Ақпарат

ПТР түтіктерін сыйымдылыққа толтыру мәселесі бар ма?

ПТР түтіктерін сыйымдылыққа толтыру мәселесі бар ма?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Мен ПТР реакциясын ұлғайтуды жоспарлап отырмын және ПТР түтіктерін максималды 200 ул. көлемге толтыру қиындық туғыза ма деп ойлаймын. Бұл тамшуырдың әлдеқайда аз екенін білдіреді, өйткені маған түтіктердің 1/4 бөлігі ғана қажет болады.

Мен көрген типтік хаттамалар ПТР реакциясы үшін әрқашан 50 ul пайдаланады, мен үлкен көлемдегі мәселелер бар ма деп ойлаймын, мысалы: жылу берудегі айырмашылықтар, егер мен бір түтіктегі көлемді үлкейтсем, мәселе туындауы мүмкін.

Дыбыс деңгейін ұлғайту проблемалы ма? Қандай да бір нақты аспектілерді қарастыруым керек пе?


(Сондай-ақ түсініктеме беру үшін тым ұзақ.) Бұл сұрақ маған Рейджи Оказаки (Оказаки фрагменттерін ашушы) қабылдаған масштабты ұлғайту тәсілі туралы Артур Корнберг айтқан анекдотты есіме түсірді.

Мұнда дәйексөз алынды Ферменттерге деген сүйіспеншілік үшін: Артур Корнбергтің Биохимик Одиссеясы

Рейджидің зерттеу стилі оның жарияланымдарынан оңай алынбайды, бірақ ол менің жадымда анық. Бір мысал мен Оказаки маневрі деп атаймын. Ферментті тазарту кезінде ол қыздыру қадамын қолданды: 10 миллилитр фермент ерітіндісін пробиркада 70°C температурада бес минут ұстады; содан кейін коагуляцияланған қоспалар центрифугалау арқылы жойылды. Ол процедураны бірнеше литрге дейін ұлғайту нүктесіне келгенде, ол бастапқы қыздыру процедурасын бірнеше жүз рет қайталады. Біздің басылымда мұндай күрделі емес процедура туралы хабарлауға мәжбүр болдым. Бірақ содан кейін мен оның бұл қадамды бірнеше сағаттың ішінде аяқтай алатынын түсіндім және үлкен стакан немесе колбада қыздыруды үйрену үшін қымбат уақыт пен материалды ысырап етудің қажеті жоқ екенін түсіндім. Кейінірек, менің тағы бір шәкіртім ферментті қыздыру қадамымен тазартып, оның процедурасын 3 миллилитрден 6 литрге дейін 2000 есе ұлғайтуға мәжбүр болғанда, мен Оказаки маневріне кеңес бердім: ол 200 пробирканың әрқайсысына 3 миллилитр қосты. процедураны тоғыз рет қайталай отырып, қыздыру және центрифугалау қадамы. Бұл ферменттің үлкен көлемін бір қадамда қыздыруға тырысқан тағы бір студент оны қалың коагулумда жоғалтып алды.


Түсініктеме үшін тым ұзақ: бұл ПТР-ге байланысты дер едім. Мен өзім 50ul максималды көлемді қолдандым, егер маған жоғарырақ көлемді дайындау керек болса, мен бір қоспаны жасадым, ол кейіннен 50ul макс. көп түтіктерге таратылды.

Үлкен көлемдердегі мәселе жылдам және біртекті жылыту мен салқындату болып табылады. Түтіктің сырты жылдамырақ болса, онда реакция қазірдің өзінде басталады, ал ортасында бұлай болмауы мүмкін. Бұл үлгінің біркелкі емес денатурациясына және күшейтілуіне әкелуі мүмкін. Қысқа тізбектерді күшейту кезінде кейінгісі әсіресе қиын болады. Бұл жерде күшейту уақыты әлдеқашан біткен болуы мүмкін және ПТР бағдарламасы үлгі аяқталғанға дейін қозғалады, бұл сіздің толық өлшемді өніміңіздің азаюына және қысқа нұсқалардың байытылуына әкеледі.

Үлкен реакцияларда туындауы мүмкін тағы бір мәселе бар: температура градиенттеріне байланысты реактивтілік градиенттеріне байланысты, менің ойымша, реагенттер (dNTPs, Mg-иондар) жақсы кірісті одан әрі тежейтін градиенттерді құра алады.

Ақырында мен ПТР аппараттарымыздың бірінде бір нәрсені сынадым: ПТР түтігі қыздыру/салқындату блогына орнатылған. Ол блокқа толығымен орнатылмаған, бірақ жартылай шығып тұрады, сондықтан оны максималды сыйымдылыққа дейін толтырсаңыз, жоғарғы 75-100ул (шамамен) жылыту блогынан тыс қалады және бізде жылу мәселесі бар. Ондағы реакция қоспасы тек конвекцияға байланысты қызады.


Тазартусыз молекулалық биологиялық реагенттерді өндіру

Филиалдар Молекулярлық биоғылымдар бөлімі, Жаратылыстану ғылымдары колледжі, Остиндегі Техас университеті, Остин, Техас, Америка Құрама Штаттары, Жүйелер және синтетикалық биология орталығы, Остиндегі Техас университеті, Остин, Техас, Америка Құрама Штаттары

Рөлдер Ресми талдау, зерттеу, әдістеме, валидация, визуализация, жазу – шолу және өңдеу

Affiliation Freshman Research Initiative, DIY Diagnostics Stream, Остиндегі Техас университеті, Остин, Техас, Америка Құрама Штаттары

Рөлдер әдістемесі, ресурстар, визуализация, жазу – шолу және өңдеу

Affiliation Freshman Research Initiative, DIY Diagnostics Stream, Остиндегі Техас университеті, Остин, Техас, Америка Құрама Штаттары

Рөлдер әдістемесі, ресурстар

Филиалдар Молекулярлық биоғылымдар бөлімі, Жаратылыстану ғылымдары колледжі, Остиндегі Техас университеті, Остин, Техас, Америка Құрама Штаттары, Жүйелер және синтетикалық биология орталығы, Остиндегі Техас университеті, Остин, Техас, Америка Құрама Штаттары

Рөлдер Ресми талдау, зерттеу, әдістеме, валидация, жазу – шолу және өңдеу

Филиал Mboalab Biotech, Яунде, Камерун

Рөлдер тұжырымдамасы, формальды талдау, зерттеу, әдістеме, ресурстар, қадағалау, тексеру, визуализация, жазу – шолу және өңдеу

Кембридж университетінің Химиялық инженерия және биотехнология бөлімі, Кембридж, Ұлыбритания

Рөлдер Ресми талдау, зерттеу, әдістеме, валидация, жазу – шолу және өңдеу

Филиал Hive Biolab, Кумаси, Гана

Филиалдар Молекулярлық биоғылымдар бөлімі, Жаратылыстану ғылымдары колледжі, Остиндегі Техас университеті, Остин, Техас, Америка Құрама Штаттары, Жүйелер және синтетикалық биология орталығы, Остиндегі Техас университеті, Остин, Техас, Америка Құрама Штаттары

Филиалдар Молекулярлық биоғылымдар бөлімі, Жаратылыстану ғылымдары колледжі, Остиндегі Техас университеті, Остин, Техас, Америка Құрама Штаттары, Жүйелер және синтетикалық биология орталығы, Остиндегі Техас университеті, Остин, Техас, Америка Құрама Штаттары

Рөлдер тұжырымдамасы, формальды талдау, қаржыландыруды алу, әдістеме, жобаны басқару, қадағалау, тексеру, визуализация, жазу – шолу және өңдеу

Кембридж университетінің Химиялық инженерия және биотехнология бөлімі, Кембридж, Ұлыбритания

Рөлдердің тұжырымдамасы, қаржыландыруды алу, жобаны басқару, қадағалау, жазу – шолу және өңдеу

Филиалдар Молекулярлық биоғылымдар бөлімі, Жаратылыстану ғылымдары колледжі, Остиндегі Техас университеті, Остин, Техас, Америка Құрама Штаттары, Жүйелер және синтетикалық биология орталығы, Остиндегі Техас университеті, Остин, Техас, Америка Құрама Штаттары


TapeStation & Bioanalyzer үлгісіне қойылатын талаптар

TapeStation реагенттеріне жиі кері тапсырыстар болғандықтан, үлгілер биоанализерде өңделуі мүмкін. Тиімді өңдеу үшін үлгілерді топтастыру арқылы TapeStation және Bioanalyzer реагенттерін сақтауға тырысқанда деректерді қайтару кешігуі мүмкін. Нәтижелер Genomics Depot сайтына жарияланған кезде, Genomics Core қызметкері сізге электрондық пошта арқылы хабарлайды.

Bioanalyzer жұмысына арналған қалыпты баға тоқтатылады және бір үлгінің құны TapeStation талдау бағасына сәйкес болады. Жалпы РНҚ үлгілері әрқайсысы 9 долларға сыналады. Фрагменттелген ДНҚ, dsDNA ПТР өнімдері және өлшемі <1000 bp дайындалған кітапханалар әрқайсысы 9 долларға өңделеді. Фрагменттелген ДНҚ, dsDNA ПТР өнімдері және өлшемі 1000 bp дейін немесе одан асатын дайындалған кітапханалар (мысалы, cDNA немесе ATAC-seq кітапханалары) әрқайсысы $13 үшін өңделеді.

Өсімдіктің жалпы РНҚ үлгілерін өсімдікке жатпайтын эукариоттық параметрмен талдауға болатынын ескеріңіз, бұл RIN көрсеткішін автоматты түрде есептеуге әсер етеді. Genomics Core мұны кітапхананы дайындауға ұсынылған үлгілердің сапасын бағалау кезінде ескереді.

TapeStation/Bioanalyzer талдауына қатысты кез келген сұрақтар бойынша [email protected] мекенжайына хабарласыңыз.

Genomics Core жүйесінде Agilent 4200 TapeStation және Agilent 2100 биоанализаторы бар. Екі құрал да ДНҚ мен РНҚ сапасы мен санын бағалау үшін автоматтандырылған электрофорезді пайдаланады.

Genomics Core жүйесінде Agilent 4200 TapeStation және Agilent 2100 биоанализаторы бар. Екі құрал да ДНҚ мен РНҚ сапасы мен санын бағалау үшін автоматтандырылған электрофорезді пайдаланады. Осы құралдардың көмегімен Genomics Core жалпы РНҚ, дайындалған кітапханалар, dsDNA ПТР өнімдері, фрагменттелген ДНҚ және жоғары молекулалық салмақты геномдық ДНҚ талдауын қамтамасыз ете алады.

Барлық үлгілер, егер басқаша талап етілмесе, TapeStation жүйесінде өңделеді. Жалғыз ерекшелік - шағын РНҚ немесе микро РНҚ кітапханасын дайындауға жіберілетін жалпы РНҚ. Бұл үлгілер биоанализаторда талданады, себебі ол шағын РНҚ және микро РНҚ түрлеріне сезімтал.

4200 TapeStation талдауы жеке адрестелетін жолақтары бар ScreenTape құрылғысында орындалады, мұнда әр жолақ үшін 1 үлгі орындалады. Бұл бір уақытта 1 немесе одан да көп үлгіні талдауға мүмкіндік береді. TapeStation талдауы әрбір үлгі негізінде сатылады.

2100 Bioanalyzer талдауы 1-ден 11-ге дейінгі үлгілерді талдауға мүмкіндік беретін 11 шұңқырдан тұратын чипте орындалады. Биоанализатормен 11 үлгіге арналған реагенттер тіпті 11 үлгіден аз талданса да пайдаланылады. Сондықтан биоанализер талдауы әр чип негізінде сатылады (1-ден 11 үлгіге дейін).

Үлгі концентрациялары Qubit немесе PicoGreen сияқты флюорометриялық әдіспен өлшенуі керек.

Төмендегі кесте TapeStation немесе Bioanalyzer құрылғысында талдау үшін үлгілерді Genomics Core жүйесіне жіберуге арналған спецификацияларды сипаттайды.


Клиникалық зертханада нуклеин қышқылын талдау

Күшейтуге негізделген байыту әдістері

Ампликон негізіндегі NGS әдістері секвенирлеу кітапханаларын жасау үшін ПТР пайдаланады және тек белгілі бір ROI секвенирлеу үшін өте қолайлы (Cурет 13.11A). Олар материалы шектеулі мұрағатталған тіндерді талдау кезінде өте қолайлы және псевдогендердің (немесе ROI-ге жоғары реттілік гомологиясы бар геномдық аймақтардың) күшеюін болдырмау немесе азайту үшін мұқият жобаланған праймерлер жиынтығына сүйенеді. Қазіргі уақытта қызығушылық тудыратын мақсатты реттіліктерді дайындау және байыту үшін кем дегенде төрт ампликонға негізделген кітапхананы дайындау тәсілі пайдаланылады: мультиплексті ПТР, бірплексті ПТР, мақсатты түсіру, одан кейін мультиплексті ПТР және анкерленген мультиплексті ПТР [46,48]. Ампликонға негізделген байыту стратегиялары әр ампликонның бастау және тоқтату координаталары алдын ала анықталғандықтан, мақсаттан тыс реттілігі аз аймақты 100% қамтуға қол жеткізе алады. Дегенмен, күшейтуге негізделген мақсатты байытудың бір шектеуі оның аллельді жоғалтуға бейімділігі болып табылады, бұл жалған-теріс қоңырауларға әкелуі мүмкін. Аллельді түсіру нұсқа праймерді байланыстыратын жерде орналасқанда орын алады, бұл сәтсіз күшейтуге және аллельді қиғаштыққа әкеледі [49].

13.11-сурет. (A) ампликон негізіндегі кітапханалық дайындық және (B) будандастыру негізіндегі кітапханалық дайындық арасындағы айырмашылықтардың схемалық көрінісі.


ҚОЛДАУ ХАТТАМАСЫ 1

ТЕРМИЯЛЫҚ ДЕНАТУРАЦИЯ МӘЛІМЕТТЕРІН СЫЗЫҚТЫҚ ЕМЕС ҚАБЫЛДАУДАН БАЛҚУ ТЕМПЕРАТУРАСЫН АНЫҚТАУ

Бұл қолдау хаттамасы балқу температураларын алу үшін термиялық денатурация қисықтарының негізгі сызықты емес фитингін аяқтау үшін қажетті қадамдарды сипаттайды (3-сурет). Балқу температурасын бағалаудың балама әдісі 3c-суретте (осы бірлікте қарастырылмаған) көрсетілгендей температураға қатысты флуоресценттік сәулеленудің бірінші туындысын есептеуді қамтиды.

Әдеттегі термиялық ығысу талдау деректері және талдау. (А) Рекомбинантты ақуыздың типтік термиялық денатурация профилі. Бөлме температурасындағы төмен флуоресценция ақуыздың жақсы бүктелгенін көрсетеді. Флуоресценцияның эмиссиясы температураның жоғарылауымен артады, бұл белоктың бірлесіп ашылуын білдіретін сигмоидальды қисық сызығын тудырады. Протеин: бояғыш кешендердің ең жоғары шоғырлануынан кейінгі флуоресценция сигналының сөнуіне әкеледі. (Б) Термиялық денатурация қисықтарын автоматтандырылған өңдеу шыңнан кейінгі сөндіруді жою үшін деректер жиынын қысқартады. Алынған сигмоидальды қисықтар балқу температурасын анықтау үшін Больцман теңдеуіне сызықты емес сәйкестендіріледі немесе Тм, бұл ашылатын өтудің ортасында орын алады. Сұр сызық флуоресценция қисығының Больцман теңдеуіне сызықтық емес сәйкестігін білдіреді. (C) Немесе, the Тм температураға (�/d) тәуелді флуоресценциялық эмиссияның бірінші туындысының графигін салу арқылы оңай анықталады.Т). Мұнда, Тм қисығының ең төменгі бөлігі ретінде көрсетіледі.

Материалдар

Excel бағдарламасы (Microsoft Office, Microsoft, Inc.)

Графикалық бағдарламалық құрал (мысалы, GraphPad Prism 5.0, GraphPad Software, Inc.)

Шыңнан кейінгі флуоресценцияны қысқарту

Excel бағдарламасындағы нақты уақыттағы ПТР құралының өңделмеген флуоресценция деректерін қамтитын csv файлын ашыңыз. Деректер баған пішімінде болуы керек, мұнда әр баған шешімнің басқа күйін көрсетеді және әр жол 25 ºC-ден 95 ºC-ге дейінгі басқа температурада флуоресценцияның шығарылуын қамтамасыз етеді. Қажет болса, деректер бағандарына шешім шарттары бар белгілерді қосыңыз. Парақты ‘Raw Data’ деп белгілеңіз.

Excel жазу кітапшасында жаңа парақ жасаңыз. Жаңа параққа бастапқы деректер мен белгілерді көшіріңіз. Парақты ‘Қосылған деректер’ деп белгілеңіз.

Мәтінді пішімдеу бұзылмаған 1-қосымша файлға енгізу арқылы Excel бағдарламасында жаңа �leteaftermax’ макросын жасаңыз. Стандартты Excel протоколдарына сәйкес қысқартылған деректер жиынында �leteaftermax’ макросын орындаңыз.

Бұл макрос деректер бағанындағы ең үлкен сандық мәнді табады және осы максимумнан кейінгі екі жолдан кейінгі барлық деректер нүктелерін жояды.

Кесілген флуоресценция деректерінің сызықты емес сәйкестігі

Сызықты емес фитингті орындай алатын графикалық бағдарламалық құралды ашыңыз (мысалы, GraphPad Prism). Талдау үшін қысқартылған деректерді жаңа файлға көшіріңіз.

Кесілген деректер жиынын Больцманның сигмоидальды қисығына сызықты емес сәйкестендіруді келесі теңдеумен орындаңыз:

Мұндағы Y = ерікті бірліктерде флуоресценция шығарылымы X = температура Төменгі жағы = төмен температурадағы негізгі флуоресценция Жоғарғы = кесілген деректер жиынының жоғарғы жағындағы максималды флуоресценция Еңіс = қисық сызықтың тіктігін сипаттайды, үлкен мәндері таяз қисықтарды және Тм = ақуыздың балқу температурасы.

Алдыңғы қадамда макроспен ең жоғары флуоресцентті сөндіруді жою арқылы, Больцманның сигмоидтық теңдеуімен сызықты емес фитинг T үшін жақсырақ сәйкестікті қамтамасыз етеді.м максималды флуоресценцияны жақсырақ бағалауға негізделген.

Графикалық бағдарламалық құрал теңдеудегі әрбір параметр үшін сәйкес мәндерді, сондай-ақ стандартты қателерді және деректерді талдау үшін 95% сенімділік интервалдарын қамтамасыз етеді.

Идеал профильдерге (төмен негізгі флуоресценция, денатурация кезіндегі сигмоидальды өту және т.б.) сәйкес келетін термиялық денатурация қисықтары әдетте T береді.м стандартты қателермен сәйкес келеді ≤ 0,3 ଌ.

Сюжет Тмs ерітінді жағдайларының функциясы ретінде немесе стандартты буферге қатысты ерітінді жағдайларын өзгерту функциясы ретінде жылу ығысуын зерттеу үшін келесі талдауларды орындаңыз (яғни балқу температурасының өзгеруін есептеу, ΔТм).

Негізгі шешім жағдайын (бұрын пайдаланылған буфер шарты) бастапқы T ретінде анықтау пайдалым және Т-ны зерттеңізм осы Т-ке қатысты шешім шарттарым.


Коронавирус: мыңдаған зертханалық сынақтар түсініксіз болып, кідірістердің ықтималдығын арттырады

Қоғамдық денсаулық сақтау сарапшылары COVID-19 пациенттерін диагностикалаудағы баяу бұрылыс контактілерді іздеуге нұқсан келтіруі мүмкін деп ескертеді.

Сәрсенбі 27 мамыр 2020 жыл 10:25, Ұлыбритания

Үкіметтің негізгі сынақ зертханасында жүргізілген мыңдаған коронавирустық сынақтар нақты нәтиже бермейді, деп хабарлайды Sky News, бұл адамдарды қайта тестілеу кезінде бірнеше күн күтуге мәжбүр етеді.

Sky News үкіметтің Милтон Кейнстегі негізгі сынақ зертханасында жүргізілген жағынды сынақтарының 4% химиялық сынақ процесіндегі шектеулерге байланысты «түсініксіз» деп жарияланғанын білді.

Тесттер, сондай-ақ, егер олар дұрыс енгізілмесе, оларды зертханаға тасымалдауда кідіріс болса немесе таңбалау, штрих-кодтау немесе қаптамада ақаулар болса, нақты нәтиже бермеуі мүмкін.

Ұлыбританиядағы коронавирус трекері: Сіздің аймағыңызда қанша жағдай бар

Барлығы қанша сынақ нәтижесіз екені белгісіз, бірақ премьер-министр Борис Джонсон айдың соңына дейін тестілеу желісі бойынша сынақ өткізу қабілетін күніне 200,000-ға дейін арттыруға уәде берді.

Бұл күніне кемінде 8 000 сынақ немесе аптасына 56 000 анық емес болуы мүмкін дегенді білдіреді.

Ғалымдар түсініксіз нәтижелер тестілеу процесінің қалыпты бөлігі екенін айтты, бірақ денсаулық сақтау сарапшылары адамдарға нәтижелерді алудың кешігуі үкіметтің келесі аптада іске қосылуы күтілетін сынақ, бақылау және бақылау жүйесін бұзуы мүмкін екенін ескертті.

Сынақ нақты нәтиже бермесе, адамдардан сынақты қайталау сұралады. Оларға мәтіндік хабарлама жіберіледі, онда:

Ковид-19 туралы толығырақ

COVID-19: Борис Джонсон 2021 жыл коронавируспен «не болса да» халықаралық саяхат үшін «қиын» жыл болады дейді

КОВИД-19: Никола Стерджен Энди Бернхэмді Үлкен Манчестерге саяхаттауға тыйым салуға байланысты онымен «жанжал тудырды» деп айыптайды

COVID-19: Борис Джонсон бұл 19 шілдеде «жақсы көрінеді» дейді, бірақ қыста одан әрі құлыптауды жоққа шығармайды

Билли Гилмур: Шотландиялық жартылай қорғаушы COVID сынағы оң болғаннан кейін Хорватияға қарсы Еуро-2020 топтық матчын өткізіп жібереді

Ковид-19: Үкімет екі соққыдан зардап шеккен адамдар үшін 10 күндік оқшаулау ережелерін алып тастағысы келеді, дейді Мэтт Хэнкок

COVID-19: Англиядағы қалған шектеулердің 5 шілдеде ерте жойылуы екіталай - министр

«Сенің COVID-19 сынақ түсініксіз болып шықты. Бұрын пайдаланған маршрут арқылы қайта сынақтан өтіңіз."

Содан кейін оларда симптомдар жалғаса берсе, өзін-өзі оқшаулау ұсынылады.

Үкіметке контактілерді іздеу қолданбасы туралы кеңес беретін ғалым диагноздың кешігуі контактілерді іздеуді қиындатқанын айтты.

Оксфордтың Үлкен деректер институтының зерттеушісі Дэвид Бонсалл: «Контактіні іздеу жұмыс істеуі үшін ол жылдам болуы керек», - деді.

«Егер сіз адамдарды іздеп, басқаларды жұқтырғаннан кейін адамдарды тапсаңыз, контактілерді іздеудің қажеті жоқ, сіз вирусты қуып жетуіңіз керек.

«Бұл вирус тестілеудің қаншалықты жылдам болуы керектігін анықтайды және ол өте жылдам болуы керек».

Sky News түсініксіз сынақ нәтижелерін алған адамдармен сөйлескенде, олар жүйе өте баяу болуы мүмкін екенін айтты.

«Маған нәтижелерімді бес күн ішінде алатынымды айтты, бірақ олар маған нәтижелер анық емес екенін айту үшін 16 күн қажет болды», - деді Крис Данн.

«Олар мені қайтадан тестілеуден өтуім керек деді, бірақ мен мұны өте мағынасыз деп көрдім, өйткені бұл сынақтан өтудің ең жақсы уақыты белгілер пайда болғаннан кейін үш күн ішінде екенін айтады».

Толық аты-жөнін атамаған Келли анасының тестілеу нәтижесін алуы үшін «екі апта» қажет болғанын айтты, бірақ ол белгісіз болды.

«Ол уақытта біз екі рет фельдшерлерді шақыруға тура келді, ал екінші рет ол Уистон ауруханасына емделуге жатқызылды», - деді ол.

«Ол жерде екі рет сынақтан өтті, бірақ дәрігер оның белгілерінің 12-ші күні болғандықтан, оның теріс болуы мүмкін екенін ескертті».

North Cumbria University Hospitals NHS Trust-те жұмыс істейтін Мэтт Уоллер тестілеуден кейін 11 күннен кейін белгісіз сынақ нәтижесін алды, өйткені ол серіктесінде COVID белгілері болған.

«Бұл мені біраз алаңдатты, өйткені сол кезде мен сенімгерліктегі екі A&E бөлімінде пациенттерді көріп, тәуекелге ұшырайтын қызметкерлермен бірге жұмыс істедім», - деді ол.

"Мен әлі асимптоматикалық болдым, бірақ кәсіби денсаулық бөліміне хабарласуды шештім. Олар нәтижесіз сынаманың негізінде мені жағындылауға келісті. Мен осы дүйсенбіде жағынды, ол 19-да теріс болып шықты. Мұның бәрі өте сәйкес келмейтіндей болды."

Денсаулық сақтау және әлеуметтік көмек департаментінің өкілі Sky News-ке:

"Біз сынақтарымыздың сенімділігіне толық сенімдіміз және біздің жоғары білікті ғалымдарымыз қорытындысыз нәтижелер өте сирек болатынына көз жеткізу үшін қолдан келгеннің бәрін жасайды. Кез келген вирусқа арналған сынақтармен қорытындысыз сынақ нәтижелері болады."

«Қазір 1,8 миллионнан астам адам тестілеуден өтті және олардың басым көпшілігінде сынақ нәтижелерімен ешқандай проблемалар болмады», - деп қосты олар.

Руперт Бийл, Лондондағы Крик институтының COVID-19 сынақтарын жүргізетін ғалымы, кез келген тестілеу процесінің түсініксіз нәтиже беруі қалыпты жағдай екенін айтты.

«Әдетте бұл өте төмен вирустық жүктеме болғанын немесе вирустық жүктеме болмағанын және сіз олардың арасындағы айырмашылықты айта алмайтыныңызды білдіреді», - деді ол.

«Бұл шын мәнінде тестілеу процесінің шектеулері туралы».

Симптомдар жалғаса берсе, өзін-өзі оқшаулау туралы үкіметтің кеңесі ақылға қонымды ма деген сұраққа доктор Бил «бұл өте ақылға қонымды көрінеді» деді.

«Барлық зертханалар вирустың үлкен мөлшерін анықтауда керемет жақсы - бұл таралуды шектеу үшін маңызды нәрсе».


МИКОЛОГИЯ ЖӘНЕ ПАРАЗИТОЛОГИЯ ПРИНЦИПТЕРІ МЕН ҚОЛДАНЫЛУЫ

Микроорганизмдерді дәл анықтау мүмкіндігі саңырауқұлақ эпидемиологиясы мен диагностикасының барлық аспектілері үшін негізгі болып табылады. Фитопатологияда ауру қоздырғыштарын ерте анықтау қоздырғыштарды тану үшін өте маңызды (60). Соңғы он жылда ПТР технологиясы арқылы саңырауқұлақтардың молекулалық диагностикасында жетістіктерге қол жеткізілді. Дәстүрлі әдістерден айырмашылығы, үлгілерді ПТР арқылы тікелей сынауға және культураларды қажет етпестен оқшаулауға болады. Техника жылдам және өте нақты. Оны белгілер пайда болғанға дейін қоршаған орта үлгілерінен саңырауқұлақ ДНҚ-сының іздік мөлшерін анықтау үшін пайдалануға болады. Сондықтан ауруды ерте бақылау әдістерін енгізуге мүмкіндік береді. ПТР жүйелі түрде орындалуы мүмкін және нәтижелерді түсіндіру үшін арнайы дағдыларды қажет етпейді. Технология сонымен қатар нақтырақ сандық деректерді ұсына алады, шешім қабылдауға және саңырауқұлақ агенттерінің биологиялық бақылауда қаншалықты тиімді екенін бағалауға қажетті қосымша ақпаратты қамтамасыз етеді. 1980 жылдардың ортасында енгізілгеннен бері ПТР ДНҚ технологиясының негізіне айналды және көптеген байланысты технологияларды құру жолын ашты. Ол бір немесе бірнеше бастапқы тізбектерден күшейтілген ДНҚ мөлшерін анықтау қабілетімен ерекшеленеді. Дәстүрлі ПТР сандық емес, сапалы. Ол қоршаған орта үлгілерінің бүкіл жиынтығынан саңырауқұлақтарды анықтау, бақылау және анықтау үшін қолданылған және молекулярлық саңырауқұлақ диагностикасының өзегі болып табылады (4).

Флуоресцентті ПТР орнында Жартылай өткізгіштіктен кейін тіркелген қоршаған орта үлгілеріндегі саңырауқұлақтарды анықтау және орналастыру үшін флуоресцентті таңбаланған праймерлерді немесе зондтарды пайдаланады (102). Праймерлердің немесе зондтардың флуоресценциясы конфокальды микроскоптың көмегімен анықталады. Бұл әдіс үлгідегі ағзаны тікелей анықтауға мүмкіндік береді. Ол сондай-ақ кеңістікте таралуын, иесімен және басқа организмдермен өзара әрекеттесуін көрсетеді. Баго, Пиче, Саймон (5) қолданылған орнында Арбускулярлы микориза саңырауқұлақтары тудырған инфекцияларды анықтау және орналастыру үшін ПТР. ПТР қолдану аясы шексіз (5). Оны бір түрді немесе тұтас қауымдастықтарды зерттеу үшін пайдалануға болады (22,35,80).

Pneumocystis jiroveci (бұрын аталған саңырауқұлақ Pneumocystis carinii) АҚТҚ жұқтырған немесе басқа да иммунитеті төмендеген науқастарда ауыр пневмонияны тудыруы мүмкін, бірақ оны анықтау тыныс алу жолындағы үлгілердің микроскопиясымен шектеледі. анықтау үшін микроскопия P. jiroveci әдетте дақтарды қолдануды қамтиды. Иммунофлуоресценция бұл дақтарға қарағанда сезімталырақ, бірақ қымбатырақ және арнайы қондырғыларды қажет етеді. ПТР әсіресе АИТВ-ны жұқтырмаған науқастарда аса сезімтал, сондықтан айтарлықтай пайдалы болуы мүмкін (36). ПТР спецификасы шектеулі, бірақ бұл микроорганизм барлық жерде таралған комменсал болғандықтан, ауру болмаған кезде оны ПТР арқылы анықтауға болады (37).

Микологияда ПТР технологиясын қолданудың тағы бір мысалы - инфекцияны анықтау Аспергиллус ssp. нейтропениямен ауыратын науқастарда. Бұл ауруды культура әдісінің нашар сезімталдығына және тромбоциттер саны төмен адамдарда гистопатологиялық үлгілерді табу қиындығына байланысты диагностикалау өте қиын. Ең жақсы нәтижеге жету үшін ерте емдеу маңызды. ПТР нақты диагнозға қажетті уақытты қысқартуы мүмкін (111). Нақты уақыттағы ПТР патогендердің санын анықтау үшін сәтті қолданылды (7,13,21,112), осылайша саңырауқұлақ ауруларын қалай емдеуге және саңырауқұлақтардың әсерін бағалауға қатысты шешім қабылдауға көмектеседі (57).

Паразитологиялық диагностикаға молекулярлық әдістер көмектесуі мүмкін. Көптеген паразиттер зертханада өсірілмейді және диагностика негізінен серологияға және салыстырмалы түрде аз сезімтал микроскопияға негізделген. Микроскопия безгек диагностикасын қолдау болып қала береді, бірақ оның жоғары сезімталдығына байланысты ПТР бұл ауруды тіпті қиын жағдайларда да диагностикалауға мүмкіндік береді. Плазмодий түрлерін әртүрлі инфекцияларда да анықтауға болады, бұл микроскопиялық анықтауға кедергі келтіруі мүмкін (99)


NHS Test және Trace Lighthouse зертханаларында зертханалық дағдыларыңызды пайдаланыңыз

NHS сынағы және бақылау COVID-19-ға қарсы үздіксіз күш-жігерде зертханалар желісін кеңейтуде. Ұлыбритания қыс айларына кіргендіктен, зертханалық мүмкіндіктерді арттыруды жалғастыру өте маңызды. Британдық иммунология қоғамы олармен байланысып, зертханалық дағдылары бар адамдардан COVID-19 пандемиясы кезінде тестілеу бағдарламасын арттыруға көмек сұрады. Кіші лауазымдардан бастап, алдыңғы зертханалық тәжірибесі бар студенттерден бастап, зертхананы басқару тәжірибесі бар жоғары лауазымдарға дейін бірқатар рөлдер бар.

Олар келесі тұлғаларды іздейді:

  • зертханалық басқару тәжірибесі бар және/немесе HCPC тіркелген BMS
  • деңгейіне қарамастан зертханалық жағдайда (академиялық, клиникалық немесе өндірістік) жұмыс тәжірибесі бар
  • биологиялық пән бойынша ғылыми дәрежесі немесе жоғары оқу орнынан кейінгі біліктілігі болуы
  • Милтон Кейнс, Кембридж, Манчестер, Ньюпорт, Чарнвуд және Глазгодағы бар маяк зертханаларына қосылу үшін молекулалық биология тәжірибесі бар техниктер, докторанттар және аспиранттар. Оларға дереу ПТР талдау әдістерін (qRT-PCR және ePCR) меңгерген 400-ден астам техник қажет.
  • немесе алдыңғы зертханалық тәжірибесі бар студент болсаңыз, әсіресе вирусология, микробиология немесе биомедициналық ғылымдар бойынша және сіз толық емес жұмыс күнін іздеп жүрсіз. Минималды талаптар – биологиялық қауіпсіздік шкафтарында тамшуырлау және жұмыс істеу тәжірибесі.

Бос жұмыс орындары уақытша, тұрақты, толық немесе толық емес жұмыс күні негізінде қол жетімді, бұл ретте қысқа мерзімді орналастыру (1 айдан бастап) және ұзақ мерзімді рөлдер (18 айға дейін) қарастырылады.

Тиісті біліктілігі мен дағдылары бар кез келген басқа адамдарға, топтарға немесе желілерге жіберу арқылы осы бос орындар туралы жаңалықтарды таратуға көмектесіңіз.

Ұлттық тестілеу бағдарламасына мына жерден жазылуға болады. Ұлыбританияда әртүрлі деңгейдегі дағдылары мен біліктілігі бар адамдардың кең ауқымын қызықтыруы мүмкін рөлдер бар. Рөлдер уақытша, тұрақты толық емес және толық уақыттық негізде қол жетімді.


Тәжірибеші уролог үшін ДНҚ секвенциясы бойынша праймер

Сіз зертханалық эфирде жоғалып кеткен пациент үлгісімен нақты не болатынын ойлап көрдіңіз бе? Кенеттен нәтижелермен толтырылған есеп пациенттің файлында сиқырлы түрде пайда болады, бірақ сол белгісіз кезеңде не болады? Жауабы: көп. Бұл үлгі күрделі молекулалық саяхаттан өтеді.

Бұл мақала сізге генетикалық реттілік пен полимеразды тізбекті реакцияның (ПТР) тарихымен таныстырады, олар бүгінгі күні қайда орналасқан, микромассивтерге түртіңіз, кейбір стандартты терминологияны және осы терминдер қоятын сұрақтарды түсіндіреді, сонымен қатар клиникалық зертхананың жұмыс процесін сипаттайды.

ДНҚ және Сэнгер секвенциясы

Қазіргі молекулярлық сынақтар әлемінде 2 өте кең таралған қолданбалар бар: реттілік және сандық полимеразды тізбекті реакция (qPCR). Сэнгер секвенциясы ретінде белгілі секвенирлеудің бірінші әдісін PhD докторы Фредерик Сэнгер құрды.
Бір категорияда екі рет Нобель сыйлығын алу үшін 2 адамның 1-і. Ол Уолтер Гилбертпен, PhD докторымен жұмысы үшін ДНҚ секвенирлеудің пионері болып саналады. 1 Оның жұмысына дейін көптеген зерттеулер бір тізбекті және өте ерекше нуклеотидтер тізбегінде кесілген RNase ферменттерімен оңай басқарылатын РНҚ бойынша жасалды.

Уотсон мен Крик ДНҚ-ны ашу арқылы нуклеотидтер құрылыс блоктарын құрайтынын және аденин тиминмен, ал цитозин гуанинмен байланысып, негізгі жұпты (bp) түзетінін атап өтті. Бұл нуклеотидтер дезоксинуклеотидтер деп аталады, яғни оларда гидроксил тобы жоқ. Тізбектеу кезінде қызығушылық тудыратын гендер мен ДНҚ-ны сұрау және «оқу» үшін базалық жұптар оқылады және анықталады. Сэнгер секвенциясы сол нуклеотидтердің кішкене бөлігіне кілтті лақтырып, оларды дидеоксинуклеотидтерге айналдырып, басқа гидроксил тобын жоюды шешті. Бұл дидеоксинуклеотидтер қосылғанда, секвенирлеу дереу тоқтайды. Сіз әдеттегі өлшемдегі 2-4 бөліктен Lego мұнарасын салып жатырсыз деп елестетіңіз, бірақ басқа бөліктерді қосу үшін үстіңгі жағында кедір-бұдыр жоқ, шамамен 10% дұрыс емес, жалпақ бөліктерді араластырыңыз. Дидеоксинуклеотидтер осылай жұмыс істейді. Олар сіздің Lego мұнарасының өсуін тоқтатады.

Сэнгер секвенциясы сол кезде өте революциялық және маңызды болды және келесі 20 жыл бойы ол адам геномы жобасында қолданылды. 2 Тізбектерді қабаттастыру арқылы адам геномы бір уақытта шамамен 500-ден 600 битке дейін жасалды, Сэнгер секвенциясы бүкіл жобаның маңызды аспектісі болды. Әдіс әлі күнге дейін өте жылдам және арзан секвенирлеу нәтижелері мен геномның реттілігі қиын бөліктері үшін қолданылады.

Келесі ұрпақ секвенциясы

Кез келген технология сияқты, компаниялар талдаудың жылдамдығын, дәлдігін және құнын жақсартуға тырысады. Сэнгерден кейінгі келесі қадамның бірнеше итерациялары болды, бірақ басым болғаны келесі ұрпақ секвенциясы (NGS) деп аталады, бұрын жаппай параллельді реттілік ретінде белгілі. Қазіргі уақытта секвенирлеудің 2 нұсқасы бар: қысқа оқулар (Illumina) және ұзақ оқулар (Pacific Biosciences және Oxford Nanopore). Қысқа оқулар 1 жүгірісте бірге 600 бит / бит-ке дейін көтеріледі, ал ұзақ оқулар бірден 10 000 бит-тен асып кетуі мүмкін, кейбір оқулар миллиондаған бит-ке жетеді. Мұны перспективаға қою үшін, BRCA2 ақуыздың ұзындығы шамамен 3000 амин қышқылы. Анықтау бойынша, амин қышқылы 3 жұп негізде кодталған және әрбір негізде 2 нуклеотид болады. Осылайша, 9000-нан астам bp (18 000 нуклеотид) бар BRCA2 ген.

Қысқа оқылатын NGS оған ДНҚ-ның қысқа бөліктерін будандастыру, сол ДНҚ-ны репликациялау, содан кейін оны қайта-қайта, кейде жүздеген рет көшіру үшін ағындық жасушаны пайдаланады. Әрбір нуклеотид флуоресцентті және оқу кезінде белсендіріледі, бұл нуклеотидті реттілікке қосуға мүмкіндік береді. Бала кезіңізде Lite-Brites есіңізде ме? Сіз кішкене бөліктерді тесіктері бар қара тақтаға қоясыз, содан кейін бөліктер жарқырайды. Үлгі ретінде 1 Lite-Brite бар екенін елестетіп көріңіз және бір кескінді жүздеген рет көшіруге тырысыңыз және бөлікті қосқан сайын ол сол жарыққа немесе бұл жағдайда нуклеотидке тағайындалған белгілі бір түсті жарқыратады. Жол бойында сіз дәл сол жерде үнемі қате жібересіз. Бұл жарықтың дәйектілігі дұрыс емес болғандықтан, бұл жай ғана қате емес. Оның орнына, бұл қызықты диагностикалық мүмкіндікке айналады, себебі бұл пациент үлгісінде мутация бар.

Қысқа оқылатын NGS пайдаланудың 2 кең таралған жолы бар: толық геномды секвенирлеу (WGS) және мақсатты секвенирлеу, сонымен қатар ампликонды секвенирлеу немесе панельді реттілік ретінде белгілі. WGS дәл мынаны білдіреді: белгілі бір қамту деңгейінде бүкіл геномды реттілікпен белгілеңіз, бұл сілтеме геномымен салыстырғанда базалық жұпты қаншалықты жиі оқисыз. Most of the time, 30 times coverage, meaning each base pair on average was read 30 times, is sufficient for nondisease applications. Gene panel sequencing looks at a specific subset of known disease genes, at a much greater coverage, up to 1000 times but mostly 500 to 600 times. For example, a provider may want to run a gene panel on a patient with a history of colorectal cancer to determine whether there is a hereditary component. Genes included in this panel would include MSH1, PMS2, MLH2, MSH6, EpCAM, all of which are associated with Lynch syndrome, as well as APC және MUTYH, which are associated with other syndromic patterns where colorectal cancers are common. 3 Prostate cancer–specific panels will often include BRCA1, BRCA2, ATM, CHEK2, PALB2, HOXB13, және басқалар.

Long reads act a little differently from short reads. Instead of creating many short copies on a chip, long reads use a very large circular sequence of DNA and continuously run it through a mechanism, such as a protein pore, to consistently read the same DNA over and over. Comparatively, this is like copying a Lego tower repeatedly using the same colors in the same order vs riding a Ferris wheel and having the operator check each cab every time it passes the bottom. Long reads will catch the same errors as short reads, but also provide some structural variant support and help getting through more difficult areas to read. This allows for some deeper understanding of possible disease states and their proximity to other possible issues.

Quantitative PCR

Kary Mullis, PhD, was a chemist at Cetus Corporation. One night while driving around Mendocino County with his girlfriend, also a chemist at Cetus, he recognized that DNA base pairs were constant in their pairing, and had a random thought to match/hybridize short pieces of DNA that were complementary to long pieces of DNA plus DNA polymerase. This matching added nucleotides to a piece of DNA. 4 This allowed a short piece of DNA to be amplified repeatedly using different temperatures, creating billions of copies over many cycles, which would then be studied on an agarose gel (Figure 1). Hence, PCR was invented. Mullis was awarded the Nobel Prize in 1993 for this groundbreaking invention, which led to so many discoveries in science. Around the same time, Higuchi et al discovered that increasing amounts of DNA could be directly studied using a fluorescent marker without the need for agarose gel. 5 And voilà! qPCR was invented.

In order to use qPCR in diagnostics, the clinic has to know which specific gene is of interest, as the primers have to flank the target sequence to be amplified. The high specificity of this type of assay is both a blessing and a hindrance. It’s a blessing because the clinic can answer a diagnostic question with high confidence but a hindrance because it may miss other possible disease states that are outside the targeted region. Most of the time, a sample will be split up to run multiple different assays at the same time to cover a wider array of diseases. qPCR is also very commonly used to get to the heart of urinary tract infections (UTIs) and their persistent nature. Many companies are offering qPCR diagnostics for UTIs, prostatitis, and more. 6 Most of the time, those companies will also offer an NGS panel in addition to cover all diagnostic bases.

Microarrays

Microarrays are small chips with imprinted specific DNA targets of interest (2-сурет). The test is run with a reference sample, often labeled with a green fluorescent dye, and the targeted DNA sample, labeled with a red fluorescent dye. Both are then hybridized to the chip, and a comparative analysis is done. If the targeted DNA is expressed at a higher rate, that small area will glow red. If the control DNA is expressed higher (or decreased expression in the target DNA), it will glow green. Finally, if expressed in equal amounts, essentially no mutation, the square will glow yellow. 8 The sensitivity is generally low, but the ability to study many targets at once is a highlight. Microarrays are a common technique of many companies that offer testing for determining cultural heritage. Those companies will study up to 700,000 targets at 1 time. However, microarrays are slowly declining because of the greater adoption of NGS assays. These direct-to-consumer companies are really fun and interesting for those who are seeking information about their ancestry but should not be used for cancer risk assessment.

What happens to a sample in the clinical lab?

When a patient has a sample sent for molecular testing, whether it’s tissue, urine, blood, or saliva, that specimen is immediately tagged with a number specific to that patient. The sample is transported to the lab with the appropriate storage. The lab receives the sample and inputs it into their system, also called accessioning. Then, the molecular journey is as follows:

Nucleic acid isolation: convert RNA to DNA if needed

а. Sonication or enzyme digestion to create uniform DNA segments

б. Enrich the target DNA if needed, as target enrichment and amplicon generation workflows used in gene panels

в. Barcode ligation: also known as multiplexing, which is adding unique markers per patient sample so they can be mixed together, then parsed upon software analysis

d. Adapter ligation: allows the DNA to bind to the flow cell

Sequence the DNA: 0.5 days to several days, depending on sequencing type and instrument used

Bioinformatics: Results are parsed and analyzed.

Report generated: Details around the disease state are provided, and sometimes potential treatment scenarios depending on the software’s FDA approvals

What does a clinical laboratory look for in their tests?

Although you’ve learned about generic methods and workflows, labs look for specific issues using molecular methods that cause various disease states. In this section, I’ll lay out a few of the more common terms in the lexicon of genomic testing.

Single-nucleotide polymorphism (SNP). As the name implies and by definition, this occurs when a single nucleotide change is identified in a particular gene and present in 1% of the population. This SNP results in a gene mutation but may or may not cause an alteration of downstream protein function, depending on whether the change affects the specific amino acid in which it is coding. There is significant interest in looking at a panel of SNPs to determine risk assessment for breast and prostate cancer.

Copy number variation. This is a duplication or deletion of a sequence of nucleotides, not just a single nucleotide like an SNP. Most genes in the human genome have 2 alleles, 1 each inherited from your mother and father. In rare instances, short sequences can be replicated many times. Мысалы, HTT gene codes for the protein huntingtin. In this case, the trinucleotide CAG can be repeated 36 times or more. The result is abnormal protein production, which can then lead to Huntington disease. 7

In other cases, entire genes can be repeated or deleted, causing overexpression or underexpression, as in the case of α-amylase 1 and its overexpression because of dietary differences. 8 The largest example of this is the trisomy issues that cause Down syndrome.

Gene fusions. Fusions occurs when 2 genes fuse during replication, causing a pseudogene that creates expression issues. One of the earliest discovered examples of this is a reciprocal translocation where the ABL1 gene of chromosome 9 is translocated and fuses to the BCR gene on chromosome 22, causing a BCR-ABL1 gene (the Philadelphia chromosome), which induces chronic myeloid leukemia.9 This is difficult to detect using molecular testing because there are various fusion loci on each gene, but it can be done with proper techniques, such as digital PCR and NGS.

This partial list of 3 common issues is just a sample of what a molecular lab can discover. Some tests are more involved than others from a workflow and difficulty perspective, whereas others are fairly straightforward. The most challenging part for a lab is to discern the ability of a specific assay type to get the proper answer because some answers are much more difficult to come by.

Қорытындылар

The world of clinical diagnostics is changing. The development of targeted therapies is increasingly more specific to various molecular changes that are therapeutic resistance drivers. The development of companion diagnostics so patients can receive these new agents is mandatory. In addition, the ability to detect and potentially mitigate disease at a much earlier stage before systemic/metastatic disease has clear upside potential. Therefore, embracing and understanding these new and emerging molecular techniques will improve your patient outcomes and enhance your practice.

Wright has been involved in biotech and clinical sales and marketing for nearly 20 years. He has a Master’s in molecular biology from Washington University in St. Louis and an MBA in strategy and operations from Boston University. He has worked for companies such as Thermo Fisher and Illumina and has started multiple companies outside of the biotech world.


Relevance to cell biology

Most predicted effects of macromolecular crowding, confinement, and adsorption on macromolecular isomerization equilibria and association equilibria and rates have been confirmed qualitatively (and in favorable cases quantitatively) in vitro ‡ , but are such effects similarly important in a living cell? On the basis of results obtained from partitioning and size-exclusion experiments conducted with concentrated cell lysates, Zimmerman and Trach estimated that excluded volume effects in the cytoplasm of E. coli are comparable to those obtained in a 35% solution of a ∼70 kDa globular protein, such as bovine serum albumin or hemoglobin (Zimmerman and Trach, 1991). Although this estimate might provide a useful starting point, it is clear that the answer is far more complex and elusive. Any cell is extremely large relative to any particular macromolecule of interest and is likely to contain several micro-environments, within each of which a particular macromolecule X will be subject to a different set of background interactions. For example, the cytoplasm of even an organism as simple as E. coli contains at least three such micro-environments: the immediate vicinity of the inner plasma membrane, within which X will encounter a high local concentration of membrane phospholipids and proteins the interior and immediate vicinity of the nucleoid, within which X will encounter an extremely high local concentration of DNA and the remaining cytoplasm, within which X will be subject primarily to the influence of other soluble proteins. One would expect the relative contributions of macromolecular crowding, confinement and adsorption to macromolecular reactivity to be rather different within each of these three micro-compartments. That complexity acknowledged, it is nevertheless true that large and unambiguous background effects have indeed been observed within certain specialized, simplified cells.

Predicted effects of macromolecular confinement on association equilibria have not yet been tested.

(A) Dependence of the solubility of deoxy HbS upon dextran concentration (Bookchin et al., 1999). A 1.75-fold increase in dextran concentration results in a greater than four-fold increase in the equilibrium tendency of deoxy HbS to polymerize. (B) Time course of assembly of HIV capsid protein in the absence (•) and presence (▪) of 100 g/l Ficoll 70 (del Alamo, 2005). The half-time for assembly of the protein is decreased ten-fold in the presence of Ficoll. (C) Temperature dependence of the ellipticity of α-lactalbumin in bulk solution (▴) and encapsulated in hydrated silica sol-gel glass (○). The confined protein behaves normally at low temperature, but exhibits only partial unfolding even at temperatures approaching 100°C. Figure reproduced with permission from Eggers and Valentine (Eggers and Valentine, 2001). (D) Time dependence of adsorption of several unrelated proteins to a supported phospholipid bilayer (symbols and solid curves) (Fernandez and Berry, 2003). The dotted curves indicate the time dependence that would be expected in the absence of interaction between adsorbed proteins. The enhanced steepness of the experimentally observed curves (solid) relative to the reference curves (dotted) indicates self-association resulting in clustering of the adsorbed proteins (Minton, 2001b).

(A) Dependence of the solubility of deoxy HbS upon dextran concentration (Bookchin et al., 1999). A 1.75-fold increase in dextran concentration results in a greater than four-fold increase in the equilibrium tendency of deoxy HbS to polymerize. (B) Time course of assembly of HIV capsid protein in the absence (•) and presence (▪) of 100 g/l Ficoll 70 (del Alamo, 2005). The half-time for assembly of the protein is decreased ten-fold in the presence of Ficoll. (C) Temperature dependence of the ellipticity of α-lactalbumin in bulk solution (▴) and encapsulated in hydrated silica sol-gel glass (○). The confined protein behaves normally at low temperature, but exhibits only partial unfolding even at temperatures approaching 100°C. Figure reproduced with permission from Eggers and Valentine (Eggers and Valentine, 2001). (D) Time dependence of adsorption of several unrelated proteins to a supported phospholipid bilayer (symbols and solid curves) (Fernandez and Berry, 2003). The dotted curves indicate the time dependence that would be expected in the absence of interaction between adsorbed proteins. The enhanced steepness of the experimentally observed curves (solid) relative to the reference curves (dotted) indicates self-association resulting in clustering of the adsorbed proteins (Minton, 2001b).

The interior of an erythrocyte is essentially a highly concentrated solution of hemoglobin. The affinity of erythrocytes containing sickle cell hemoglobin (HbS) for oxygen depends significantly upon the intracellular hemoglobin concentration, because oxygen binding is linked to the polymerization of HbS (May and Huehns, 1975). The concentration dependence of oxygen affinity may be quantitatively accounted for if, and only if, steric repulsion between hemoglobin molecules is taken into account (Minton, 1976). Ferrone has recently reviewed a large body of work demonstrating that the extensively characterized kinetics of cell sickling subsequent to deoxygenation may be well accounted for by models that take into account the substantial effect of macromolecular crowding within erythrocytes upon the thermodynamic activity (effective concentration) of monomers and each oligomer in the hemolyzate (Ferrone, 2004). By means of cleverly designed experiments, volume regulatory mechanisms in dog erythrocytes were shown to respond nonspecifically to changes in the intracellular concentration of macromolecules rather than changes in volume per se (Colclasure and Parker, 1992).

The interior of an eye lens cell consists essentially of a solution of a small number of crystallins at very high concentration (total protein concentration >500 g/l). These proteins are not translated postnatally. Thus, the crystallin molecules that an animal is born with must remain structurally intact over much of its lifetime to preserve lens transparency. The thermal stability of these proteins increases with concentration (Steadman et al., 1989), and the extraordinary thermal stability of an intact lens has been attributed in part to the stabilizing effects of macromolecular crowding inside the lens cell (Bloemendal et al., 2004).

Excluded volume theory predicts that at the high levels of fractional occupancy characterizing almost all biological fluid media, even small changes in cellular hydration will result in disproportionately large changes in the reactivity of a broad spectrum of macromolecular reactants. This prediction is consistent with and may account for the following general observations: (1) Relatively modest changes of cellular volume in animal cells are associated with changes in a wide variety of diverse intracellular processes, such as the polymerization/depolymerization of cytoskeletal filaments or the activation/deactivation of membrane ion channels, that are much too large to be accounted for on the basis of simple mass action (reviewed by Lang et al., 1998). (2) Complex and very diverse systems for maintaining the concentrations of cellular contents within narrow limits have evolved within all life forms, be they bacterial, plant or animal (Somero et al., 1992). (3) The age-related onset of a variety of protein-aggregation-linked diseases (Koo et al., 1999) correlates with significant loss of cellular and tissue hydration in the elderly and concomitant increases in the volume excluded to protein (Parameswaran et al., 1995 Hatters et al., 2002).

During the last few years several experimental techniques have been developed that enable certain aspects of the behavior of selected macromolecules – typically labeled and/or overexpressed – to be monitored within living cells (e.g. Ghaemmaghami and Oas, 2001 Ignatova and Gierasch, 2004 McNulty et al., 2006). It is hoped that techniques like these, or others yet to be devised, can be used to investigate the influence of background interactions upon the behavior of the selected species within their native environments. However, one must be extremely cautious about interpreting the results of such experiments. In particular, it is necessary to design and carry out control experiments that clearly indicate whether or not the processes of labeling and/or overexpression result in abnormal distribution of the selected protein within the cell, induction of artifactual associations, or disruption of the normal background interactions that one is attempting to investigate.

This Commentary bears as its title the provocative question “How can biochemical reactions within cells differ from those in test tubes?” When one can specify the composition of the local environment of a particular reaction at a specific intracellular location and at a particular time point in the cell cycle, studies such as those cited here will help to provide answers to the equally interesting and perhaps more biological question “By how much do biochemical reactions within cells differ from those in test tubes?”


Бейнені қараңыз: Жалеп (Ақпан 2023).