Ақпарат

4.3: Зертханалық процедуралар - Бактериялық жағынды, қарапайым және граммен бояу - Биология

4.3: Зертханалық процедуралар - Бактериялық жағынды, қарапайым және граммен бояу - Биология


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Оқыту нәтижелері

  • Микроорганизмдерді микроскопиялық бақылауға дайындау.
  • Бактериялар мен басқа бір жасушалы микроорганизмдер арасындағы өлшемдік айырмашылықты байқаңыз.
  • Қарапайым бояуды және Грам бояуын орындаңыз.
  • Боялған микроорганизмдерді бақылаңыз және олардың мөлшерін, пішінін және бояу қасиеттерін анықтаңыз.

I бөлім: Бактериялық жағынды дайындау

Осы семестрде сіз екі бояу процедурасын орындайсыз: Қарапайым бояу және Грам бояуы. Бұл бояу процедураларының екеуі де бактериялық жағынды дайындаудан басталады.

Материалдар

  • Микроскоптың слайдтарын тазалаңыз
  • Бояу табақшалары мен газеттер
  • Су бөтелкесі (шаюға арналған)
  • Бактериялық культуралар: Ішек таяқшасы, Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Pseudomonas aeruginosa,

Бактериялық жағынды қалай жасауға болады

1. Қызыл балауыз маркерін пайдаланып таза шыны слайдты белгілеңіз. Бактерия үлгісін қойған шыны сырғытпаның жағын тану маңызды екенін ескеріңіз.

2. a қосыңыз кішкентай слайдқа физиологиялық ерітінді тамызыңыз (әдетте сіз микроскоптың бір слайдына екі бактерия саласыз - нұсқаушының арнайы нұсқауларын орындаңыз). Мұны инокуляция ілмегіне бір тамшы тұзды салып, содан кейін оны слайдқа жіберу арқылы жасауға болады. Егер сіз физиологиялық ерітінді тамызғышты тікелей слайдқа қолдансаңыз, толық тамшысын жібермеңіз.

3. Егу циклімен немесе инемен бактериялардың аз мөлшерін алыңыз. Оны тұзды ерітіндімен жақсылап араластырыңыз және қоспаны слайдтың кең аймағына таратыңыз.

  • Екі жағынды бір-біріне тиіп кетпеу үшін абай болыңыз.

4. Слайдтағы бактериялық үлгіні ауада кептіріңіз (жылытқышты да қолдануға болады).

5. Слайдтар толығымен ауада кепкен кезде, слайдты жалынның үстінен екі рет баяу өткізу арқылы бактерия үлгісін қыздырыңыз (мұны нұсқаушы көрсетеді).

  • Жылу бекіту жасушаларды өлтіреді және оларды слайдқа жабыстырады.
  • Егер олар жылумен дұрыс бекітілмесе, ұяшықтар слайдтардан шайылады.
  • Бұл процедурада слайдтарды қызып кетуден сақ болыңыз

Жылумен бекіту аяқталғаннан кейін слайдты қарапайым немесе грамм бояумен бояуға дайынсыз.

1-сурет: Бунсен оттығының үстіне жылумен бекіту

1 -бейнені қараңыз: жылыту қондырғысы арқылы

1-бейне көру: Доктор Г. Кайзер ұсынған бактерицидті қолдану арқылы жылуды бекіту туралы URL мекенжайы: https://youtu.be/Rh0GrcTzjnU

II бөлім: Қарапайым бояу

Мәдениеттер

Bacillus megaterium

Micrococcus luteus

Saccharomyces cerevisiae - ашытқы

Материалдар

Метилен көгінің бояу ерітіндісі бар тамшылатып құты

Брайтфилд жарық микроскопы

Майға батыру

линза қағазы

библиялық қағаз

Зертханалық процедуралар

A. Brightfield Light микроскоппен жұмыс істеуге арналған зертханалық процедураларды қарап шығыңыз

B. Бояу үшін бактериялық жағынды дайындау

Бояуға арналған бактериялардың препараттарын агар пластинасында өсуден немесе сорпа культурасынан жасауға болады.

1. Агарлы ортада өсірілген жасушалардан слайд дайындау үшін бірінші кезекте а КІШІ тамшы, ілмек жақсы жұмыс істейді, таза майсыз слайдқа су. Әрі қарай, стерильді ілмекпен тасымалдау а АЗ СОЛ су тамшысына дейін өсіп, ілгекті материал мүмкіндігінше біркелкі бөлінгенше айналдыра отырып, бұлыңғыр суспензия түзеді. Тамшыны а. үстіне таратыңыз кішкентай жеңіл көрінетін бұлыңғырлығы бар жұқа пленка жасау үшін слайдтың бір бөлігі.

2. Үш бөлек жағынды дайындаңыз, әрқайсысы бір Bacillus megaterium. Micrococcus luteus, және Saccharomyces cerevisiae.

3. Келесі, жылуды түзету слайдты жылытқышқа 5 минутқа қою арқылы. Үлгінің бетін жоғары қаратып қойып, слайдтың бір ұшына өзіңіздің бас әріптеріңізбен белгі қойыңыз. Бұл процесс деп аталады жылуды бекіту үлгіні слайдқа салыңыз. Оның мақсаты - бояу кезінде шайылып кетпес үшін үлгіні слайдқа байлау. Жылу бекіту арқылы жасушаларды өлтіру олардың бояу кезінде қолданылатын бояғыштарға өткізгіштігін де арттырады.

Үлгіні аз бекітпеңіз (жағынды жуылады) немесе қатты қыздырмаңыз (жасушалар жарылып немесе бұрмаланады). Слайд жанасу үшін жылы болуы керек, ыстық емес. Егер сіз слайдты тым қатты қыздырдым деп ойласаңыз, білу үшін слайдты қолыңызға тигізбеңіз. Мүмкін, сіздің күдігіңіз дұрыс және сіз ыстық стаканмен қолыңызды күйдіретін шығарсыз. Оның орнына слайдты келесі жолы қысқа мерзімге қыздырып бекітіңіз, содан кейін сынап көріңіз.

4. Салқындағаннан кейін үлгі қарапайым даққа дайын болады.


C. Метилен көк – қарапайым дақ

Тірі бактериялар дерлік түссіз және анық көріну үшін олар суспензияда тұрған сумен жеткілікті контрастты көрсетпейді. Бояудың мақсаты - организмдер мен фон арасындағы контрастты жоғарылату, сондықтан олар жарық микроскопында оңай көрінеді. Қарапайым бояуда бактериялық жағынды жасуша түрлерін немесе құрылымдарын ажыратпай, барлық жасушаларды бірдей түске бояйтын бір бояу ерітіндісімен боялады. Мұнда қолданылатын жалғыз бояғыш - метилен көк, негізгі дақ. Оң зарядқа ие негізгі дақтар бактериялық нуклеин қышқылдары мен жасуша қабырғалары сияқты теріс зарядталған жасуша компоненттерімен күшті байланысады.

1. Жағынды толығымен метилен көгімен жабу арқылы бояу. Бұл болуы керек
сырғытпа ұстағышы бар раковинаның үстінде орындалады.

*Киіміңізге, кітаптарыңызға және саусақтарыңызға дақ түсуін болдырмаңыз. Оны алып тастау өте қиын.

2. Дақтың 1-2 минут әрекет етуіне мүмкіндік беріңіз.

3. Дақтың ағып кетуі үшін сырғыманы еңкейтіңіз. Енді қалған бояуды а көмегімен шайыңыз жұмсақ краннан немесе жууға арналған бөтелкеден су ағыны.

4. Слайдты библиялық қағазбен құрғатыңыз. Слайдтан артық суды слайдтың бір бұрышын кептіру қағазына тигізу арқылы алып тастаңыз, слайдты таза қағаз парақтарының арасына тазартқышқа салыңыз. дақ құрғақ. Сенімді бол сүртпеңіз жағынды.

5. Алдымен 10X, содан кейін 100X майға батыру объектісін пайдаланып микроскоптың астында қараңыз.

6. Өз бақылауларыңызды есеп парақтарына жазыңыз.

D. Сынақ табақшасының изоляты

1. 1-зертханадағы «сынақ пластиналарын» тексеріңіз: I-жаттығу, D бөлімі (микроорганизмдердің барлық жерде болуы) оқшауланған дара колониялар сынақ тақтасының изолятына үміткер болуы үшін.

2. ІІ жаттығудың В бөлігінде сипатталғандай, сынақ пластинасының изолятын қарапайым бояуға тырысыңыз. Бақылауларыңызды жазыңыз.

3. Нұсқаушыға оқшауланған жалғыз сынақ пластинасының изоляциясын және сіз таңдаған үлгінің қарапайым дақтарының сырғымасын көрсетіңіз. Бұл саңырауқұлақ изолятының орнына бактериялық мәдениетпен жұмыс істеуді қамтамасыз ету үшін қажет.

4. Егер сіз «сынақ пластиналарында» бірде-бір колониялы бактерия изоляттарын алмасаңыз, зертханада басқа студенттен біреуін пайдаланыңыз, бірақ сол студент таңдағаннан басқа изолят таңдағаныңызға көз жеткізіңіз немесе нұсқаушы пластиналарынан біреуін пайдаланыңыз.

5. Сынақ пластинасының изоляциясына үміткерді таңдағаннан кейін оның таза дақыл екеніне көз жеткізу керек. I Жаттығудың C бөлігіндегі («Т» жолағы) әдісті пайдаланып, жалғыз колониялар үшін қайта жолақ жасау үшін жаңа Nutrient агар тақтасын пайдаланыңыз. Көріп, түртіп жатқаныңызға көз жеткізіңіз тек қана бір колония, сіз белгісіз ретінде пайдаланғыңыз келетін колония. Түпнұсқа табақты сақтаңыз. Келесі зертханалық кезеңге дейін инкубациялаңыз.

E. Демонстрациялық слайд

Сіз слайдтарды дайындадыңыз Бациллус (таяқша пішіні) және Микрококк (кокк). Біз бактерияларда байқалатын үшінші негізгі жасушалық пішінді көрсету үшін слайд орнаттық. Spirillum volutans Тұщы суда кездесетін спираль тәрізді микроорганизм. Демонстрациялық слайдты қараңыз және нәтижелер бетінде бақылауларыңызды жазыңыз.

Граммен бояу процедурасы

  • Граммен бояу процедурасының барлық қадамдары үшін слайдтың бактериялары бар аймақтарын жабу үшін жеткілікті ерітінді қосыңыз. Бүкіл слайдты сумен толтырудың қажеті жоқ.
  • Барлық бояуды бояу науасы үстінде жасау керек. Төгілген жағдайда газетті науаның астына қоюды ұмытпаңыз.
  • Бояу кезінде қолғап киіп, микроскоппен жұмыс жасамас бұрын алып тастау керек.
ҚАДАМДАР ТҮСІНДІРУ
1. Бірнеше тамшысын қосыңыз кристалды күлгін (бастапқы дақ) жағындыға жағып, 60 секундқа қалдырыңыз.
2. Слайдты сумен шайыңыз.Барлық жасушалар күлгін осы қадамнан кейін. Мұнда тоқтау а болар еді қарапайым дақ.
3. Бірнеше тамшы қосыңыз Грам йоды (мордант) жағып, 60 секундқа қалдырыңыз.Грам -йод кристалды күлгінден тұратын кешенді құрайды
4. Слайдты сумен шайыңыз.Барлық жасушалар күлгін осы қадамнан кейін.
5. Түссіздендіру бар 95% этанол: жағындыдан кристалдық күлгін түс шықпайынша (уақыт өзгереді — 5-10 секундтан аспайды) сырғытпаның үстіне спиртті ағызыңыз.Грам оң жасушалар кристалды күлгін ұстайды және қалады күлгін. Грам теріс жасушалар кристалды күлгін жоғалтады және қазір түссіз
6. Сумен шайыңыз.Сумен шаю түссіздену процесін тоқтатады
7. Бірнеше тамшысын қосыңыз сафранин (қарсы) және оны 60 секундқа қалдырыңыз.Сафранин - қызғылт/қызыл бояғыш
8. Сумен шайыңыз. Киелі кітапта құрғатыңыз. Бактерияларды сүртіп алмау үшін абай болыңыз.Грам оң жасушалар қалады күлгін; грам теріс жасушалар қазір қызғылт/қызыл
9. Слайдты микроскоппен бақылаңыз.Әр организм үшін морфологиясын, орналасуын және грамдық реакциясын анықтаңыз

Граммен бояу: принцип, процедура, интерпретация, мысалдар және анимация

Грам әдісімен бояу - бұл микробиологиядағы кең таралған, маңызды және ең көп қолданылатын дифференциалды бояу әдістері, оны дат бактериологы Ганс Кристиан Грам 1884 жылы енгізген. Бұл сынақ бактерияларды грам-оң және грам-теріс бактерияларға ажыратады, бұл бактерияларды жіктеуге және саралауға көмектеседі. микроорганизмдер

Граммен бояу принципі

Бактериялар бастапқы дақ Crystal Violet бояуымен боялған және мордантпен бекітілген кезде, кейбір бактериялар бастапқы дақты сақтай алады, ал кейбіреулері спиртпен түссізденеді. Грам оң бактериялардың жасуша қабырғаларында пептидогликан деп аталатын ақуыз-қант кешендерінің қалың қабаты болады және липидтердің мөлшері төмен. Жасушаның түссізденуі бұл қалың жасуша қабырғасының сусыздануына және кішірейіп кетуіне әкеледі, бұл жасуша қабырғасындағы тесіктерді жауып, дақтардың жасушадан шығуына жол бермейді. Сондықтан этанол грам оң бактериялардың пептидогликанының қалың қабатымен байланысқан және көк немесе күлгін түсті болып көрінетін кристалды күлгін-йод кешенін жоя алмайды.

Грам теріс бактериялар кезінде жасуша қабырғасы CV-йод кешенін де алады, бірақ пептидогликанның жұқа қабаты мен липидтерден тұратын қалың сыртқы қабаттың арқасында CV-йод кешені жуылады. Олар алкогольге ұшыраған кезде, түссіздендіргіш жасуша қабырғаларындағы липидтерді ерітеді, бұл кристалды күлгін-йод кешенінің жасушалардан шайылуына мүмкіндік береді. Содан кейін қайтадан сафранинмен боялған кезде олар дақты алып, қызыл түске боялады.

  • Кристал күлгін, негізгі дақ
  • Йод, мордант
  • Ацетон мен спирттен жасалған түссіздендіргіш (95%)
  • Сафранин, қарсы дақ

Граммен бояу процедурасы

  1. Таза, майсыз слайдты алыңыз.
  2. Суспензия жағындысын сынама толтырылған таза слайдқа дайындаңыз.
  3. Ауамен кептіріңіз және қыздырыңыз
  4. Crystal Violet құйып, шамамен 30 секундтан 1 минутқа дейін ұсталып, сумен шайыңыз.
  5. Грам ’с йодты 1 минутқа толтырып, сумен жуыңыз.
  6. Содан кейін 95% спиртпен немесе ацетонмен шамамен 10-20 секунд жуып, сумен шайыңыз.
  7. Сафранинді 1 минуттай қосып, сумен жуыңыз.
  8. Ауада құрғатыңыз, құрғатыңыз және микроскоп астында бақылаңыз.

Грам оң: Көк/Күлгін түс
Грам теріс: Қызыл түс

Грам оң бактериялар: Актиномицтер, бациллалар, клостридиялар, коринебактериялар, энтерококктар, гарднереллалар, лактобациллалар, листериялар, микоплазмалар, нокардиялар, стафилококктар, стрептококктар, стрептомицтер , т.б.
Грам-теріс бактериялар: Ішек таяқшасы (E. coli), Сальмонеллалар, Шигеллажәне басқа энтеробактериялар, Псевдомонас,Моракселла, Хеликобактер, Стенотрофомоналар, Бделловибриосірке қышқылының бактериялары, Легионелла т.б.


Граммен бояу принципі

Грам-оң және грам-теріс бактериялардың жасуша қабырғасының құрамындағы айырмашылықтар Грам бояуындағы айырмашылықтарды тудырады. Грам оң жасуша қабырғасының қалың қабаты бар пептидогликан түссізденуге қарсы тұратын көптеген тейхой қышқылының кросс-байланысы бар.

Су ерітінділерінде кристалды күлгін CV+ және Cl – иондарына диссоциацияланады, олар грам-оң және грам-теріс жасушалардың қабырғасы мен мембранасы арқылы енеді. CV+ бактериялық жасушалардың теріс зарядталған компоненттерімен әрекеттеседі, жасушаларды күлгін түске бояйды.

Қосқанда йод (I- немесе I3-) CV+-мен әрекеттесіп, цитоплазмада және жасушаның сыртқы қабаттарында үлкен кристалды күлгін-йод (CV-I) кешендерін түзеді.

  • Грам-теріс жасушаның сыртқы қабығы жасушадан жойылып, пептидогликан қабаты ашық қалады. Грам-теріс жасушаларда пептидогликанның жұқа қабаттары бар, грам-оң жасушалардың пептидогликанынан сәл өзгеше құрылымы бар тереңдігі бір-үш қабат. Этанолмен өңдеу кезінде грам-теріс жасуша қабырғалары ағып кетеді және үлкен CV-I кешендерін жасушадан жууға мүмкіндік береді.
  • Жоғары тоғысқан және көп қабаттыпептидогликан Грам-оң жасуша этанол қосу арқылы сусызданады. Пептидогликанмен бірге көпқабатты табиғаты сусыздандыру этанолмен өңдеуден жасуша ішіндегі үлкен CV-I кешендерін ұстайды.

Түссізденгеннен кейін грам-позитивті жасуша күлгін түсті болып қалады, ал грамтеріс ұяшық күлгін түсті жоғалтады және қарсы дақ, оң зарядты бояу кезінде ғана ашылады. сафранин, қосылады.


Грам оң жасуша қабырғасы:

Грам-позитивті бактериялардың қалың тор тәрізді жасуша қабырғасы бар, ол пептидогликаннан (жасуша қабырғасының 50-90%) тұрады, ол күлгін түске боялады. Пептидогликан негізінен N-ацетилглюкозамин және N-ацетилмурам қышқылы деп аталатын екі суббірліктен тұратын полисахарид болып табылады. Пептидогликанның іргелес қабаттары түзілгендіктен, олар транспептидаза ферментінің көмегімен пептидтердің қысқа тізбегі арқылы айқаса байланысады, нәтижесінде жасуша қабырғасының пішіні мен қаттылығы пайда болады. Грам-позитивті организмдердің қалың пептидогликан қабаты бұл организмдерге кристалды күлгін-йод кешенін сақтауға мүмкіндік береді және жасушаларды күлгін түске бояйды.

Липотеихой қышқылы (LTA)-пептидогликан қабатына енген грам-позитивті бактериялардың жасуша қабырғасының тағы бір негізгі құрамдас бөлігі. Ол гейцеридтер арқылы липидті қос қабатқа бекітілген рибитолфосфаттың ұзын тізбектері болып табылатын техой қышқылдарынан тұрады. Ол автолитикалық қабырға ферменттерінің реттеушісі ретінде әрекет етеді (мурамидазалар: жарақаттан немесе өлімнен кейін жасушаның ыдырауына әкелетін жасуша қабырғасында орналасқан бактериялық ферменттер).

Грам оң жасуша қабырғасының медициналық маңызы:

LTA сонымен қатар жасуша өлгеннен кейін жасуша қабырғасынан босатылған кезде арнайы иммундық жауаптарды ынталандыратын антигендік қасиеттерге ие. Жасушаның өлуі лизоцимальды белсенділікпен, лейкоциттердің катиондық пептидтерімен немесе бета-лактамды антибиотиктермен туындаған лизиске байланысты.


Процедура

Жағынды дайындау

  1. Стерильденген егу ілмегін пайдаланып, құрамында бактериялары бар сұйық суспензияның ілмегін слайдқа (майсыз таза микроскопиялық слайд) немесе оқшауланған колонияны культуралық пластинадан су тамшысы бар слайдқа тасымалдаңыз.
  2. Слайдтағы су тамшысына ілмектегі бактерияларды таратыңыз және тамшыны бір тиын көлеміндей аумаққа таратыңыз. Бұл жұқа, біркелкі жағынды болуы керек.
  3. Жағындыны жақсылап кептіруге рұқсат етіңіз.
  4. Слайдтың астыңғы жағын оттық жалынынан екі немесе үш рет өткізіп, жағындыны абайлап бекітіңіз. Ол слайдтағы ұяшықты бекітеді. Слайдты қатты қыздырмаңыз, себебі ол бактерия жасушаларын бұрмалайды.

Бояу

  1. Жағынды метилен көгімен жабыңыз және бояғыштың жағындыда шамамен бір минут қалуына мүмкіндік беріңіз (бұл жерде бояу уақыты 30 секундтан 2 минутқа дейін маңызды емес, егер сізге бояуды қалдырсаңыз, бояуды ұзақ қалдырсаңыз, дақ қоюырақ болады).
  2. Дистилденген сумен жууға арналған бөтелкені қолданып, слайдтың үстінен жұмсақ су ағынын жібере отырып, метилен көк түсінен ақырын шайыңыз.
  3. Слайдтың түбіне түскен дақты да жуыңыз.
  4. Жағындыны қайтадан қанықтырыңыз, бірақ бұл жолы йодпен. Йод дақты қояды
  5. Артық йодты ағынды сумен жуыңыз. Мұқият шайыңыз. (Кейбір оқулықтарда 4 және 5-қадам туралы айтылмауы мүмкін)
  6. Слайдтың артқы жағын сүртіңіз және боялған бетін бибулярлық қағазбен немесе қағаз сүлгімен сүртіңіз.
  7. Боялған жағынды микроскоптың жағынды жағын жоғары қаратып қойыңыз және жағындыға 10Х объективті қолданыңыз.
  8. Жағынды аймағын таңдаңыз, онда жасушалар моноқабатта жақсы таралады. Зерттелетін аймақты ортаға салыңыз, батырмалы майды тікелей жағындыға жағыңыз және жағынды 100X объективімен майдың астына қойыңыз.


Бейнені қараңыз: Окраска бактерий по Граму (Ақпан 2023).