Ақпарат

9.12С: РНҚ онкогенді вирустар - Биология

9.12С: РНҚ онкогенді вирустар - Биология


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Дүние жүзіндегі адам қатерлі ісік ауруларының шамамен 15% вирустармен байланысты болуы мүмкін.

үйрену мақсаттары

  • Онкогендік қасиеті бар вирустарды жіктеңіз

Негізгі нүктелер

  • ДНҚ және РНҚ вирустарының екеуі де адамдарда қатерлі ісік тудыруы мүмкін екендігі дәлелденді.
  • Адамның 1 типті Т-лимфотрофты вирусы және С гепатиті вирустары адамның қатерлі ісігіне ықпал ететін екі РНҚ вирусы болып табылады.
  • С гепатиті вирусы – бауыр жасушаларын жұқтыру арқылы адамдарда жедел және созылмалы гепатит тудыруы мүмкін қабықпен қапталған РНҚ вирусы. Дүние жүзі халқының 3%-ы тасымалдаушылар болып табылады. С гепатиті вирусымен созылмалы инфекция циррозға әкеледі, бұл өз кезегінде бауыр обырына әкелуі мүмкін.

Негізгі шарттар

  • онкогенді: Ісіктердің пайда болуына бейім.
  • гепатоцеллюлярлық: Бауыр жасушаларына қатысты немесе оларға қатысты

Қатерлі ісік вирустарының екі класы бар: ДНҚ және РНҚ вирустары. Адамдардағы қатерлі ісіктің кейбір түрлерімен бірнеше вирустар байланысқан. Бұл вирустардың көбею жолдары әртүрлі және бірнеше түрлі вирустар тұқымдастарын білдіреді. Атап айтқанда, РНҚ вирустарының генетикалық материалы ретінде РНҚ бар және бір тізбекті РНҚ (ssRNA) немесе қос тізбекті (dsRNA) болуы мүмкін. РНҚ вирустары Балтимор классификация жүйесі негізінде жіктеледі және олардың өмірлік циклінде ДНҚ аралық өнімдері бар вирустарды есепке алмайды. Генетикалық материалы үшін РНҚ бар, бірақ өмірлік циклінде ДНҚ аралық өнімдерін қамтитын вирустар «ретровирустар» деп аталады. «Әртүрлі қатерлі ісік түрлерімен байланысқан көптеген РНҚ онкогенді вирустар бар. Бұл әртүрлі онкогенді вирустарға мыналар жатады:

1. Адамның 1 типті Т-лимфотрофты вирусы (HTLV-I), ретровирус Т-жасушалық лейкозбен байланысқан. 2. Созылмалы инфекциясы бар адамдарда С гепатиті вирусы бауыр ісігімен байланысты.

2. Гепатит вирустары В гепатитін қамтиды және С гепатиті гепатоцеллюлярлық карциномамен байланысты.

3. Адам папилломавирустары (HPV) жатыр мойнының, анустың, жыныс мүшесінің, қынаптың/вульваның және бас пен мойынның кейбір ісіктерімен байланысты болды.

4. Капоши саркомасымен байланысты герпесвирус (HHV-8) Капоши саркомасымен және бастапқы эффузиялы лимфомамен байланысты.

5. Эпштейн-Барр вирусы (EBV) Буркитт лимфомасымен, Ходжкин лимфомасымен, трансплантациядан кейінгі лимфопролиферативті аурумен және мұрын-жұтқыншақ карциномасымен байланысты.

РНҚ ретровирустары

Ретровирустардың ДНҚ ісік вирустарынан айырмашылығы олардың геномы РНҚ болып табылады, бірақ олар геномы иесі геномына біріктірілген ДНҚ ісік вирустарына ұқсас. РНҚ жетілген вирус бөлшектерінің геномын құрайтындықтан, оны қабылдаушы жасуша хромосомасына біріктіру алдында ДНҚ-ға көшіру керек. Бұл өмір салты молекулалық биологияның орталық догмасына қайшы келеді, онда ДНҚ РНҚ-ға көшіріледі. Сыртқы конверт хост жасушасының плазмалық мембранасынан келеді. Қабық ақуыздары (беттік антигендер) env (конверт) генімен кодталады және гликозилденген. Бір негізгі ген өнімі жасалады, бірақ ол жетілген вируста бірнеше беттік гликопротеидтер болатындай етіп бөлінеді (бөліну Гольджи аппаратындағы қожайын ферменті арқылы жүзеге асырылады). Бастапқы ақуыз (бөлінуге дейін) эндоплазмалық ретикулумға бекітілген рибосомаларда жасалады және трансмембраналық (1 типті) ақуыз болып табылады. Мембрананың ішінде гаг генімен (топқа тән AntiGen) кодталған белоктары бар икосаэдрлік капсид бар. Гаг-кодталған ақуыздар геномдық РНҚ-ны да жабады. Тағы да бір негізгі ген өнімі бар. Бұл вирустық кодталған протеазамен (пол генінен) бөлінеді. Бір вирус бөлігінде 5′ қалпақшасы және 3′ поли А тізбегі бар екі геномдық РНҚ молекуласы бар. Осылайша, вирус диплоидты болып табылады. РНҚ плюс сезімді (мРНҚ сияқты сезім). Жетілген вирустың ішінде кері транскриптазаның шамамен 10 данасы бар, олар пол генімен кодталған. Пол гені бірнеше функцияларды кодтайды (қайтадан, gag және env сияқты, полипротеин жасалады, содан кейін кесіледі).


Онкогенді вирус гликолизді басу арқылы жасушаның өмір сүруіне және жасушаның өзгеруіне ықпал етеді

Аэробты гликолиз әртүрлі ісіктердің жылдам өсуін қолдау үшін өте маңызды. Дегенмен, оның стресс жағдайында рак клеткаларының өмір сүруіндегі рөлі анық емес. Біз бұған дейін егеуқұйрықтың бастапқы мезенхималық дің жасушаларының Капоши саркомамен байланысты герпес вирусының (KSHV) индукцияланған жасушалық трансформациясының гаммагерпесвирусының тиімді үлгісін хабарлаған болатынбыз. KSHV-трансформацияланған жасушалар Капоши саркомасының ісіктерін еске түсіретін патологиялық ерекшеліктері бар жалаңаш тышқандарда ісіктерді тиімді түрде индукциялайды. Мұнда біз KSHV қоректік стресс жағдайында аэробты гликолизді және тотығу фосфорлануын басу арқылы жасушалардың өмір сүруіне және жасушалық трансформацияға ықпал ететінін хабарлаймыз. Атап айтқанда, KSHV microRNAs және vFLIP глюкоза тасымалдаушыларын GLUT1 және GLUT3 төмендету үшін NF-κB жолын белсендіру арқылы гликолизді басады. Тасымалдаушылардың шамадан тыс экспрессиясы гликолитикалық белсенділікті құтқарса да, ол апоптозды индукциялайды және глюкоза тапшылығы жағдайында жұмсақтагарда колония түзудің тиімділігін төмендетеді. Механикалық түрде GLUT1 және GLUT3 AKT және NF-κB про-өмір сүру жолдарының конститутивтік белсендіруін тежейді. Бір қызығы, GLUT1 және GLUT3 адам KS ісіктеріндегі KSHV жұқтырған жасушаларда айтарлықтай төмендейді. Сонымен қатар, біз Burkitt's лимфома жасуша желісі BJAB салыстырғанда бірнеше KSHV жұқтырған бастапқы эффузия лимфомасының жасушалық желілерінде аэробты гликолиз деңгейінің төмендегенін анықтадық және BJAB жасушаларының KSHV инфекциясы аэробты гликолизді азайтты. Бұл нәтижелер онкогендік вирус ісік микроортасында стресске бейімделу үшін негізгі метаболикалық жолды реттейтін жаңа механизмді ашады және әсіресе стресс жағдайында рак клеткаларының көбеюі мен өмір сүруін қолдау үшін метаболикалық жолдарды дәл реттеудің маңыздылығын көрсетеді.


Люк Монтанье

Мен 1932 жылы 18 тамызда Луара алқабының оңтүстігінде Берриде орналасқан ауылдан үлкен, бірақ қаладан кіші Чабристе дүниеге келдім. Бұл уэльс қояны, ешкі ірімшігі және ақ спаржа сияқты белгілі өнімдері бар ауыл шаруашылығы аймағы болды және әлі де солай. Бұл менің анамның өскен жері еді, бірақ мен ол жерде ешқашан тұрмадым.

Менің әкем жағынан оның ата-анасы Францияның орталығындағы бай жазықтар мен ескі жанартаулардан тұратын Оверн провинциясынан келген, соңғысы менің фамилиямның бастауында болса керек: Монтанье, тауда тұратын адам.

Жас кезінде әкем қорқынышты ауруға шалдыққан: стрептококкты артрит, аорта қақпақшаларының қайтымсыз зақымдануымен аяқталды. Сондықтан ол әскери қызметке жарамсыз деп танылды және отырықшы жұмыс табуға мәжбүр болды: ол есепші болды және бұл мамандықта үздік болды, бұл сол кезде негізінен қолмен жұмыс істеуді білдіреді. Ол Пуатье аймағында жұмыс істей бастады, содан кейін Тур мен Пуатье арасындағы шағын қала Шателлероға солтүстікке қарай жылжыды.

Жалғыз бала кезімде мені үй шаруасындағы анам жақсы көретін, бірақ соғысқа дейінгі кезеңде екі оқиға басым болды, ол менің есімде жақсы сақталады:

Мен үлкен жолды кесіп өтіп бара жатқанда қатты жылдамдықпен келе жатқан көлік қатты жарақаттанды: менде бірнеше көрінетін жарақаттар бар. Екі күн комада жатып, 5 жасымда қайтадан туылғандай болып шықтым (1-сурет).

Сурет 1. Люк Монтанье 5 жаста.

… жəне екі жылдан кейін 1939 жылы соғыс жарияланды, ал бүкіл отбасы анамның ағасының жүзім алқабында жүзім жинап жатқанда’ Неміс ұшақтарының бомбалауынан кейінгі Варшава қирандылары туралы газеттегі суреттер әлі есімде.

Содан кейін, 1940 жылы «шынайы соғыс» келді: неміс шапқыншылығы, ата-анам және мен үйлерін тастап (қауіпті теміржол вокзалына жақын), жолдарда кішкентай көлікпен қашып, ақырында немістерге көбірек ұшырадық. осы “шығу” кезіндегі бомбалау, егер біз үйде қалғанымыздан гөрі.

Неміс оккупациясының бірінші жылы қорқынышты болды, өйткені бізде азық-түлік қоры болмады және біз көп жағдайда аштықтан өлдік. Мен өте жұқа бала едім, соғыстың төрт жылында бір грамм да алған жоқпын! “ersatz” шоколад пен апельсинді армандаған кезде тәбетімді аштырмады! Менің әкем созылмалы энтероколитпен ауырды, одан да жаманы, атам (оның әкесі) тік ішектің қатерлі ісігімен ауырды. Ол 1947 жылы ауыр азаптан кейін қайтыс болды және мен оған барған сайын аурудың тоқтаусыз асқынғанын көрдім. Бұл маған қатты әсер еткені соншалық, кейінірек медицинаны оқып, қатерлі ісік ауруын зерттеуді бастаудың бір себебі осы болса керек.

1944 жылы маусымда біздің үй (темір жолға жақын) жартылай қирап қалды - бұл жолы одақтастардың бомбалауынан. Мен Францияның азат етілген жылы туралы аралас сезімді сақтаймын. Бұл үлкен жеңілдік болды, бірақ мен көптеген өлген адамдардың, бейбіт тұрғындар мен сарбаздардың көрінісін және концлагерьлерден босатылған арық жер аударылғандардың суреттерін ұмыта алмадым. Мен өмірімнің соңына дейін соғыстар мен олардың зұлымдықтарын жек көремін.

Орта мектепте мен жақсы оқыдым, әдетте сыныптастарымнан алда болдым. Дәл осы кезде мен өзімнің діни католиктік сенімімді қалдырып, ғылыми білімге құмар болдым.

Бос уақытында электр батареясымен айналысқан әкемді үлгі тұтып, жаңа үйдің жертөлесіне химия зертханасын орналастырдым. Онда мен сутегі газын, хош иісті альдегидтерді және нитроқосылыстарды (нитроглицерин емес!) ынта-жігермен өндірдім, олар менің бетімнен үрлеу әдеті болды.

Мен танымал кітаптардан физиканың, әсіресе атомдық физиканың әсерлі жетістіктерін оқығаныма өте қуаныштымын. Физика мен химияда жақсы болғандықтан – бірақ математикада онша жақсы емес – мен “Grandes Ecoles” үшін бәсекеге түсуге дайындалмай, Пуатьедегі Медицина мектебіне және ғылым факультетіне тіркелуді шештім. Менің мақсатым адам биологиясы бойынша ғылыми-зерттеу саласын бастау болды, бірақ Пуатьеде медицинада да, ғылымда да мұндай мамандық болған жоқ. Факультет де, мектеп те жаяу қашықтықта болғандықтан, мен таңертең ауруханада, ал түстен кейін ғылымдар бойынша дәреже курсының негізгі пәндері болып табылатын ботаника, зоология және геология курстарына қатыса алатынмын.

Бақытымызға орай, жаңа ботаника профессоры Пьер Гаваудан өте типтік емес профессор болды, өйткені оның ғылыми қызығушылықтары өсімдіктер классификациясынан әлдеқайда асып түсті. Шындығында, мен оған жаңа биологияның, ДНҚ қос спиралының, жаңа биологияның бастамасы туралы үлкен терезе ашқаны үшін қарыздармын. in vitro рибосомалар арқылы белоктардың синтезі және вирустардың құрылысы.

Осы кезде мен әкемнің сыйлығының арқасында үйге уақыт түсіретін кинокамера мен микроскопты біріктіретін құрылғыны орнатумен айналыстым. Бұл менің алғашқы зерттеу жұмысымды жасауға мүмкіндік берді. Мен 1908 жылдан бері хлоропласттардың фототаксисі ретінде белгілі бір құбылысты зерттедім: тоғандардың бетінде тұратын кейбір балдырлардың үлкен бірегей хлоропласттарды жарық қарқындылығына қарай бағдарлау қасиеті, егер жарық тым қарқынды болса, хлоропласт түтікшенің ішіне айналады. оның жиегін көрсету үшін ұяшық. Қараңғы немесе әлсіз жарықта хлоропласт, жалпақ пластина, оның үлкен бетін ашады. Бұл құбылыс бірнеше минутқа созылды, оны уақытша кинематография арқылы талдауға болады. Әртүрлі шыны сүзгілерді қолдана отырып, мен хлоропластардың бағытын реттейтін хлорофилл (қызыл жарық) сіңіретін толқын ұзындығы емес, көк жарықты жұтатын кейбір сарғыш пигменттер жанама екенін көрсете алдым. Мен 21 жасымда бұл жұмысты Пуатье ғылымдар факультетінде шағын диссертация ретінде қорғағанымды мақтан тұттым. Менің тәлімгерім Пьер Гаваудан маған әдебиетке негізделген тақырып бойынша зерттеу жүргізуді сұрады: бактериялардың L-формалары. Бұл маған бактерияларды сүзу әлеміне соңғы емес, бірінші рет кіруге мүмкіндік берді. Мен осы даулы тақырып бойынша анықтамаларды Париждегі Пастер институтының кітапханасынан ғана таба алдым. Бұл шынымен де мен Пуатьеден Парижге кеткен уақыт болды, онда мен медициналық оқуымды аяқтадым, сонымен қатар адамдарға жақынырақ биологияның кейбір аспектілерін, атап айтқанда нейрофизиология, вирусология және онкологияны зерттей алдым.

23 жасымда Сорбоннаға ассистент болып жұмысқа қабылданғандықтан, мен Алексис Каррельдің балапан эмбрионының жүрек культуралары, сондай-ақ моноқабаттардағы адамның жасушалық линиялары бойынша жұмысынан алынған ескі үлгідегі технологияларды үйрене бастадым. Менің зерттеулерім мүлде нәтижелі болмаса да, мен осы кезеңнен бастап антибиотиктерді қолданбай тамаша стерильді жағдайларда жұмыс істеуге арналған пастерлік технологиялардың берік тәжірибесін сақтаймын.

1957 жылы Френкель-Конрат пен Гиерер мен Шраммның темекі мозаикалық вирусынан жұқпалы вирустық РНҚ-ның алғашқы сипаттамасы менің мамандығымды анықтады: молекулярлық биологияның заманауи тәсілін қолдана отырып, вирусолог болу.

Мен табан және ауыз вирусынан бастадым, содан кейін Лондонның жанындағы Каршалтондағы Кингсли Сандерс зертханасында мен алғаш рет тышқан энцефаломиокардиті вирусын жұқтырған жасушалардан жұқпалы екі тізбекті РНҚ анықтағанымды мақтанышпен қабылдадым. тізбекті РНҚ вирусы. Бұл РНҚ-ның негізді жұптастырылған комплементарлы тізбекті жасау арқылы ДНҚ сияқты репликациялай алатынын алғаш рет көрсетті.

Онкогенді вирустар туралы білімімді жетілдіру үшін мен Каршалтоннан Глазгоға көштім, онда жақында жаңа вирусология институты ашылды, оны тамаша вирусолог Майкл Стокер басқарды және мұнда көптеген жоғары лауазымды келушілер, соның ішінде Ренато Дулбекко да болды. демалыс жылдарын өткізу.

Кішкентай онкогенді ДНҚ вирусында, полиомамен жұмыс істей отырып, мен И.Макферсонмен бірге трансформацияланған жасушалардың жұмсақ агарда өсетін жаңа қасиетін көрсете алдым. Бұл әдісті қолдана отырып, полиома вирусының және оның ДНҚ-ның трансформациялау қабілетін анықтау оңай болды. Біз тек жалаңаш ДНҚ вирустың барлық онкогендік потенциалын алып жүретінін көрсеттік. Бұл қазір өте айқын көрінеді, бірақ ол кезде олай емес еді.

Кюри институтында Францияға оралғанда, мен бұл тұжырымды онкогендік РНҚ немесе ДНҚ вирустары арқылы өзгерген немесе өзгертілмеген бірқатар рак клеткаларына қатысты айттым. Дегенмен, бұл қасиет маған кейбірін ажыратуға мүмкіндік берді in vitro плазмалық мембрананың және оны қоршап тұрған көмірсу қабатының кейбір модификацияларымен байланысты болатын трансформация процесінің қадамдары.

Сол кезде үлкен құпия қалды: қазір ретровирустар деп аталатын онкогенді РНҚ вирустарының репликациясы. Говард Темин (2-сурет) ДНҚ аралық гипотезасын ұсынған болатын, бірақ басқа мүмкіндіктерді қарастыруға болады. Мен өзім балапан эмбрионының жасушаларын жұқтыруға және түрлендіруге қабілетті вирус, роус саркома вирусына тән қос тізбекті РНҚ табуға тырыстым. Мен шынымен де қос тізбекті РНҚ тізбегін оқшауладым, бірақ олар жасушалық шыққан және жұқтырмаған жасушаларда бірдей деңгейде болған! Луиза Харелмен бірге мен кейінірек бұл РНҚ ішінара ДНҚ-ның қайталанатын тізбегінен шыққанын көрсеттім. Өткенге қарасақ, ол кем дегенде ішінара хабаршы РНҚ аудармасының теріс бақылауына қатысатын жақында анықталған интерференциялық РНҚ-ны көрсете алады.

Сурет 2. 1985 жылы Говард Теминнің қолынан Американдық патологиялар қоғамының марапаттау тақтасын алу.

1969–70 жылдары везикулярлы стоматит вирусының вирустық бөлшектерімен байланысты РНҚ-полимеразаның оқшаулануы, мүмкін негізгі ферменттің онкогенді РНҚ вирустарымен де байланысты болуы мүмкін деген ойға әкелді. Шынында да, Ховард Темин мен Мизутани және дербес Дэвид Балтимор 1970 жылы вирустық РНҚ-ны ДНҚ-ға кері транскрипциялауға қабілетті Рус саркома вирусымен (RSV) байланысты арнайы ферментті, кері транскриптазаны (RT) ашты.

Шамамен сол уақытта Вильежуифте (Франция) Хилл мен Хиллова РСВ трансформацияланған жасушалардан алынған ДНҚ жұқпалы екенін және вирустық РНҚ-ның генетикалық ақпаратын тасымалдайтынын көрсетті, бұл фермент жұқтырылған жасушаларда адал жұмыс істейтінін растады.

Мен өзім П.Видьемен бірге бұл жаңалықты растадым және кеңейттім, бұл жұқпалы ДНҚ жасушалардың хромосомалық ДНҚ-сымен байланысты болды, бұрын Темин айтқан провирустық ДНҚ интеграциясын көрсетеді.

Тауық RSV бойынша жұмыс сүтқоректілердегі ұқсас вирустарға кеңейтілді, сондықтан сол кездегі көптеген зерттеушілер RT белсенділігі адамның лейкозы мен қатерлі ісігіндегі ұқсас вирустарды анықтауға арналған жаңа, өте сезімтал құрал деп есептеді. Бұған Американың Ұлттық денсаулық сақтау институттары іске қосқан жомарт қаржыландырылған вирусқа қарсы бағдарлама ынталандырды. Өкінішке орай, адам ретровирустарын іздеу негізінен сәтсіз болды, бірақ жануарлар ретровирустарының молекулалық биологиясы бойынша маңызды негізгі жұмыстарды жүргізді.

1972 жылы маған сол кездегі Пастер институтының басшысы Жак Монод институттың жаңадан құрылған вирусология бөлімінде ғылыми-зерттеу бөлімін құруды сұрады. Мен қабылдадым және бұл жаңа зертхана маған вирустық онкологияның жалпы тақырыбы аясында зерттеудің жаңа бағыттарын дамытуға мүмкіндік берді, бұл адамның қатерлі ісігіне қатысатын вирустарды анықтау болып қала берді.

Осылайша, мені интерферонның әсер ету механизмі және оның ретровирустар экспрессиясындағы рөлі қызықтырды. Мен бұл салаға осы саладағы әлемге әйгілі екі сарапшы Эдвард және Жаклин Де Майермен бірлесіп интерферон хабаршысы РНҚ-ның биологиялық белсенділігін көрсеткеннен кейін келдім.

1973 жылдан бастап Ара Хованесьян және оның әріптестері менің бөлімшеге қосылып, жаңа өлшемді әкелді: жасушалық ақуыздардың осы тамаша тобының вирусқа қарсы белсенділігін қамтамасыз ететін күрделі биохимиялық механизм.

1975 жылы менің бөлімшеме тағы екі зерттеуші қосылып, тышқан ретровирустары бойынша тәжірибелерін ортаға салды: Дж.К.Черманн және оның әріптесі Франсуа Барре-Синусси (3-сурет). Соңғысы ретровирустарды RT белсенділігі арқылы анықтауды игерді. Мен оларды адам ісігіндегі ретровирустарды қайта іздеу үшін бөлімшедегі бірлескен зерттеуге қатысуға сендірдім. Біз 1977 жылы Париждің әртүрлі ауруханаларынан алынған қан үлгілері мен биопсия үлгілерінен бастадық.

Сурет 3. 1987 жылы '8220100 сақшылар жиналысы' үзіліс кезінде, Париж маңындағы Гаршестегі Институт Пастер қосымшасының саябағында АИТВ жұқтырғандар. Солдан оңға қарай: Джонас Салк, Жан-Клод Глюкман, Жан-Клод Черман, Люк Монтанье, Роберт Галло, Франсуа Барре-Синусси, Вилли Розенбаум, Шарль Мери.

Басқа зертханаларда жасалған екі ілгерілеу бұл іздеуді күшейтті:

Вильежуифте (Франция) Ион Грессер жеке жасушалар өндіретін альфа эндогендік интерферонның кез келген молекуласын бейтараптандыратын күшті антисарысу дайындады.Бұл интерферон, біз түсіндік, олардың кейбір эндогендік ретровирустарын экспрессиялау үшін индукцияланған тінтуір жасушалары шығарған. Оның антисарысумен қоршауы қоректік ортадағы эндогендік ретровирустардың өндірісін 50 есеге дейін арттырды. Біз эндогендік ретровирустардың миллиондаған жылдар бойы омыртқалы жануарлардың геномында біріктірілгеніне қарамастан, олардың экспрессиясын экзогендік вирустар сияқты интерферон жүйесі әлі де бақылайды деген қорытынды жасауға болады.

Шамамен сол кезеңде Денис Морган мен Фрэнк Русетти доктор Галлоның зертханасында өсуге мүмкіндік беретін өсу факторын ашты. in vitro адамның Т лимфоциттерінің көбеюі (TCGF, ​​кейін интерлейкин 2, Il2 деп аталады) тұрақты дақылдарда Т лимфоциттерін көбейтуге мүмкіндік берді.

Біз сол кезде тінтуірдің сүт безінің ісігінің түзілуіне қатысатын кейбір ретровирустардың ісік жасушаларында ғана емес, сонымен қатар айналымдағы лимфоциттерде де көрінетінін білдік.

Осы екі жетістіктерді пайдалана отырып, біз адам қатерлі ісігіндегі ретровирустарды іздеуді бастадық. Интерферонға қарсы сарысу мен Il2 қолдану арқылы біз әсіресе сүт безі қатерлі ісігімен ауыратын науқастардың Т-лимфоцит культураларына назар аудардық.

Шынында да, 1980 жылы біз сүт безінің қабыну ісігінің жасушаларында (солтүстік африкалық әйелден) ғана емес, сонымен қатар оның өсірілген Т-лимфоциттерінен де сол MMTV-ге жақын ДНҚ тізбегін анықтай алдық. Екінші науқас ұқсас нәтиже көрсетті.

Өкінішке орай, сол кездегі молекулярлық құралдар бізге эндогендік ретровирустық тізбектермен немесе экзогендік вируспен айналысатынымызды айта алмады. Қазіргі уақытта қуаттырақ технологияларға қол жеткізе отырып, мен бұл зерттеулерді қайта бастауды жоспарлап отырмын.

Бірақ 1983 жылы дәл осындай тәсіл, антиинтерферон сарысуын қолдану және Т-лимфоциттердің ұзақ мерзімді культураларын қолдану АИТВ-ның оқшаулануын айтарлықтай жеңілдетті.

Менің ЖҚТБ-ға қатысуым 1982 жылы, бұл жаңа жұмбақ аурудың бастауында трансмиссивті агент - мүмкін вирус болуы мүмкін деген ақпарат тараған кезде басталды. Ол кезде Францияда аз ғана жағдай болды, бірақ олар жас клиникалар мен иммунологтар тобының қызығушылығын тудырды. Олар вирусологтарды, әсіресе ретро-вирусологтарды іздеді, өйткені ықтимал гипотеза HTLV - осы уақытқа дейін белгілі, жақында RC Gallo сипаттаған адам ретровирусы - қатысуы мүмкін. Кеміргіштердегі лейкозды тудыратын ретровирус жиі қайталама иммундық депрессияның нәтижесі болуы мүмкін ысырап ету синдромын тудырады. Бұл HTLV тудырған лейкозбен ауыратын науқастарға да қатысты.

Жұмыс тобының мүшесі Франсуаза Брун-Везинет сол кезде мен басқарған вирусология курсының бұрынғы студенті болды. Ол мені аурудың ерте белгісімен, лимфоденопатиямен келген науқастан болжамды ретровирусты іздеуді ұйымдастыруға шақырды. Науқас АҚШ-қа барған және жұмыс тобының жетекшілерінің бірі доктор Вилли Розенбаумнан мойын лимфа түйінінің ісінуі бойынша кеңес алған жас гей жігіт болатын.

Оның себебі, егер біз аурудың осы бастапқы кезеңінде вирусты тапсақ, бұл иммундық депрессияның салдары емес, себебі болуы мүмкін.

Бұл зерттеуді бастауға тағы бір ынталандыру Пастер институтының өнеркәсіптік еншілес кәсіпорнындағы В гепатиті вирусына қарсы вакцина өндірушілерінің өтініші болды. Олар американдық қан донорларының плазмаларын пайдаланды және олардың вирустық антигенді тазарту процедурасы арқылы ЖИТС агентінің берілу қаупіне алаңдады.

Лимфа түйіндерінің биопсиясы 1983 жылдың 3 қаңтарында келді, бұл күн менің есімде жақсы сақталды, өйткені ол Пастер институтындағы вирусология курсының бірінші күні болатын, мен оны енгізуге тура келді. Мен кішкене қатты бөлікті күннің соңында ғана бөле алдым. Мен лимфоциттерді Dounce шыны гомогенизаторымен диссоциацияладым және оларды бактериялық митогенмен, В және Т лимфоциттерінің активаторы ретінде белгілі А протеинімен культивациялауды бастадым, өйткені лимфоциттердің қай фракциясы болжамды вирусты тудыруы мүмкін екенін білмедім. Үш күннен кейін мен Жан Дауссеттің зертханасында жұмыс істейтін әріптесімнен алған Т жасушаларының өсу факторын қостым.

Т жасушалары жақсы өсті. Бұрын адам қатерлі ісігінде ретровирусты іздеу хаттамасында белгіленгендей, менің серіктестерім Франсуа Барре-Синусси және Жан-Клод Черманнмен бірге қоректік ортадағы RT белсенділігін әр 3 күн сайын өлшеу туралы шешім қабылданды. 15-ші күні Франсуаза маған позитивтіліктің (полимерлі ДНҚ-ға радиоактивті тимидиннің қосылуы) белгісін көрсетті, ол келесі аптада расталды.

Бізде ретровирустың дәлелі болды, бірақ бұл бірқатар сұрақтардың басы ғана болды:
• HTLV-ге жақын болды ма, жоқ па?
• Бұл жолаушы вирусы ма, әлде, керісінше, аурудың нақты себебі ме?

Осы негізгі сұрақтарға жауап беру үшін біз вирусты биохимиялық және иммунологиялық тұрғыдан сипаттауымыз керек болды және ол үшін оны жеткілікті мөлшерде көбейту керек болды. Бақытымызға орай, вирус ересек қан донорларының белсендірілген Т лимфоциттеріне оңай таралуы мүмкін. Бұл бірінші изолятта цитопатиялық әсер байқалмады, бірақ HTLV жұқтырған дақылдардан айырмашылығы, қалыпты лимфоциттер сияқты 3-4 аптадан кейін әрқашан өлетін дақылдардан трансформацияланған өлмейтін жасуша линиялары шыға алмайды.

Керісінше, СПИД-пен ауыратын науқастардың лимфоциттерінің культурасынан жасалған кейінгі изоляттар Т-лимфоциттердің культурасы үшін цитопатиялық болды және біз кейінірек анықтадық - лейкемиядан алынған ісік жасушаларының линияларында көбірек мөлшерде өсіруге болады.

Вирусты оқшаулағаннан кейін көп ұзамай мен және менің әріптестерім оның HTLV-мен иммунологиялық байланысы жоқ екенін және электронды микроскопияда HTLV вирустық бөлшектерінен өте ерекшеленетінін көрсете алдық. Шындығында, 1983 жылдың маусымында мен қойлардағы висна вирусының, жылқылардағы жұқпалы анемия вирусының және сиырдың лимфоцитарлы вирусының жарияланған электронды микроскопиялық суреттерімен біздің вирустың квази- сәйкестігін байқадым: бұл ретролентивирус, суб. -иммундық тапшылығы жоқ жануарларда ұзаққа созылатын ауру тудыратын вирустар тұқымдасы.

Бұл біздің HTLV вирусынан мүлдем өзгеше вируспен күресіп жатқанымызды анық көрсетті және менің міндетім осы жаңа вирус шынымен ЖҚТБ-ның себебі екендігі туралы дәлелдерді жинақтау үшін зерттеушілер тобын ұйымдастыру болды.

Бұл қызықты кезең болды, өйткені әр сенбі күні таңертең кеңсемде жиналыс болған кезде, менің серіктестерім вирустың қоздырғыш рөлін қолдайтын жаңа деректер әкелді. Вирустық изоляттар лимфаденопатиямен байланысты вирусқа арналған LAV деп аталды, ол ісінген лимфа түйіндері бар науқастардан оқшауланған кезде инфекцияның ерте кезеңінің жиі белгісі. Толық СПИД-пен ауыратын науқастардан жасалған изоляттар иммундық тапшылықпен байланысты вирустар (IDAV) деп аталды. Соңғысы әдетте Т-лимфоцит культурасында жақсы өсті және бірнеше жұқтырған жасушалар арасындағы біріктіру нәтижесінде пайда болатын үлкен синцитияның пайда болуына себеп болды. Олардың кейбіреулері - біз кейінірек білдік - сонымен қатар B немесе T жасушаларының үздіксіз жасушаларында көбейе алады. Соңғы қасиет вирустың коммерциялық мақсатта жаппай өндірісін айтарлықтай жеңілдетті.

1983 жылдың қыркүйегінде мен Cold Spring Harbor-да Л.Гросс пен Р.Галло ұйымдастырған HTLV бойынша кездесуде вирус пен ауру арасындағы себепті байланысты қолдайтын барлық деректеріміздің синтезделген тұсаукесерін жасай алдым.

Бұл презентацияны шағын аудитория күмәнмен қабылдады (бұл түнгі сессия болды) және HTLV теориясы әлі де басым болды. Психикалық тұрғыдан келушілердің көпшілігі ретровирустардың (лентиретровирустар) адамдарда бар және иммундық тапшылықты тудыратын және жануарларда ұқсастығы жоқ екінші отбасы туралы идеяны қабылдауға дайын емес еді!

Бұл жағдай ғылымда сирек емес, өйткені жаңа ашылулар жиі дау туғызады. Жалғыз мәселе - бұл қан құйылған адамдар мен гемофилиямен ауыратындар үшін өмір мен өлім мәселесі болды, өйткені біздің вирус антигенін қолданатын серологиялық қан сынағы зертханалық деңгейде жұмыс істеп тұрды, бірақ өнеркәсіптік және коммерциялық дамуды күтті.

Бұл 1985 жылы, басқа екі зерттеушілер тобы, біріншіден, 1984 жылдың басындағы NIH-тегі доктор Галло және Сан-Францискодағы Джей Леви біздің тұжырымдарымызды растап, кеңейткеннен кейін келді. Атап айтқанда, доктор Галло және оның серіктестері вирус пен ауру арасындағы корреляцияға көбірек күш берді, антиденелердің реакциясын анықтауды жақсартты және қатерлі ісік тектес Т-жасушалық желілерде бірнеше вирустық штаммдарды, соның ішінде біздікін де өсіре алды. Осы уақытта менің әріптестерім CD4T жасушалары үшін вирустың тропизмін көрсетті және CD4 беткі молекуласын вирустың негізгі рецепторы ретінде анықтады.

Оқиғаның қалған бөлігі келесі тарауда сипатталады. Мен АИТВ тудырған иммундық жүйенің бұзылуын түсіндіру үшін екі маңызды құбылыс деп есептейтін нәрсені қалай ашқанымды суреттегім келеді.

Инфекцияның жасырын кезеңінде қанда вирус табылмайды. Ол негізінен лимфа тіндерінің лимфоциттерінде локализацияланған, бірақ біз қандағы лимфоциттердің көпшілігі ауру екенін анықтадық! 1987 жылы менің зертханама Швециядан Ян Альбертс деген жас келуші келді. Ол адамның лимфоциттерін сарысусыз синтетикалық ортада өсіруді және АИТВ культурасы туралы кейбір технологияларды үйренгісі келді. Біз оның сау донорлар мен АҚТҚ жұқтырған науқастардың лимфоциттерінің ортасындағы өміршеңдігін, тіпті инфекцияның симптомсыз ерте сатысында да салыстырған кезде таң қалдырдық. Алғашқысы бірнеше күн өлмей-ақ өмір сүре алса, соңғысының көпшілігі (50%-дан астамы) өте тез өлді. Интерлейкин 2 қосу олардың өлімін ішінара болдырмайды.

Біз ұрықтың бұзау сарысуымен толықтырылған қалыпты қоректік ортаны пайдаланған кезде, жұқтырған науқастардағы лимфоциттердің өмір сүру уақыты ұзағырақ болғанымен, бірдей айырмашылық байқалды.

Менің үш әріптесім мұндай өлімнің себебін тапқанға дейін көп уақыт өткен жоқ: апоптоз. Бұл жасуша ортаға тым көп улы қосылыстарды шығармай, таза жолмен өлуді шешетін белсенді процесс.

Бұл белсендірілген лимфоцит клондарының анормальды пролиферациясының алдын алудың физиологиялық әдісі, бірақ бұл жерде құбылыс өте үлкен болды және АИВ-инфекциясының негізгі жасушалық нысанасы CD4+ Т-лимфоциттерге ғана емес, сонымен қатар вирус жұқтырмайтын жасушаларға да әсер етті. CD8+ Т-лимфоциттер, В-лимфоциттер, моноциттер, табиғи өлтіруші жасушалар … Бұл жалпы құбылыс болды, культура жай ғана айналымдағы қан жасушаларының көпшілігінің апоптозға бейімділігін ашады, бірақ олардың көпшілігі жұқтырмаған. . Шынында да, менің әріптесім Мари-Лиза Гужон арасында өте жақсы қарым-қатынас табылды in vitro апоптоз және in vivo науқастарда CD4 Т жасушаларының төмендеуі байқалды.

Біз бұл жаппай апоптоздың шығу тегін табуға көп уақыт жұмсадық, толықтай қанағаттанарлық түсініктеме таппадық: ең алдымен, пациенттерде олардың инфекциясы басталғаннан бері болған қарқынды тотығу стрессі. Бұл сондай-ақ мен мақтан тұтатын нәтиже: тотығу стрессін ЖИТС зерттеушілері мүлде назардан тыс қалдырғанымен және әлі де болса, ол иммундық жүйенің құлдырауының басталуында дұрыс емес белсендіруін күшейтуі мүмкін, сонымен қатар ол қабынуды тудырады. цитокиндерді өндіру арқылы.

Әрине, келесі сұрақ туындайды: тотығу стрессін тудыратын факторлар: вирустық ақуыздар, вирустық ДНҚ фрагменттері, микоплазмалармен коинфекция? 25 жыл өтсе де, біз әлі толық жауабын білмейміз. Бірақ бұл құбылыс бар және емдеуді қажет етеді, ал СПИД бойынша дәрігерлердің көпшілігі бұл туралы мүлдем ойламайды!

Біріктірілген антиретровирустық терапия арқылы емдеу, сөзсіз, бұл өлімге әкелетін аурудың болжамын, өлім жазасынан “қалыпты” дерлік өмірге дейін өзгертті. Дегенмен, вирус әлі де бар, емдеу үзілген кезде көбеюге дайын және дамушы елдердегі АИТВ жұқтырған науқастардың барлығының оған қолы жете бермейді. Ал індет әлі де жыл сайын 2-3 миллион адамды өлтіреді. Сондықтан бұл мәселелерді шешу өте қажет. Іргелі зерттеулерді, сонымен қатар клиникалық зерттеулерді жалғастыру керек.

Сонымен қатар, мен 1990 жылдары зерттеулерді дамыған елдердің бай зертханаларында ғана емес, сонымен қатар СПИД-пен және туберкулез, безгек сияқты көптеген басқа аурулармен ауыратын оңтүстік елдерде де жүргізу керек екенін түсіндім.

Тым көп мысалдар солтүстік және оңтүстік зерттеу зертханалары арасындағы ынтымақтастық тең емес екенін көрсетті, оңтүстік солтүстікте талдау үшін сарысу үлгілерін қамтамасыз етеді. Бұл “safari” тұжырымдамасы қате. Қазір солтүстік зертханаларда дайындалған көптеген жас зерттеушілер өз елдеріне қайтқысы келеді, бірақ зертханалар мен тиісті құрылымдардың жоқтығынан бұған жол берілмейді. Оның үстіне, шындықтың қаншалықты күрделі екенін түсіну үшін ауру көбейетін аймақтарда болу керек.

Сондықтан мен ЮНЕСКО-ның бұрынғы Бас директоры Федерико Майормен Африка елдерінде зерттеу және алдын алу орталықтарын құруға бағытталған қорды құруға бастамашылық жасадым. Тапсырма қиын болғанымен, бұл тұжырымдама әріптестер мен медицина дәрігерлерінің ынтасымен қарсы алынды, сонымен қатар үкіметтердің, әсіресе Кот-д’Ивуар мен Камерунның қолдауына ие болды.

Осы пилоттық эксперименттердің негізінде ұқсас орталықтардың тұтас желісі халықтары эпидемиядан қатты зардап шеккен дамушы әлемнің барлық елдерін қамтуын қалаймын.

ЖҚТБ-мен күресу тәжірибесінен алған тағы бір сабақ иммундық жүйеге тотығу стрессінің әлсіреу әсері және оның Паркинсон, Альцгеймер және ревматоидты артрит сияқты көптеген созылмалы аурулардағы қабынуға қарсы рөлі: созылмалы инфекциялардың ықтимал салдары? Әлде салдары да, себебі де ме? Тынымсыз еңбек пен жаңашыл ойлау арқылы ғана шешілетін мәселелер көп. Мен екеуін де жалғастыра аламын деп үміттенемін.

бастап Лес-при Нобель. 2008 жылғы Нобель сыйлығы, Редактор Карл Грандин, [Нобель қоры], Стокгольм, 2009 ж

Бұл өмірбаян/өмірбаян марапаттау кезінде жазылған және кейінірек кітаптар сериясында жарияланған Лес При Нобель/ Нобель дәрістері/Нобель сыйлықтары. Ақпарат кейде Лауреат ұсынған қосымшамен жаңартылады.

Авторлық құқық және көшіру Нобель қоры 2008 ж

Осы бөлімге сілтеме жасау үшін
MLA стилі: Люк Монтанье – Өмірбаяндық. NobelPrize.org. Нобель сыйлығының хабарлауы AB 2021. Сәр. 30 маусым 2021 жыл. <https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/2008/montagnier/biographical/>

Көбірек білу үшін

Нобель сыйлығы 2020

Он екі лауреат 2020 жылы адамзатқа ең үлкен пайда әкелген жетістіктері үшін Нобель сыйлығымен марапатталды.

Олардың жұмысы мен ашқан жаңалықтары қара тесіктер мен генетикалық қайшылардың пайда болуынан аштықпен күресуге және аукционның жаңа форматтарын әзірлеуге дейін.


Биологтар 33 миллион жыл бұрынғы көне ретровирустардың тарихын ашты

Бостон колледжіндегі ғалымдар тобы, Каштан Хилл 33 және 15 миллион жыл бұрын (олигоцен және ерте миоцен) арасында кеңінен таралған — ERV-Fc — нақты ретровирустық тегінің табиғи тарихын қайта құрды.

rhesus macaque плацента жасушаларынан бүршіктенетін ретровирус бөлшектері. Сурет несиесі: Дороти Фельдман, aacrjournals.org арқылы.

Табиғатта ретровирустар өте көп және адамның иммун тапшылығы вирустары (АИТВ-1 және АИВ-2), адамның Т-жасушалық лейкоз вирустары (HTLV-1 және -2), тышқандардың және басқа модельдік организмдердің жақсы зерттелген онкогендік ретровирустарын қамтиды. көптеген басқалар.

2016 жылдың 8 наурызында журналда жарияланған топтың қорытындылары eLife, ERV-Fc ретінде белгілі ретровирустардың ежелгі тобы кем дегенде 28 сүтқоректілердің ата-бабаларын жұқтырғанын көрсетеді, соның ішінде жыртқыштар, кеміргіштер және приматтар — 15 миллионнан 33 миллион жыл бұрын.

Осы ежелгі сүтқоректілер арасында ERV-Fc ретровирустарының таралуы вирустардың Антарктида мен Австралиядан басқа барлық континенттерге тарағанын және олардың бір түрден екіншісіне 20 еседен астам секіргенін көрсетеді.

Зерттеу сонымен қатар ERV-Fc пайда болуын кем дегенде олигоценнің басына дейін орналастырады.

«Өкінішке орай, вирустар қазба қалдықтарын қалдырмайды, яғни біз олардың қалай пайда болатыны мен дамитыны туралы өте аз білеміз», - деді команда мүшесі, профессор Уэлкин Джонсон, Бостон колледжінің биология факультетінен.

«Алайда миллиондаған жылдар ішінде вирустық генетикалық тізбектер тірі ағзалардың, соның ішінде адамдардың ДНҚ геномдарында жинақталады және вирустар мен олардың иелерінің табиғи тарихын зерттеу үшін молекулалық «қазбалар» ретінде қызмет ете алады».

Осындай «қазба» қалдықтарын пайдалана отырып, профессор Джонсон және бірлескен авторлар ERV-Fc табиғи тарихын ашуға тырысты.

Олар әсіресе бұл қоздырғыштардың ежелгі дүниеде қай жерде және қашан табылғанын, олардың қай түрді жұқтырғанын және сүтқоректілердің иелеріне қалай бейімделгенін білуге ​​қызығушылық танытты.

Бұл әрекетті орындау үшін олар алдымен ERV-Fc локустары үшін сүтқоректілердің геномының реттілігінің дерекқорларын толық іздеуді жүргізді, содан кейін қалпына келтірілген тізбектерді салыстырды.

Жеткілікті ERV-Fc тізбегі бар әрбір геном үшін олар осы түрдің ата-бабаларын колонизациялаған вирусты білдіретін белоктардың тізбегін қалпына келтірді.

Содан кейін бұл тізбектер ERV-Fc байланысты вирустардың табиғи тарихын және эволюциялық қатынастарын анықтау үшін пайдаланылды.

Ғалымдар: «Сүтқоректілердің геномдарында ERV-Fc-ге ұқсас жүздеген мың ежелгі вирустық қалдықтар бар», - дейді ғалымдар.

«Болашақ жұмыс жаңа вирустардың қашан және неге пайда болатынын және вирустармен ұзақ мерзімді байланыс олардың қабылдаушы ағзаларының эволюциясына қалай әсер ететінін түсінуді жақсарту үшін оларды зерттеуге болады».

Уильям Э. Диль т.б. 2016. Қазіргі сүтқоректілердің геномдарын пайдалана отырып, көне ретровирустың түраралық берілісін және ұзақ мерзімді эволюциясын қадағалау. eLife 5: e12704 doi: 10.7554/eLife.12704


РНҚ-байланыстырушы протеин IGF2BP3 онкогендік транскрипттерге бағытталған гемопоэтикалық прогениторлардың пролиферациясына ықпал етеді

1 Патология және зертханалық медицина бөлімі, Дэвид Геффен медицина мектебі, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

2 Молекулалық, жасушалық және интегративті физиология бөлімі, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

3 Молекулалық, жасушалық және даму биологиясы бөлімі, UCSC, Санта-Крус, Калифорния, АҚШ.

4 Bioo Scientific корпорациясы, Остин, Техас, АҚШ.

5 Химия және биохимия кафедрасы, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

6 СДБ әйелдер мен балалар денсаулығы департаменті, Падова университеті, Падова, Италия.

7 Джонссон жан-жақты онкологиялық орталық (JCCC) және

8 Кең бағаналы жасушаларды зерттеу орталығы, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

Корреспонденцияның мекенжайы: Dinesh S. Rao, Патология және зертханалық медицина бөлімі, Дэвид Геффен медицина мектебі, UCLA, 650 Charles E Young Drive, 12-272 Factor, Лос-Анджелес, Калифорния 90095, АҚШ. Телефон: 310.825.1675 E-mail: [email protected]

Авторлық ескерту: Дж.Кумар Паланичами, Т.М. Тран және Дж.М.Ховард бұл жұмысқа бірдей үлес қосты.

Паланичами, Дж. мақалаларын табыңыз: JCI | PubMed | Google ғалымы

1 Патология және зертханалық медицина бөлімі, Дэвид Геффен медицина мектебі, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

2 Молекулалық, жасушалық және интегративті физиология бөлімі, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

3 Молекулалық, жасушалық және даму биологиясы бөлімі, UCSC, Санта-Крус, Калифорния, АҚШ.

4 Bioo Scientific корпорациясы, Остин, Техас, АҚШ.

5 Химия және биохимия кафедрасы, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

6 СДБ әйелдер мен балалар денсаулығы департаменті, Падова университеті, Падова, Италия.

7 Джонссон жан-жақты онкологиялық орталық (JCCC) және

8 Кең бағаналы жасушаларды зерттеу орталығы, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

Корреспонденцияның мекенжайы: Dinesh S. Rao, Патология және зертханалық медицина бөлімі, Дэвид Геффен медицина мектебі, UCLA, 650 Charles E Young Drive, 12-272 Factor, Лос-Анджелес, Калифорния 90095, АҚШ. Телефон: 310.825.1675 E-mail: [email protected]

Авторлық ескерту: Дж.Кумар Паланичами, Т.М. Тран және Дж.М.Ховард бұл жұмысқа бірдей үлес қосты.

1 Патология және зертханалық медицина бөлімі, Дэвид Геффен медицина мектебі, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

2 Молекулалық, жасушалық және интегративті физиология бөлімі, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

3 Молекулалық, жасушалық және даму биологиясы бөлімі, UCSC, Санта-Крус, Калифорния, АҚШ.

4 Bioo Scientific корпорациясы, Остин, Техас, АҚШ.

5 Химия және биохимия кафедрасы, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

6 СДБ әйелдер мен балалар денсаулығы департаменті, Падова университеті, Падова, Италия.

7 Джонссон жан-жақты онкологиялық орталық (JCCC) және

8 Кең бағаналы жасушаларды зерттеу орталығы, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

Корреспонденцияның мекенжайы: Dinesh S. Rao, Патология және зертханалық медицина бөлімі, Дэвид Геффен медицина мектебі, UCLA, 650 Charles E Young Drive, 12-272 Factor, Лос-Анджелес, Калифорния 90095, АҚШ. Телефон: 310.825.1675 E-mail: [email protected]

Авторлық ескерту: Дж.Кумар Паланичами, Т.М. Тран және Дж.М.Ховард бұл жұмысқа бірдей үлес қосты.

1 Патология және зертханалық медицина бөлімі, Дэвид Геффен медицина мектебі, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

2 Молекулалық, жасушалық және интегративті физиология бөлімі, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

3 Молекулалық, жасушалық және даму биологиясы бөлімі, UCSC, Санта-Крус, Калифорния, АҚШ.

4 Bioo Scientific корпорациясы, Остин, Техас, АҚШ.

5 Химия және биохимия кафедрасы, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

6 СДБ әйелдер мен балалар денсаулығы департаменті, Падова университеті, Падова, Италия.

7 Джонссон жан-жақты онкологиялық орталық (JCCC) және

8 Кең бағаналы жасушаларды зерттеу орталығы, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

Корреспонденцияның мекенжайы: Dinesh S. Rao, Патология және зертханалық медицина бөлімі, Дэвид Геффен медицина мектебі, UCLA, 650 Charles E Young Drive, 12-272 Factor, Лос-Анджелес, Калифорния 90095, АҚШ. Телефон: 310.825.1675 E-mail: [email protected]

Авторлық ескерту: Дж.Кумар Паланичами, Т.М. Тран және Дж.М.Ховард бұл жұмысқа бірдей үлес қосты.

Contreras, J. мақалаларын табыңыз: JCI | PubMed | Google ғалымы

1 Патология және зертханалық медицина бөлімі, Дэвид Геффен медицина мектебі, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

2 Молекулалық, жасушалық және интегративті физиология бөлімі, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

3 Молекулалық, жасушалық және даму биологиясы бөлімі, UCSC, Санта-Крус, Калифорния, АҚШ.

4 Bioo Scientific корпорациясы, Остин, Техас, АҚШ.

5 Химия және биохимия кафедрасы, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

6 СДБ әйелдер мен балалар денсаулығы департаменті, Падова университеті, Падова, Италия.

7 Джонссон жан-жақты онкологиялық орталық (JCCC) және

8 Кең бағаналы жасушаларды зерттеу орталығы, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

Корреспонденцияның мекенжайы: Dinesh S. Rao, Патология және зертханалық медицина бөлімі, Дэвид Геффен медицина мектебі, UCLA, 650 Charles E Young Drive, 12-272 Factor, Лос-Анджелес, Калифорния 90095, АҚШ. Телефон: 310.825.1675 E-mail: [email protected]

Авторлық ескерту: Дж.Кумар Паланичами, Т.М. Тран және Дж.М.Ховард бұл жұмысқа бірдей үлес қосты.

Фернандо, Т. мақалаларын табыңыз: JCI | PubMed | Google ғалымы

1 Патология және зертханалық медицина бөлімі, Дэвид Геффен медицина мектебі, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

2 Молекулалық, жасушалық және интегративті физиология бөлімі, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

3 Молекулалық, жасушалық және даму биологиясы бөлімі, UCSC, Санта-Крус, Калифорния, АҚШ.

4 Bioo Scientific корпорациясы, Остин, Техас, АҚШ.

5 Химия және биохимия кафедрасы, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

6 СДБ әйелдер мен балалар денсаулығы департаменті, Падова университеті, Падова, Италия.

7 Джонссон жан-жақты онкологиялық орталық (JCCC) және

8 Кең бағаналы жасушаларды зерттеу орталығы, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

Корреспонденцияның мекенжайы: Dinesh S. Rao, Патология және зертханалық медицина бөлімі, Дэвид Геффен медицина мектебі, UCLA, 650 Charles E Young Drive, 12-272 Factor, Лос-Анджелес, Калифорния 90095, АҚШ. Телефон: 310.825.1675 E-mail: [email protected]

Авторлық ескерту: Дж.Кумар Паланичами, Т.М. Тран және Дж.М.Ховард бұл жұмысқа бірдей үлес қосты.

Sterne-Weiler, T. мақалаларын табыңыз: JCI | PubMed | Google ғалымы

1 Патология және зертханалық медицина бөлімі, Дэвид Геффен медицина мектебі, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

2 Молекулалық, жасушалық және интегративті физиология бөлімі, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

3 Молекулалық, жасушалық және даму биологиясы бөлімі, UCSC, Санта-Крус, Калифорния, АҚШ.

4 Bioo Scientific корпорациясы, Остин, Техас, АҚШ.

5 Химия және биохимия кафедрасы, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

6 СДБ әйелдер мен балалар денсаулығы департаменті, Падова университеті, Падова, Италия.

7 Джонссон жан-жақты онкологиялық орталық (JCCC) және

8 Кең бағаналы жасушаларды зерттеу орталығы, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

Корреспонденцияның мекенжайы: Dinesh S. Rao, Патология және зертханалық медицина бөлімі, Дэвид Геффен медицина мектебі, UCLA, 650 Charles E Young Drive, 12-272 Factor, Лос-Анджелес, Калифорния 90095, АҚШ. Телефон: 310.825.1675 E-mail: [email protected]

Авторлық ескерту: Дж.Кумар Паланичами, Т.М. Тран және Дж.М.Ховард бұл жұмысқа бірдей үлес қосты.

Katzman, S. мақалаларын табыңыз: JCI | PubMed | Google ғалымы

1 Патология және зертханалық медицина бөлімі, Дэвид Геффен медицина мектебі, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

2 Молекулалық, жасушалық және интегративті физиология бөлімі, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

3 Молекулалық, жасушалық және даму биологиясы бөлімі, UCSC, Санта-Крус, Калифорния, АҚШ.

4 Bioo Scientific корпорациясы, Остин, Техас, АҚШ.

5 Химия және биохимия кафедрасы, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

6 СДБ әйелдер мен балалар денсаулығы департаменті, Падова университеті, Падова, Италия.

7 Джонссон жан-жақты онкологиялық орталық (JCCC) және

8 Кең бағаналы жасушаларды зерттеу орталығы, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

Корреспонденцияның мекенжайы: Dinesh S. Rao, Патология және зертханалық медицина бөлімі, Дэвид Геффен медицина мектебі, UCLA, 650 Charles E Young Drive, 12-272 Factor, Лос-Анджелес, Калифорния 90095, АҚШ. Телефон: 310.825.1675 E-mail: [email protected]

Авторлық ескерту: Дж.Кумар Паланичами, Т.М. Тран және Дж.М.Ховард бұл жұмысқа бірдей үлес қосты.

1 Патология және зертханалық медицина бөлімі, Дэвид Геффен медицина мектебі, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

2 Молекулалық, жасушалық және интегративті физиология бөлімі, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

3 Молекулалық, жасушалық және даму биологиясы бөлімі, UCSC, Санта-Крус, Калифорния, АҚШ.

4 Bioo Scientific корпорациясы, Остин, Техас, АҚШ.

5 Химия және биохимия кафедрасы, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

6 СДБ әйелдер мен балалар денсаулығы департаменті, Падова университеті, Падова, Италия.

7 Джонссон жан-жақты онкологиялық орталық (JCCC) және

8 Кең бағаналы жасушаларды зерттеу орталығы, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

Корреспонденцияның мекенжайы: Dinesh S. Rao, Патология және зертханалық медицина бөлімі, Дэвид Геффен медицина мектебі, UCLA, 650 Charles E Young Drive, 12-272 Factor, Лос-Анджелес, Калифорния 90095, АҚШ. Телефон: 310.825.1675 E-mail: [email protected]

Авторлық ескерту: Дж.Кумар Паланичами, Т.М. Тран және Дж.М.Ховард бұл жұмысқа бірдей үлес қосты.

1 Патология және зертханалық медицина бөлімі, Дэвид Геффен медицина мектебі, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

2 Молекулалық, жасушалық және интегративті физиология бөлімі, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

3 Молекулалық, жасушалық және даму биологиясы бөлімі, UCSC, Санта-Крус, Калифорния, АҚШ.

4 Bioo Scientific корпорациясы, Остин, Техас, АҚШ.

5 Химия және биохимия кафедрасы, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

6 СДБ әйелдер мен балалар денсаулығы департаменті, Падова университеті, Падова, Италия.

7 Джонссон жан-жақты онкологиялық орталық (JCCC) және

8 Кең бағаналы жасушаларды зерттеу орталығы, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

Корреспонденцияның мекенжайы: Dinesh S. Rao, Патология және зертханалық медицина бөлімі, Дэвид Геффен медицина мектебі, UCLA, 650 Charles E Young Drive, 12-272 Factor, Лос-Анджелес, Калифорния 90095, АҚШ. Телефон: 310.825.1675 E-mail: [email protected]

Авторлық ескерту: Дж.Кумар Паланичами, Т.М. Тран және Дж.М.Ховард бұл жұмысқа бірдей үлес қосты.

Бассо, Г. мақалаларын табыңыз: JCI | PubMed | Google Scholar | />

1 Патология және зертханалық медицина бөлімі, Дэвид Геффен медицина мектебі, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

2 Молекулалық, жасушалық және интегративті физиология бөлімі, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

3 Молекулалық, жасушалық және даму биологиясы бөлімі, UCSC, Санта-Крус, Калифорния, АҚШ.

4 Bioo Scientific корпорациясы, Остин, Техас, АҚШ.

5 Химия және биохимия кафедрасы, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

6 СДБ әйелдер мен балалар денсаулығы департаменті, Падова университеті, Падова, Италия.

7 Джонссон жан-жақты онкологиялық орталық (JCCC) және

8 Кең бағаналы жасушаларды зерттеу орталығы, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

Корреспонденцияның мекенжайы: Dinesh S. Rao, Патология және зертханалық медицина бөлімі, Дэвид Геффен медицина мектебі, UCLA, 650 Charles E Young Drive, 12-272 Factor, Лос-Анджелес, Калифорния 90095, АҚШ. Телефон: 310.825.1675 E-mail: [email protected]

Авторлық ескерту: Дж.Кумар Паланичами, Т.М. Тран және Дж.М.Ховард бұл жұмысқа бірдей үлес қосты.

Pigazzi, M. мақалаларын табыңыз: JCI | PubMed | Google Scholar | />

1 Патология және зертханалық медицина бөлімі, Дэвид Геффен медицина мектебі, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

2 Молекулалық, жасушалық және интегративті физиология бөлімі, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

3 Молекулалық, жасушалық және даму биологиясы бөлімі, UCSC, Санта-Крус, Калифорния, АҚШ.

4 Bioo Scientific корпорациясы, Остин, Техас, АҚШ.

5 Химия және биохимия кафедрасы, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

6 СДБ әйелдер мен балалар денсаулығы департаменті, Падова университеті, Падова, Италия.

7 Джонссон жан-жақты онкологиялық орталық (JCCC) және

8 Кең бағаналы жасушаларды зерттеу орталығы, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

Корреспонденцияның мекенжайы: Dinesh S. Rao, Патология және зертханалық медицина бөлімі, Дэвид Геффен медицина мектебі, UCLA, 650 Charles E Young Drive, 12-272 Factor, Лос-Анджелес, Калифорния 90095, АҚШ. Телефон: 310.825.1675 E-mail: [email protected]

Авторлық ескерту: Дж.Кумар Паланичами, Т.М. Тран және Дж.М.Ховард бұл жұмысқа бірдей үлес қосты.

Санфорд, Дж. мақалаларын табыңыз: JCI | PubMed | Google ғалымы

1 Патология және зертханалық медицина бөлімі, Дэвид Геффен медицина мектебі, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

2 Молекулалық, жасушалық және интегративті физиология бөлімі, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

3 Молекулалық, жасушалық және даму биологиясы бөлімі, UCSC, Санта-Крус, Калифорния, АҚШ.

4 Bioo Scientific корпорациясы, Остин, Техас, АҚШ.

5 Химия және биохимия кафедрасы, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

6 СДБ әйелдер мен балалар денсаулығы департаменті, Падова университеті, Падова, Италия.

7 Джонссон жан-жақты онкологиялық орталық (JCCC) және

8 Кең бағаналы жасушаларды зерттеу орталығы, UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния, АҚШ.

Корреспонденцияның мекенжайы: Dinesh S. Rao, Патология және зертханалық медицина бөлімі, Дэвид Геффен медицина мектебі, UCLA, 650 Charles E Young Drive, 12-272 Factor, Лос-Анджелес, Калифорния 90095, АҚШ. Телефон: 310.825.1675 E-mail: [email protected]

Авторлық ескерту: Дж.Кумар Паланичами, Т.М. Тран және Дж.М.Ховард бұл жұмысқа бірдей үлес қосты.

Ген экспрессиясының посттранскрипциялық бақылауы қалыпты және патологиялық жасушалық фенотиптерді анықтау үшін маңызды. In vitro, РНҚ-байланыстырушы ақуыздар (RBPs) посттранскрипциялық реттеуде маңызды рөл атқаратыны жақында көрсетілді, дегенмен RBP-тің жасуша спецификациясына қосқан үлесі жақсы түсінілмеген. Мұнда біз RBP инсулин тәрізді өсу факторы 2 мРНҚ-байланыстыратын ақуыз 3 (IGF2BP3) қосалқы типті құрайтын аралас лейкоз-қайта реттелген (MLL-қайта реттелген) B-жедел лимфобластикалық лейкозда (B-ALL) ерекше артық экспрессияланатынын анықтадық. нашар болжаммен және рецидивтің жоғары қаупімен байланысты бұл қатерлі ісік. IGF2BP3 B-ALL жасушаларының тіршілігі үшін қажет болды, өйткені нокдаун пролиферацияның төмендеуіне және апоптоздың жоғарылауына әкелді. IGF2BP3-тің мәжбүрлі экспрессиясы тышқанның БМ жасушаларына күшті өмір сүру артықшылығын қамтамасыз етті, гемопоэтикалық бағаналы және прогениторлық жасушалардың пролиферациясына әкелді және гемопоэтикалық дамуды В жасушасы/миелоидтық линияға бұрды. Кросс-байланысты иммунопреципитация және жоғары өнімділік секвенциясы онкогендерді қамтитын IGF2BP3 реттелетін транскриптомды ашты. MYC және CDK6 тікелей нысана ретінде. IGF2BP3 транскрипттері 3′ аударылмаған аймақтардағы (3′UTR) мақсатты элементтер арқылы реттелді және тышқандардағы IGF2BP3 экспрессиясы күшейтілген экспрессияға әкелді. Myc және CDk6 БМ-де. Біздің деректеріміз бірге онкогендік транскрипттердің IGF2BP3-делдалдық мақсаттылығы MLL-қайта реттелген B-ALL-да маңызды патогенетикалық механизмді көрсетуі мүмкін екенін және IGF2BP3 және оның туыстық РНҚ-байланыстыратын серіктестерін осы аурудағы әлеуетті терапевтік мақсаттар ретінде қолдауы мүмкін екенін көрсетеді.

В жасушасының ерте тегінің онкогенезі балалар мен жас ересектердегі ең таралған гематологиялық ісік В жасушасының жедел лимфобластикалық лейкозына (B-ALL) әкеледі (1). B-ALL жағдайларының көпшілігі генетикалық өзгерістерді, соның ішінде қайталанатын хромосомалық қайта құруларды көрсетеді, бұл байқалған клиникалық мінез-құлықтың гетерогенділігіне ықпал етеді (2). Атап айтқанда, аралас лейкоздың хромосомалық қайта құрылуы бар B-ALL (MLL) ген барлық B-ALL жағдайларының 5%-6%-ын құрайды және нашар болжаммен және емдеуден кейін ерте қайталану қаупімен байланысты (3 ). MLLH3K4 метилтрансферазаны кодтайтын лейкемогенез кезінде пайда болатын транскрипциялық дисрегуляцияда маңызды рөл атқарады (3, 4). MLL-дің бұрын көрсетілген мақсаттары жасушалардың өмір сүруі мен пролиферациясында маңызды гендерді қамтиды, мысалы BCL2, MYC, және CDK6 ( 5 – 7 ). Сонымен қатар, MLL гемопоэзді реттейтіні белгілі және оның экспрессиясы гемопоэтикалық дің жасушаларының (HSC) өзін-өзі жаңартуы мен дифференциациясының сақталуымен байланысты (8, 9). Қалыпты HSC қызметіндегі осындай рөлге сәйкес, MLL синтез белоктары индукцияланады HOXA9 және MEIS1, дің жасушасына ұқсас қасиеттерді көрсететін лейкозды тудыратын (10 – 12). Бұл нәтижелер ген экспрессиясының реттелуінің бұзылуы мен қатерлі трансформация арасындағы тығыз байланысты көрсетеді және ген экспрессиясын реттеудегі негізгі ойыншыларды зерттеудің маңыздылығын көрсетеді.

Қарапайым түрде ген экспрессиясы транскрипциялық және посттранскрипциялық деңгейлерде реттелуі мүмкін. Соңғы жұмыс реттелетін мРНҚ-ға тән тізбектерді ғана емес, сонымен қатар миР, РНҚ байланыстыратын ақуыздар (RBP) және кодталмаған РНҚ сияқты басқа факторларды қамтитын соңғы механизмнің күрделілігін анықтады (13). Ақуызды кодтайтын мРНҚ мен miR және RBP-ге бағытталған 3′ трансляцияланбаған аймақ (3′UTR) арасындағы күрделі өзара әрекеттесу туралы хабарланды (14). Дегенмен, В жасушаларының қатерлі трансформациясында RBP арқылы ген экспрессиясын реттеудің рөлі түсінілмейді. B-ALL-да маңызды RBP-делдалдық реттеуді анықтау мақсатында біз зертханамызда жасалған жоғары өнімділік деректер жинағын зерттеуден, инсулинге ұқсас өсу факторы 2 мРНҚ-байланыстырушы протеин 3 анықтаудан бастадық.IGF2BP3) MLL-транслокацияланған B-ALL ішіндегі ең жоғары реттелмеген гендердің бірі ретінде. IGF2BP3 локализация, тұрақтылық және трансляция арқылы мРНҚ-ның цитоплазмалық тағдырына әсер ететін құрылымдық және функционалдық байланысты 3 паралогтан (IGF2BP1, IGF2BP2 және IGF2BP3) тұратын мРНҚ-байланыстырушы белоктар отбасына жатады (15, 116). IGF2BP3 – эмбриогенез кезінде жоғары экспрессияға ие, ересек тіндерде аз экспрессияға және қатерлі тіндерде реэкспрессияға ие онкофетальды ақуыз. Эпителий ісігінде IGF2BP3 экспрессиясы неопластикалық фенотиптердің ауқымымен байланысты (17-20). Дегенмен, бұл зерттеулердің көпшілігі негізінен корреляциялық болды және В жасушаларының онкогенезіндегі IGF2BP3 немесе кез келген RBP-нің адал функционалдық рөлі анықталмаған.

Бұл зерттеуде біз В жасушаларының лейкемогенезіндегі IGF2BP3 функциясын анықтауға тырыстық. Біз өліммен сәулеленген тышқандардың БМ-да IGF2BP3 шамадан тыс экспрессияландық және оның MLL-қайта реттелген B-ALL кейбір ерекшеліктерін қайталай отырып, гемопоэтикалық бағаналы және прогениторлық жасушалардың пролиферациясында маңызды рөл атқаратынын анықтадық. IGF2BP3 BM прогениторларына бәсекеге қабілетті өмір сүру артықшылығын қамтамасыз етті және олардың таралуын арттырды.Біз сондай-ақ IGF2BP3 B-ALL жасуша желілерінің өмір сүруі үшін маңызды екенін анықтадық. Біз протеин-РНҚ өзара әрекеттесуінің in situ ерекшелігін анықтау және транскриптомдағы ақуызды байланыстыру орындарының позициялық контекстін ашу үшін жеке нуклеотидтерді айқастыратын иммунопреципитацияны (iCLIP) қолдандық. Барлығы IGF2BP3 байланыстыру орындарын бірнеше жүздеген транскрипттерде 2 B-ALL ұяшық сызығында анықтадық. IGF2BP3 кросс-байланыс тораптары мақсатты транскрипттердің 3′UTR-де қатты байытылған. Көптеген IGF2BP3 мақсатты транскрипттерінің ішінен біз IGF2BP3 арқылы онкогенді нысандардың экспрессиясының жақсарғанын көрсеттік. CDK6 және MYC B-ALL жасушаларында және гемопоэтикалық ізашар жасушаларда in vivo. IGF2BP3 РНҚ-байланыстырушы домендерінің жойылуы мақсатты мРНҚ байланысуын, сондай-ақ гемопоэтикалық өзек пен прогенитордың кеңеюін жойды. Біздің зерттеулеріміз бірге онкогенді нысандардың IGF2BP3-делдалдық жоғарылауы MLL-қайта реттелген B-ALL-да негізгі патогенетикалық механизмнің операнты болып табылатынын көрсетеді.

IGF2BP3 MLL-қайта реттелген B-ALL түрінде дифференциалды түрде көрсетіледі. Біз бұрын пациенттің B-ALL үлгілерінде орындалған микромассив тәжірибесін сипаттадық (21). Бірнеше гипотезаны сынау үшін түзетуден кейін біз айтарлықтай дифференциалданған ақуызды кодтаушы гендермен (түзетілген) бақыланбайтын иерархиялық кластерлеуді орындадық. П ≤ 0,01). Бұл біздің микромассив эксперименттерінде (ETV-RUNX1, E2A-PBX және MLL-қайта реттелді) пайдаланылған B-ALL 3 цитогенетикалық ішкі түрі арасында дифференциалды түрде көрсетілген RBP тізімін жасады. MLL-қайта реттелген лейкозда экспрессиясы ең жоғары болған RBP тізімінде, IGF2BP3 үздік үміткерлер қатарында болды (сурет 1А). MLL-қайта реттелген лейкоздар діңгекпен байланысты гендердің жоғары экспрессиясы бар бағаналы жасуша белгісін көрсетеді. HOXA9, MEIS1, және CD44 (11, 22). Осыған сәйкес біз мұны байқадық HOXA9, MEIS1A, CDK6, және MYC - онкогенді MLL синтез ақуызының болжамды мақсаттары - басқа 2 жиынтықпен салыстырғанда MLL-қайта реттелген топта айтарлықтай шамадан тыс экспрессияланды (Қосымша сурет 1, A-D). B-ALL пациентінен алынған БМ-ның үлкен когортында сандық ПТР (qPCR) орындау арқылы біз растадық IGF2BP3 және CD44 MLL тобында жоғары көрсетілген (барлығы n = 134) (1-сурет, В және С). Оған қоса, IGF2BP3 Экспрессия барлық B-ALL үлгілерінде сау донорлардан бөлінген CD19 + B жасушаларымен салыстырғанда айтарлықтай жоғары болды (1В-сурет). IGF2BP3-тің ген экспрессиясына MLL-делдалдық әсерлеріне тәуелділігін зерттеу үшін біз жақында MLL-ге тәуелді ген экспрессиясын тежейтіні көрсетілген бромодомен және қосымша терминал (BET) домен ингибиторы I-BET151 қолдандық (23). RS411 - MLL-AF4-экспрессиялайтын адамның B-ALL жасушалық желісі - I-BET151-мен емдеу дозаға тәуелді экспрессияның төмендеуіне әкелді. MYC, CDK6, және IGF2BP3 (1D-сурет). Ол сондай-ақ G1-S фазасында жасушалық циклді тоқтатуды тудырды (1-сурет, E және F). Бұл тәжірибелер шамадан тыс экспрессияны растайды IGF2BP3 B-ALL ішінде, ең жоғары өрнек MLL-қайта реттелген B-ALL ішінде көрінеді. IGF2BP3 MLL синтез белоктарының төменгі ағынына сәйкес, төмендейді IGF2BP3 mRNA деңгейлері, басқа MLL-AF4 мақсатты деңгейлерінің төмендеуімен бірге BET тежелуінен кейін байқалады.

IGF2BP3 MLL-транслокацияланған B-ALL-да шамадан тыс экспрессияланған. (А) B-ALL арасындағы дифференциалды түрде көрсетілген RBP көрсететін микромәліметтерден алынған жылу картасы. IGF2BP3 MLL-қайта реттелген B-ALL-да жоғары дәрежеде көрсетілген. (Б және C) qPCR негізіндегі артық экспрессияны растау IGF2BP3 (Б) және оның бұрын анықталған мақсаты, CD44 (C), MLL-қайта реттелген B-ALL (барлығы n = 134 бір жақты ANOVA, одан кейін Бонферронидің бірнеше салыстыру сынағы **П < 0,01, ***П < 0,001, ****П < 0,0001). (DF) I-BET151 дозасын жоғарылату арқылы RS411 жасуша желісін емдеу. (D) qPCR MYC, CDK6, және IGF2BP3 RS411 жасушаларындағы деңгейлер барлық 3 мРНҚ деңгейлерінің айтарлықтай төмендеуін көрсетеді (т сынақ MYC, П = 0.04, П = 0.06 IGF2BP3, П < 0,0001, П = 0.1 CDK6, П = 0.005, П = 0,004 1 мкМ және 2 мкм, тиісінше). (Е және F) RS411 жасушаларын I-BET151 өңдеуден кейін пропидий йодидімен бояу арқылы жасушалық циклді талдау CDK6 тежелуіне байланысты G1 тоқтауын көрсетеді. Валидация үшін эксперименттер 3× жүргізілді. qPCR талдаулары актинге қалыпқа келтірілді (Б және C) және РНҚ Пол II (D). Деректер орташа ±SD көрсетеді. Сондай-ақ 1-суретті қараңыз.

IGF2BP3 функциясының жоғалуы B-ALL жасушаларында апоптозды тудырады. Адамның B-ALL ішіндегі IG2BP3 онкогенді экспрессия үлгісін ескере отырып, біз оның 4 түрлі B-ALL жасуша желісіндегі экспрессиясын, соның ішінде 697 (E2A-PBX ауыстырылған), RS411, REH (ETV-RUNX1 транслокацияланған) және NALM6 (қоса алғанда) зерттей бастадық. 2А-сурет). IGF2BP3 нокдаунының әсерін зерттеу үшін біз RS411 жасушаларын түрлендіру үшін 2 түрлі miR пішімделген siRNA тізбегін білдіретін лентивирустық векторды қолдандық (2В-сурет). Екі siRNA төмендеді IGF2BP3 qPCR арқылы өрнек (2С-сурет). Пропидий йодидімен бояу апоптотикалық суб-G1 фракциясының және 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолийдің (МТС) жоғарылауын көрсетті. ) талдау IGF2BP3 нокдаунымен жасуша пролиферациясының айтарлықтай төмендеуін көрсетті, бұл өмір сүру үшін B-ALL жасуша желілерінің IGF2BP3-ке тәуелділігін растады (2-сурет, D және E). жою IGF2BP3 CRISPR-Cas9 жүйесін қолданатын локус RS411 ұяшық желісінде де жасалды. Біз LentiCRISPR жүйесін (24) 2 түрлі бағыттаушы жіптермен, Cr1 және Cr2, мақсатқа жету үшін қолдандық. IGF2BP3 жою орны. CRISPR арқылы жою T7 эндонуклеаза талдауымен (Қосымша 2, D және E суреті) IGF2BP3 протеинінің Cr2 бағыттаушы РНҚ бар толық күшін жою арқылы расталды, ал қалдық ақуыз Cr1 арқылы анықталды (2F-сурет). Cr2 арқылы жою MTS талдауы арқылы жасуша пролиферациясының төмендеуіне, суб-G1 бояуының жоғарылауына және анексин V оңдылығының жоғарылауына әкелді (2-сурет, G–I). Бұл тұжырымдарды растау үшін біз лентивирустық siRNA экспрессия жүйесін пайдалана отырып, NALM6 жасушаларында нокдаунға арналған IGF2BP3-ті мақсат еттік (Қосымша сурет 2A). Азайтылды IGF2BP3 mRNA деңгейлері екі siRNA-да да байқалды, si2 жасуша пролиферациясының күшті төмендеуін береді, бұл MTS талдауынан көрінеді (қосымша 2, В және С сурет). Бірге бұл нәтижелер IGF2BP3-тің B-ALL-да жасушалардың өмір сүруін және пролиферациясын сақтаудағы маңыздылығын көрсетеді.

IGF2BP3 нокдаун жасуша өсуінің бұзылуына және апоптоздың жоғарылауына әкеледі. (А) IGF2BP3 адамның B-ALL жасуша желілеріндегі экспрессиясы. (Б) IGF2BP3 нокдаунында қолданылатын лентивирустық вектордың схемасы. (C) IGF2BP3 RS411 ұяшық сызығында көрсетілген qPCR арқылы өлшенген құлату (т сынақ ***П = 0.0005). (D) Пропидий йодидті бояумен жасушалық циклды талдау. (Е) IGF2BP3 нокдаунымен жасуша пролиферациясының айтарлықтай төмендегенін көрсететін MTS талдауы. (F) Cr1 немесе Cr2 құрылымдарын пайдаланып CRISPR-Cas9 арқылы мақсатты бағыттаудан кейін IGF2BP3 өрнегін көрсететін Western Blot. Cr1-делдалдық мақсаттау кейбір қалдық ақуызға әкеледі. β-Актин жүктеуді басқару құралы ретінде пайдаланылады. (Г) Cr2 нысанаға алғаннан кейін жасуша пролиферациясының айтарлықтай төмендегенін көрсететін MTS талдауы (т сынақ **П Барлық белгіленген салыстырулар үшін ≤ 0,01). (Х) Cr2-экспрессиялайтын жасушаларда жасуша өлімінің жоғарылауын (суб-G1 шыңы) көрсететін пропидий йодидімен бояу арқылы жасуша циклін талдау. (I) IGF2BP3 KO бар Cr2 мақсатты жасушаларда анексин V бояуының жоғарылауы. I3, IGF2BP3. Валидация үшін эксперименттер 3× жүргізілді. Деректер орташа ±SD көрсетеді. Сондай-ақ Қосымша 2-суретті қараңыз. UbC, ubiquitin C промоторы Puro, пуромицин LC, lentiCRISPR бақылауы.

IGF2BP3-тің мәжбүрлі экспрессиясы лейкоциттердің жоғарылауына және ұлғаюына әкеледі. Гемопоэтикалық жүйедегі IGF2BP3 рөлін тікелей бағалау үшін біз мәжбүрлі экспрессияның әсерін зерттеу үшін in vivo экспериментін жасадық. Біз бастапқыда IGF2BP3 адамның немесе тінтуірдің кодтау тізбегін MIG, тышқан бағаналы жасуша вирусына негізделген (MSCV негізіндегі) ретровирустық векторға клондадық (3A сурет) және IGF2BP3 және GFP маркерін экспрессиялаудағы вектордың функционалдығын растадық (сурет) 3, B–D және деректер көрсетілмеген). 4 аптада осы тышқандардың шеткі қан кетуі GFP + жасушаларының айтарлықтай ұлғаюын көрсетті, ол адам мен тінтуірдің мәжбүрлі экспрессиясы бар тышқандарда уақыт өте келе сақталды. IGF2BP3, туа біткен CD45.2 және CD45.1 FACS маркерлерімен өлшенгендей (3-сурет, E және F). Сонымен қатар, IGF2BP3 экспрессиясына қатысты гемопоэтикалық шығудың жоғарылауын растайтын GFP + лейкоцит жасушаларының айтарлықтай жоғарылауы табылды (3G-сурет). Бұл өзгерістер толық трансплантациядан кейін перифериялық қандағы В жасушасы мен миелоидты жасушалар санымен шектелді (3-сурет, H және I). Перифериядағы Т жасушаларының санында айырмашылық болмады (3J сурет). Бір қызығы, тромбоциттер мен эритроциттердің саны IGF2BP3-қолданылған экспрессиямен айтарлықтай төмен болды (3-сурет, K және L). Бұл тұжырымдар бірге IGF2BP3 БМ-дан жалпы гемопоэтикалық шығуға ықпал ететінін және BM дамуын В жасушасына/миелоидтық линияға және Т-жасушаларынан, эритроидты жасушалардан және мегакариоциттерден алшақтатады деп болжайды. Бұл нәтижелер, атап айтқанда, В жасушалары мен миелоидты жасушалардың артықшылықты ұлғаюы, MLL қайта түзілулері тек B-ALL-да ғана емес, сонымен бірге жедел миелоидты лейкозда және аралас лейкозда жиі кездеседі, бұл көбінесе В-нің екеуін де білдіретін. жасуша және миелоидты маркерлер.

IGF2BP3-тің мәжбүрлі экспрессиясы В-жасушаның/миелоидты дамуының жақсаруына және қисаюына әкеледі. (А) IGF2BP3 мәжбүрлі өрнек үшін пайдаланылатын бицистрондық вектордың схемасы. (Б) Вестерн блоты тышқанның В алдындағы жасуша сызығында IGF2BP3 шамадан тыс экспрессиясын көрсетеді, 7OZ/3 және адамның эмбриональды бүйрек жасушалары желісі, 293T. (C) mRNA деңгейінде 7OZ/3 шамадан тыс экспрессияны көрсететін qPCR (т сынақ **П = 0.0013). (D) БМТ кейін 6 аптадан кейін тышқандардан алынған PB-ның FACS талдауы сәтті транскрантация мен трансдукцияны (GFP +) көрсетеді. (Е) CD45.2 және GFP позитивтілігін (бір жақты ANOVA, содан кейін Бонферрони сынағы арқылы) БМТ кейін 4 аптада орындалған PB FACS ****П < 0,0001). (F) Трансплантациядан кейінгі 4 және 16 апта аралығындағы PB-дегі GFP экспрессиясының саны әсердің айқын және тұрақты екенін көрсетеді. (Г) 16 аптада PB лейкоциттер саны лейкоциттердің жоғарылауын көрсетеді (Бонферрони сынамасымен бір жақты ANOVA ***П & lt 0.001). (Х және I) B220+ ұяшықтарының едәуір жоғары саны (Х) және CD11b + ұяшықтары (I) PB (Бонферрони сынағымен бір жақты ANOVA ***П & lt 0.001). (Дж) Т-клеткалардың FACS негізіндегі санауы айналымдағы Т жасушаларында айтарлықтай өзгерісті көрсетпейді. (Қ және L) CBC арқылы эритроциттер мен тромбоциттерді санау айтарлықтай төмендегенін көрсетеді (Бонферрони сынамасы бар бір жақты ANOVA ***П < 0,001, ****П < 0,0001). n = 8 барлық 3 топ үшін. PB, перифериялық қан БМТ, БМ трансплантациясы hI3, адамның IGF2BP3 mI3, тышқан IGF2BP3 CBC, толық қан анализі LTR, ұзақ терминалды қайталанатын IRES, рибосоманың ішкі кіру орны. Валидация үшін үш бөлек BMT эксперименті аяқталды. Деректер орташа ±SD көрсетеді.

IGF2BP3-тің мәжбүрлі экспрессиясы пролиферацияның жоғары қарқыны бар БМ-де прогениторлардың көбеюіне әкеледі. Осы гемопоэтикалық өзгерістерді әрі қарай сипаттау үшін IGF2BP3 шамадан тыс экспрессияланатын тышқандар құрбандыққа шалынды және трансплантациядан кейін 6 айдан кейін қан жасау органдары талдау үшін жиналды. GFP + жасушаларының пайызы шеткергі қанға ұқсас IGF2BP3 шамадан тыс экспрессиялық БМ-де айтарлықтай жоғары болды (қосымша 3, А және В сурет). БМ-дегі миелоидты және В жасушаларының жалпы үлесі бақылау және IGF2BP3-экспрессиялайтын тышқандар арасында ұқсас болды (қосымша сурет 3, C және D). BM тінтуірінен жиналған РНҚ-дан алынған qPCR адам мен тінтуірдің IGF2BP3 шамадан тыс экспрессиясын растады (қосымша 3, E және F суреті). Бұл өзгерістер бізді БМ-да гемопоэтикалық прогениторларда өзгерістер бар-жоғын сұрауға әкелді. Шынында да, IGF2BP3-тің мәжбүрлі экспрессиясы HSCs, лимфоидпен толтырылған мультипотентті прогениторлар (LMPPs) және жалпы лимфоидты ізашарлар (CLPs) фракциясының ұлғаюына әкелді (4-сурет, A–C). Біз Hardy және басқалары жасаған схеманы орындау арқылы В жасушаларының даму жолын ұстандық. ( 25 ). Hardy фракцияларының арасында біз A және B фракцияларындағы жасушалар санының айтарлықтай ұлғаюын байқадық, дамудың кейінгі кезеңдерінде байқалған айтарлықтай айырмашылықтар байқалмайды (3-сурет, H, I және K қосымша). Демек, IGF2BP3 шамадан тыс экспрессиясы HSC деңгейінен бастап, про-В жасушалық сатысына дейін жетілмеген гемопоэтикалық фракциялардың ұлғаюына әкелді. БМ-дағы әртүрлі прогениторлық жасушалардың пролиферация жылдамдығын талдау үшін біз Ki67 көмегімен жасушаішілік бояуды прогениторлық жасушалардың дақтарымен бірге орындадық. Ki67 Lin – Sca1 + c-Kit + (LSK) популяциясында және IGF2BP3 шамадан тыс экспрессиялық BM-дегі LMPP-де айтарлықтай жоғары болды (4-сурет, D және E). CLPs Ki67 өрнегінде айтарлықтай айырмашылықты көрсетпеді (қосымша сурет 3, G және J). Бұл тұжырымдар IGF2BP3 экспрессиясының жоғарылауына байланысты ерте ұрпақтардың (HSCs және LMPPs) пролиферация жылдамдығының жоғарылауын білдіреді. Болжам бойынша, бұл олардың санының ұлғаюына және анағұрлым сенімді төменгі тегінің (CLPs және Hardy фракциялары А және В) дифференциациясына әкеледі. Демек, IGF2BP3-тің мәжбүрлі экспрессиясы ерте ұрпақтар популяцияларының санының артықшылықты өсуіне және пролиферациясына себеп болады, бұл шеткерде байқалған В жасушасы- және миелоидты жақты лейкоцитозға әкеледі.

IGF2BP3 шамадан тыс экспрессияланатын тышқандардан БМ тегі популяциясын талдау. (А) Басқару векторынан – (сол жақтан екінші панель), адам IGF2BP3– (оң жақтан екінші) және тышқандар IGF2BP3 – шамадан тыс экспрессивті тышқандардан (оң жақтағы панель) HSC анықтау үшін санау (сол жақтағы панель) және репрезентативті ағын цитометрия гистограммалары. (Б және C) Тышқандардан алынған LMPP және CLP үшін талдау келесідей атап өтілді А. LMPPs және CLPs арасында статистикалық маңызды айырмашылықтар табылды. (D) HSC үшін байытылған LSK популяциясының сол жағында санауымен бірдей жолмен бейнеленген жасушаішілік Ki67 бояуы және FACS негізіндегі талдаулар. Ki67 экспрессиясының жоғары популяциясында айтарлықтай айырмашылықтар анықталды. (Е) Клетка ішілік Ki67 бояуы және LMPP популяциясындағы пролиферацияның FACS талдауы пролиферативті фракциядағы елеулі айырмашылықтарды көрсетеді. Барлық салыстыруларда бір жақты ANOVA, содан кейін Бонферрони сынағы қолданылды. *П < 0,05 **П & 0,01 ***П & lt 0.001 ****П < 0,0001. LSK, Lin – Sca1 hi c-Kit hi . Валидация үшін үш бөлек BMT эксперименті аяқталды. Деректер орташа ±SD көрсетеді. Қосымша 3-суретті де қараңыз. hI3, адам IGF2BP3 mI3, тышқан IGF2BP3.

IGF2BP3 тимустағы В жасушаларының және көкбауырдағы миелоидты жасушалардың санын арттырады. Қалыпты тінтуір тимус негізінен Т-жасушалық прогениторлардан тұрады, бірақ лейкемия мен лимфоманың көптеген тышқан үлгілерінде ол үлкейіп, қатерлі лейкоциттермен толып кетеді (26). Микроскопиялық зерттеуде IGF2BP3 үлкен жасушалармен инфильтрациямен тимусты медулярлық кеңеюді тудырды. Адамның IGF2BP3 экспрессиясы бар тимустардың бірінде кортико-медуллярлық қосылыс толық абляциясы болды (5А-сурет). Демек, IGF2BP3 экспрессиясы қатерлі трансформацияның прекурсоры болуы мүмкін. Адам немесе тінтуір IGF2BP3 шамадан тыс экспрессияланған кезде тимустағы GFP + B220 + B жасушаларының айтарлықтай жоғары пайызын байқадық, бұл әсер тінтуір IGF2BP3 арқылы айқынырақ болды (5, В және С-сурет). Тінтуірдің IGF2BP3 экспрессиясы бар тышқандар да CD3ε + T жасушаларының санының айтарлықтай төмендеуін көрсетті. Бұл тимустардағы GFP + жасушаларының деңгейінде айтарлықтай айырмашылық болмады, бұл В жасушаларының тектік спецификалық кеңеюін көрсетеді (Қосымша 4-сурет, G–I). Адамның IGF2BP3 шамадан тыс экспрессиясы бар тимустың төртеуі және IGF2BP3 шамадан тыс экспрессиялық тінтуірдің 1/8 бөлігінің салмағы 50 мг-нан жоғары болды, бақылау тышқандарында мұндай өсім байқалмады (деректер көрсетілмеген). Бір қызығы, көкбауырлар IGF2BP3 мәжбүрлі экспрессиясынан кейін де ұлғайған. Көкбауыр салмағындағы айырмашылықтар адам IGF2BP3 шамадан тыс экспрессиясы бар тышқандар үшін статистикалық маңызды болды, бұл тінтуірдің IGF2BP3 тобына тән трендпен (4А қосымша суреті). IGF2BP3 CD3ε + T жасушаларының санының айтарлықтай төмендеуімен көкбауырдағы миелоидты жасушалардың көбеюіне әкелді (4-сурет, B-F қосымша). Жалпы алғанда, IGF2BP3 гемопоэтикалық даму бағдарламасын В жасушасы мен миелоидтық линияларға қарай қисайтады. Демек, БМ-да байқалатын өзгерістер - В-лимфоидты және миелоидты тегінің көбеюі мен көбеюі - шеткері гемопоэтикалық гомеостаздың өзгеруіне әкелуі мүмкін.

IGF2BP3 шамадан тыс экспрессивті тышқандардан тимустың жасушалық құрамын және бәсекеге қабілетті репопуляциялық артықшылықты талдау. (А) IGF2BP3 мәжбүрлі экспрессиясы бар тышқандардың тимус бөлімдерінің гистологиялық суреттері. H&E бояуы. Масштаб жолағы: 40 мкм. (Б және C) Міндетті экспрессиясы бар тышқандардың тимусындағы B220 + жасушаларының ұлғаюын көрсететін FACS өкілі графиктері және санау (Бонферрони сынағымен бір жақты ANOVA **П < 0,01). Сондай-ақ 4-суретті қараңыз. n = 8 барлық 3 топ үшін. Валидация үшін үш бөлек BMT эксперименті аяқталды. (DХ) Бәсекеге қабілетті қайта құруды зерттеу. (D) IGF2BP3 бәсекелес репопуляциясын зерттеуде трансплантациядан кейінгі 4 және 20 апта аралығындағы PB-дегі GFP экспрессиясының сандық көрсеткіші. (ЕГ) PB FACS (Е), BM (F) және тимус (Г) БМТ кейін 20 аптада орындалды, CD45.2 және GFP оңдылығын көрсетеді (бір жақты ANOVA, содан кейін Бонферрони сынағы **П < 0,01, ***П & lt 0.001). (Х) шамадан тыс экспрессияны qPCR растау IGF2BP3 тінтуірде BM (т сынақ ***П = 0.0006). n = 8 (MIG), n = 8 (Hoxa9), n = 5 (hI3), және n = 4 (100% CD45.1). Валидация үшін бәсекелестік репопуляцияны зерттеу 3× аяқталды. Деректер орташа ±SD көрсетеді. hI3, адам IGF2BP3 mI3, тышқан IGF2BP3 PB, перифериялық қан.

IGF2BP3 гемопоэтикалық прогениторларға өмір сүру артықшылығын береді. IGF2BP3 шамадан тыс экспрессиясы BM прогениторларын сәулелендірілген хост тінтуірінің BM қайта толтыру кезінде артықшылықпен жабдықталғанын растау үшін біз ресми бәсекеге қабілетті репопуляция трансплантациясы талдауын жасадық. CD45.1 BM жасушаларының 50 пайызы 50% MIG немесе IGF2BP3- немесе HOXA9 шамадан тыс экспрессивті CD45.2 BM жасушаларымен араласып, өлімге әкелетін сәулеленген тышқандарға енгізілді. IGF2BP3 шамадан тыс экспрессиялайтын CD45.2 жасушаларының уақыт өте келе шеткергі қан кетулердегі еңгізу кезінде MIG- немесе MIG-HOXA9-экспрессиялаушы жасушалардан айқын артықшылығы болды (5-сурет, D және E). БМ жинау IGF2BP3 BM жасушаларына бәсекелестік артықшылық беретінін көрсетті (5F-сурет). Бұл тимуста да көрініс тапты (5G-сурет).Бұл IGF2BP3 шамадан тыс экспрессиясын (5Н-сурет) көрсететін бұрынғы деректерімізді растайды, бұл BM прогениторы санының, сондай-ақ пролиферация жылдамдығының артуына әкеледі.

iCLIP B-ALL жасушаларындағы IGF2BP3-РНҚ интерактомын анықтайды. Жақында RBP әрекетінің молекулалық негізі iCLIP және жоғары өткізу қабілеттілігі секвенциясы арқылы зерттелді. IGF2BP3 жасушаларының өсуі мен MLL басқаратын лейкемогенездегі рөлі туралы түсінік алу үшін біз осы протеинмен iCLIP талдауын жасадық. iCLIP нуклеин қышқылы мен ақуыз қалдықтарының фотореактивтілігін және in situ болып жатқан ақуыз-РНҚ өзара әрекеттесулерін түсіру үшін ақуызбен байланысқан транскрипттердің нуклеазалық фрагментациясын пайдаланады. IGF2BP3-ке қарсы антиденелер бақылау немесе ультракүлгін сәулеленген RS411 және REH жасушаларынан ақуыз-РНҚ кешендерін иммунопреципитациялау үшін пайдаланылды (қосымша 5, A және C суретте көрсетілген кіріс). Күтілгендей, иммунопреципитацияланған материал антиденеге тәуелді және ультракүлгін сәулеге тәуелді болды, ал кешеннің электрофоретикалық қозғалғыштығы ақуыз-РНҚ кешені үшін болжанғандай нуклеазаға сезімтал болды (қосымша 5, В және D сурет). Копреципитацияланған РНҚ cDNA кітапханаларына түрлендірілді (қосымша 5E сурет) және жоғары өткізу қабілеттілігі секвенирлеуіне ұшырады. ПТР қайталануларын есептегеннен кейін біз әрбір репликада шамамен 1 миллион оқуды алдық, оның ішінде >70% адам геномымен бірегей түрде салыстырылған (Қосымша 1-кесте). RS411 және REH ұяшықтарынан алынған iCLIP тізбегін қайталау жоғары қайталанатын болды (қосымша 6, D және E суреті). Гетерогенді рибонуклеопротеин A1 (hnRNPA1 HEK жасушалары) үшін iCLIP кросс-байланыс тораптарымен және геномнан кездейсоқ алынған модельденген деректермен салыстырғанда, iCLIP тізбектерінің 5′ соңында орналасқан IGF2BP3 кросс-байланыс тораптары экзондармен байытылды (6А-сурет) .

Адамның лейкозының жасушалық желілеріндегі IGF2BP3 iCLIP талдауы. (А) Экзондарда, интрондарда немесе адам геномының аннотацияланбаған аймақтарында байқалған IGF2BP3 (REH және RS411 жасушалары), hnRNPA1 (HEK жасушалары) және симуляцияланған (Геном) айқаспалы байланыс тораптарының үлесі. (Б) Кодтаушы және кодталмаған экзондардағы IGF2BP3 (REH және RS411 жасушалары), hnRNPA1 (HEK жасушалары) және симуляцияланған (мРНҚ фоны) байланыстыру орындарының үлесі. (C) RS411 және REH ұяшықтарындағы IGF2BP3 кросс-байланыстыру орындарында тетрамер тізбегін байыту (тиісінше жоғарғы және төменгі панель). (D) IGF2BP3 (REH, RS411) және hnRNPA1 (HEK ұяшықтары) аяқтау кодондарына қатысты көлденең байланыс учаскесінің тығыздығы. (Е) REH (қара көк сызық) және RS411 (ашық көк сызық) ұяшық сызықтарынан алынған IGF2BP3 қиылысу тығыздығы, аннотацияланған miR мақсатты тораптарына қатысты салыстырылады. HEK293 ұяшықтарынан hnRNPA1 (қара сызық) айқастыратын тораптар басқару элементі ретінде қосылған. (F және Г) UCSC Genome шолғышының суреті CDK6 және MYC 3′UTR локустары, сәйкесінше. Әрбір панель геннің экзон-интрондық құрылымын, омыртқалы жануарлар түрлері бойынша бірізділікті сақтауды және әрбір ұяшық сызығынан 2 iCLIP репликасынан алынған бірегей оқуды қамтиды. Әрбір позициядағы ең көп оқу саны әр гистограмманың сол жағында көрсетілген. Сондай-ақ 5 және 6 қосымша суреттерді қараңыз. (Х) IGF2BP3 RIP протеин үлгілерінің батыс дақтары. Кіріс иммунопреципитация үшін пайдаланылатын RS411 жасуша лизатына қатысты. FT - бұл бақылаудан (тінтуірдің IgG) немесе IGF2BP3 RIP арқылы иммунопреципитация ағыны. RIP - бақылаудан (тышқан IgG) немесе α-IGF2BP3 антиденелерінен (D-7) РНҚ иммунопреципитациясы. (I) үшін қатпарлы байытуды салыстыратын шашыраңқы жолақ сызбалары MYC (n = 4, т сынақ **П < 0,01) және CDK6 (n = 3, т сынақ *П < 0,05) бақылауда (тінтуірдің IgG) және α-IGF2BP3 антиденелерінің РНҚ иммунопреципитацияларында. деңгейлері MYC және CDK6 сілтеме ретінде 18s рРНҚ бар жалпы РНҚ кіріс деңгейлеріне қалыпқа келтіріледі.

Біз RS411 және REH жасушаларының әрбір биологиялық көшірмесінде теріс биномдық модельді (Әдістерді қараңыз) пайдаланып шыңдарды анықтадық. Барлығы REH және RS411 iCLIP эксперименттерінде сәйкесінше 669 гендегі 849 шың және 1149 гендегі 1937 шың анықталды. mRNA тізбегінде шақырылған шыңдардың көпшілігі 3′UTR ішінде орналасқан (6В-сурет және 6-қосымша сурет, A–C). Айқас байланысқан аймақтардағы реттілік ерекшелігін іздеу REH және RS411 деректер жиынында фондық GCAC тетрамері бар мотивтердің 8-16 есе байытылуын анықтады (6С-сурет). Мақсатты транскрипттердің 3′UTR-де IGF2BP3 байланыстыру орындарының айқын ауытқуын ескере отырып, біз mRNA тоқтату кодондарына қатысты бір нуклеотидтік рұқсатта кросс-байланыс сайттарының позициялық ауытқуын зерттедік. IGF2BP3 кросс-байланыс тығыздығы 3′UTR-дегі hnRNPA1-ден ерекшеленді, оның шыңына тоқтау кодонынан төмен қарай жетті. Бұл деректер 3′UTR ішіндегі IGF2BP3 байланыстыратын тораптар B-ALL ұяшық сызықтарының екеуінде де тоқтау кодонына жақын тізбектерге арнайы бағытталғанын көрсетті (6D-сурет).

IGF2BP3 кросс-байланыс тораптарының 3′UTR ішінде таралуына негізделе отырып (6D-сурет), біз IGF2BP3 байланыстыру тораптарымен қабаттасуы мүмкін деп болжадық. cis-3′UTR арқылы гендік реттеумен байланысты реттеуші ерекшеліктер. Бұл мүмкіндікті зерттеу үшін біз IGF2BP3 кросс-байланыстырушы тораптарының 2 түрлі жасуша желісіндегі miR мақсатты сайттарына қатысты таралуын зерттедік. Модельденген кросс-байланыс тораптарының біркелкі фондық таралуын түзеткеннен кейін, біз REH және RS411 ұяшық желілеріндегі IGF2BP3 кросс-байланыс тығыздығы болжанған miR мақсатты тізбегіне негізделген 25-bp терезеде жоғары байытылғанын анықтадық (6E сурет). Керісінше, hnRNPA1 кросс-байланыс сайттарының тығыздығы miR мақсатты сайттарына қатысты біркелкі бөлінген. iCLIP-секвенирлеу (CLIP-Seq) арқылы күшті сигналы бар гендердің арасында болды CDK6 және MYC. IGF2BP3-тің осы 2 нысанмен iCLIP арқылы өзара әрекеттесуін көрсететін тұжырымдарымызды растау үшін (6-сурет, F және G) біз РНҚ иммунопреципитациясын (RIP 6H суреті) қолдандық, ол MYC және CDK6 (6I-сурет) IGF2BP3 RIPs ішіндегі тінтуірдің IgG басқаруы. Бұл деректер адам лейкозының жасушаларынан алынған IGF2BP3 РНҚ өзара әрекеттесу аймағының толық атласын біздің білуімізше алғаш рет көрсетеді. Бұл кең ауқымды өзара әрекеттесу картасы IGF2BP3-тің 3′UTR-ге біркелкі емес байланысуын, miR мақсатты сайттарының жанында GCAC-ға бай консенсус мотивін таңдауды көрсетеді.

IGF2BP3 өз мақсаттарының өрнегін модуляциялайды. Функционалды түрде жіктеу үшін ENRICHR құралы ( 27 ) пайдаланылды IGF2BP3 REH және RS411 жасушаларындағы мРНҚ мақсаттары. Екі жасуша желісінде де біз мақсатты транскрипттердің рибосома биогенезіне және трансляцияға байланысты KEGG жолдары үшін байытылғанын анықтадық (қосымша кесте 2). Керісінше, ENRICHR бойынша жіктелген транскрипттер патогендіктерге қатысты E. coli инфекция және, мүмкін, ең бастысы, созылмалы миелоидты лейкоз (CML) RS411-де байытылған, бірақ REH деректер жинағы емес (Қосымша кесте 2). Осылайша, біз жаһандық деңгейде геннің экспрессиясына IGF2BP3 байланысуының функционалдық салдарын одан әрі зерттегіміз келді. IGF2BP3 iCLIP мақсаттары (3-қосымша кесте) IGF2BP3 өрнек деңгейлерімен реттелетінін анықтау үшін біз бақылауда және IGF2BP3-таусылған RS411 жасушаларында RNA-Seq орындадық (4-қосымша кесте). RS411-спецификалық IGF2BP3 iCLIP мақсаттарымен кем дегенде 1,5 есе дифференциалды түрде экспрессияланған гендердің айқаспалы валидациясы 216 жалпы генді тапты. Осы мақсаттардың көпшілігі IGF2BP3 таусылуымен IGF2BP3 iCLIP мақсаттарының экспрессиясының төмендегенін көрсетті (157 азайды және 59 өсті, 7A суреті). Жалпы гендер когортасын жіктеу үшін ENRICHR құралын пайдалана отырып, OMIM ауруының гендік онтологиялық талдауы (GO талдауы) лейкемогенезбен байланысты гендерді анықтады (7А-суреттегі қара шеңберлер), соның ішінде CDK6 және MYC. Төмен реттелетін IGF2BP3 iCLIP мақсаттары үшін GO талдауы посттранскрипциялық бақылаумен, гемопоэтикалық жасушалардың дифференциациясымен және хроматин модификациясымен байланысты гендерді анықтады (сурет 7C). KEGG Pathway талдауы сондай-ақ бұл нысандардың жасушалық циклге және әртүрлі қатерлі ісік жолдарына қатысатынын көрсетті (7C-сурет). Керісінше, жоғары реттелетін IGF2BP3 iCLIP мақсаттары негізінен трансляциямен және ақуызды локализациямен байланысты гендерді ашты (сурет 7B).

IGF2BP3 iCLIP мақсаттарының IGF2BP3-сезімтал дифференциалды экспрессияланған гендермен айқаспалы валидациясы. (А) Дифференциалды түрде экспрессияланған гендердің жанартау сызбасы (көк нүктелер) бақылаудан алынған RNA-Seq үлгілеріндегі DESeq талдауы арқылы анықталған және IGF2BP3 нокаут RS411 жасушалары (2-суретте сипатталғандай). iCLIP арқылы IGF2BP3 мақсаттары ретінде анықталған дифференциалды экспрессияланған гендер бөлектеледі (қызғылт сары нүктелер). Қара контурлармен бөлінген нүктелер OMIM-ассоциацияланған ауру жолдарының GO талдауы арқылы лейкемогендік гендер болып табылады. Нүктелі сызықтар өрнектің 1,5 есе өзгеруін білдіреді (тік сызықтар) және П < 0,05 кесу (көлденең сызық). (Б және C) экспрессияның жоғарылауын көрсететін гендік топшалардың GO талдауы (Б) және азайған өрнек (C) ENRICHR ген тізімін байыту талдау веб-құралы арқылы IGF2BP3 нокдаунымен. Осы талдауда қолданылған термин тізімдері 269 IGF2BP3 мақсатты және -сезімтал гендердің айқас расталған тізімінен байытылған процестер мен жолдарды анықтау үшін GO_Biological_Processes және KEGG болды. Тік нүктелі сызықтар білдіреді П мәнді кесу (П < 0,05). К.Д., нокдаун.

CDK6 және MYC mRNAs in vitro және in vivo IGF2BP3 нысанасы болып табылады. Көптеген IGF2BP3 мРНҚ нысандарының арасында, CDK6 және MYC MLL-транслокацияланған B-ALL патогенезінде өте маңызды (6, 7). Біздің пациенттердің деректер жинағында B-ALL-ның MLL-транслокацияланған жағдайлары IGF2BP3 арқылы байланыстырылған және реттелетін нысаналар ретінде ұсынылған рөліне сәйкес осы гендердің жоғары деңгейлерін көрсетті (1, А және В қосымша суреті). IGF2BP3 экспрессиясын посттранскрипциялық түрде реттейтін гипотезаны тексеру үшін CDK6 және MYC 3′UTR-де байланыстыратын тораптар арқылы біз тиісті UTR-терді қамтитын қос люцифераза репортер жүйесін пайдалана отырып, векторлар сериясын жасадық (8А-сурет). The CDK6 3′UTR (10 кб) 5 бөлек бөлікке клондалған (CDK6-1 - CDK6-5). Люцифераза векторларының IGF2BP3-пен котрансфекциясы CDK6-3-те люцифераза белсенділігінің CDK6-5-ке дейін жоғарылауына, сондай-ақ MYC 3′UTR тілшілері (8В-сурет). Бұл iCLIP және RNA-Seq деректерімен бірге осы гендердің 3′UTR-мен IGF2BP3 байланысуын растайды, мРНҚ-ны тұрақтандырады және/немесе аударманы күшейтеді. Ішіндегі байланыс орындарының бірінің мутациясы MYC 3′UTR, MYC Δ3 деп белгіленген, IGF2BP3-тәуелді әлсіреуінің аз, бірақ қайталанатын әлсіреуіне әкелді. MYC 3′UTR репортері (8C-сурет). Дегенмен, IGF2BP3 байланыстыратын жеке учаскелердің мутациясы CDK6 3′UTRs, одан кейін IGF2BP3 шамадан тыс экспрессиясы және люцифераза талдауы айтарлықтай айырмашылықты көрсетпеді (деректер көрсетілмеген). Бұл нәтижелер келесі мүмкіндіктердің бірінен туындауы мүмкін: (i) ген экспрессиясының өзгеруі үшін байланысу жеткіліксіз болуы мүмкін немесе (ii) ген экспрессиясына әсер ету үшін бірнеше учаскелерде бірлескен байланысу қажет болуы мүмкін. Шынында да, миР жағдайында кейбір параллельдер байқалды, онда репрессияның жоғарылауы бірнеше байланыстыру орындары бар нысандарда байқалады (28). Дегенмен, IGF2BP3 байланысуы IGF2BP3 артық экспрессиялайтын жасушаларда CDK6 және MYC деңгейлерінің жоғарылауына және нокдаун жасушаларындағы деңгейлердің төмендеуіне әкеледі деп болжанады.

CDK6 және MYC IGF2BP3 арқылы бағытталған. (А) Қолданылған люцифераза талдауының схемасы. (Б) Мақсаттылығын көрсететін люцифераза талдауы CDK6 және MYC IGF2BP3 бойынша 3′UTR (т сынақ *П = 0.05 П = 0,0250 CDK6-4, П = 0,0475 CDK6-5, П = 0,0165 MYC). (C) жою MYC IGF2BP3 3′UTR байланыстыру орындары қарапайым, бірақ люцифераза белсенділігінің айтарлықтай төмендеуіне әкелді (т сынақ *П = 0.05 П = 0,0120 MYC, П = 0,0294 MYC Δ3). (D және Е) BM тегінің CDK6 талдауы GFP + BM жасушаларында CDK6 ақуызының айтарлықтай артқанын көрсетеді (т сынақ *П = 0.0213) (D) бірақ GFP-де емес – (Е) жасушалар. (F және Г) MYC үшін жасушаішілік бояу IGF2BP3 әсерінен кейін GFP + BM жасушаларында айтарлықтай жоғарылаған деңгейлерді көрсетеді (т сынақ ****П < 0,0001) (F) бірақ GFP-де емес – (Г) жасушалар. n = 8 барлық 3 топ үшін. (Х және I) Кейін Igf2bp3 7OZ/3 ұяшықтарындағы құлату (т IGF2BP3 si1 және si2 сынағы ***П = 0.0007, ***П = 0,0005), CDK6 және MYC протеинінің экспрессиясы төмендейді (Х). RS411 жасушалық желісінде Western blot IGF2BP3 протеинінің құлағанын және CDK6 ақуызының экспрессиясының төмендегенін растады (I). Валидация үшін эксперименттер 3× жүргізілді. Деректер орташа ±SD көрсетеді. Сондай-ақ Қосымша 7-суретті қараңыз. hI3, адам IGF2BP3 PE, фикоэритрин.

IGF2BP3 CDK6 және MYC in vivo нысанаға алатынын анықтау үшін біз IGF2BP3 экспрессиясы бар тышқандардың БМ жасушаларында жасушаішілік бояуды орындадық және ағын цитометриясы арқылы орташа флуоресценция қарқындылығын (MFI) өлшедік. Адамның IGF2BP3-экспрессиялайтын тышқандарынан алынған BM GFP + жасушалары CDK6 және MYC үшін MFI-ны арттырды (8-сурет, D және F). Бақылау ретінде GFP – екі топтың ұяшықтары ешқандай айырмашылықты көрсетпеді (8-сурет, E және G). Осы in vivo деректерін толықтыру үшін біз IGF2BP3 бұрын siRNA көмегімен ыдыраған жасуша желілеріндегі CDK6 және MYC ақуыз деңгейлерін талдадық. IGF2BP3 нокдаунынан кейін RS411 жасушаларында CDK6 ақуыз деңгейінің айтарлықтай төмендеуі байқалды (8I-сурет). Сол сияқты, Igf2bp3 тышқанның пре-B 7OZ/3 жасушалық сызығын құлату CDK6 және MYC ақуызының азаюына әкелді (8-сурет, H және I). Бұл нәтижелер RNA-Seq деректерімен сәйкес келеді және IGF2BP3 үшін сақталған функцияны көрсетеді (7А-сурет).

mRNA деңгейінде IGF2BP3 шамадан тыс экспрессиясы аздап, бірақ айтарлықтай жоғарылауына әкелді. Myc мРНҚ деңгейлері, бірақ ішінде емес CDk6, жаппай БМ (Қосымша 7, А және В суреті). ұлғаюы мүмкін CDk6 БМ жасушаларының гетерогенділігіне немесе IGF2BP3 арқылы мРНҚ тұрақтылығына әсері мРНҚ-ға тән болуы мүмкін болғандықтан, мРНҚ анықталмауы мүмкін. Сол сияқты, тышқанның 7OZ/3 жасушалары да аздап өскенін көрсетті CDk6 IGF2BP3 тышқан шамадан тыс экспрессияланған кездегі мРНҚ деңгейлері (Қосымша сурет 7, C–E). Бұл нәтижелер IGF2BP3 байланысуын және осы мақсатты гендердің кейінгі трансляциялық күшейтуін растайды. Жалпы алғанда, бұл эксперименттер әртүрлі жүйелерде IGF2BP3 арқылы CDK6 және MYC мақсаттылығын көрсетеді және бұл мәжбүрлі экспрессияның байқалған фенотиптік әсерлерінің негізі болуы мүмкін.

Мутацияланған IGF2BP3 in vivo гемопоэтикалық прогениторлар санын арттырмайды. IGF2BP3-тің 6 РНҚ-байланыстырушы домені бар: IGF2BP3-тің РНҚ-байланыстыру функциясына делдал болатыны болжанған 2 РНҚ тану мотивінің домені (RRM) және 4 K гомологиялық домен (KH) домендері. Біз 2 жою мутанттарын жасадық: құрамында тек 4 KH домендері бар және RRM домендерінің екеуі де жоқ KH мутант және 2 RRM домені бар және 4 KH домендері жоқ RRM мутанты (9-сурет, A және F). MIG, WT IGF2BP3, KH және RRM мутанттарымен тышқанның БМ трансплантациясы өліммен сәулеленген реципиенттерге жасалды. WT протеинінен айырмашылығы, бұл мутантты протеиндердің күштеп экспрессиясы күшейтілген гемопоэзді немесе біз бұрын байқаған В жасушасы мен миелоидтық линияларға қарай қисаюды тудырмады. Мутантты реципиент тышқандар сіңірудің төмендегенін көрсетті (9-сурет, В және С). Перифериядағы B жасушалары мен миелоидты жасушалар саны IGF2BP3 мутантты тышқандарда қалыпқа келу тенденциясын көрсетті (9, D және E-сурет). көмегімен люцифераза талдауы MYC 3′UTR және WT және мутант IGF2BP3 салыстыру люцифераза белсенділігінің төмендеуін көрсетті, бұл мутанттар бұдан былай мақсатты мРНҚ-лармен байланыспайды және/немесе тұрақтандырмайды деген идеяны растады (9G-сурет). Бір қызығы, бір зерттеу KH домендерінің рөлі әртүрлі IGF2BP отбасы мүшелерінің (29) арасында IGF2BP3-те жақсы түсінілмейтінін хабарлады. РНҚ байланысуының нақты детерминанттары белгісіз болса да, біздің нәтижелеріміз IGF2BP3 функциясы үшін маңызды домендер мен қалдықтарды анықтау үшін құрылымдық функцияның егжей-тегжейлі талдауларын орындауға серпін береді. Біздің жоғары өнімділік деректерімен бірге бұл эксперименттер осы ақуыздың РНҚ байланыстыру функциясын организм деңгейіндегі фенотиптермен байланыстыратын алғашқы кешенді зерттеулерді қамтамасыз етеді.

IGF2BP3 РНҚ-байланыстырушы домен мутанттарының in vivo және in vitro экспрессиясы. (А) IGF2BP3 байланыстыру домендері және сәйкес мутанттар (KH және RRM) бар схемасы. (Б) Трансплантациядан кейінгі 4 және 20 апта аралығындағы PB-дегі MIG-ге нормаланған трансплантацияның уақыт курсы. (C) CD45.2 және GFP позитивтілігін (бір жақты ANOVA, содан кейін Бонферрони сынағы ***) көрсете отырып, БМТ кейін 4 аптада орындалған PB FACS ***П & lt 0.001). (D) Трансплантациядан кейін 16 аптадан кейін PB-дағы В жасушалары. (Е) Трансплантациядан кейін 12 аптадан кейін PB-дағы миелоидты жасушалар. n = 8 барлық топтар үшін. Валидация үшін мутант BMT эксперименті екі рет аяқталды. (F) Western blot IGF2BP3 (64 кДа), KH (47 кДа) және RRM (22 кДа) белоктарының 7OZ/3-те анти-T7 (үстіңгі панель) және анти-IGF2BP3 (төменгі) антиденелерінің көмегімен экспрессиясын растады. Актин жүктеуді басқару құралы ретінде пайдаланылады. (Г) Люцифераза талдауы люцифераза белсенділігінің жоғарылауын көрсетеді MYC hI3-пен котрансфекцияланған кезде 3′UTR және люцифераза белсенділігі төмендейді MYC KH және RRM мутанттарымен котрансфекцияланған кезде 3′UTR (т hI3, K,H және RRM сынағы ***П & lt 0.001 ****П < 0,0001). Эксперимент 3× аяқталды. Деректер орташа ±SD көрсетеді. hI3, адамның IGF2BP3 PB, перифериялық қан.

2 онжылдық бойы транслокация және нәтижесінде пайда болған синтез белоктары туралы білімге қарамастан, MLL-фузия протеиндері арқылы жүзеге асырылатын лейкемогенездің молекулалық механизмі толық түсінілмейді. Лейкозды дамыту үшін қайталама, генетикалық емес өзгерістер қажет екендігі барған сайын танылады. Мысалы, MLL-AF4 синтез протеині арқылы тартылатын DOT1L арқылы эпигенетикалық белгілердің реттелуі негізгі онкогендік механизм болып табылады (30). Бұл зерттеуде біз RBP, IGF2BP3, B-ALL жағдайларында шамадан тыс экспрессияланатынын анықтадық. MLL ген. Біз посттранскрипциялық ген экспрессиясының дисрегуляциясы да лейкемогенезде маңызды рөл атқаруы мүмкін деп ұсынамыз. Бұл басқа RBP, musashi-2, оның жедел миелоидты лейкозда жоғары дәрежеде көрсетілгенін және оның шамадан тыс экспрессиясы миелоидты лейкемогенезді (31) ілгерілету үшін BCR-ABL-мен ынтымақтаса алатынын көрсеткен алдыңғы зерттеулермен дәлелденді. Тағы бір соңғы мысал - HuR протеині, ол көптеген эпителий қатерлі ісіктерінде реттеледі және мақсатты mRNAs (32) 3′UTR ішіндегі AU-ға бай элементтермен байланысу арқылы өз мақсаттарын тұрақтандырады. Мұндағы нәтижелер реттелмеген RBP өрнек репертуарын B-ALL дейін кеңейтіп, осы ауру туралы жаңа түсініктер береді.

MLL-AF4-экспрессиялық лейкозда IGF2BP3 жоғарылау механизмі маңызды мәселе болып табылады. Біздің зерттеулеріміз BET доменінің ингибиторы RS411-де IGF2BP3-ті төмендететінін көрсетті және бұл төмен дозаларда (23) MLL-делдалдық транскрипцияға арнайы бағытталған деп саналады. Алдыңғы есептер сондай-ақ IGF2BP3-тің тышқанның БМ жасушаларында MLL-AF4 шамадан тыс экспрессиясынан кейін реттелетінін көрсетті (4).Бір қызығы, SEM жасушаларында (MLL-AF4 транслокациясын тасымалдайтын) жанама ChIP-Seq талдауы синтез ақуызының IGF2BP3 (33) бар геномдық локуспен байланысуын көрсетті. Сондықтан бұл туралы болжам жасауға азғырылады IGF2BP3 MLL синтез ақуыздарының тікелей транскрипциялық нысанасы болып табылады. Дегенмен, IGF2BP3 сыналған B-ALL жасушалық желілерінің көпшілігінде, әр түрлі жетілген В жасушалық жаңа түзілімдерде (34 – 37) және бірқатар эпителий қатерлі ісіктерінде шамадан тыс экспрессияланған. Сонымен қатар, бұл ақуыздың дифференциалды реттелуі B-ALL (38) де байқалды. Демек, оның жоғарылау механизмі басқа онкогендік жолдарды қамтуы мүмкін.

Бұрын эпителий жасушаларының линияларында IGF2BP3 нокдаунының жасуша пролиферациясын азайтып, апоптозды тудыратыны көрсетілген (18, 37, 39). Біз IGF2BP3-тің siRNA немесе CRISPR-Cas9 жүйесі арқылы жойылуы немесе жойылуы жасуша пролиферациясының төмендеуіне және RS411, MLL-AF4-экспрессиялайтын жасуша желісі және NALM6, жоғары деңгейлерді көрсететін басқа B-ALL жасуша желісінде апоптоздың жоғарылауына әкелетінін анықтадық. IGF2BP3. Бұл нәтижелер B-ALL жасушаларының қатерлі мінез-құлқын сақтауда посттранскрипциялық гендік реттеудің маңызды рөлін көрсетеді. IGF2BP3 төмен экспрессиялық деңгейлері бар B-ALL IGF2BP3-тің төменгі ағындық әсеріне делдал болатын негізгі mRNA-ларды жарықтандыру мақсатында өзгертілген РНҚ-байланыстыратын репертуарды көрсететінін зерттеу үлкен қызығушылық тудырады.

Бұл ақуыздың патогенетикалық функциясын зерттеу үшін біз сондай-ақ тышқанның гемопоэтикалық жүйесінде IGF2BP3 экспрессиясының бірінші in vivo моделін жасадық. Біз IGF2BP3 BM-дағы HSCs, LMPPs және CLPs санын HSCs және LMPPs таралу жылдамдығының бір мезгілде жоғарылауымен арттыратынын анықтадық. IGF2BP3 бәсекеге қабілетті қалпына келтіру артықшылығын берді және тінтуірдің гемопоэзін B жасушасына және шеткері миелоидтық линияға, шеткергі қандағы лейкоцитозбен, тимустық миға атипті В жасушаларының инфильтрациясымен және көкбауырдағы миелоидты жасушалардың ұлғаюымен қамтамасыз етті. Тышқандар трансплантациядан кейін 6 ай ішінде айқын лейкозды дамытпаса да, бұл дамудың аномальді белгілері B жасушасы мен миелоидтық тегінің кеңеюін қамтитын MLL басқаратын лейкемогенездің басында байқалғандарға ұқсас. Бағаналы және ізашар жасушаларға IGF2BP3 басқаратын мұндай әсерлер және дифференциация тағдырлары гемопоэтикалық жүйеден тыс болуы мүмкін. IGF2BP3 бұл тінде арнайы артық экспрессияланған кезде экзокринді ұйқы безінің қайта құрылуын тудыруы мүмкін және гепатоцеллюлярлық карциномада ісік дің жасушаларында/ісік тудыратын жасушаларда жоғары дәрежеде көрінеді (40, 41).

IGF2BP3 mRNA-ға бағытталғаны белгілі IGF2, CD44, және транскрипция факторы HMGA2 (16, 42). HMGA2 және IGF2BP туралы қосымша есептер олардың ұрықтың HSC-тің өзін-өзі жаңарту әлеуетінде рөл атқаруы мүмкін екенін көрсетті (43, 44). Let-7 miR IGF2BP3-ге (45) бағытталған ісік жасушаларының миграциясы мен инвазиясын тежейтіні белгілі. Осылайша, IGF2BP3 даму және онкогендік процестерді реттеуде жұмыс істей алады. Жасуша және гемопоэтикалық гомеостазда байқалған бұзылулардың артындағы молекулалық механизмді зерттеу үшін біз iCLIP-Seq талдауларын жасадық. Бір қызығы, біз B-ALL жасушалық желілерінде IGF2BP3-тің көптеген РНҚ нысандарын анықтадық, олар MLL-дің белгілі нысандары болды, соның ішінде CDK6 және MYC. Жақында CDK6 B-ALL-да өте маңызды мақсат ретінде тартылды және CDK6-ның тежелуі B-ALL-да (7) жаңа терапевтік араласудың негізін құра алады. MYC квинтессенциалды онкоген болып табылады және оның шамадан тыс экспрессиясы көптеген В-жасушалық лейкоздарда және лимфомада тікелей себепші рөл атқарады. Репортер талдаулары IGF2BP3-тің 3′UTR-мен өзара әрекеттесуін растады. MYC және CDK6 функционалдық маңызы бар. РНҚ-байланыстырушы домендердің жойылуы бар IGF2BP3 байланысып, тұрақтана алмады MYC Люцифераза репортер талдауындағы мРНҚ. Дегенмен, файлда жалғыз IGF2BP3 байланыстыру орындары жойылған кезде MYC және CDK6 3′UTR, осы жоюлардың көпшілігі репортер талдауындағы фенотипті кері қайтара алмады. 3′UTR мақсаттылығының күрделілігі RBP және кодталмаған РНҚ-ның әртүрлілігімен суреттелген, олармен байланысады. MYC және CDK6 3′UTR (46 – 49). Демек, RBP оның туысқан мақсаттарына әрекеті дозаға тәуелді болуы мүмкін және бірлескен бірнеше RBP әсер ету үшін әртүрлі жерлерде бірдей 3′UTR-мен байланысуы керек. CDK6 және MYC протеинінің in vivo және in vitro таргеттелуі тінтуірдің BM және лейкоз жасушаларының линияларында функцияның жоғалуы және артуы параметрлерінде расталды. Осылайша, біз iCLIP-ті ауруға қатысты мақсаттарды ашудың күшті әдісі ретінде растадық. Басқа мРНҚ болуы мүмкін екенін атап өту маңызды MYC және CDK6 IGF2BP3-пен өзара әрекеттесетін, соның ішінде біз осында анықтайтындар, жасушалық пролиферацияда және/немесе дифференциацияда маңызды рөл атқарады. Бұл RS411 жасушаларын котрансдукциялау арқылы IGF2BP3 делдалдық жасуша өлімін құтқару әрекетімізбен суреттелген. MYC 3′UTR бар немесе жоқ конструкциялар. IGF2BP3 функциясының жоғалуынан туындаған жасушалық циклдегі өзгерістерді құтқару үшін жалғыз MYC жеткіліксіз болды (деректер көрсетілмеген).

iCLIP-Seq талдаулары IGF2BP3 арқылы реттелетін транскриптомның ғаламдық көрінісін береді. Алдыңғы зерттеулер осы ақуызға арналған бір немесе бірнеше нысананы көрсетті, бірақ біздің жұмысымыз осы ақуызмен байланысқан бірнеше жүз мРНҚ-ны көрсетеді. Ықтимал транскрипттер тізімін нақтылау үшін біз осы биохимиялық мақсатты сәйкестендіруді IGF2BP3 функциясының жоғалуы бар жасушалардағы ген экспрессиясын зерттеумен біріктірдік. IGF2BP3 арқылы байланысқан гендердің белгілі бір жиынтығы жоғары немесе төмендетілген реттелуді көрсетті, төмендетілген гендер жасушалық цикл мен лейкозға байланысты жолдар үшін байытуды көрсетті. Бұл нәтижелер B-ALL ішіндегі IGF2BP3 жоғарылауы лейкемогендік ген экспрессиясын тұрақтандыруға қызмет ететінін көрсетеді. Посттранскрипциялық ген экспрессиясын реттеудің басқа режимдері сияқты, IGF2BP3 әрекеттері жасушалық транскрипция бағдарламасына тәуелді. IGF2BP3 өзі MLL-AF4 арқылы индукцияланады және ол бірнеше мРНҚ-мен байланысады және оларды реттейді (мысалы, CDK6 және MYC) олар да MLL-AF4 арқылы индукцияланады. Осылайша, IGF2BP3 генді экспрессиялау бағдарламасының кейбір аспектілерін күшейте алады, осылайша онкогенезді сақтайды. Бір қызығы, бұл протеиннің мәжбүрлі экспрессиясы гемопоэтикалық прогениторлық жасушалардың көбеюіне әкелді, бұл РНҚ тұрақтандыру және/немесе трансляциялық күшейту ерекшелігі дамуды бағыттай алады және ұрпақ таңдауы мен пролиферациясына әсер етеді.

Онкогендік мутациялар мен транслокациялар әртүрлі жоғары өткізу қабілеттілігімен секвенирлеу тәсілдері арқылы каталогталатындықтан, бір ғана генетикалық ауытқулар онкогенезді тудыру үшін жеткіліксіз екені белгілі болып отыр. Алдыңғы жұмыстар толыққанды онкогенез жолындағы негізгі факторлар ретінде эпигенетикалық реттеуді қоса алғанда, генетикалық емес механизмдерге қатысты болды. Мұнда біздің зерттеулеріміз CDK6 және MYC сияқты онкогенді ген өнімдерін тұрақтандырудың посттранскрипциялық механизмін ашты. Бұл механизм қосымша зерттеуді және нақтылауды талап етеді және лейкемогенездегі ген экспрессиясының реттелуінің табиғаты туралы маңызды түсініктер береді. CDK6 және MYC-ге қарсы мақсатты терапия пайда болған кезде, онкогендік гендік экспрессиялық бағдарламаларды реттеудегі посттранскрипциялық механизмдердің рөлін қарастыру маңызды болады. Сонымен қатар, қазіргі зерттеу терапевтік әдістерді ұсынады, соның ішінде IGF2BP3-тің оның мақсаттарына немесе РНҚ-байланыстыру функциясын блоктауға арналған осы ақуыздың шағын молекулалық ингибиторларына қосылуын блоктау үшін раковина РНҚ-ларының генерациясы. Қатерлі ісіктің көптеген түрлерінде IGF2BP3 экспрессиясын ескере отырып, байланыстырылған мРНҚ репертуарының әртүрлі гистогенездегі ісіктердегі ұқсастығын және консервіленген онкогенді жолдарды гематологиялық және гематологиялық емес қатерлі ісіктерге бағыттауға болатынын анықтау үлкен қызығушылық тудырады.

Пациент үлгілері, CD19 + ұяшықты оқшаулау және микромәліметтер талдауы. Бұларға қатысты барлық процедуралар мен протоколдар бұрын сипатталған және микромәліметтер жинағы жалпыға қолжетімді болды (NCBI’s Gene Expression Omnibus [GEO GSE65647]) (21).

Апоптозды, пролиферацияны және жасушалық циклді талдау. Жасуша пролиферациясын өлшеу үшін 96 шұңқырлы пластиналарда бір ұңғымаға 2000–4000 жасуша өсірілді. MTS реагенттері өндірушінің нұсқауларына сәйкес қосылды (Promega CellTiter 96 AQueous Радиоактивті емес жасуша пролиферациясын талдау жинағы) және жасушалар 37°C, 5% СО инкубацияланды.2 сіңіру 490 нм-де өлшенгенге дейін 4 сағат бойы. Апоптозды өлшеу үшін жасушалар APC белгісі бар анексин V-мен боялған және ағынды цитометрия арқылы талданған. Жасуша циклін талдау үшін жасушалар 70% этанолмен бекітілді және PBS ішіндегі 1 × пропидий йодид ерітіндісімен боялды және ағындық цитометрияның көмегімен талданды.

qPCR. Адам үлгілерінен жиналған РНҚ iScript реагентінің (Quanta BioSciences) көмегімен кері транскрипцияланды. Жасуша сызықтарынан алынған РНҚ qScript (Quanta BioSciences) көмегімен кері транскрипцияланды. qPCR PerfeCTa SYBR Green FastMix реагентінің (Quanta BioSciences) көмегімен StepOne Plus нақты уақыттағы ПТР жүйесімен (қолданбалы биожүйелер) орындалды. Пайдаланылған qPCR праймер тізбегі қосымша 5 кестеде келтірілген.

Вестерн дақ. Жасушалар Halt Protease және Phosphatase Inhibitor Cocktail (Thermo Scientific) қосылған RIPA буферінде (Boston BioProducts) лизиден өтті. Протеин лизатының бірдей мөлшері (бицинхонин қышқылының ақуыз талдауы, BCA [Thermo Scientific] көмегімен сандық түрде анықталған) 5%-12% SDS-PAGE-де электрофорезденді және нитроцеллюлоза мембранасына электроблотталды. Қолданылған антиденелер c-MYC қоянының поликлоналы (каталог 9402, ұяшық сигнализациясының технологиясы), CDK6 қоянының моноклоналы (каталог DCS83, ұяшық сигнализациясының технологиясы), IGF2BP3 ешкі поликлоналы (каталог sc-47893, Santa Cruz Biotechnology rabbit (polycalogal Inc.), Tclonal7). AB3790, Millipore) және β-актин (каталог AC15, Sigma-Aldrich) тінтуірдің моноклоналды. Қосымша HRP-конъюгацияланған антиденелер (Santa Cruz Biotechnology Inc.) және SuperSignal West Pico жинағы (Pierce Biotechnology) хемилюминесценция негізіндегі анықтауды жақсарту үшін пайдаланылды.

Жасуша мәдениеті, плазмидалар және спин инфекциясы. mmu-miR-155 немесе hsa-miR-21 пішімделген siRNAs pHAGE6 лентивирустық векторының (pHAGE6-CMV-siRNA-UBC-ZsGreen) NotI және BamHI учаскелері арасында немесе GFP төмен ағынындағы модификацияланған pHAGE6 векторының NotI және BamHI учаскелері арасында клондалған. (CMV-GFP-siRNA-UBC-пуромицин). Тінтуірдің жасушалық желілерінде siRNA және ақуызды кодтаушы кірістірулер MGP және MIG векторларына клондалған (50). T7 эпитоп тегі бар WT IGF2BP3 және жою мутанттары (KH және RRM) MIG негізіндегі вектордағы BglII және XhoI тораптары арасында клондалған (MSCV-T7 тегі-Мутант CDS-IRES-GFP Қосымша 5-кестені қараңыз). CRISPR-Cas9 арқылы мақсатты бағыттау үшін бағыттаушы РНҚ Zhang зертханасының веб-сайты (http://crispr.mit.edu/) арқылы әзірленген және LentiCRISPR векторына клондалған (24). RS411 жасушалары полибреннің қатысуымен 30°C температурада 90 минут бойы спинмен жұқтырылды. Жасушалар 7 күн бойы 5 мкг/мл пуромицинмен таңдалды және жасуша пролиферациясы мен апоптозды талдау үшін пайдаланылды. Адамның B-ALL жасуша желілері RS411 (MLL-AF4 ауыстырылған ATCC CRL-1873), NALM6 (К. Сакамотодан сыйлық, Стэнфорд университеті, Стэнфорд, Калифорния, АҚШ), 697 (К. Сакамотодан E2A-PBX1 ауыстырылған сыйлық) , Reh (TEL-AML1-транслокацияланған ATCC CRL-8286), тышқанның В-ге дейінгі лейкоздық жасуша желісі 7OZ/3 (ATCC TIB-158) және HEK 293T жасуша желісі (ATCC CRL-11268) олардың сәйкес орталарында 37 градуста өсірілді. °C 5% CO2 инкубатор. Лентивирустар мен ретровирустар бұрын сипатталғандай жасалды (50, 51).

БМ трансплантациясы және бәсекеге қабілетті репопуляция талдауы. БМ жиналды және 8 апталық CD45.2 + донор C57BL/6J аналық тышқандардан бұрын сипатталғандай (50) жұқтырылды. Біз сондай-ақ T7 эпитопы бар IGF2BP3 және мутанттық құрылымдары бар донорлық тышқандарды трансплантацияладық, соның ішінде РНҚ байланыстыру домендері жоқ жою мутанттары. Сегіз апталық CD45.1 + реципиент B6.SJL-Ptprc-Pep3/BoyJ ұрғашы тышқандар сәулеленуден кейін 6 сағаттан кейін өлімге ұшыраған және донор БМ енгізілді. Әр топқа сегіз тышқан пайдаланылды. Кейбір тәжірибелерде нормаланған қиюу пайыздық қию/трансдукция тиімділігі ретінде есептелді. Бәсекеге қабілетті репопуляция эксперименттері үшін 8 апталық CD45.1 + донорлық B6.SJL-Ptprc-Pep3/BoyJ аналық тышқандар және 8 апталық CD45.2 + донор C57BL/6J аналық тышқандар БМ үшін жиналды. CD45.2 + BM MIG, HOXA9 немесе IGF2BP3 шамадан тыс экспрессиялайтын вирустармен жұқтырылған. CD45.1 + және CD45.2 + BM жасушалары 1: 1 қатынасында араластырылды және өліммен сәулеленген 8 апталық CD45.2 + реципиент C57BL/6J аналық тышқандарға енгізілді. Теріс бақылау тобында өліммен сәулеленген 8 апталық CD45.2 + реципиент C57BL/6J аналық тышқандарға енгізілген 100% CD45.1 + BM жасушалары болды. Тышқандар шеткергі қанды талдау үшін БМ инъекциясынан кейін 4, 8, 12, 16 және 20 аптада қан алды. Барлық тышқандар Джексон зертханасынан сатып алынды және UCLA-да патогенсіз жағдайда орналастырылды.

Ағын цитометриясы. Қан, БМ, тимус және көкбауыр трансплантациядан кейін 27 аптада стерильді жағдайда тышқандардан жиналды. Бір жасуша суспензиялары эритроциттердің лизис буферінде лизиске ұшырады. Бояу үшін фторхроммен конъюгацияланған антиденелер қолданылды. Қолданылатын антиденелердің тізімі қосымша 6-кестеде берілген. Жасуша ішілік бояу үшін беттік маркерлік антиденелермен бастапқы бояудан және 1% параформальдегидпен (PFA) фиксациядан кейін жасушалар жасушаішілік антигендерге (Ki67, Cdk6 және Myc) қарсы антиденелермен инкубацияланды. Құрамында MACS буфері бар 1% тритон. 4°C температурада 30 минут бояудан кейін жасушалар екі рет PBS-пен жуылды және 1% PFA-мен бекітілді. Ағынды цитометрия UCLA JCCC және Broad Stem Cell Research Flow Core-да орындалды. Талдау FlowJo бағдарламалық құралы арқылы орындалды.

Гистопатология. Бекіту және кесу бұрын сипатталған (51). Талдауды сертификатталған гематопатолог (D.S. Rao) жүргізді.

iCLIP. iCLIP бұрын сипатталғандай орындалды ( 52 ). Қысқаша айтқанда, RS411 немесе REH жасушалары in vivo нуклеин қышқылдарына қайтымсыз ковалентті кросс-байланыс ақуыздарын қалыптастыру үшін УК-С сәулесімен сәулеленді. Жасуша лизисінен кейін РНҚ микрококкты нуклеазаны қолдану арқылы ішінара фрагменттелді, ал IGF2BP3-РНҚ кешендері А ақуызымен қапталған магнитті моншақтарда (Invitrogen) иммобилизацияланған анти-IGF2BP3 антиденелерімен (MBL International Corporation) иммунопурификацияланды. Қатаң жуудан және дефосфоризациядан кейін (FastAP, Fermentas) РНҚ 3′ ұштарында 3′ алдын ала адениляцияланған РНҚ адаптеріне байланды, радиоактивті түрде таңбаланды, MOPS негізіндегі ақуыз гельдік электрофорезі арқылы іске қосылды және нитроцеллюлоза мембранасына ауыстырылды. Бос протеиннен 15-80 кДа жоғары ақуыз-РНҚ кешендері мембранадан кесіліп, РНҚ денатурация (3,5 М мочевина) жағдайында протеиназа K ыдырауы арқылы қалпына келтірілді. Кері транскрипцияға арналған олигонуклеотидтер BamHI шектеу алаңымен және 5′ ұшында штрих-код аймағымен бөлінген, Bioo NEXTflex шағын РНҚ кітапханасын дайындау жинағынан (Bioo Scientific) бейімделген 2 кері бағытталған адаптер аймағын қамтыды. жеке cDNA молекулаларын белгілеу үшін 5 nt кездейсоқ штрих-код ішінде. cDNA молекулаларының өлшемдері денатурациялаушы PAGE көмегімен тазартылды, CircLigase II (Эпицентр, Illumina) арқылы айналдырылды, шектеу аймағын толықтыратын олигонуклеотидке күйдірілді және BamHI (New England Biolabs Inc.) көмегімен кесілді. Сызықты cDNA-лар содан кейін адаптер аймақтарын толықтыратын праймерлермен (Bioo Scientific) Immomix PCR Master Mix (Biolin) көмегімен ПТР күшейтілді және Illumina HiSeq көмегімен жоғары өткізу қабілеттілігінің реттілігіне ұшырады. iCLIP протоколының толығырақ сипаттамасы жарияланды ( 53 ). Осы жарияланымда талқыланған деректер NCBI GEO ( 54 ) (GSE76931) ішінде сақталған.

iCLIP деректерін талдау. «TopHat2» (55) көмегімен транскриптомиялық және геномдық теңестіруден кейін жеке оқулар айқаспалы байланыс орнын көрсету үшін 5′ ұштарына дейін қысқартылды. Белгілі бір протеин-РНҚ өзара әрекеттесу орындарын белгілеу үшін фон бойынша 30-bp байыту аймақтары таңдамалы жергілікті ковариаты бар нөлдік қысқартылған теріс биномдық режимде «Пиранха» (56) көмегімен анықталды. Ковариат протеин-РНҚ өзара әрекеттесуінің көрсеткіші ретінде жалпы тереңдігі жоғары аймақтарды бақылау үшін көрші 6 қалтаға (әр жағында 3) әрбір 30-bp қалтаның көлденең байланыс санын біркелкі бөлу арқылы есептелді. Көршілес қоқыс жәшіктері маңызды П Пиранхадан алынған мәндер (α < 0,05) бір аймақтарға біріктірілді. Барлық 3 репликада статистикалық маңызды деп табылған тек қабаттасатын шың аймақтары әрі қарай талдау үшін биологиялық қайталанатын үміткерлер болып саналды. iCLIP-Seq сайттарының интрагендік үлестірімдерін алу үшін біз hg19 (57) үшін UCSC Genome Browser MySQL дерекқорын сұрадық және канондық ORF анықтау үшін алдымен CCDS генінің аннотациялары (58) негізінде ең жақын қабаттасатын генді анықтадық, ал екіншіден Gencode V19 жан-жақты басқа мүмкіндіктер үшін ( 59 ). Осыдан кейін ең жақын интрагендік якорь (транскрипцияның басталу орны, бастапқы кодон, 5′ қосылу орны, 3′ қосылыс орны, тоқтау кодоны және полиаденилдену учаскесі) жазылды және ең жақын ORF шекарасына дейін жалғанған қашықтық есептелді. Фондық бақылау ретінде біркелкі бөлінген кросс-байланыс тораптары hg19-дан «төсек құралдары» (60) көмегімен жалған кездейсоқ интервалдармен модельденді. Бұл тораптардың интрагендік таралуы iCLIP кросс-байланыс тораптары сияқты әдістеме бойынша анықталды.

IGF2BP3 байланыстыру ерекшелігін анықтау үшін соңғы экзоннан биологиялық қайталанатын және статистикалық маңызды шыңның шегінде орын алатын әрбір кросс-байланыс орнын қоршап тұрған 10 nt терезе алынып, әрбір n-mer саны (4-тен 6-ға дейін) есептелді. . Әрбір кросс-байланыс алаңына іргелес 100-300 нуклеотидтер терезесінен кездейсоқ 20-bp интервалдары әрбір n-мерді байқаудың фондық ықтималдығын (p) көрсету үшін n-мерлердің нормаланған жиілігі ретінде қосылды. Әрбір n-mer өлшемі үшін N жалпы бақылаудың кейбір n-mer-дің k пайда болуын байқау ықтималдығы биномдық түрде таратылады (k

Bin[p, N]) және Пуассон жуықтап, N үшін жеткілікті үлкен мәндер берілген (>1,000) және П (<0,01). Пуассонмен жуықталған жеке n-мерлер П 5% жалған табу жылдамдығымен маңызды мәндер ( 61 ) содан кейін бір-бірімен теңестірілді және k оңтайлы мәндері үшін k-медоидтық кластерлеу арқылы мотивтерге топтастырылды (орташа силуэт енін пайдалану). Әр нуклеотидтің пайда болу жиілігі әр мотив кластері үшін позицияға тән тәртіпте сызылған.

РНҚ иммунопреципитациясы. 100 мМ натрий фосфат буферіндегі (рН 8,1) протеин А Dynabeads (Invitrogen) тінтуірдің IgG антиденесімен (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.) немесе α-IGF2BP3 (Santa Cruz Biotechnology Inc.) 41 сағат бойы өңделген.Содан кейін моншақтарды RSB-100 буферімен (10 мМ Tris-Cl [pH 7,4], 100 мМ NaCl, 2,5 мМ MgCl) 3 рет жуды.2, 0,5% NP-40). Цитоплазмалық лизаттар құрамында RNase тежегіштері бар RSB-100 ішіндегі RS411 суспензия жасушаларынан дайындалды. Лизат супернатанттары моншақпен/антиденелермен біріктіріліп, түні бойы 4°C-та айналдырылды және жуылды, ал бір бөлігі Western Blot талдауы үшін жойылды. Түйіршіктелген түйіршіктер Proteinase K буферінде (100 мМ Tris-HCl [pH 7.4], 50 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА [pH 8.0]) қайта суспензияланды. Үлгілер RQ DNase I (Promega) арқылы өңделді, содан кейін Proteinase K (Ambion) өңделді, екеуі де 37°C температурада инкубацияланды. РНҚ қышқыл фенол-хлороформмен экстракцияланды және натрий ацетаты, абсолютті этанол және GlycoBlue (Ambion) копреципитатымен тұндырылды. РНҚ центрифугалау арқылы қалпына келтірілді, жуылды және РНазсыз суда қайта суспензияланды. Саны мен сапасы Nanodrop және Total RNA NanoBioanalyzer жинағы (Agilent Technologies) көмегімен тексерілді. РНҚ үлгілері (IgG бақылау элементтерінің және α-IGF2BP3 иммунопреципитацияларының әрбір үлгі үштік көшірмесінің 200 мкг) жоғары сыйымдылықты cDNA кері транскрипция жинағы (Thermo Scientific) және келесі qPCR (Lightcycler Dianostics 480) көмегімен кері транскрипцияға ұшырады.

РНҚ секвенирлеу эксперименттері. РНҚ NEXTflex Rapid Directional qRNA-Seq Library Prep Kit (Bioo Sciquen Kittific) көмегімен қос тізбекті кітапханаларға түрлендіріліп, TRI-Reagent LS (Sigma-Aldrich) көмегімен IGF2BP3 азайған немесе бақылау RS411 жасушаларының екі цитозолдық фракцияларынан да тазартылды, және Illumina HiSeq 2500 платформасын пайдалану. Illumina HighSeq 2500 арқылы жасалған және бір үлгіде шамамен 30–115 миллион оқуға сәйкес келетін жоғары өткізу қабілетті РНҚ реттілік деректері Bowtie және Top бағдарламалық құралының көмегімен адам геномының hg19 құрылымына (2009 ж. GRCh37, NCBI Build 37.1) салыстырылды. (62, 63). Барлық деректерді жинау және талдау Perl көмегімен, ал статистикалық талдаулар R, 2.14.1 нұсқасымен орындалды. Пайдаланылған барлық сыртқы кітапхана бумалары CPAN немесе CRAN жүйесінде қол жетімді. DESeq көмегімен дифференцияланған гендер анықталды. Деректерге NCBI GEO (GSE76931) арқылы қол жеткізуге болады.

Люцифераза талдаулары. The CDK6 3′UTR шамамен 10 кб ұзындықты құрайды MYC 3′UTR шамамен 300 бит. MYC Δ3 және MYC Δ4 мутантты болып табылады MYC iCLIP деректерінен анықталған IGF2BP3 байланыстыру орындары жоқ 3′UTR. Праймерлер осы байланыстырушы тораптарды алып тастауға арналған, синтездік ПТР аяқталды және MYC және MYC Δ 3′UTRs SacI және XhoI сайттары арасындағы pmirGlo векторында отты люциферазаның төменгі ағынында клондалды (64). The CDK6 3′UTR 5 бөлікке бөлінді (CDK6 1–5

әрқайсысы 2 кб) және отты люциферазаның төменгі ағынында жеке клондалған. 293Т жасушалары құрамында MIG бос векторы, MIG-hIGF2BP3 шамадан тыс экспрессия векторы, MIG-T7-hIGF2BP3 шамадан тыс экспрессия векторы немесе MIG-T7-KH/RRM мутанты бар репортер векторлары бар pmirGlo, 3′UTR немесе Δ 3′UTR трансфекцияланған. векторлар 1:10 қатынасында (50:500 нг). Котрансфекциялар өндірушінің нұсқауларына сәйкес Lipofectamine 2000 (Invitrogen) көмегімен орындалды. Жасушалар 24 сағаттан кейін лизиске ұшырады, субстрат қосылды және люминесценция GloMax-Multi Jr (Promega) құрылғысында өлшенді. Барлық үлгілер үшін оттаяқтың Ренилла люцифераза белсенділігіне қатынасы есептелді. pmirGlo бос векторы үшін hIGF2BP3/MIG немесе мутант/MIG люминесценциясы қалыпқа келтіру бақылауы ретінде пайдаланылды.

Статистика. Деректер үздіксіз сандық деректер үшін орташа ±SD мәнін білдіреді. Бір жақты ANOVA, одан кейін Бонферронидің бірнеше салыстыру сынағы немесе екі құйрықты студент т сынақтар GraphPad Prism бағдарламалық құралын пайдалану арқылы орындалды және суреттің аңыздарында сипатталғандай әрбір экспериментке қолданылды. А П 0,05-тен төмен мән маңызды деп танылды. *П < 0,05, **П < 0,01, ***П < 0,001 және ****П < 0,0001.

Зерттеуді бекіту. Науқастардың барлық ата-аналарынан жазбаша ақпараттандырылған келісімді Италия балалар гематологиясы және онкология қауымдастығы (AIEOP) және Берлин-Франкфурт-Мюенстер (BFM) ALL-2000 сынағы алды. Падова университеті IRB барлық процедураларды мақұлдады және зерттеу UCLA-да қараудан босатылған деп саналды. Анонимделген донорлардан алынған перифериялық қанның мононуклеарлы жасушалары UCLA-дағы СПИД зерттеу вирусологиясының негізгі зертханасы орталығынан немесе жазбаша келісімімен және IRB рұқсатымен UCLA патология және зертханалық медицина департаментінен диагностикалық жұмыстан кейін алынды. Тінтуірлердің барлық эксперименттік процедуралары UCLA канцлерінің Жануарларды зерттеу комитетінің (ARC) мақұлдауымен жүргізілді.

JKP зерттеуді әзірледі, эксперименттер жасады, деректерді талдады және қағазды жазды. JRS және DSR зерттеуді әзірледі, деректерді талдады және қағазды жазды. TMT және JMH эксперименттер жасады, деректерді талдап, қағазды жазды. JRC және TRF эксперименттерді орындады. TSW, SK, MT, WY, MP және GB деректерді талдады.

Рао зертханасының мүшелеріне пайдалы талқылаулары үшін алғыс айтамыз. Парт Пател, Мэй Пэйинг, Норма Ирис Родригес-Малаве, Дженнифер Кинг, Джаспал Басси, Ким Пиоли, Нолан Унг және Хайме Ангианоға техникалық қолдау көрсеткені үшін алғыс айтамыз. Бұл жұмысқа NIH гранты R01 CA166450, UCLA JCCC тұқым гранты және K08CA133521 мансаптық даму сыйлығы (D.S. Rao үшін), сондай-ақ NIH гранттары R01GM109146 және R21AG042003 (J.R. Sanford) қолдау көрсетті. J.R. Contreras ісік иммунологиясын оқыту гранты, NIH T32CA009120 қолдауымен болды. Т.Р. Фернандоға ісік биологиясы бойынша оқыту гранты NIH T32CA009056 қолдау көрсетті. Дж.М.Ховардқа R41HG007336 қолдау көрсетті. Ағын цитометриясы NIH AI-28697, P30CA016042, JCCC, UCLA СПИД институты және UCLA Дэвид Геффен Медицина мектебі қолдайтын UCLA JCCC/CFAR Flow Cytometry Core Facility ғимаратында орындалды.

Джаянт Кумар Паланичамидің қазіргі мекен-жайы: Биохимия бөлімі, Бүкіл Үндістан медициналық ғылымдар институты, Нью-Дели, Үндістан.

Мүдделер қақтығысы: Авторлар мүдделер қақтығысы жоқ деп мәлімдеді.

Анықтамалық ақпарат: J Clin Invest. 2016126(4):1495–1511. doi: 10.1172/JCI80046.


9.12С: РНҚ онкогенді вирустар - Биология

Жиырмасыншы ғасырдың аяғында ЖИТС деп аталатын жүре пайда болған иммун тапшылығы синдромынан артық ауру жоқ шығар. Дегенмен, 2004 жылғы Біріккен Ұлттар Ұйымының ЖИТС-тің жаһандық індетінің жай-күйі туралы есебіне сәйкес, ЖИТС-ке бұрынғыдай қоғам назарын аудармағанына қарамастан, бұл ауру әлем халқына ықпалын азайта бастаған жоқ. жасады. Керісінше, көптеген елдерде, соның ішінде Америка Құрама Штаттары сияқты табысы жоғары елдерде инфекциялар өсуде. 2003 жылы бес миллионға жуық адам ЖИТС-ті тудыратын адамның иммун тапшылығы вирусын (АИТВ) жұқтырды, бұл ЖИТС 1981 жылы ресми түрде ауру ретінде танылғалы бері бір жылдағы жаңа инфекциялардың ең көп саны.

АИТВ-ға жауап беретін вирусты алғаш рет 1983 жылы американдық Роберт Галло және француз ғалымы Люк Монтанье бөліп алған. Сол уақыттан бері СПИД-тің қоздырғышына бағытталған көптеген зерттеулер жүргізілді және вирустың құрылымы мен оның типтік әрекеті туралы көп нәрсе білді. АИТВ – ретровирустар деп аталатын атипті вирустар тобының бірі, олар генетикалық ақпаратты рибонуклеин қышқылы (РНҚ) түрінде сақтайды. Кері транскриптаза деп аталатын ферментті қолдану арқылы АИВ және басқа ретровирустар РНҚ-дан дезоксирибонуклеин қышқылын (ДНҚ) өндіруге қабілетті, ал көптеген жасушалар ДНҚ-ның генетикалық материалын РНҚ-ға транскрипциялай отырып, керісінше процесті жүзеге асырады. Ферменттің белсенділігі АИТВ-ның генетикалық ақпаратын қабылдаушы жасушаның геномына (хромосомаларына) тұрақты түрде біріктіруге мүмкіндік береді.

АИТВ-ның негізгі иелері – көмекші Т-лимфоциттер, көмекші Т-клеткалар немесе CD4+ Т жасушалары деп аталатын ақ қан жасушалары. Бұл жасушалар иммундық жүйенің маңызды құрамдас бөліктері болып табылады, олар әдетте көптеген басқа иммундық жасушалардың жауаптарын белсендіруге жауап береді. АИТВ жұқтырған көмекші Т жасушалары тез өледі. Бастапқы инфекциядан кейін көп ұзамай организм әдетте жұқтырған Т-клеткаларының жоғалуын оларды көп мөлшерде өндіру арқылы өтей алады, бұл кезде АИТВ жұқтырған адамдар симптомсыз болады. Уақыт өте келе, вирус барған сайын өткір болады және көмекші Т жасушаларының баяу төмендеуі байқалады. Демек, ағзадағы көмекші Т жасушаларының саны (CD4 саны деп аталады) әдетте вирустың дамуын өлшеу үшін қолданылады. Қанның бір микролитрінде шамамен 200 жасушадан аз CD4 саны әртүрлі оппортунистік инфекциялармен бірге жүруі мүмкін және инфекцияның соңғы кезеңі болып саналады. Мұндай инфекциялардың тұрақты тосқауылдары әдетте ЖИТС-пен ауыратындардың өліміне әкеледі.

АИВ – салыстырмалы түрде күрделі вирус, ол негізінен Т-клеткаларының беттерінде кездесетін CD4 ақуызына қосылатын gp120 (1-суретті қараңыз) деп аталатын конвертіне енгізілген гликопротеиннің арқасында көмекші Т жасушаларын жұқтыруға қабілетті. АИТВ-ның қабылдаушы жасушаға енуі, әдетте, хемокиндердің рецепторлары ретінде қызмет ететін CCR5 немесе CXCR4 жасуша бетіндегі ко-рецепторды қамтиды деп саналады. АИТВ вирусының қабығы бүршіктену арқылы алынған хост жасушасының плазмалық мембранасының туындысы болып табылады. АИТВ жасушаға енуге әрекет жасағанда, жасуша бетінің молекулалары мен вирустық конверт ақуыздары арасындағы өзара әрекеттесу конверттің жасуша мембранасымен қосылуына мүмкіндік береді. Бұл процесте gp41 деп аталатын конверт ақуызы маңызды рөл атқаратыны белгілі.

Вирус жұқтырған жасушада АИВ кері транскрипциядан өтеді, ДНҚ-ны РНҚ шаблонынан транскрипциялайтын мамандандырылған вирусқа спецификалық ферменттің көмегімен кері транскриптазаның көмегімен РНҚ-дан қос тізбекті ДНҚ түзеді. ДНҚ пішініне енгеннен кейін АИТВ-ның генетикалық ақпараты провирус ретінде хост жасушасының ДНҚ-сымен біріктіріледі. Провирустық геном кейіннен АИТВ ақуыздарына трансляциялау үшін мРНҚ және вирустың кейінгі ұрпақтары үшін геном ретінде қызмет ететін вирустық РНҚ-ға транскрипциялануы мүмкін. Капсидтер вирустық геномдар мен белоктардың айналасында жасуша мембранасынан бүршіктенбей тұрып, материалды конвертке салып, одан әрі қоректендіреді.

АИВ репликация процесі өте жоғары мутация жылдамдығымен байланысты, өйткені кері транскрипция нуклеотидтердің қосылуындағы қателерді түзетуге мүмкіндік бермейді. АИТВ адам геномының эволюциясынан миллион есе жылдам дамып, иммундық жүйені тануды және онымен тиімді күресуді қиындатады. Осыған ұқсас себептерге байланысты АИТВ-ға қарсы препараттарды немесе вакциналарды жасау күрделі жұмыс болып табылады, вирус пациенттен пациентке айтарлықтай өзгеріп қана қоймайды, сонымен қатар жеке адамдарда айтарлықтай геномдық сәйкессіздіктерді көрсетеді. АҚТҚ-ны емдеу әлі де қиын болып қалуда, бірақ айтарлықтай жетістіктер пациенттер алатын медициналық көмектің сапасын айтарлықтай жақсартты. Бірнеше кері транскриптаза мен протеаза тежегіштерін қолдануды қамтитын жоғары белсенді антиретровирустық терапия (HAART) көптеген пациенттер үшін өте тиімді емдеу түрін дәлелдеді, бірақ терапияның құны оны әлемнің көптеген бөліктерінде кеңінен қолдануға кедергі келтірді. АҚТҚ және ЖҚТБ жұқтырған.


9.12С: РНҚ онкогенді вирустар - Биология

Ретровирустар репликация кезінде вирустық РНҚ-ның сызықты қос тізбекті ДНҚ-ға кері транскрипциясын қолдануымен және осы ДНҚ-ны қабылдаушы жасушаның геномына кейіннен біріктіруімен ерекшеленетін, қабықшаланған РНҚ вирустарының әртүрлі отбасын құрайды. Бұл отбасының мүшелері АИВ-1, мысық лейкозы және бірнеше қатерлі ісік тудыратын вирустар сияқты маңызды патогендерді қамтиды. Алайда бұл вирустарға деген қызығушылық олардың ауру тудыратын мүмкіндіктерінен асып түседі. Мысалы, осы саладағы зерттеулер онкогендердің ашылуына әкелді, бұл қатерлі ісік генетикасы саласындағы үлкен жетістік. Ретровирустарды зерттеу эукариоттық гендердің экспрессиясын реттейтін механизмдерді түсінуімізге үлкен үлес қосты. Сонымен қатар ретровирустар молекулалық биологиядағы құнды зерттеу құралдары болып табылады және гендік терапияда сәтті қолданылды (мысалы, X-мен байланысты ауыр аралас иммун тапшылығын емдеу үшін).

Үздік ретровирустық мамандар жазған бұл кітап осы маңызды вирустардың геномикасын, молекулалық биологиясын және патогенезін қарастырады, барлық соңғы жетістіктерді жан-жақты қамтиды. Тақырыптар: қожайын мен ретроэлементтердің өзара әрекеттесуі, эндогендік ретровирустар, ретровирустық ақуыздар мен геномдар, вирустың енуі және жабынсыздануы, кері транскрипция және интеграция, транскрипция, сплайсинг және РНҚ тасымалдау, онковирусты инфекциялардың патогенезі, иммун тапшылығы вирусының инфекцияларының патогенезі, ретровирустық вариальды шектеу факторлары және ретровирустық шектеуші факторлар қорғаныс корреляциялары, гаммаретровирустық және лентивирустық векторлар, сүтқоректілер мен балықтардың приматтық емес ретровирустары, симиандық экзогендік ретровирустар және HTLV және АИВ. Әрбір ретровирусолог үшін маңызды оқу және барлық вирусология және молекулалық биология зертханалары үшін ұсынылатын мәтін.

"Примат емес сүтқоректілердің ретровирустары, симиан ретровирустары, балық ретровирустары, ретровирустық векторларды пайдалану және ретровирустық инфекцияны шектейтін жасушалық факторлар туралы тамаша тараулар. Барлық тараулар әдемі суреттелген және осы саладағы ең беделді билік орындарымен жазылған. К және В-ның «Ретровирустар» кітабын студенттерге де, сарапшы әріптестерге де ұсыныңыз». ретровирусология блогынан

"Әсерлі жұмыс. Салаға елеулі ресурс. Жетекші мамандардың зерттеуді мұқият қамту жағдайы. Ветеринария ғалымдары, клиницистер, вирусологтар және осы саладағы магистранттар үшін маңызды оқу." SciTech Book News (2010 жылғы наурыз)

"Тек ретровирустардың ғана емес, сонымен қатар басқа ретроэлементтердің де биологиясының қысқаша, заманауи қысқаша мазмұны. жан-жақты, ыңғайлы және қанағаттанарлық анықтамалық жұмыс" Microbiology Today (2010)

Arzneimittelforschung (2010) 60:466-469 «өмір туралы ғылымды зерттеушілер мен биологиядағы барлық студенттерге ұсынылады»

(EAN: 9781904455554 9781912530977 Пәндер: [вирусология] [микробиология] [медициналық микробиология] [молекулярлық микробиология] [геномика] )


Жұқтыру немесе жұқтырмау: Про- және вирусқа қарсы стратегиялардағы EVs

In vivo, EV вирустармен және бір-бірімен тікелей немесе хост жауаптарын модуляциялау арқылы әрекеттесе алады, осылайша вирустар мен хост арасындағы «Соғыс және бейбітшілікке» қатысады (49, 50). Кейбір вирустар жұқтырған жасушаларды сезімтал мақсатты жасушалар қорын ұлғайту (мысалы, белсендірілген жасушалардың санын көбейту арқылы) немесе олардың вирустық инфекцияға бейімділігін арттыру арқылы немесе вирусқа қарсы антиденелерді сіңіретін жемсау ретінде қызмет ету арқылы инфекцияны жеңілдететін модификацияланған EV-ларды шығаруға итермелейді, осылайша вирусқа қарсы иммунитет. Керісінше, вирустық ақуыздарды тасымалдайтын EV-лар, мысалы, адаптивті иммундық жауаптардың басталуын жеңілдету үшін дендритті жасушаларды вирустық антигендермен қамтамасыз ету арқылы иесіне де пайдалы болуы мүмкін. Гипотетикалық түрде, EV-ның рұқсат етілген жасушалардың өмір сүру ұзақтығын реттеу және вирусқа қарсы иммундық жауаптарды өзгерту қабілеті хостқа вирустық инфекцияға жауап беруде қосымша икемділік беруі мүмкін. Осылайша, вирустық инфекция кезінде пайда болған EVs вирусқа қарсы немесе вирусқа қарсы рөл атқара алады (3-сурет). Вирус тудырған EV-ге қатысты әртүрлі функциялар ішінара әртүрлі зерттеулерде қолданылатын EV популяцияларының тазалығының айырмашылығымен түсіндірілуі мүмкін бе, жоқ па, қазір белгісіз. Сондықтан EV-ның вирустық инфекцияларға таза әсерін анықтайтын параметрлер туралы жалпы түсінік әлі де жоқ.

Ретровирусты жұқтырған жасушалар шығаратын EVs провирустық және вирусқа қарсы әсерлері. Ретровирусты инфекция инфекцияны жеңілдететін немесе басатын модификацияланған EV-лердің шығарылуына әкелуі мүмкін. Әлеуетті вирусқа қарсы әсерлері мыналарды қамтиды:А) инфекцияға төзімділікті арттыру үшін APOBEC3G сияқты вирусқа қарсы компоненттерді EV арқылы жеткізу (Б) сезімтал емес көрші жасушаларды вирустық инфекцияның болуы туралы ескерту үшін вирустық РНҚ сияқты TLR лигандтарының EVs арқылы таралуы және (C) адаптивті иммундық жауаптардың басталуын жеңілдету үшін антигенді ұсынатын жасушаларды вирустық антигенмен қамтамасыз ету. Потенциалды вирустық әсерлер мыналарды қамтиды:D) ЭВ-ның бейтараптандырғыш әсерін тежеу, EV-ның вириондармен байланысуының төмендеуіне және басқа жасушаларды жұқтыруы мүмкін вириондар санының артуына алып келеді (Е) Жасушаның қартаюын немесе вирусқа қарсы иммундық жасушалардың өлуін индукциялайтын вирустық компоненттерді (мысалы, Nef) EV арқылы жеткізу (F) Иммундық жасушалардың қызметін басатын вирустық компоненттерді EV арқылы жеткізу (мысалы, В жасушаларының антидене өндірісінің неф-индукциялық төмендеуі) және (Г) вирусқа сезімтал жасушалар пулының ұлғаюы, мысалы, вирустың басқа жасушалармен байланысуы үшін корецепторлардың тасымалдануы арқылы.

EVs вирустық инфекцияны жеңілдетеді.

АИТВ жұқтырған жасушалардан шығарылған EV-да бірнеше АИТВ ақуыздары мен РНҚ анықталды. EVs арқылы шығарылатын вирустық компоненттердің бірі АИВ трансактивациясына жауап беру элементі (TAR) РНҚ (51) болып табылады. TAR – АИВ-1 транскрипттерінің 5′ ұштарында орналасқан РНҚ дің-ілмекті құрылымы, ол жұқтырған жасушаларда Tat-пен байланысуы мүмкін, осылайша ұзарту факторларының тартылуын жеңілдетеді және вирустық РНҚ өндірісін арттырады (52). EVs арқылы тасымалданған кезде TAR РНҚ сезімтал нысана жасушаларының популяциясын көбейте алады. EV-мақсатты жасушалардың ішінде толық ұзындықтағы TAR РНҚ миРНҚ-ға өңделеді, олар Bcl-2 өзара әрекеттесетін ақуыз үшін мРНҚ кодтауын өшіреді. Нәтижесінде апоптозға төзімділіктің артуы жасушаға ұзақ уақыт бойы вирус шығаруға мүмкіндік береді, осылайша АИТВ-инфекциясын жеңілдетеді (51).

Сонымен қатар, АИВ-инфекцияланған жасушалар шығаратын EVs Nef секрециясының модификация аймағының жасушалық протеин айналымына қатысатын Hsp70 шаперондар отбасының мүшесі морталинмен әрекеттесу арқылы АИВ вируленттілік факторы Nef таңдамалы түрде біріктіреді (53). EV-мен байланысты Nef-ті Т-жасушаларға жеткізу бұл жасушаларға бірнеше жолмен әсер етеді. Біріншіден, тасымалданған Nef Т-клеткаларын белсендіріп, оларды АИТВ инфекциясына сезімтал етеді (54). Екіншіден, EVs Nef-ті кейбір CD4 + T жасушаларына жеткізе алады және жасушаның қартаюын немесе өлімін тудырады (55). Бұл механизм АИВ-инфекциясының бастапқы кезеңдерінде, вирустық жүктеме әлі де төмен болған кезде Т-жасушалық өлімнің жоғары деңгейіне ықпал етуі мүмкін (55). Соңында, EVs арқылы Nef жасушааралық тасымалдануы B жасушаларында IgG2 және IgA өндірісін басу арқылы гуморальдық иммундық жауаптан жалтаруды жеңілдетуі мүмкін, бұл сондай-ақ АИВ-жұқтырған макрофагтардың жасушааралық өткізгіштер арқылы B жасушаларына Nef тасымалдауы үшін көрсетілгендей (56).In vitro жүйелерінде EVs CCR5 және CXCR4 АИВ корецепторларын басқа жасушаларға тасымалдай алатыны, осылайша оларды АИТВ инфекциясына бейімділігі көрсетілген (57, 58). Бұл EV-делдалдық процесс АҚТҚ жұқтырған жасушалардың спектрін кеңейтуі мүмкін, бірақ мұндай құбылыстың in vivo маңызды рөл атқаратыны әлі белгісіз.

EV вирустық инфекцияны басады.

In vitro эксперименттерінде Т-клеткаларының CD4 АИВ-рецепторы бар EV-ді шығара алатыны көрсетілді. Бұл EV вирустық бөлшектерге қосыла алады, осылайша CD4 + Т жасушаларын жұқтыратын вириондардың санын азайтады (59). Дегенмен, АИТВ бұл EV-ге АИВ-Нефтің қосылуын ынталандыру арқылы қарсы тұра алады, бұл EV-ге CD4 қосылуының тежелуіне және жоғарыда сипатталған вирусқа қарсы вирусқа қарсы реакцияның тиімділігінің төмендеуіне әкеледі (59).

АИТВ-дан басқа EV-делдалдық хост жасушаларын қорғау механизмі APOBEC3G вирусқа қарсы вирусқа қарсы протеиннің EV арқылы тасымалдануын қамтиды. Бұл цитидиндеаминаза әдетте ретровирустық РНҚ-мен бірге вириондарға қосылады және транскрипцияланған вирустық ДНҚ-да G-A-мутацияларын жасау арқылы вирустың репликациясын тежейді (60). APOBEC3G вирусқа қарсы әрекетіне АИВ-кодталған Vif протеині қарсы әрекет етеді, ол APOBEG3G вириондарға қосылуына кедергі жасайды. APOBEC3G-ді EVs арқылы Vifсіз жеткізу Vif әсеріне қарсы тұруы мүмкін және осылайша EV-мақсатты жасушалардың АИТВ инфекциясына төзімділігін арттырады (34). Сол сияқты, соңғы деректер екінші хабаршы циклдік гуанозин монофосфат-аденозин монофосфатының (cGAMP) (cGAMP синтазасымен индукцияланған) АИВ бөлшектерінде де, жұқтырған жасушалардан шығарылатын EV-де де қоршалғанын көрсетеді. cGAMP жасушааралық тасымалдануы EV-ге қарағанда вирустармен тиімдірек жүзеге асырылса да, интерферон гендерінің стимуляторы (STING)-тәуелді түрде жаңадан жұқтырылған жасушаларда вирусқа қарсы IFN жауаптарын тудырады (35, 36).

Вирус жұқтырған жасушалардан алынған EV-да эндогендік (ми)РНҚ ғана емес, сонымен қатар вирустық РНҚ-да (мысалы, HCV индукцияланған EV жағдайында) селективті байытылатыны көрсетілген (38). EV-мақсатты жасушалардағы PRR мұндай РНҚ-ны патогенмен байланысты молекулалық үлгілер (PAMPs) ретінде тануы және туа біткен антивирустық жауапты іске қосу арқылы жауап беруі мүмкін (38, 61). АИВ-инфекцияланған макрофагтар сонымен қатар EV мақсатты бақылаушы макрофагтарда эндосомалық TLR8 және NF-κB сигналын іске қосатын вирустық РНҚ (вирустық miRNAs vmiR88 және -99) бар EV-ді шығарады (61). Қабынуға қарсы цитокиндердің кейінгі өндірісі (мысалы, TNFα) АИТВ-ға қарсы иммундық жауаптың басталуына ықпал етеді. Вирустық РНҚ-ны EVs арқылы тарату сезімтал емес көрші жасушаларды вирустық инфекцияның болуы туралы ескерту стратегиясын қамтамасыз етеді. HCV инфекциясы кезінде, мысалы, плазмацитоидты DC құрамында EV бар вирустық РНҚ бағытталған және нәтижесінде қабыну реакциясын бастайды (38). Сонымен қатар, вирусқа төзімді жасушалар шығаратын хост миРНҚ бар EV басқа жасушаларға төзімділік көрсете алады. Бұл әртүрлі вирустармен, соның ішінде АҚТҚ-мен инфекцияға төзімді трофобластар үшін көрсетілді, мүмкін, in vivo ұрықты қорғауға ықпал етеді. Осы жасушалар шығаратын EVs in vitro миРНҚ-ларды тасымалдайды және оларды вирусқа сезімтал жасушаларға жеткізеді, бұл оларды вирустық инфекцияға төзімді етеді (62).


Джон Джозеф Карижолич, Ph.D.

Вирустармен инфекция мен неоплазия арасындағы байланыс әртүрлі ісік аурулары үшін жақсы анықталған. Шын мәнінде, бүкіл әлем бойынша адам ісіктерінің шамамен 12% онкогенді вирустық инфекциялардан туындайды, жағдайлардың 80% -дан астамы дамушы елдерде кездеседі. Олардың таралуына және қоғамдық денсаулық сақтаудағы маңыздылығына қарамастан, біздің түсінігіміз бен вирустық ісіктерді басқару қабілеті әлі де шектеулі. Бұл ішінара жасушалық трансформацияға әкелетін хост-вирус әрекеттесуінің күрделілігіне байланысты.

Біздің зертханамыздағы зерттеулер гаммагерпесвирустық инфекция контексінде хост-вирус әрекеттесуін анықтауға бағытталған. ¿-герпесвирустар, адамның онкогендік вирустары Kaposi Sarcoma-ассоциирленген герпесвирус (KSHV) және Epstein Barr вирусы (EBV) қамтиды, әр түрлі бұзылулардың қоздырғыштары болып табылатын үлкен екі тізбекті ДНҚ лимфотрофты вирустар тұқымдасы, оның ішінде лимфопролиферативті аурулар, лимфомалар, сондай-ақ сүтқоректілердегі басқа лимфоидты емес ісіктер. Вирустық инфекцияға хост реакциясын зерттеу тарихи түрде белокты кодтайтын гендерге бағытталған, сондықтан белокты кодтамайтын транскриптомның, соның ішінде вирустық және хосттан алынған кодталмаған РНҚ-ның хост-вирус әрекеттестігіне қалай әсер ететінін түсінуіміз шектеулі. Осы бағытта біздің негізгі зерттеу мақсаттарымыз кодталмаған РНҚ-лар мен олардың РНҚ-байланыстыратын ақуыздары 191-герпесвирустық инфекция кезінде ген экспрессиясын реттеуге және иммундық жауаптың модуляциясына қалай біріктірілгенін түсінуге бағытталған. Осы мақсатқа жету үшін біз вирусология, иммунология, РНҚ биохимиясы, протеомика және геномика/транскриптомияны біріктіретін көпсалалы тәсілді қолданамыз. Зертхананың негізгі тақырыптық сұрақтарына мыналар жатады:

1) Туа біткен иммундық модуляцияға ықпал ететін эндогендік және экзогендік кодталмаған РНҚ түрлері қандай және бұл функциялар қалай делдалды?

2) Жасушаның ішкі туа біткен иммундық жүйесі ¿-герпесвирустың өмірлік циклін қалай қалыптастырады және қандай қожайын мен вирустық субъектілер ойнайды?

3) Эндогендік ретровирустар мен транспозондардың қожайын-вирустың әрекеттесуіне қандай үлесі бар?

Е Х, Чжао Ы, Карижолич Дж. Жасырын және литикалық KSHV геномдары бойынша транскрипцияны бастау пейзажы. PLoS патоги. 2019 жылғы 15 маусым (6): e1007852. PMID: 31188901, PMCID: PMC6590836, PII: PPATHOGENS-D-19-00162, DOI: 10.1371/journal.pat.1007852, ISSN: 1553-7374.

Heinrich MJ, Purcell CA, Pruijssers AJ, Zhao Y, Spurlock CF, Sriram S, Ogden KM, Dermody TS, Scholz MB, Crooke PS, Карижолич Дж, Aune TM. Эндогенді қос тізбекті Alu РНҚ элементтері қайталанатын ремиттік склерозда IFN-жауаптарын ынталандырады. J. Аутоиммун [баспа-электрондық]. 2019 жылғы 100 маусым: 40-51. PMID: 30826177, PMCID: PMC6513682, PII: S0896-8411(18)30699-1, DOI: 10.1016/j.jaut.2019.02.003, ISSN: 1095-9157.

Чжао Ы, Е Х, Дункер В, Ән Ы, Карижолич Дж. RIG-I ұнататын рецепторларды қабылдаушы РНҚ-ны сезіну KSHV инфекциясына жасушаның ішкі иммундық жауабын жеңілдетеді. Nat Commun. 2018 ж., 11/19/2018 9(1): 4841. PMID: 30451863, PMCID: PMC6242832, PII: 10.1038/s41467-018-07314-7, DOI: 10.10314-7, DOI: 10.10147-10.14018- 1723.

Дункер В, Сон Ы, Чжао Ы, Карижолич Дж. FUS Капошидің саркомамен байланысты герпесвирус генінің экспрессиясын теріс реттейді. Вирустар. 2018 ж. 7/6/2018 10(7): PMID: 29986386, PMCID: PMC6070805, PII: v10070359, DOI: 10.3390/v10070359, ISSN: 1999-1995

Гессер CR, Карижолич Дж, Dominissini D, He C, Glaunsinger BA. N6-метиладенозинді модификациялау және YTHDF2 оқу құралының ақуызы Капоши саркомасымен байланысты герпесвирус инфекциясы кезінде литикалық вирустық геннің экспрессиясында жасуша түріне ерекше рөл атқарады. PLoS патоги. 2018 жылғы 14 сәуір(4): e1006995. PMID: 29659627, PMCID: PMC5919695, PII: PPATHOGENS-D-17-02239, DOI: 10.1371/journal.pat.1006995, ISSN: 1553-7374.

Чжао Ю, Дункер В, Ю Ю, Карижолич Дж. Ядролық ген экспрессиясының оқиғаларындағы кодталмаған РНҚ псевдоуридиляциясының рөлі. Front Bioeng Biotechnol. 2018 6: 8. PMID: 29473035, PMCID: PMC5809436, DOI: 10.3389/fbioe.2018.00008, ISSN: 2296-4185.

Дункер В, Чжао Ы, Сон Ы, Карижолич Дж. Инфекцияның SINE-терін тану: ретротранспозондық экспрессияны реттеу және хост жасушаларының процестерін модуляциялау. Вирустар. 2017 ж. 12/18/2017 9(12): PMID: 29258254, PMCID: PMC5744160, PII: v9120386, DOI: 10.3390/v9120386, ISSN: 1999-1949

Ge J, Карижолич Дж, Чжай Ы, Чжэн Дж, Ю Ю. 5-Фторурацилмен емдеу трансляциялық қайта кодтаудың тиімділігін өзгертеді. Гендер (Базель). 2017, 10/31/2017 8(11): PMID: 29088058, PMCID: PMC5704208, PII: genes8110295, DOI: 10.3390/genes8110295, ISSN: 2053.

Карижолич Дж, Чжао Ю, Алла Р, Глаунсингер Б. Инфекциядан туындаған SINE РНҚ-ның геномдық картасы іріктелген мРНҚ экспортындағы рөлді көрсетеді. Nuclein Acids Res [баспа-электрондық]. 2017 наурыз 3/15/2017 PMID: 28334904, PII: 3071714, DOI: 10.1093/nar/gkx180, ISSN: 1362-4962.

Чжао Ы, Карижолич Дж, Glaunsinger B, Zhou Q. 7SK snRNA-ның псевдоуридилденуі АИВ-1 транскрипциясын басу және кідірістен құтылу үшін 7SK snRNP түзілуіне ықпал етеді. EMBO Rep [баспа-электрондық]. 2016 тамыз 8/24/2016 PMID: 27558685, PII: embr.201642682, DOI: 10.15252/embr.201642682, ISSN: 1469-3178.

Хуан Ц, Карижолич Дж, Ю Ю.Т. РНҚ 2'-О-метиляция мен псевдоридилденуді анықтау және сандық анықтау. Әдістер [баспа-электронды]. 2016 шілде 7/1/2016 103: 68-76. PMID: 26853326, PMCID: PMC4921259, PII: S1046-2023(16)30021-4, DOI: 10.1016/j.ymeth.2016.02.003, ISSN: 1095-9130.

Карижолич Дж, Yi C, Yu YT. РНҚ псевдоридилденуінің транскриптомдық кең динамикасы. Нат. Аян Мол. Cell Biol [баспа-электрондық]. 2015 қазан 16(10): 581-5. PMID: 26285676, PII: nrm4040, DOI: 10.1038/nrm4040, ISSN: 1471-0080.

Карижолич Дж, Ю Ю.Т. РНҚ модификациясының жаңа дәуірі. РНҚ. 2015 сәуір 21(4): 659-60. PMID: 25780180, PMCID: PMC4371322, PII: 21/4/659, DOI: 10.1261/rna.049650.115, ISSN: 1469-9001.

Карижолич Дж, Abernathy E, Glaunsinger BA. Инфекциядан туындаған ретротранспозоннан алынған кодталмаған РНҚ NF-¿B жолы арқылы герпесвирустық геннің экспрессиясын жақсартады. PLoS патоги. 2015 11(11): e1005260. PMID: 26584434, PMCID: PMC4652899, PII: PPATHOGENS-D-15-02010, DOI: 10.1371/journal.pat.1005260, ISSN: 1553-7374.

Карижолич Дж, Ю Ю.Т. Мерзімінен бұрын аяқталатын кодондардың емдік басылуы: механизмдер және клиникалық ойлар (шолу). Int. Ж.Мол. Med [баспа-электрондық]. 2014 жылғы 34 тамыз (2): 355-62. PMID: 24939317, PMCID: PMC4094583, DOI: 10.3892/ijmm.2014.1809, ISSN: 1791-244X.

Карижолич Дж, Чжао Ю, Петерсон Б, Чжоу Цю, Глаунсингер Б. Капошидің саркомамен байланысты герпесвирусы ORF45 RSK2 арқылы АҚТҚ-1 ұзақ терминалды қайталануының транскрипциялық белсендірілуіне делдалдық етеді. Дж. Вирол [баспа-электрондық]. 2014 маусым 88(12): 7024-35. PMID: 24719417, PMCID: PMC4054375, PII: JVI.00931-14, DOI: 10.1128/JVI.00931-14, ISSN: 1098-5514.

Lim SJ, Scott A, Xiong XP, Vahidpour S, Карижолич Дж, Гуо Д, Пэй С, Ю ЮТ, Чжоу Р, Ли ВХ. РНҚ интерференциясы мен Дисер-2 тұрақтылығындағы CRIF1 талабы. РНҚ био. 2014 11(9): 1171-9. PMID: 25483042, PMCID: PMC4615304, DOI: 10.4161/rna.34381, ISSN: 1555-8584.

Карижолич Дж, Хэмпси М. Медиатор кешені. Curr. Биол. 2012 желтоқсан 12/18/2012 22(24): R1030-1. PMID: 23257183, PII: S0960-9822(12)01320-6, DOI: 10.1016/j.cub.2012.11.011, ISSN: 1879-0445.

Карижолич Дж, Ю Ю.Т. Мақсатты псевдоридиляция арқылы мағынасыз кодондарды сезім кодондарына түрлендіру. Табиғат. 2011 маусым 6/16/2011 474(7351): 395-8. PMID: 21677757, PMCID: PMC3381908, PII: nature10165, DOI: 10.1038/nature10165, ISSN: 1476-4687.

Хуан Ц, Карижолич Дж, Ю Ю.Т. Жасанды Box H/ACA және Box C/D RNP арқылы РНҚ-ның транскрипциядан кейінгі модификациясы. Әдістері Мол. Биол. 2011 718: 227-44. PMID: 21370052, PMCID: PMC4161979, DOI: 10.1007/978-1-61779-018-8_14, ISSN: 1940-6029.

Карижолич Дж, Ю Ю.Т. Spliceosomal snRNA модификациялары және олардың қызметі. RNA Biol [баспа-электрондық]. 2010 наурыз 7(2): 192-204. PMID: 20215871, PMCID: PMC4154345, PII: 11207, ISSN: 1555-8584.

Карижолич Дж, Кантарцис А, Ю Ю.Т. РНҚ модификацияларының сандық талдауы. Әдістері Мол. Биол. 2010 ж. 629: 21-32. PMID: 20387140, PMCID: PMC4154561, DOI: 10.1007/978-1-60761-657-3_2, ISSN: 1940-6029.

Карижолич Дж, Кантарцис А, Ю Ю.Т. РНҚ модификациялары: ген экспрессиясын модуляциялайтын механизм. Әдістері Мол. Биол. 2010 629: 1-19. PMID: 20387139, PMCID: PMC4154353, DOI: 10.1007/978-1-60761-657-3_1, ISSN: 1940-6029.

Карижолич Дж, Ю Ю.Т. H/ACA RNP қорапшасының ақуыздық құрамдас бөліктері туралы түсінік. Карр протеомикасы. 2008 шілде 7/1/2008 5(2): 129-37. PMID: 19829749, PMCID: PMC2760984, DOI: 10.2174/157016408784911936, ISSN: 1570-1646.

Moelling C, Oberschlake R, Ward P, Карижолич Дж, Борисова К, Бжелос Н, Бергерон Л. Actinomyces naeslundii-де сидерофордың және биофильмнің түзілуінің металға тәуелді репрессиясы. FEMS микробиол. Lett [баспа-электронды]. 2007 қазан 275(2): 214-20. PMID: 17825071, PII: FML888, DOI: 10.1111/j.1574-6968.2007.00888.x, ISSN: 0378-1097.

Карижолич Дж, Стивенсон Д, Ю Ю. Псевдоридиляцияға қатысатын H/ACA RNP қораптарын биохимиялық тазарту. Мет. Фермент. 2007 ж. 425: 241-62. PMID: 17673087, PII: S0076-6879(07)25011-6, DOI: 10.1016/S0076-6879(07)25011-6, ISSN: 0076-6879.

Авторлық құқық және көшірме 2021 Вандербилт университеті. Мәселе бар ма?
Вандербилт университеті тең мүмкіндіктер және оң әрекет принциптерін ұстанады.


Шоу-Цзян (СЖ) Гао, Ph.D.

Доктор Гаоның зертханасындағы негізгі зерттеу бағыты Капоши саркома-ассоциативті герпесвирусы (KSHV) және СПИД-ке байланысты қатерлі ісіктерге назар аудара отырып, вирустық онкогенез болды. Зертхана мультидисциплинарлық күш-жігермен айналысады және зерттеу бағдарламасын трансляциялық және қатерлі ісік терапиясы, қатерлі ісік метаболизмі, микробиота, қабыну, ангиогенез, туа біткен иммунитет және микроРНҚ-ға кеңейтеді. Зертхана осы алдыңғы қатардағы биомедициналық мәселелерді шешу үшін геномика, эпигенетика, РНҚ эпигенетика, метаболомика, жоғары өнімді геномдық скрининг, жоғары өнімді дәрілік скрининг және жүйелік биологиядағы заманауи тәсілдер мен технологияларды қолданды. Атап айтқанда, зертхана жақында жаңа терапиялық мақсаттарды анықтау және инфекциялар мен қатерлі ісіктерге арналған жаңа үлгілік жүйелерді әзірлеу нәтижесінде дәрі-дәрмектерді скринингке және ашуға инвестициялады. Доктор Гаоның зертханасы сырттай қаржыландыру арқылы жақсы қолдау көрсетеді. Қазіргі уақытта белсенді PPG-нің 6 белсенді R01 және 1 қосалқы жобасы бар. Мұнда жүргізіліп жатқан зерттеу бағыттары мен жобаларының кейбірі берілген:

1. Дәрі-дәрмек скринингі және ашылуы: Зертхана қатерлі ісік пен инфекцияның бірнеше модельдерін әзірледі және оларды Crispr-Cas9 арқылы геномдық скринингте және есірткі скринингінде қолданды. Зертхана қазірдің өзінде көптеген жаңа мақсаттар мен агенттерді анықтады, олардың in vitro және in vivo үлгілерінде тиімді екендігі көрсетілген.

2. Жүйе биологиясы: Зертхана эпигенетика, РНҚ эпигенетика және қатерлі ісік және инфекциялардағы метаболомика бойынша жұмыстармен айналысады.

3. Инфекциялар, қабыну және туа біткен иммунитет: Зертхана микроРНҚ-ларды, қабынуды, ангиогенезді, туа біткен иммунитетті және инфекцияларды зерттеуді жалғастыруда.

Өкілдік басылымдар

Граффаз М, Чжоу SH, Васан К, Рушинг Т, Майкл КЛ, Лу С, Юнг Джу, Гао С-Дж. KSHV жасырын және литикалық репликацияларына бағытталған бастапқы эффузиялық лимфоманы емдеу үшін цитарабинді қайта өңдеу. mBio, 2018, 9: e00756-18.

Тан Б, Лю Х, да Силва СР, Юань ХФ, Сорел О, Чжан Л, Мэн Дж, Хуан ЮФ, Гао СЖ. KSHV өмірлік цикліндегі вирустық және жасушалық N6-метиладенозин және N6,2'-O-диметиладенозин эпитранскриптомдары. Табиғат микробиологиясы, 2018, 3:108-120

Граффаз М, Васан К, Тан Б, да Силва СР, Гао СДж. TLR4-делдалдық қабыну STAT3 жолын белсендіру арқылы KSHV-индукцияланған жасушалық трансформацияға және ісік пайда болуына ықпал етеді. Рак зерттеулері, 2017, 77: 7094-7108.

Чжу Ю, Ли ТТ, да Силва СР, Джэ-Джин Ли, Лу Ц, Хёнгжин Эох, Джун Джу, Гао СДЖ. Онкогенді вирус ұрлаған рак клеткаларында нуклеотидтер биосинтезі үшін глутамин мен аспарагин γ-азотының маңызды рөлі. mBio, 2017, 8. pii: e01179-17. doi: 10.1128/mBio.01179-17.

Чжу Ю, да Сильва СР, Лян ЦМ, Лу Ц, Фэн ПХ, Джунг Джу, Гао СЖ. KSHV арқылы гликолизді басу жасушалардың өмір сүруіне және онкогендік трансформацияға ықпал етеді. PLoS патогендер, 2016, 12: e1005648.

Ли МС, Джонс Т, Сонг Ди, Джанг Джэй, Джун Джу, Гао С-Дж. Жасушаның өмір сүруі және тұрақты инфекция үшін онкогенді Капоши саркомамен байланысты герпесвирустың комплемент жүйесін пайдалану. PLoS патогендер, 2014, 10: e1004412.

Moody R, Zhu Y, Huang YF, Cui XD, Jones T, Bedolla R, Lei XF, Bai ZQ, Gao S-J. KSHV микроРНҚ-лары жасушаның өсуіне және өмір сүру жолдарына артық бағыттау арқылы жасушалық трансформация мен ісік пайда болуына делдалдық жасайды. PLoS патогендер, 2013, 9: e1003857.

Greene W, Zhang W, He ML, Witt C, Ye FC және Gao S-J. Убиквитин/протеазом жүйесі Капоши саркомымен байланысты герпесвирустың эндотелий жасушаларына енуін реттейді. PLoS патогендер, 2012, 8: e1002703.

Джонс Т, Йе ФК, Бедолла Р.Г., Хуан ЮФ, Мэн Дж, Цянь Л.В., Пан ХY, Чжоу ФК, Муди Р, Вагнер, Б, Арар М және Гао С-Дж. KSHV арқылы бастапқы егеуқұйрық метанефрикалық мезенхималық жасушалардың тікелей тиімді жасушалық трансформациясы. Клиникалық зерттеулер журналы, 2012, 122, 1076-1081.

Lei XF, Bai ZQ, Ye FC, Xie JP, Kim CG, Huang YF және Gao S-J. NF-kB ингибиторы IkBa реттелуі және KSHV микроРНҚ арқылы вирустық репликация. Табиғат жасушаларының биологиясы, 2010, 12, 193-199.