе басқа нуклеин қышқылы, мысалы, РНҚ жоқ ДНҚ немесе ДНҚ жоқ РНҚ сияқты ластаушы заттар болмауы керек [3]. Оқшауланған нуклеин қышқылының сапасы мен тұтастығы барлық кейінгі ғылыми зерттеулердің нәтижелеріне тікелей әсер етеді [4].

Екінші жағынан, РНҚ тұрақсыз молекула және жасушадан немесе тіндерден алынған бір рет өте қысқа жартылай шығарылу кезеңіне ие [5]. Табиғатта кездесетін РНҚ-ның бірнеше түрі бар, соның ішінде рибосомалық РНҚ (рРНҚ) (80%-90%), хабаршы РНҚ (мРНҚ) (2,5%-5%) және трансферттік РНҚ (тРНҚ) [3]. РНҚ-ны оқшаулау үшін ерекше күтім мен сақтық шаралары қажет, өйткені ол деградацияға бейім [3, 6]. РНҚ қанда, барлық тіндерде, сондай -ақ көптеген бактериялар мен саңырауқұлақтарда болатын ферменттер болып табылатын РНазалардың барлық жерде болуына байланысты әсіресе тұрақсыз [3, 5]. Күшті денатуранттар әрдайым РНҚ -ны оқшаулау кезінде эндогенді РНазаларды тежеу ​​үшін қолданылған [2]. РНҚ экстракциясы жақсы зертханалық техникаға және РНазасыз әдіске негізделген. РНҚ ыстыққа төзімді және жылу денатурациясынан кейін қайта оралады. Оларды инактивациялау қиын, себебі олар кофакторларды қажет етпейді [2]. Ең көп таралған оқшаулау әдістерін екі классқа бөлуге болады: 4 М гуанидиний тиоцианатын қолдану және фенол мен СДС утилизациясы [2].

Ақуызды тазарту олардың қызметін түсіну үшін ақуызды зерттеудің маңызды бөліктерінің бірі болып табылады, себебі олар ДНҚ синтезінің кез келген қызметіне ішінара немесе толық қатысуы мүмкін. Ақуызды тазарту оның бірегей сипаттамаларын, соның ішінде өлшемін, зарядын, пішінін және қызметін анықтау үшін қажет [7]. Жасуша негізіндегі экстракция барлық дерлік ақуызды тазартудың бастапқы қадамы болып табылады. Ақуызды ақуыздардың кетуіне мүмкіндік беру үшін жасушаның айналасындағы мембраналарды әлсіретуге және бұзуға бағытталған жуғыш заттың лизисі, қырқу күші, төмен иондық тұзбен өңдеу (тұздану) және қысымның тез өзгеруі сияқты бірнеше әдістермен алуға болады. ]. Ақуыздармен жұмыс жасау кезінде кейбір факторларды ескеру қажет. Әдетте, ақуызды экстракциялау өте төмен температурада орындалады (

) ақуыздар жасушалардан босатылғаннан кейін денатурацияға оңай түседі. Буферлік жағдай - бұл ескеру қажет негізгі факторлардың бірі. Белгілі бір буферлік жағдайларды сақтау ұсынылады, себебі ақуыздардың қоршаған ортаның рН өзгерістеріне сезімталдығы [4]. Судың тазалығы соңғы өнімдердің шығымына әсер етеді, себебі тазартылмаған суда ақуыздың ыдырауына әкелетін көптеген микроорганизмдер немесе протеазалар бар [4]. Ерітіндіде немесе буферде болуы мүмкін ақуыз ингибиторы ақуыздардың гидролизін тудырады. Жуғыш зат, ақуызды тазарту кезінде назардан тыс қалмайтын тағы бір маңызды фактор, сызықты немесе тармақталған көмірсутектің гидрофобты бөлігінен және гидрофильді «басынан» тұрады [4]. Олар мембраналық ақуызды ерітеді және ақуыздардың гидрофильді басы бар мицеллаларды құрайтын амфифатикалық молекулалар болып табылады [4]. Тотықтыру нәтижесінде пайда болатын ақуыздардың немесе ферменттердің белсенділігінің жоғалуын болдырмау үшін ақуызды экстракциялау және тазарту үшін ерітіндіге немесе буферге қалпына келтіретін агенттер қосылады. Ақуыздарды сақтау маңызды, өйткені ақуыздың жартылай шығарылу кезеңі әдетте сақтау температурасына байланысты [4].

Ақуызды тазарту үшін арнайы талдау қажет. Белгілі молекулалық салмағы, белгілі бір жақындығы немесе ферментативті емес ақуыздың иммуноаффинділігі сәйкес әдісті қолдану арқылы анықталуы үшін ақуызды тазарту үшін жылдам және оңай талдау әдісі белгілі болуы керек [7]. Протеинді тазартуда әдетте қолданылатын бірнеше әдістер бар. Олар ион алмасу хроматографиясы, гельді фильтрациялау, ұқсастық хроматографиясы және гельдік электрофорез [4].

2. Тарих

2.1. Нуклеин қышқылының экстракциясы

Ең алғашқы ДНҚ изоляциясын 1869 жылы швейцариялық дәрігер Фридрих Мишер жасаған [8]. Ол өмірдің негізгі принциптерін шешуге, жасушалардың химиялық құрамын анықтауға үміттенген. Ол эксперимент үшін лимфа түйіндерінен жасушаларды оқшаулауға тырысты, бірақ лимфоциттердің тазалығын жеткілікті мөлшерде алу қиын болды. Сондықтан ол лейкоциттерге көшті, онда оларды іріңнен жиналған хирургиялық бинттерде алды.

Бастапқыда Мишер лейкоциттерді құрайтын ақуыздың әртүрлі түріне назар аударды және белоктар жасуша цитоплазмасының негізгі құрамдас бөлігі екенін көрсетті. Тексеру кезінде ол қышқыл қосқанда ерітіндіден заттың тұнбаға түсетінін және сілтіні қосқанда қайтадан еритінін байқады. Бұл бірінші рет ол ДНҚ-ның шикі тұнбасын алды.

Мишер ДНҚ -ны жасуша экстракттарындағы ақуыздардан ажырату үшін жасуша ядроларын цитоплазмадан, содан кейін оқшауланған ДНҚ -дан ажырататын жаңа хаттама жасады. Алайда, оның бірінші хаттамасы одан әрі талдауды жалғастыру үшін жеткілікті материал бере алмады. Кейінірек оның студенті Ричард Альтман «нуклеин қышқылы» деп атаған тазартылған нуклеиннің көп мөлшерін алу үшін оған екінші хаттаманы жасау керек болды [8].

2.2. Ақуызды экстракциялау

XVIII ғасырда белоктарды Антуан Фуркрой және басқалар биологиялық молекулалардың ерекше класы ретінде білді. Олар бұл молекуланы жылумен немесе қышқылмен өңдеу кезінде коагуляциялау қабілетімен ерекшелендірді. Алайда ақуызға бірінші сипаттама 1893 жылы голландиялық химик Герхардус Йоханнес Мулдермен жүргізілген [9]. Оның жануарлар заттарының, негізінен фибрин, альбумин және желатиннің құрамы туралы зерттеулері көміртегі, сутегі, оттегі мен азоттың болуын көрсетті [9]. Сонымен қатар, ол күкірт пен фосфордың кейде көп атомдардан тұратын жануарлар заттарында болатынын мойындады және бұл «заттардың» макромолекулалар екенін анықтады [9].

Алғашқы зерттеулердің көпшілігі көп мөлшерде тазартылуы мүмкін белоктарға бағытталған. Мысалы, қан, жұмыртқаның ақтығы және әртүрлі токсиндер. Ақуыздардың көпшілігін миллиграммнан асатын мөлшерде тазарту қиын, тіпті қазіргі заманғы әдістермен де. Ақуызды тазарту әдістерінің көпшілігі Екінші дүниежүзілік соғыс кезінде протеин ғалымы Эдвин Джозеф Кон бастаған жобада жасалған. Ол қан тазартуға жауапты болды және қан плазмасының сарысуындағы альбумин фракциясын оқшаулау әдістерін жасады, бұл қан тамырларындағы осмостық қысымды ұстап тұруда маңызды, бұл сарбазды тірі қалдыруға көмектеседі [10].

3. Қазіргі тенденция

Мишер жасушадан ДНҚ алуға қол жеткізген оқиғадан кейін, көптеген басқа адамдар ДНҚ -ны оқшаулау мен тазарту хаттамасын одан әрі жетілдіруге әкеліп соқтырды. ДНҚ экстракциясының бастапқы зертханалық процедуралары тығыздық градиентінің центрифугалау стратегиясынан жасалған. Меселсон мен Сталь 1958 жылы ДНҚ -ның жартылай консервативті репликациясын көрсету үшін бұл әдісті қолданды [3]. Кейінгі процедуралар сілтілі буфердегі үлкен хромосомалық ДНҚ, плазмидалар мен ақуыздардың ерігіштігіндегі айырмашылықтарды қолданды [3].

Қазіргі уақытта таза ДНҚ, РНҚ немесе ақуызды алудың көптеген арнайы әдістері бар. Әдетте олар шешім негізіндегі немесе баған негізіндегі хаттамаларға бөлінеді. Бұл хаттамалардың көпшілігі биомолекулаларды алу процестерін жеңілдететін коммерциялық жинақтарға әзірленді.

3.1. Нуклеин қышқылын алу түрі
3.1.1. Дәстүрлі әдіс

Гуанидиний тиоцианаты-фенол-хлороформ экстракциясы
Тұз - нуклеин қышқылының үлгілеріндегі қарапайым қоспалар. Нуклеин қышқылының сынамаларынан төмендегі процестер мен талдаулар жүргізілмес бұрын, оларды әрқашан алып тастау қажет болды. Сондықтан нуклеин қышқылынан тұратын үлгіні тұзсыздандыру үшін бір немесе бірнеше бөлу және/немесе тазарту қадамдары қажет [11]. Нуклеин қышқылын тазартудың жалпы қадамдарына лизат жасау үшін жасушалық құрылымды бұзатын жасуша лизисі, DNase және RNase сияқты жасушалық нуклеазаларды инактивациялау және қажетті нуклеин қышқылын жасуша қалдықтарынан бөлу жатады [2]. Органикалық еріткіш-фенол-хлороформ экстракциясы-нуклеин қышқылын бөлуде кеңінен қолданылатын мысалдардың бірі.
Жанғыш, коррозиялық және улы карбол қышқылы фенол ақуыздарды тез денатурацияласа да, ол РНҚ белсенділігін толық тежемейді [12]. Бұл мәселені фенол: хлороформ: изоамил спирті қоспасы арқылы шешуге болады (25: 24: 1). Ақуыздар, липидтер, көмірсулар және жасуша қалдықтары фенол мен хлороформның органикалық қоспасымен сулы фазаны экстракциялау арқылы жойылады [12, 13]. Фенол мен хлороформ қосылғанда екі фазалы эмульсия түзіледі. Содан кейін центрифугалау арқылы эмульсияның гидрофобты қабаты түбіне, ал гидрофильді қабаты үстіңгі жағына тұндырылады [3]. ДНҚ бар жоғарғы фаза жиналады және 2: 1 немесе 1: 1 пропорциясында этанол немесе изопропанол қосу және тұздың жоғары концентрациясы арқылы үстіңгі қабаттан ДНҚ тұндыруға болады [3]. ДНҚ тұнбасы центрифугалау арқылы жиналады, ал артық тұз 70% этанолмен шайылады және этанолдың үстіңгі затын тастау үшін центрифугаланады. Содан кейін ДНҚ түйіршігі ТЭ буферімен немесе стерильді тазартылған сумен ерітіледі [3].
РНҚ экстракциясында гуанидиниум изотиоцианатын қолдану туралы Ульрих және т.б. (1977). Әдіс көп күш жұмсады. Сондықтан оны бір сатылы техникамен ауыстырды, ол Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform экстракциясы деп аталады, Chomczynski and Sacchi (1987) [12], осылайша гомогенат рН төмендегенде фенол/хлороформмен алынады. Гуанидиний тиоцианаты – ақуыздың ыдырауында қолданылатын хаотропты агент. Бұл бір сатылы әдістеменің принципі: гуанидиний тиоцианаты, натрий ацетаты, фенол және хлороформнан тұратын қышқыл ерітіндісімен экстракциядан кейін РНҚ ДНҚ-дан бөлінеді [13]. Қышқылдық жағдайда жалпы РНҚ бүкіл қоспаның жоғарғы сулы фазасында қалады, ал ДНҚ мен ақуыздар интерфазада немесе төменгі органикалық фазада қалады. Жалпы РНҚ -ны қалпына келтіру изопропанолмен тұндыру арқылы жүзеге асады [12].

Сілтілік экстракция әдісі
Сілтілік лизис плазмидтік ДНҚ-ны оқшаулау үшін қолданылған және E. coli [12]. Ол барлық штаммдарымен жақсы жұмыс істейді E. coli және натрий додецил сульфаты (SDS) қатысуымен мөлшері 1 мл -ден 500 мл -ден асатын бактериялық дақылдармен. Әдістің принципі жоғары молекулалық хромосомалық ДНҚ -ның селективті сілтілі денатурациясына негізделген, ал ковалентті жабық дөңгелек ДНҚ екі тізбекті болып қалады [14]. Бактериялық ақуыздар, сынған жасуша қабырғалары және деноцирленген хромосомалық ДНҚ додецилсульфатпен қапталған үлкен кешендерге енеді. Плазмидті ДНҚ -ны денатуратталған материалды центрифугалау арқылы алып тастағаннан кейін үстіңгі қабаттан алуға болады.

CTAB экстракция әдісі
Өсімдікті экстракциялау үшін бастапқы қадам - ​​үлгіні сұйық азотпен мұздатқаннан кейін ұнтақтау. Бұл қадамның мақсаты - жасуша қабырғасындағы материалды сындыру және нуклеин қышқылына қол жеткізу, ал зиянды жасушалық ферменттер мен химиялық заттар белсенді емес күйінде қалады. Үлгіні ұнтақтағаннан кейін оны CTAB сияқты қолайлы буферде қайта тоқтатуға болады.
Цетилтриметиламмоний бромиді (CTAB) - иондық беріктігі төмен ерітінділерден нуклеин қышқылдары мен қышқыл полисахаридтерді тұндыра алатын ионды емес жуғыш зат [15]. Бұл кезде белоктар мен бейтарап полисахаридтер ерітіндіде қалады. Жоғары иондық күші бар ерітінділерде CTAB нуклеин қышқылдарын тұнбаға түсірмейді және ақуыздармен комплекстер түзеді.Сондықтан CTAB өсімдіктер мен кейбір грамтеріс бактериялар сияқты полисахаридтердің көп мөлшерін шығаратын организмдерден нуклеин қышқылын тазарту үшін пайдалы [15].
Бұл әдіс келесі қадамдарда органикалық еріткіштерді және спиртті тұндыруды да пайдаланады [12]. Нуклеин қышқылын тазарту үшін ерімейтін бөлшектер центрифугалау арқылы жойылады. Еритін белоктар мен басқа материал хлороформмен араластыру және центрифугалау арқылы бөлінеді. Осыдан кейін нуклеин қышқылын шөгінділерден тұндырып, ластаушы тұздарды кетіру үшін мұқият жуу керек. Содан кейін тазартылған нуклеин қышқылы қайтадан суспензияға жіберіледі және ТЭ буферінде немесе стерильді тазартылған суда сақталады.

) Градиентті центрифугалау
градиентті центрифугалау басқа тазарту протоколдарымен салыстырғанда күрделі, қымбат және көп уақытты қажет ететін әдіс. Бұл үлкен бактериялық өсіруді қажет етеді. Сондықтан ДНҚ плазмидасының минимепрепараты үшін қолайлы емес [4]. Нуклеин қышқылдарын центрифугалау арқылы шоғырландыруға болады

алкоголь тұндырудан және қайта суспензиядан кейінгі градиент. Интеркалация молекуланың жоғары молярдағы жүзу тығыздығын өзгертеді

Ковалентті тұйықталған дөңгелек молекулалар градиентте төменгі тығыздықта жиналады, өйткені олар сызықты молекулалармен салыстырғанда бір негіз жұбына азырақ кіреді. Содан кейін экстракциядан кейін гидрофобты тиісті гидрофобты еріткіштермен алып тастайды. Тазартылған нуклеин қышқылы спиртпен тұнбаға түседі [1].

Олигп бойынша РНҚ (dT) -целлюлоза хроматографиясы
Поли РНҚ ақуызды трансляциялаудың үлгісі болып табылады және эукариоттық мРНҚ-лардың көпшілігі оның тракттарын 3' ұшында тасымалдайды [4, 15]. Ол жалпы РНҚ-ның 1-2% құрайды және олиго (дТ) -целлюлоза бойынша аффиниттік хроматографиямен бөлуге болады. Поли (А) құйрықтар әр түрлі тірек матрицаларына бекітілетін олиго (дТ) қысқа тізбектері бар тұрақты РНҚ-ДНҚ гибридтерін құрайды [4, 15]. Нуклеин қышқылының дуплекстерін тұрақтандыру үшін хроматография буферіне жоғары тұзды қосу керек, себебі бірнеше dT-A негіздік жұптары ғана түзіледі. Матрицадан полиадениляцияланбаған РНҚ жуылғаннан кейін тұзы аз буфер қолданылады. Бұл буфер қос тізбекті құрылымдарды тұрақсыздандыруға және шайырдан поли РНҚ-ны элюциялауға көмектеседі [15].
Поли РНҚ таңдау кезінде әдетте екі әдіс қолданылады - олиго (дТ) бағандарындағы колонналық хроматография және пакеттік хроматография. Бағаналық хроматография әдетте көп мөлшерді тазарту үшін қолданылады (& gt25

ж) сүтқоректілер жасушаларынан оқшауланбаған радиоактивті поли (А) + РНҚ. Пакеттік хроматография сүтқоректілердің жалпы РНҚ аз мөлшерде (<50 г) жұмыс істегенде қолайлы әдіс болып табылады. Оны радиоактивті немесе жоқ РНҚ -ның көптеген үлгілерін өңдеу қажет болғанда қолдануға болады. Пакеттік хроматография олиго (дТ) целлюлозасының жұқа сортымен байланыстыру мен элюция үшін оңтайлы температурада жүргізіледі [15].

3.1.2. Қатты фазалы нуклеин қышқылының экстракциясы

Қатты фазалы нуклеин қышқылын тазартуды нарықта бар коммерциялық экстракциялық жинақтардың көпшілігінен табуға болады. Ол әдеттегі әдістермен салыстырғанда тез және тиімді тазартуға мүмкіндік береді [16]. Сұйық-сұйық экстракциямен байланысты көптеген проблемаларды, мысалы, фазаның толық бөлінбеуін болдырмауға болады. Қатты фазалы жүйе рН мен буфердегі тұздың мөлшеріне байланысты экстракция процесінде нуклеин қышқылын сіңіреді. Абсорбция процесі келесі принциптерге негізделеді: хаотропты жағдайда гидрофильді матрицамен сутегімен байланысатын өзара әрекеттесу, анионды алмастырғыштың көмегімен сулы жағдайда иондық алмасу, аффиналдылық пен өлшемді алып тастау механизмдері.

Қатты фазалы тазарту әдетте центрден тепкіш күшпен басқарылатын айналдыру бағанының көмегімен жүзеге асады [17]. Бұл әдіс нуклеин қышқылын қарапайым әдістермен салыстырғанда тез тазартады. Кремний тотығы матрицалары, шыны бөлшектері, диатомды жер және анион алмастырғыштар қатты фазалық экстракция әдісінде қатты тірек ретінде пайдаланылған мысалдар болып табылады. Қатты фазалы экстракцияға қатысатын төрт негізгі қадам-жасуша лизисі, нуклеин қышқылдарының адсорбциясы, жуу және элюция [6].

Қатты фазалы экстракция процесінің бастапқы қадамы - үлгіні адсорбциялау үшін шартты орнату. Колоннаны кондиционерлеу қатты заттағы бетті немесе функционалды топтарды белгілі бір химиялық түрге айналдыру үшін белгілі бір рН кезінде буферді қолдану арқылы жүзеге асады. [17]. Әрі қарай, лизис буферін пайдалану арқылы бұзылған үлгі бағанға қолданылады. Қажетті нуклеин қышқылы жоғары рН және тұз ерітіндісінің тұз концентрациясының көмегімен бағанға сіңеді [17]. Ақуыз сияқты басқа қосылыстар да баған бетімен күшті спецификалық байланысқа ие болуы мүмкін. Бұл ластаушы заттарды жуу сатысында бәсекеге қабілетті агенті бар жуу буферінің көмегімен жоюға болады [17]. Элюция сатысы үшін колоннадан қажетті нуклеин қышқылын босату үшін TE буфері немесе су енгізіледі, осылайша оны тазартылған күйде жинауға болады [17]. Әдетте тазарту процесінің жуу және тазарту кезеңдерінде жылдам центрифугалау, вакуумдық сүзу немесе колонналық бөлу қажет.

Нуклеин қышқылының аралас қабатты қатты фазалы экстракциясы және оны нуклеин қышқылын бөліп алу кезінде қолданылуы ашылды [18]. Бұл өнертабыстың аралас қабатты қатты фазалары-қатты немесе жартылай қатты, кеуекті немесе кеуекті емес болуы мүмкін кем дегенде екі түрлі қатты фазаның қоспасы. Әр қатты фаза әр түрлі ерітінді жағдайында мақсатты нуклеин қышқылымен байланысып, ұқсас элюция жағдайында нуклеин қышқылын бөле алады [18].

Кремний матрицалары
Нуклеин қышқылын тазартумен байланысты көптеген өнімдердің негізі ДНҚ -ны селективті байланыстыру үшін кремнезем матрицаларының бірегей қасиеттері болып табылады. Шыны талшықты сүзгі қағаздарын ұнтақтау арқылы дайындалған шыны ұнтағы, кремнезем бөлшектері және шыны микрофибра тәрізді шыны бөлшектерін қосқанда кремнеземді материалдардың түрлері және диатомды жерді қосқанда [19]. Кремний диоксидін натрий гидроксидінде немесе калий гидроксидінде шамамен 2:1-ден 10:1-ге дейін молярлық қатынаста кемінде 48 сағат бойы рефлюксациялау арқылы дайындалған гидратталған кремний тотығы матрицасы ДНҚ тазартуға енгізілген. ДНҚ бейорганикалық матрицамен байланысады және қыздырылған суда шығарылады [20].
Кремнезем матрицаларын тазарту принципі теріс зарядталған ДНҚ омыртқасының оң зарядталған кремнезем бөлшектеріне жоғары жақындығына негізделген [21]. Натрий нуклеин қышқылының фосфат омыртқасындағы теріс зарядталған оттегін тартатын катиондық көпір рөлін атқарады [22]. Натрий катиондары жоғары тұз жағдайында (рН ≤7) судағы сутегі мен кремнеземдегі теріс зарядталған оттегі иондары арасындағы сутектік байланыстарды үзеді [22]. ДНҚ тығыз байланыстырылған және кеңінен жуу барлық ластануларды жояды. Тазартылған ДНҚ молекулалары төмен иондық беріктікте (рН ≥7) кейін TE буферін немесе тазартылған суды қолдану арқылы элюциялануы мүмкін [21].
Кремний диоксиді матрицаларынан басқа, нейлон матрицалары сияқты нитроцеллюлоза және полиамидті мембраналар да нуклеин қышқылдарымен байланысатыны белгілі, бірақ ерекшелігі аз. Бұл материалдар көбінесе қатты фазалы нуклеин қышқылын беру және будандастыру матрицасы ретінде қолданылады [23]. Полиамидті матрицалар нитроцеллюлозаға қарағанда берік және нуклеин қышқылдарын қайтымсыз байланыстыратыны белгілі. Нуклеин қышқылдары төмен иондық күшті буферде полиамидті матрицаларда иммобилизациялануы мүмкін [23].

Шыны бөлшек
Шыны бөлшектер, ұнтақ және моншақтар нуклеин қышқылын тазарту үшін пайдалы. Мысалы, агарозды гельдерден ДНҚ-ны оқшаулау ДНҚ-ның қарапайым силикатты шыныға, шақпақтас шыныға және боросиликатты шыныға (шыны талшықты фильтр) қосылуын жеңілдету үшін хаотропты тұздарды қолдануды қамтыды. Шыны субстратқа нуклеин қышқылының адсорбциясы адсорбциялық хроматографияға ұқсас механизм мен принцип негізінде жүзеге асады [24]. Нуклеин қышқылын тазартуды силикагель мен шыны қоспасында да жүргізуге болады [19]. Бұл өнертабыс силикагель мен шыны бөлшектерінің қоспасын хаотропты тұздар ерітіндісінің қатысуымен нуклеин қышқылын басқа заттардан бөлу үшін қолдануға болатынын анықтады.

Диатомды жер
Диатомды жер, оны кизельгур немесе диатомит деп те атайды, құрамында кремнеземнің мөлшері 94% дейін жетеді [25]. Ол фильтрацияда және хроматографияда қолданылған және плазмиданы және басқа ДНҚ -ны тазартуда пайдалы, оның бөлшектеріне ДНҚ -ны хаотропты агент қатысында иммобилизациялау арқылы. Алынған диатомды жермен байланысқан ДНҚ содан кейін спирті бар буфермен жуылады. Содан кейін құрамында спирті бар буфер жойылады және ДНҚ аз тұзды буферде немесе тазартылған суда элюцияланады [25].

Магнитті моншақ негізіндегі нуклеин қышқылын тазарту
Магнитті сепарация - бұл қазіргі кезде нуклеин қышқылын тазартуда қолданылатын қарапайым және тиімді әдіс. Көптеген магниттік тасымалдаушылар қазір сатылымда бар. Магниттік заряды бар бөлшектерді магнит өрісін қолдану кезінде тұрақты магнит көмегімен жоюға болады. Көбінесе оқшаулау процесінде иммобилизацияланған аффинды лигандтары бар немесе мақсатты нуклеин қышқылына жақындықты көрсететін биополимерден дайындалған магнитті тасымалдаушылар қолданылады. Мысалы, әр түрлі синтетикалық полимерлерден, биополимерлерден, кеуекті шыныдан немесе магниттік бөлшектерден, беті өзгертілген темір оксиді сияқты бейорганикалық магниттік материалдардан жасалған магниттік бөлшектер. Нуклеин қышқылдарын байланыстыру үшін беті үлкен материалдарды қолданған жөн. Моншақ тәрізді магнитті бөлшектер оқшаулау процесінде тірек болған жөн, өйткені олардың байланыстыру қабілеті үлкен. Нуклеин қышқылын байланыстыру процесіне нуклеин қышқылының тірекке «орауы» көмектесуі мүмкін. Магнит ыдыстың қабырғасына жақын орналасқан бөлшектерді біріктіруге және сынаманың қалған бөлігін төгуге арналған үлгі қоспасы бар ыдыстың бүйіріне қолданылуы мүмкін [26].
Магниттік немесе парамагниттік қасиеттері бар бөлшектер олар магниттелетін целлюлоза сияқты полимерге инкапсуляцияланған өнертабыста қолданылады [27]. Тұз мен полиалкиленгликольдің белгілі бір концентрациясы болған жағдайда магниттелетін целлюлоза нуклеин қышқылдарымен байланысады. Кішкене нуклеин қышқылы магниттелетін целлюлоза бөлшектерімен берік байланысуы үшін тұздың жоғары концентрациясын қажет етті. Сондықтан тұз концентрациясын өлшеміне қарай магниттелетін целлюлозамен байланысқан нуклеин қышқылын босату үшін таңдаулы түрде басқаруға болады. Нуклеин қышқылымен байланысқан магниттелетін целлюлоза целлюлозамен қалаған нуклеин қышқылын бөліп алу үшін сәйкес элюциялық буфермен байланысқанға дейін тиісті жуу буферімен жуылады. Магниттелетін целлюлозаны барлық тазарту қадамдары кезінде үстіңгі қабаттан бөлу оларды төмен түсіру немесе ыдыстың жағына тарту үшін магнит өрісін қолдану арқылы жүзеге асырылуы мүмкін [27]. Осы өнертабыста пайдаланылған магниттелетін целлюлозаның құрамында темір оксидінің мөлшері целлюлозаның жалпы массасының шамамен 90% құрайды. Целлюлозаның магниттік құрамдас бөлігі темір оксиді немесе никель оксиді сияқты басқа магниттік қосылыстармен де алмастырылуы мүмкін [27].
Нуклеин қышқылын магнитті тазарту принципіне негізделген экстракциялық жинақ нарықта сатылымда бар [28]. Бұл жинақтың ерекше бөлігі берілген реагенттер магнитті құралдармен пайдалануға арналған. Бұл магнитті құрал микротүтік пішімінде жұмыс істеген жағдайда ұсынылады. Бұл магниттік бөлшектер технологиясы негізінде бөлуді орындауға арналған практикалық құрылғы. Жинақ органикалық еріткіштерді қажет етпейді және қайталап центрифугалауды, вакуумдық сүзуді немесе колонкаларды бөлу қажеттілігін жояды. Хаттама нуклеин қышқылын магниттік бөлшектермен байланыстыратын модификацияланған сілтілі лизис процедурасына негізделген. Магнитті құрал магнитті бөлшектерді байланған нуклеин қышқылымен ұстау үшін пайдаланылады және ластаушы заттар жуғыш буфермен жуу арқылы жойылады. Содан кейін нуклеин қышқылы магнитті бөлшектерден элюция буферімен [28] шығарылады.
Басқа экстракция жинағы жоғарыда сипатталған экстракция сияқты принципке ие, ол нуклеин қышқылын тазарту үшін магнитті-бөлшек технологиясын пайдаланды [29]. Ол магнитті бөлшектермен ыңғайлы жұмыс жасауда кремний негізіндегі ДНҚ тазартудың жылдамдығы мен тиімділігін біріктіреді. Магниттік бөлшектерді ұстау үшін таяқша қақпағымен қорғалған магниттік таяқша қолданылады. Ол үлгілері бар ыдысқа кіреді және магниттік бөлшектерді тартады. Содан кейін магниттік шыбықтың қақпағы басқа ыдыстың үстіне орналастырылады және магниттік бөлшектер шығарылады [29].
Циркония бисерін қолдану арқылы нуклеин қышқылын тазарту - бұл бисерге негізделген магнитті тазартудың тағы бір түрі. Бұл микросфералық парамагниттік моншақтар үлкен қол жетімді байланыстыру бетіне ие және ерітіндіде дисперсті болуы мүмкін. Бұл сипаттама нуклеин қышқылын мұқият байланыстыруға, жууға және элюцияға мүмкіндік берді. Нуклеин қышқылын тазарту үшін осы технологияны қолданатын жалпы нуклеин қышқылын оқшаулау жиынтығы нуклеин қышқылын шығаратын ғана емес, сонымен қатар үлгі матрицасында нуклеазаны инактивациялайтын гуанидиний тиоцианат негізіндегі циркония бисері бар үлгілердің механикалық бұзылуын қолданады. 30]. Лизис қадамынан кейін үлгілерді сұйылту изопропанолды қолдану арқылы жүзеге асырылады. Парамагенетикалық моншақтар нуклеин қышқылын байланыстыру мақсатында үлгілерге қосылады. Моншақтар мен нуклеин қышқылының қоспасы магниттерге иммобилизацияланады және ақуызды және ластаушы заттарды кетіру үшін жуылады. Қалдық байланыстырушы ерітіндіні жою екінші жуу ерітіндісімен жүзеге асырылады және соңында нуклеин қышқылы аз тұзды буферде элюцияланады [30].
ПТР тазарту жүйесі үшін сапалы ДНҚ жеткізу үшін қатты фазалы қайтымды иммобилизацияның парамагенетикалық моншақтарға негізделген технологиясы қолданылды. Ол центрифугасыз және сүзгісіз қарапайым протоколды қажет етеді. ПТР ампликондары оларды ерітіндіден шығаратын парамагнетикалық бөлшектермен байланысады, бұл dNTP, праймерлер және тұздар сияқты ластаушы заттарды шаюға мүмкіндік береді [31].
Магниттік олиго (dT) моншақ жалпы РНҚ үлгісінен поли РНҚ тазарту үшін басқа олиго (dT) матрицаларға балама болып табылады [4]. Поли -РНҚ -ны олиго (dT) қапталған магнитті моншақтар енгізу арқылы алуға болады. Поли-А құйрығы бар РНҚ олигоға бекітіледі (dT). Моншақтар түтіктің түбіне тартылады, мРНҚ -ны жалпы РНҚ -дан тікелей алып тастайды. Арнайы өңделген магниттік моншақтар басқа нуклеин қышқылдарының спецификалық емес байланысуын азайтады және мРНҚ тазалығын қамтамасыз етеді [32].

Анион алмасу материалы
Анион алмасу шайыры-анион алмасу принципін қолданған танымал мысалдардың бірі [33]. Ол шайыр бетіндегі оң зарядталған диэтиламиноэтил целлюлоза (ДЭАЕ) топтары мен ДНҚ омыртқасының теріс зарядталған фосфаттары арасындағы өзара әрекеттесуге негізделген. Анионалмастырғыш шайыр үлкен кеуекті өлшемі бар, гидрофильді беті жабыны бар және жоғары заряд тығыздығына ие анықталған кремнеземді түйіршіктерден тұрады [34]. Шайырдың үлкен ауданы DEAE топтарын тығыз байланыстыруға мүмкіндік береді. Шайыр ДНҚ -ның РНҚ мен басқа қоспалардан бөлінуін оңтайландыратын рН (рН 6-9) және/немесе тұз концентрациясында (0.1-1.6 М) кең ауқымында жұмыс істейді [34]. Демек, буфердің тұз концентрациясы мен рН шарттары нуклеин қышқылының бағанадан байланысқанын немесе бөлінетінін анықтайтын негізгі факторлардың бірі болып табылады. ДНҚ тұз концентрациясының кең ауқымында DEAE тобымен байланысуы мүмкін. Ақуыз және РНҚ сияқты қоспалар шайырдан орташа тұзды буферлердің көмегімен жуылады, ал ДНҚ жоғары тұзды буфермен элютацияланғанша байланысқан күйінде қалады [34].
Нуклеин қышқылын бөліп алу үшін анионалмасу материалдарын қолдану әдісі өнертабыста [35] ашылды, мұнда коммерциялық сатылымда бар күшті немесе әлсіз оң зарядты анионалмасу материалдары адсорбция мен элюция үшін белгілі иондық беріктігі бар ерітінділермен қолданылған. Ақуыз сияқты суда еритін компоненттердің көпшілігін нуклеин қышқылдарының анион алмасу бағанасының материалдарымен байланыстыру үшін белгілі иондық беріктігі бар ерітіндіні қолдану арқылы бағанадан жууға болады. Элюцияның иондық күші рН күшін бақылау үшін буфермен араласқан белгілі тұз концентрациясын қолдану арқылы түзіледі, бұл нуклеин қышқылдары толығымен элюцияланатын ең төменгі иондық күшке сәйкес келеді [35].

3.2. Протеинді экстракциялау әдісінің түрі

Ақуызды тазартудағы бірінші қадам - ​​жасуша лизисі. Ақуызды тиімді тазарту және талдау үшін, олар алдымен иесі жасушадан еритін түрде шығарылуы керек. Фосфолипидтер мен ақуыздардан тұратын сүтқоректілер жасушаларының плазмалық мембранасы оңай бұзылады [36]. Салыстырмалы түрде, саңырауқұлақтар мен бактериялардан ақуызды алу олардың плазмалық мембранадан берік жасуша қабырғасына байланысты қиынырақ болып көрінеді.

Өсімдік ұлпаларында қасиеттері бойынша әр түрлі белоктар бар. Өсімдік үшін ақуызды экстракциялау протоколын жасау кезінде кейбір ерекше факторларды ескеру қажет [37]. Мысалы, жасуша құрамын босату үшін қатаң целлюлоза жасуша қабырғасының болуын кесу керек. Феноликтер мен протеиназалар диапазоны сияқты арнайы ластаушы қосылыстар ақуыздың ыдырауына немесе модификациясына әкелуі мүмкін. Сондықтан ақуызды алу және өсімдіктен тазарту үшін нақты шарттар қажет [38].

Жасуша қабырғасын алып тастау үшін French Press немесе шыны моншақтар сияқты механикалық бұзу әдістері қолданылады, содан кейін жалпы ақуызды жуғыш зат негізінде алу [39].

3.2.1. Ион алмасу хроматографиясы

Ион алмасу хроматографиясы оң зарядталған немесе теріс зарядталған химиялық топтармен модификацияланған шайырдың көмегімен белоктарды беттік иондық зарядына қарай бөледі [4, 7]. Белоктардың көпшілігінде рН берілген изоэлектрлік нүктеге (pI) байланысты жалпы теріс немесе оң заряд бар, бұл оларға қарама -қарсы зарядталған хроматографиялық матрицамен әрекеттесуге мүмкіндік береді [7]. Егер ақуыздың таза заряды pI мәнінен төмен рН кезінде оң болса, ақуыз pI мәнінен жоғары рН кезінде катионалмастырғышпен байланысады, ақуыздың таза заряды теріс болады және ақуыз анион алмастырғышпен байланысады [38] ].

Шайырлармен әлсіз әрекеттесетін ақуыздар, мысалы, теріс зарядталған топпен модификацияланған шайырдан өткен әлсіз оң зарядталған ақуыз тұзы аз буферде шығарылады. Екінші жағынан, өзара әрекеттесетін ақуыздар көп тұзды элюциялауды қажет етеді. Зарядтық сипаттамалары өте ұқсас белоктарды әртүрлі фракцияларға бөлуге болады, өйткені олар элюция буферіндегі тұздың концентрациясын жоғарылату арқылы бағаннан элюцияланады [7].

Ион алмасу бағанасы - ион алмастырушы хроматография принципін қолданған технологиялардың бірі [33]. Ол белоктарды бөлу үшін хроматографиялық матрица ретінде мембраналық сіңіргіш технологияны пайдаланады.Бағаналардағы мембраналық сіңіргіштер ақуыздардың зарядталған бетке оңай қол жеткізуін қамтамасыз ететін кеуекті құрылымы бар, тұрақтандырылған целлюлоза негізіндегі. Молекулалар мен мембранадағы белсенді учаскелер арасындағы өзара әрекеттесу конвективті саңылауларда болды. Сондықтан адсорбтивті мембраналар диффузиясы төмен ірі биомолекулаларды тазарту кезінде жоғары тиімділікті сақтап қалу мүмкіндігіне ие [33].

3.2.2. Гельді сүзу хроматографиясы

Гельдік фильтрациялық хроматография, ол сондай-ақ өлшемді алып тастау немесе гель-өткізу хроматографиясы деп аталады, ақуыздарды молекулалық өлшемдері мен пішініне сәйкес бөледі және молекулалар хроматография ортасымен байланыспайды [39]. Бұл үлкен молекулалар колонкадан кіші молекулаларға қарағанда жылдам өтетін процесс. Кішкентай молекулалар матрицаның барлық ұсақ тесіктеріне еніп, бағанға көбірек кіре алады. Кішкентай ақуыздар сол тесіктерден өтеді және бағанадан шығып кетуге көп уақыт кетеді, олар бұл тесіктерге ене алмайды, бірақ бағаннан бос кеңістік арқылы бағаннан тікелей шығып кетеді [4, 7].

Гельдік фильтрациялық хроматография жинағы гельді сүзу хроматографиясының принципін қолданады [40]. Мақсатты үлгі кеуекті моншақтары бар бағанның үстіне қолданылады, бағандағы матрицаның мысалы. Молекулалар кеуекті моншақтар бағанасынан өткенде молекулалар бөлінеді. Молекулалардың бөлінуін үш негізгі түрге бөлуге болады: жалпы шығару, селективті өткізгіштік және жалпы өткізгіштік шегі. Толық алып тастау - бұл үлкен молекулалардың кеуектерге еніп, тез элютацияланбайтын бөлігі. Селективті ену аймағы үшін аралық молекулалар кеуектерге енуі мүмкін және олардың мөлшері мен пішініне байланысты бөлшектерде орташа тұру уақыты болуы мүмкін. Жалпы өткізгіштік шегіне келетін болсақ, кіші молекулалар бағандағы кеуектерге енгеннен кейін ең ұзақ тұру уақытына ие болады [40]. Гельді фильтрацияға негізделген хроматографияның артықшылығы оның рН өзгерістеріне, металл иондарының концентрациясына және қоршаған ортаның қатал жағдайларына сезімтал болуы мүмкін биомолекулаларға қолайлы болуы болып табылады [39].

3.2.3. Сәйкестік хроматографиясы

Аффиниттік хроматография ластаушы заттардан бөлінуге әсер ету үшін ақуыз мен қатты фаза арасындағы нақты әрекеттесуге байланысты. Ол ион алмасу хроматографиясы сияқты қадамдардан тұрады [38]. Бұл ақуызды биологиялық қызметі немесе жеке химиялық құрылымы негізінде тазартуға мүмкіндік береді [41]. Лигандтар сияқты белгілі бір химиялық топтарға жақындықтары жоғары ақуыздар баған матрицасына ковалентті түрде қосылады және байланысады, ал басқа ақуыздар бағанадан өтеді [38]. Электростатикалық немесе гидрофобты әрекеттесу, ван-дер-Ваальс күштері және сутегі байланысы лигандтар мен мақсатты белоктар арасындағы биологиялық әрекеттесу болып табылады [41]. Байланысқан белоктар лигандтың еритін түрінің жоғары концентрациясы бар ерітіндімен бағаннан шығарылады [36].

Хроматография матрицасына ковалентті түрде қосыла алатын биоспецификалық лиганд аффинитті сәтті тазартудың талаптарының бірі болып табылады. Лиганд пен мақсатты ақуыз молекулалары арасындағы байланыс белоктардың белсенді түрде жойылуына мүмкіндік беру үшін қайтымды болуы керек [41]. Ластануды жуғаннан кейін, байланысқан лиганд мақсатты ақуыздармен байланыстыратын аффинділігін сақтауы керек. Әдетте аффиниттік хроматографияда қолданылатын биологиялық өзара әрекеттесудің кейбір мысалдары 1 -кестеде келтірілген ([41] қараңыз).

Моншақ тәрізді кеуекті шайырда иммобилизацияланған лигандаларға дифференциалды жақындық бойынша хроматографиялық бөлу ақуыздық зерттеулердің негізі болып табылады [42]. Нарыққа аффинділік хроматографиясы принципіне негізделген моншақ тәрізді шайырлы бағандарды қамтитын толық жинақ шығарылды [42]. Сәйкестік шайыры жүргізілетін тәжірибенің масштабы мен түріне байланысты топтамалық немесе микроцентрифугалық айналдыру бағанының пішімінде қолданылуы мүмкін. Сонымен қатар, оны гравитациялық ағынның қандай да бір үлкен бағанына салуға болады [42].

3.2.4. Гельдік электрофорез

Гель электрофорезі - ақуызды мөлшері мен зарядтау қасиетіне қарай ажырату әдісі. Хроматографиялық сепарациялардан алынған ішінара тазартылған ақуызды тазартылмайтын полиакриламидті гель электрофорезімен (PAGE) немесе табиғи гель электрофорезімен тазартуға болады [4]. PAGE-де белоктар желеленген матрица арқылы қолданылатын токпен қозғалады [43]. Бұл гель арқылы ақуыздың қозғалысы молекулалардың заряд тығыздығына (масса бірлігіне заряд) байланысты. Жоғары зарядты молекулалар тез қозғалады. Ақуыздың мөлшері мен формасы - PAGE фракциясына әсер ететін тағы екі маңызды фактор [43]. Акриламид тесігі мөлшері әртүрлі мөлшердегі белоктарды бөлу үшін молекулалық елеуіш рөлін атқарады [4]. Ақуыз неғұрлым үлкен болса, ол баяу қозғалады, себебі ол гельге көбірек араласады [43]. Пішін сонымен қатар факторлардың бірі болып табылады, себебі ықшам глобулярлы ақуыздар салыстырмалы молекулалық массадағы ұзартылған талшықты ақуыздарға қарағанда тезірек қозғалады [43].

PAGE әдетте натрий додецилсульфатының (SDS) қатысуымен жүзеге асады [44]. SDS-пен өңделген ақуыз әдетте ақуыздың екінші, үшінші және төрттік құрылымын жояды [4, 7]. Байланысқан SDS молекулалары арасындағы электростатикалық серпіліс әсерінен белоктар ұқсас таяқша тәрізді пішінге айналады. Ақуызбен байланысатын SDS молекулаларының саны шамамен ақуыздың молекулалық массасына пропорционалды (шамамен 1,4 г SDS/г ақуыз) [43]. Ақуыздардың әр түрі эквивалентті зарядқа ие және сол күшпен гель арқылы өтеді [43]. Сонымен қатар, PAGE ақуыздардың денатурациясын азайта алады. Көптеген ақуыздар PAGE жұмыс істегеннен кейін де өзінің биологиялық белсенділігін сақтайды [7]. Алайда, үлкен ақуыздар кіші ақуыздарға қарағанда жоғары дәрежеде ұсталады, себебі полиакриламид өте жоғары байланысқан [43]. Демек, белоктар SDS-PAGE арқылы олардың молекулалық массасына қарай бөлінеді. SDS-PAGE белоктар қоспасының молекулалық массасын жолақтардың орналасуын белгілі мөлшердегі ақуыздар шығаратындармен салыстыру арқылы анықтауға болады [43]. Электрофорезде қолданылатын SDS жеке полипептидтік тізбектердің ұзындығына сәйкес ақуыздар қоспасын шешеді [7].

Екі өлшемді гельдік электрофорез деп аталатын әдісті 1975 жылы Патрик О’Фаррел әзірледі. Ол екі түрлі әдіс – изоэлектрлік фокустау және SDS-PAGE [43] арқылы белоктардың күрделі қоспаларын фракциялау үшін қолданылады. Біріншіден, белоктар түтік тәрізді гельдегі изоэлектрлік нүктесіне сәйкес бөлінеді. Осы бөлуден кейін гель жойылады және SDS қаныққан полиакриламид тақтасының үстіне қойылады. Ақуыздар плиталық гельге ауысады және олардың молекулалық массасына сәйкес бөлінеді [43]. Екі өлшемді гельдік электрофорез әр түрлі жағдайда, дамудың әр түрлі кезеңдерінде немесе жасушалық циклде немесе әр түрлі организмдерде болатын белоктардың өзгеруін анықтау үшін қолайлы [43].

3.2.5. Оңтүстік-батыс блоттинг (иммуноблотинг)

Southwestern blotting - бұл ДНҚ-байланыстырушы белоктарды спецификалық олигонуклеотидтік зондтармен байланысу қабілеті бойынша оқшаулау, анықтау және сипаттау үшін қолданылатын әдіс [44, 45]. Жасушадағы көптеген ДНҚ байланыстыратын ақуыздарды жеке бөліп алу және гендік функцияны анықтау үшін сипаттау қажет [44]. Бұл әдіске үш қадам кіреді. Біріншіден, ядролық ақуыз сығындылары SDS-PAGE электрофорезімен бөлінеді. Содан кейін бөлінген белоктар нитроцеллюлоза сүзгісіне, поливинилиден дифторидіне (ПВДФ) немесе катионды нейлон мембранасына беріледі [12]. Содан кейін сүзгі адсорбцияланған ақуыздарды талдау үшін олигонуклеотидті зондтармен инкубацияланады [44, 45]. Алайда, бұл әдіс үлкен мөлшердегі ядролық ақуыздар қажет (әдетте 50-100 мг), оқшаулау кезінде ақуыздың ыдырауы, ақуыздардың молекулалық өлшемдерінің кең диапазонының тиімді электрофоретикалық бөлінуіне және ауысуына қол жеткізуде қиындықтарға тап болады. .

3.3. Барлығы бір биомолекулаларды алу

Жалпы алғанда, нарықта қолжетімді экстракция немесе тазарту әдістері немесе жинақтары мақсатты организмнен ДНҚ немесе РНҚ немесе ақуыздың бір түрін нуклеин қышқылын ғана алуға мүмкіндік береді. Жасушалық материал шектелген кезде ДНҚ, РНҚ және ақуызды бір көзден алу керек.

Хомчински мен Сакчидің (1987) бір сатылы оқшаулау әдісінің вариациясы, гуанидиний тицианат гомогенаты төмендетілген рН кезінде фенол: хлороформмен экстракцияланады, ДНҚ, РНҚ және тіндерден немесе жасушалардан ақуызды дайындауға мүмкіндік береді. Бұл әдіс бір фазалы ерітіндідегі гуанидин-изотиоцианат пен фенолмен жасушалардың лизисін қамтиды. Екінші фаза хлороформ қосылғаннан кейін пайда болады, онда ДНҚ мен белоктар алынады, РНҚ су үсті қабатында қалады. ДНҚ мен ақуыздарды этанолмен немесе изопропанолмен тұндыру арқылы органикалық фазадан бөліп алуға болады, ал изопропанолмен сулы фазадан РНҚ тұндырады [15].

Қазіргі уақытта нарықта бірнеше барлығы бір-бір экстракциялық жинақтар енгізілді. Мысалы, фенол немесе хлороформ және алкоголь тұнбасы сияқты улы заттарды қолданбай, бір биологиялық үлгідегі геномдық ДНҚ, жалпы РНҚ және жалпы ақуызды бір уақытта тазартуға арналған бағанға негізделген экстракциялық жинақ [46]. Ол аз мөлшерде өсірілетін жасушалар мен жануарлар мен адамдардан алынған тіндердің аз мөлшерімен үйлесімді. ДНҚ, РНҚ және ақуыз тазартылғанға дейін мақсатты үлгіні 3 бөлікке бөлудің қажеті жоқ [46].

Нарықта бар ерітіндіге негізделген 3-і-1 экстракциялық жинақ-кез келген түрдегі және мөлшердегі әр түрлі ағзалардан ДНҚ, РНҚ мен ақуызды шығарып тазартуға болатын органикалық емес ерітінділер жинағының тағы бір мысалы [47]. Оның шамамен 15-30 минутты алатын үш қарапайым қадам хаттамасы әртүрлі биомолекулаларды алудың жылдам және оңай әдісін қамтамасыз етеді. Сондықтан жоғары өнімділікті күтуге болады, себебі аз қадам аз шығынға әкеледі [47].

3.4. Шығарудың автоматтандырылған жүйесі

Үлгілерді жоғары өткізу қабілеттілігіне арналған үлкен, қымбат және күрделі құралдар автоматтандырылған экстракция жүйесі нуклеин қышқылдарын бөлуді жеңілдетуге көмектесті [48]. Бұл жүйе соңғы жылдары кеңейген орта және үлкен зертханаларға арналған [49]. Нуклеин қышқылын алу процесін автоматтандыру жұмыс уақытын қысқарту, еңбек шығындарын азайту, жұмысшылардың қауіпсіздігін жоғарылату сияқты бірқатар себептер бойынша потенциалды тиімді болып табылады және оның ішінде нәтижелердің қайталануы мен сапасын арттыруға мүмкіндік береді [50]. Сонымен қатар, бұл зертханалық тиімділікті арттырудың шешуші шешімі [48].

Клиникалық зертханаларда ДНҚ, РНҚ және ақуыз сияқты жоғары сапалы биомолекулаларды тазарту төмендегі тестілеуде қолданылады. Тазартылған үлгілерді жеткілікті сапа мен тазалықта алу өте маңызды [48]. Сондықтан автоматтандырылған экстракциялар неғұрлым дәйекті және қайталанатын болуы керек. Бүкіл экстракция процесінің жылдамдығы, дәлдігі мен сенімділігі максималды болуы керек және сонымен қатар көлденең ластану қаупін барынша азайтады [49]. Сапаны жоғалтпастан үлгі дайындау тиімділігін арттыру үшін шешім енгізу қажет. Кросс-ластану мүмкіндігін азайту керек және жүйелер штрих-кодпен сынаманы бақылауға қолайлы [51].

Нарықта бар өндіру жүйесі жоғарыда көрсетілген талаптарға сәйкес келді. Ол жоғары сапалы автоматтандырылған ДНҚ тазартумен қатар сынақ зертханаларына сынаманы тез және сенімді өңдеуді ұсынады [52]. Бұл үлгіні өңдейтін парамагнит-бөлшектермен жұмыс істейтін жүйе, олар өнімділікті және тазалықты қамтамасыз етеді, себебі үлгілер арасында анықталатын айқаспалы ластану жоқ. Бүкіл экстракция процесі басынан аяғына дейін шамамен 20 минутты алады, себебі тек үш қарапайым қадам қажет: реагент картриджіне реагент картридждерін қою үшін сұйықтық үлгілерін қосыңыз, старт түймесін басыңыз. ДНҚ процестің соңында элюция буферіне элюцияланады [52].

Нуклеин қышқылдары мен ақуыздарды алу үшін икемді және тиімді автоматтандырылған жүйенің тағы бір мысалы енгізілді [53]. Үлгілердің шағын және орташа өткізу қабілеттілігіне арналған бұл жүйенің көмегімен әр түрлі бастапқы материалдарды өңдеуге болады. Ол оқшауланған нуклеин қышқылын адсорбциялау үшін беттік-функционалды парамагнитті бөлшектерді қолданды [53]. Бұл жүйенің икемділігі нуклеин қышқылын бір мезгілде он екі үлгіге дейін алуға мүмкіндік береді. Экстракция процесі қолданбаға байланысты шамамен 20-дан 40 минутқа дейін қажет. Бұл жүйе үшін оңтайландырылған жиынтықтар геномдық ДНҚ, жасушалық РНҚ, вирустық немесе бактериялық нуклеин қышқылдарын шығара алады [53].

4. Болашақтың мүмкін болатын бағыты

Биомолекулаларды экстракциялау келесі талдау немесе манипуляция процесі үшін орындалуы керек бірінші қадам болып табылады. Сұйықтықты өңдеуге қойылатын талап - ең күрделі аспект. Сондықтан кез келген автоматты жүйеде әрбір экстракция сатысы үшін автоматты жабдықты ғана емес, сонымен қатар машиналар арасында сұйықтықты беруді автоматтандыруға арналған жабдықты қамтуы керек. Автоматтандыру өткізу қабілеттілігін арттыруға және процестің сенімділігін арттыруға көмектесті, бірақ бұл жүйелер әлі де тек зертханалық ортада пайдалануға арналған. Нарықта бар кейбір нуклеин қышқылы экстракция жүйесі үлкен және техникалық тәжірибесі бар зертхана қызметкерлері қолмен алдын ала өңдеу кезеңдерін қажет етеді [54]. Сондықтан нуклеин қышқылын өндіруге арналған роботты жұмыс станциялары толық автоматтандырылған процесті білдіретін шынайы «кететін» автоматтандыруды орындауы тиіс [49]. Толық автоматтандырылған экстракция жүйесі бар биомолекулаларды алу әдісі мен әдісінің бірігуі болашақта перспективалық өнертабыс бола алады. ДНҚ -ны, РНҚ -ны немесе ақуызды әр түрлі организмдерден тазартуды бір ғана экстракция әдісімен экстракция жүйесінің осы түрін қолдана отырып жүргізуге болады.

Жануарлардан, өсімдіктерден немесе тіпті клиникалық сынамадан алынған мақсатты биомолекулалардың сынамасын алу және талдау үшін зертханаға жіберу жиі қолайсыз [54]. Үлгілерді, әсіресе қан сияқты клиникалық үлгіні тоңазытқышта сақтау және алу және талдау үшін жақын жердегі зертханаға беру қажет. Демек, еңбекті азайту, қалдықтарды азайту және экстракция процесінің жылдамдығын арттыру сияқты бірнеше артықшылықтар әкелетін портативті биомолекулаларды алу жүйесі болашақта әлеуетті даму болуы мүмкін [54]. Портативті экстракция жүйесінің ДНҚ, РНҚ немесе ақуыз анализаторымен үйлесімі болашақта зерттеушілерге жұмыс уақытын қысқартуға және жұмыс тиімділігін арттыруға көмектесу үшін құрылуы мүмкін.

Миниатюризацияны жалғастыру зертханадағы роботты автоматтандырудың болашақ тенденциясы болады [28]. Көптеген клиникалық зертханалар жұмыс процесінің талдауын жүргізеді және өткізу қабілеті төмен кіші жүйелердің клиникалық зертханалық жүктемеге сәйкес келетінін анықтайды. Сонымен қатар, бұл автоматтандыру жүйесін салыстырмалы түрде төмен шығынмен енгізуге болады, бұл жөндеу мерзімін жақсартады, сонымен қатар еңбек шығындарын азайтады [55].

5. Қорытынды

Бірінші ДНҚ оқшаулауын 1869 жылы Фридрих Мишер сәтті жүргізгендіктен және 1958 жылы Месельсон мен Сталдың тығыздық градиенті центрифугалау стратегияларынан ДНҚ-ның бастапқы экстракциясы жасалғандықтан, биомолекулаларды тазартудың көптеген әдістері әзірленді. Гуанидиний тиоцианат-фенол-хлороформды экстракциядан ДНҚ және РНҚ экстракциясында кеңінен қолданылатын бағандық технологияға және хроматографиялық тазарту әдісіне ақуыздарды алу үшін қолданылатын иммуноблоттауға дейін, биомолекулаларды экстракциялау зерттеушілер мен ғалымдарға кейінгі молекулалық биология талдауын ретімен басқаруға көмектесті. жердің биологиялық материалдарын жақсы түсіну.

Автоматтандырылған нуклеин қышқылын шығару жүйесі қазіргі кезде автоматтандыру технологиясының жылдам өсуінің әсерінен құрылды. Нуклеин қышқылын алу процесін автоматтандыру жұмыс уақытын қысқарту, еңбек шығындарын азайту, жұмысшылардың қауіпсіздігін арттыру және сонымен бірге нәтижелердің қайталануы мен сапасын арттыру мүмкіндігін қоса алғанда, бірқатар себептер бойынша пайдалы. Дегенмен, кейбір құралдардың әлсіз жақтарын үнемі жетілдіру қажет. Бұл уақытта биомолекулаларды жинау жүйесі немесе миниатюралық және портативті экстракция жүйесін ойлап табу болашақта перспективалық дамуға айналуы мүмкін.

Әдебиеттер

  1. М.Винк, Молекулалық биотехнологияға кіріспе: молекулалық негіздер, әдістер мен қазіргі биотехнологияда қолдану, Wiley-VCH, Weinheim, Германия, 2006 ж.
  2. К.Дойл, Ашылу көзі: хаттамалар мен қосымшалар бойынша нұсқаулық, PROMEGA, Мэдисон, Вис, АҚШ, 1996 ж.
  3. Л.Букингем және М.Л. Кемшіліктер, Молекулярлық диагностика: негіздері, әдістері, & клиникалық қолдану, Ф.А.Дэвис, Филадельфия, Па, АҚШ, 2007 ж.
  4. L. J. Ceke, P. B. Kaufman, G. K. Podila және C.-J. Цай, Биология мен медицинадағы молекулалық және жасушалық әдістердің анықтамалығы, CRC Press, Boca Raton, Фла, АҚШ, 2 -ші басылым, 2004 ж.
  5. Г. Брукс, Денсаулық сақтаудағы биотехнология: биофармацевтикаға кіріспе, Фармацевтикалық пресс, Лондон, Ұлыбритания, 1998 ж.
  6. К.Кодзима мен С.Озава, «Нуклеин қышқылдарын бөліп алу және тазарту әдісі», Америка Құрама Штаттарының патенті АҚШ 2002/0192667 A1, желтоқсан 2002. Қараңыз: Google Scholar
  7. Дж.Д.Уотсон, Т.А.Бейкер, С.П.Белл, А.Ганн, М.Лесин және Р.Лосик, Геннің молекулалық биологиясы, Бенджамин Каммингс, Сан -Франциско, Калифорния, АҚШ, 5 -ші басылым, 2004 ж.
  8. Р.Дам, Фридрих Мишер және ДНҚ ашылуы, Elsevier, Амстердам, Нидерланды, 2004 ж.
  9. Д.Уитфорд, Ақуыздар: құрылысы мен қызметі, Джон Уайли & Sons, Лондон, Ұлыбритания, 2005 ж.
  10. J. T. Edsall, «Эдвин Джозеф Кон (1892 �)», Өмірбаяндық естеліктер, том 35, 47–83 беттер, Ұлттық ғылым академиясы, Вашингтон, АҚШ, 1961. Қарау: Google Scholar
  11. С.В.Смарасон және А.В.Смит, «Нуклеин қышқылдарын тұзсыздандыру әдісі», АҚШ 2003/0186247 A1 АҚШ патенті, deCODE генетикасы ehf., қазан 2003 ж.Қарау: Google Scholar
  12. Дж.Сэмбрук пен Д.Рассел, Молекулалық клондау: зертханалық нұсқаулық, том 3, Cold Spring Harbor зертханалық баспасы, Нью -Йорк, Нью -Йорк, АҚШ, 3 -ші басылым, 2001 ж.
  13. П.Чомчинский мен Н.Сакчи, «Гуанидиний тиоцианаты-фенол-хлороформ қышқылы арқылы РНҚ оқшаулаудың бір сатылы әдісі: жиырма жылдан кейін» Табиғат хаттамалары, том 1, жоқ. 2, 581–585 беттер, 2006. Қарау: Баспагерлер сайты | Google ғалымы
  14. H. C. Birnboim және J. Doly, «рекомбинантты плазмидті ДНҚ скринингі үшін сілтілік экстракцияның жылдам процедурасы» Нуклеин қышқылдарын зерттеу, том 7, жоқ. 6, 1513–1523 бб., 1979. Қараңыз: Google Scholar
  15. Дж.Сембрук пен Д.Рассел, Молекулалық клондау: зертханалық нұсқаулық, том 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Нью-Йорк, NY, АҚШ, 3-ші басылым, 2001 ж.
  16. Қ.-Х. Эссер, В.Х.Маркс және Т.Лисовский, «Нуклеин қышқылынсыз матрица: ДНҚ байланыстырушы бағандардың регенерациясы» Биотехника, том 39, жоқ. 2, 270–271 беттер, 2005. Қарау: Publisher сайты | Google ғалымы
  17. Д.Т.Гжерсе, Л.Хоанг және Д.Хорнби, РНҚ тазарту және талдау: үлгі дайындау, экстракция, хроматография, Wiley-VCH, Weinheim, Германия, 1-ші басылым, 2009 ж.
  18. CE Smith, DL Holmes, DJ Simpson, J. Kayzhendler, RH Bitner және JC Groseh, «Аралас төсектік қатты фаза және оны нуклеин қышқылдарын оқшаулауда қолдану», United States patent US 2002/0001812 A1, Promega Corporation, қаңтар 2002. Қарау: Google Scholar
  19. V. V. Padhye, C. York және A. Burkiewiez, «Кремнезель мен шыны қоспасындағы нуклеин қышқылын тазарту», ​​Америка Құрама Штаттары патенті US 5658548, Promega Corporation, тамыз 1997 ж. Қараңыз: Google Scholar
  20. D. L. Woodard, A. J. Howard және J. A. Down, «ДНҚ -ны гидратталған кремнеземнен тазарту процесі», Америка Құрама Штаттарының патенті US 5342931, Бектон, Дикинсон және Компания, тамыз, 1994. Қарау: Google Scholar
  21. Қ.-Х. Эссер, В.Х.Маркс және Т.Лисовский, «MaxXbond: ДНҚ байланыстыратын кремнезем матрицаларының алғашқы регенерациялық жүйесі» Табиғат әдістері, том 3, жоқ. 1, 1-2 беттер, 2006. Қарау: Жариялаушы сайты | Google ғалымы
  22. Биология кафедрасы, Дэвидсон колледжі, «Geneclean ®», http://www.bio.davidson.edu/courses/Molbio/MolStudents/spring99/lauren/geneclean.html. Қарау: Google Scholar
  23. Т.Э.Арнольд, М.Т.Мейеринг және Р.С.Честерсон, «Нуклеин қышқылын байланыстыратын матрица», Америка Құрама Штаттары патенті US 6869532 B2, CUNO Incorporated, наурыз 2005. Қарау: Google Scholar
  24. D. A. Dederich, G. Okwuonu, T. Garner et al., «Сүтқоректілер геномының жоғары өткізу қабілеттілігі үшін ДНҚ плазмидалық үлгісін шыны моншақтан тазарту», Нуклеин қышқылдарын зерттеу, том 30, жоқ. 7, e32 мақаласы, 2002. Қарау: Google Scholar
  25. M. C. Little, «ДНҚ-ны диатомды жердегі тазарту процесі», Америка Құрама Штаттарының патенті US 5075430, Bio-Rad Laboratories Inc., желтоқсан 1991. Көру: Google Scholar
  26. С.Беренсмайер, «Нуклеин қышқылдарын бөлуге және тазартуға арналған магниттік бөлшектер» Қолданбалы микробиология және биотехнология, том 73, жоқ. 3, 495–504 беттер, 2006. Көру: Publisher сайты | Google ғалымы
  27. R. D. Nargessi, «Нуклеин қышқылдарының магниттік оқшаулануы және тазартылуы», Америка Құрама Штаттары патенті US 6855499 B1, Cortex Biochem, Inc., ақпан 2005. Қарау: Google Scholar
  28. Био-Нобиль ойы, QuickPick TM плазмидті ДНҚ, Bio-Nobile Oy, Турку, Финланд, 2003.
  29. QIAGEN Inc., QАсифония ® ДНҚ анықтамалығы, QIAGEN, Аламеда, Калифорния, АҚШ, 2008 ж.
  30. Қолданылатын биожүйелер, MagMAX TM толық нуклеин қышқылын оқшаулау жинағы, Қолданбалы биожүйелер, Фостер -Сити, Калифорния, АҚШ, 2008 ж.
  31. Бекман Култер, Инк., Агенткорт ® AMPure ® Жүйе: ПТР тазарту жүйесі, Бекман Култер, Часка, Минн, АҚШ, 2009 ж.
  32. BIOMOL GmbH, ArrayGrade mRNA тазарту жиынтығы пайдаланушы нұсқаулығы, BIOMOL GmbH, Гамбург, Германия, 2004 ж.
  33. Thermo Scientific Inc. Пирс күшті ион алмасу бағандарын айналдыру, Thermo Scientific, Нью -Гэмпшир, NH, АҚШ, 2007 ж.
  34. QIAGEN Inc., QIAGEN геномдық ДНҚ анықтамалығы, QIAGEN, Валенсия, Калифорния, АҚШ, 2001 ж.
  35. D. B. Selingson және E. J. Shrawder, «Нуклеин қышқылдарын биологиялық үлгілерден бөліп алу және тазарту әдісі», United States патенті US 4935342, Syngene Inc., маусым 1990. Қарау: Google Scholar
  36. QIAGEN Inc. Qproteome TM сүтқоректілердің ақуыздарын дайындау жөніндегі нұсқаулық, QIAGEN, Валенсия, Калифорния, АҚШ, 2006 ж.
  37. Р.Ж.Фидо, Е.Н.Миллс, Н.М.Ригби және П.Р.Шеври, «Өсімдік ұлпаларынан ақуызды алу» Молекулалық биологиядағы әдістер, том 244, 21-27 бб., 2004. Қарау: Google Scholar
  38. С.М. Уилрайт, Протеинді тазарту: төменгі ағынды өңдеуді жобалау және масштабтау, Карл Хансер, Нью-Йорк, Нью-Йорк, АҚШ, 1991 ж.
  39. Генді зерттеу зертханасы, Гель фильтрациялық буфер жинағы, Генді зерттеу зертханасы, Тайпей, Тайвань, 2007 ж.
  40. Бангалор Джини, GeNei TM гельді фильтрациялау хроматографиясын оқытуға арналған нұсқаулық, Бангалор Геней, Бангалор, Үндістан, 2007 ж.
  41. Amersham биологиялық ғылымдары, Аффиниттік хроматографияның принциптері мен әдістері, Amersham Bioscience, Уппсала, Швеция, 2002 ж.
  42. Thermo Scientific Inc., Бисерден жасалған аффинді шайырды бағандарға салыңыз, Thermo Scientific, Нью -Гэмпшир, NH, АҚШ, 2008 ж.
  43. Г.Карп, Жасуша және молекулалық биология: түсініктер мен жабдықтар, John Wiley & Sons, Лондон, Ұлыбритания, 5 -ші басылым, 2008 ж.
  44. Б.Боуэн, Дж.Штайнберг, У.К.Лаэммли және Х.Вайнтрауб, «ДНҚ-ны байланыстыратын ақуыздарды ақуызды жою арқылы анықтау», Нуклеин қышқылдарын зерттеу, том 8, жоқ. 1, 1–20 беттер, 1980. Қарау: Google Scholar
  45. Дж.С.Хенден және Х.Ф.Розенберг, «Оңтүстік-батыс бояудың жетілдірілген әдісі», Биологиядағы шекаралар, том 2, 9–11 беттер, 1997. Қарау: Google Scholar
  46. QIAGEN Inc., AllPrep ® ДНҚ/РНҚ/протеинді шағын нұсқаулық, QIAGEN, Валенсия, Калифорния, АҚШ, 2007 ж.
  47. «DeRiPRO, ДНҚ, РНҚ және ақуыздарды алу технологиясы», PCT/MY2008/000059, http://terra-ju.com/TLS.htm. Қарау: Google Scholar
  48. Promega корпорациясы, Клиникалық зертханадағы жұмыс процесін оңтайландыруға арналған жеке автоматтандыру TM [брошюра], Промега, Сан Луис Обиспо, Калифорния, АҚШ, 2008 ж.
  49. Дж.Лоэффлер, К.Д.Шмидт, Х.Хебарт және Х.Эйнселе, «Автоматтандырылған нуклеин қышқылын алу» Геномика және протеомика энциклопедиясы, 93–96 беттер, 2004. Көру: Google Scholar
  50. Дж.Бойд, «Роботтық зертханалық автоматика», Ғылым, том 295, жоқ. 5554, 517–518 бб., 2002. Қараңыз: Google Scholar
  51. Г. Уоткинс, «ДНҚ -ның автоматтандырылған экстракциясы», http://www.ngrl.org.uk/Wessex/extraction.htm. Көру: Google Scholar
  52. Promega корпорациясы, Максвелл ® 16: Promega ұсынған Personal Automation TM, Промега, Сан -Луис Обиспо, Калифорния, АҚШ, 2006 ж.
  53. Analytik Jena AG, InnuPure C12 экстракциялық жүйесі, Analytik Jena AG, Йена, Германия, 2007 ж.
  54. Д.Садарангани, Б.Макдональд, А.Г.Родриго және Д.Сауль, «портативті роботтық құралдың көмегімен ДНҚ талдауы», http://www.ele.auckland.ac.nz/~macdon/general/files/acra03- dsbmards.pdf. Көру: Google Scholar
  55. А. Томсин, «Зертханалық автоматтандырудың болашағына түсініктер», IVD технологиясы, қаңтар 2007. Көру: Google Scholar

Авторлық құқық

Авторлық құқық © 2009 Сиун Чи Тан және Биу Чин Иап. Бұл Creative Commons Attribution License бойынша таратылатын ашық қол жетімді мақала, ол түпнұсқа жұмыс дұрыс сілтеме жасалған жағдайда кез келген ортада шектеусіз пайдалануға, таратуға және көбейтуге рұқсат береді.