Ақпарат

ITRAQ/TMT технологиясының электрофорезден артықшылығы қандай?

ITRAQ/TMT технологиясының электрофорезден артықшылығы қандай?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Мен қазір протеомиканы зерттеуге қатысты қағазда жұмыс істеп жатырмын. Мен бірінші курс студенттерінің оқу барысында туындауы мүмкін көптеген сұрақтарды тізімдедім. Кез келген адам iTRAQ/TMT технологиясының және электрофорездің артықшылықтары мен кемшіліктерін (зертханадағы тәжірибеңізге негізделген) түсіндіре алады ма? Қай техника жақсы?


Менің ойымша, бұл мақала сіздің сұрағыңызға жауап бере алады: Протеомика туралы сұрақ-жауап (Q1-Q5). Онда 2-DGE - MALDI-TOF технологиясымен бірге әзірленген ақуызды бөлу технологиясы делінген. Теориялық тұрғыдан жалпы ақуызды изоэлектрлік нүкте (IEF) және молекулалық салмақ (SDS-PAGE) айырмашылығымен бір-бірден бөлуге болады. Нақты жағдай соншалықты идеалды емес, өйткені аз мөлшердегі ақуызды сәтті бояу және көру мүмкін емес, ал протеин трансляциядан кейінгі модификациядан кейін теориялық позициядан ауытқиды. 2-DGE жалпы 1000-2000 ақуызды анықтай алады. 2-DE және DIGE сияқты электрофорезге негізделген әдістермен салыстырғанда iTRAQ/TMT жоғары ажыратымдылыққа ие. MtoZ Biolabs өзі өңдеген жасуша үлгілерінен ең көбі 6000 ақуызды тапты, олардың көпшілігінде сандық және сапалық ақпарат бар. Оның үстіне, оның iTRAQ жоғары ағыны бар және бір уақытта 8 үлгіге дейін толтыра алады. Егер TMT технологиясы қолданылса, ол бір уақытта 10 үлгіге дейін толтыра алады, бұл әсіресе бірнеше үлгілерді бір уақытта салыстыру және биологиялық процестерді динамикалық анықтау үшін қолайлы.


LTQ Orbitrap жүйесінде iTRAQ пайдаланатын жоғары дәлдіктегі сандық протеомика: барлығының артықшылықтарын біріктіретін жаңа масс-спектрометриялық әдіс

Мақалаларды көру - 2008 жылдың қарашасынан бастап (PDF және HTML) барлық мекемелер мен жеке тұлғалардағы толық мәтіндік мақала жүктеп алуларының ҚАРСЫ сәйкес келетін сомасы. Бұл көрсеткіштер соңғы бірнеше күндегі пайдалануды көрсету үшін жүйелі түрде жаңартылып отырады.

Дәйексөздер - бұл Crossref есептеген және күн сайын жаңартылатын осы мақалаға сілтеме жасайтын басқа мақалалардың саны. Crossref дәйексөздер саны туралы қосымша ақпаратты табыңыз.

Альтметриялық назар аудару баллы - зерттеу мақаласының желіде алған назарының сандық өлшемі. Дөңгелек белгішесін басу altmetric.com сайтында берілген мақаланың ұпайы және әлеуметтік медиа болуы туралы қосымша мәліметтері бар бетті жүктейді. Альтметриялық назар аудару баллы және балл қалай есептелетіні туралы қосымша ақпаратты табыңыз.


Аннотация

Бұл зерттеу iTRAQ 4-plex, iTRAQ 8-plex және TMT 6-plex реагенттерін пайдалана отырып, техникалық көшірмелер мен үштік көшірмелерде жалпы протеома мен дифференциалды түрде көрсетілген белок қамтуының тереңдігі мен қайталану мүмкіндігін салыстыруға бағытталған. Талдау жүргізілді, өйткені изобарлық массалық тегтердің қайталану мүмкіндігін жан-жақты салыстыру әдебиетте кеңінен хабарланбаған. Ақуыздардың ең көп саны 4-плекс, одан кейін 8-плекс, содан кейін 6-плексті реагенттермен анықталды. Сандық талдаулар 8-плексті реагенттер мен 6-плексті реагенттерге қарағанда 4-плексті реагенттермен дифференциалды түрде экспрессияланған ақуыздар анықталғанын көрсетті. Көшірмелердің қайталану мүмкіндігі техникалық көшірмелер үшін ≥69% және техникалық үштіктер үшін ≥57% болып анықталды. Нәтижелер 4-плексті эксперименттің орнына 8-плекс немесе 6-плекстік экспериментті жүргізу, сәйкесінше, 26 немесе 39% аз ақуыз сәйкестендіруіне әкелгенін көрсетеді. 4-плексті спектрлерді үш бағдарламалық құралмен (ProteinPilot, Mascot және Proteome Discoverer) іздеген кезде, ақуыз сәйкестендірулерінің ең көп саны Mascot көмегімен алынды. Теріс бақылауларды талдау эксперименттерді көшірме ретінде жүргізудің маңыздылығын көрсетті. Тұтастай алғанда, бұл зерттеу iTRAQ 4-плексті реагенттерді iTRAQ 8-плекс және TMT 6-плекс реагенттеріне қарағанда пайдаланудың артықшылықтарын көрсетеді, техникалық қайталанатын және үштік қайталану мүмкіндігін бағалайды және қайталанатын үлгілерді іске қосудың мәніне баса назар аударады.


Протеомика: техникасы

Төмен өнімділік әдістері:

1. Антиденелер негізіндегі әдістер

ELISA (ферментпен байланысты иммуносорбентті талдау) және вестерн блоттинг сияқты әдістер белоктарды анықтау және олардың экспрессия деңгейлерін сандық анықтау үшін арнайы ақуыздарға немесе эпитоптарға бағытталған антиденелердің болуына негізделген.

2. Гель негізіндегі әдістер

Екі өлшемді гельдік электрофорез (2DE немесе 2D-PAGE), бірінші протеомикалық әдістеме әзірленген, гельдегі ақуыздарды зарядына (1-ші өлшем) және массасына (2-ші өлшем) негізделген бөлу үшін электр тогын пайдаланады. Дифференциалды гельдік электрофорез (DIGE) - бір гельдегі екі-үш ақуыз үлгісін бір уақытта салыстыруға мүмкіндік беру үшін әртүрлі флуоресцентті бояғыштарды пайдаланатын 2DE модификацияланған түрі. Бұл гель негізіндегі әдістер, мысалы, масс-спектрометрия (MS) арқылы әрі қарай талдау алдында ақуыздарды бөлу үшін, сондай-ақ салыстырмалы экспрессия профилін жасау үшін қолданылады.

3. Хроматографияға негізделген әдістер

Хроматографияға негізделген әдістерді жасуша лизаттары сияқты күрделі биологиялық қоспалардан ақуыздарды бөлу және тазарту үшін қолдануға болады. Мысалы, ион алмасу хроматографиясы ақуыздарды заряд негізінде бөледі, өлшемді алып тастау хроматографиясы ақуыздарды олардың молекулалық өлшеміне қарай бөледі, ал аффинді хроматография белгілі бір жақын лигандтар мен олардың мақсатты ақуыздары арасындағы қайтымды әрекеттесулерді қолданады (мысалы, IgM және IgA тазарту үшін лектиндерді пайдалану). молекулалар). Бұл әдістерді қызықтыратын ақуыздарды тазарту және анықтау, сондай-ақ ақуыздарды, мысалы, төменгі MS арқылы әрі қарай талдауға дайындау үшін пайдалануға болады. 8

Жоғары өнімділік әдістері:

1. Аналитикалық, функционалды және кері фазалық микромассивтер


Плазма протеомикасы арқылы биомаркердің ашылуын қайта қарау

Қанның клиникалық талдауы медицинадағы ең кең таралған диагностикалық процедура болып табылады және қан биомаркерлері пациенттерді санаттарға бөлу және емдеу шешімдерін қолдау үшін қолданылады. Дегенмен, бар биомаркерлер жан-жақты емес және көбінесе ерекшелік жоқ және жаңалары өте баяу қарқынмен әзірленуде. Осы шолуда сипатталғандай, масс-спектрометрияға (MS) негізделген протеомика биологиялық зерттеулердегі қуатты технологияға айналды және қазір ол плазма протеомының сипаттамасын тереңірек анықтауға мүмкіндік береді. Алдыңғы «үшбұрышты стратегиялар» шағын когорттардағы жалғыз биомаркер кандидаттарын табуға бағытталған, одан кейін әлдеқайда үлкен валидация когорттарында классикалық иммуноталдаулар. Біз «тікбұрышты» плазмалық протеомды профильдеу стратегиясын ұсынамыз, онда үлкен когорталардың протеомдық үлгілері олардың денсаулық пен аурудағы фенотиптерімен корреляцияланады. Мұндай тұжырымдамаларды клиникалық тәжірибеге аудару диагностикалық шешім қабылдаудың бірнеше аспектілерін қайта құрылымдауды талап етеді және біз осы бағыттағы кейбір алғашқы қадамдарды талқылаймыз.

Кіріспе

Қанның адам физиологиясындағы орталық және біріктіруші рөлі оның жеке адамның күйінің немесе фенотипінің әмбебап көрінісі болуы керек екенін білдіреді. Оның жасушалық құрамдас бөліктері - эритроциттер, тромбоциттер және лимфоциттер. Сұйық бөлік барлық компоненттер сақталған кезде плазма және коагуляция каскады белсендірілген кезде сарысу (қанның ұюы) деп аталады. Қарапайымдылық үшін біз «сарысу» емес, «плазма» терминін қолданамыз, өйткені қорытындылардың көпшілігі екеуіне де қатысты.

Әртүрлі плазма компоненттерінің концентрациясы клиникалық тәжірибеде жүйелі түрде анықталады. Оларға электролиттер, шағын молекулалар, препараттар және белоктар жатады. Плазма протеомын құрайтын ақуыздарды үш түрлі класқа бөлуге болады (1А және В-сурет). Біріншісінде қандағы функционалдық рөлі бар көп ақуыздар бар. Оларға қан сарысуындағы альбумин (HSA, жалпы ақуыз массасының шамамен жартысы) аполипопротеиндер жатады, олар липидтердің тасымалдануында және гомеостазда маңызды рөл атқарады, туа біткен иммундық жауаптың жедел фазалық ақуыздары және коагуляциялық каскадтың ақуыздары. Екінші класс - қан айналымында арнайы функциясы жоқ тіндердің ағып кетуіне байланысты ақуыздар. Мысал ретінде бауыр ауруларын диагностикалау үшін қолданылатын аспартатаминотрансфераза (ASAT) және аланинаминотрансфераза (ALAT) сияқты ферменттер, сондай-ақ жүрек тропониндері сияқты ақуыздардың төмен деңгейлі, тінге тән изоформалары жатады. Үшінші класс - бұл шағын ақуыздық гормондар (мысалы, инсулин) және цитокиндер сияқты сигналдық молекулалар, олар әдетте тұрақты күйде өте аз мөлшерде болады және қажет болғанда реттеледі. Цитокин-интерлейкин-6 (IL-6) бастапқы деңгейлері 5 пг/мл құрайды, бұл плазма протеомының ең көп таралған ақуыз концентрациясы, шамамен 50 мг/HSA концентрациясымен салыстырғанда 1010 еселік динамикалық диапазонын құрайды. мл.

Сурет 1. Клиникалық жағдайда қан негізіндегі зертханалық зерттеу

Қабылданған пайдалануда «биомакер - қалыпты биологиялық процестердің, патогендік процестердің немесе әсер ету немесе араласуға жауап ретінде өлшенетін анықталған сипаттама» (FDA-NIH: Biomarker-Working-Group, 2016). Осы шолудың мақсаты үшін біз ақуызға немесе ақуызды өзгертуге негізделген биомаркерлерге ерекше назар аударамыз. Бұл мағынада 100-ден астам FDA тазартқан немесе FDA мақұлдаған клиникалық плазма немесе сарысу сынақтары бар, олар негізінен мол, функционалдық класта (50%), одан кейін тіндердің ағу маркерлері (25%), ал қалғандары рецепторлық лигандтарды қамтиды. , иммуноглобулиндер және аберрантты секрециялар (Андерсон, 2010). Олардың көпшілігі ондаған жылдарға созылған және қазіргі заманғы жаңа маркерлерді енгізу жылдамдығы жылына екіден аз (Андерсон). т.б, 2013). Әдеттегі сынақ бір нысанаға қарсы ферментативті талдаудан немесе иммундық талдаудан тұрады. Емхана дәрігерлері нәтижелерді өздерінің сарапшылық білімдеріне сүйене отырып, пациенттің басқа ақпаратымен бірге түсіндіреді. Көптік қатынасы тек нақты жағдайларда ғана қолданылады. Мысалы, бауыр ауруларының себептерін ажырату үшін ASAT/ALAT 60 жастағы Де Ритис қатынасы (De-Ritis) т.б, 1957) немесе преэклампсия диагностикасы үшін соңғы sFlt-1/PlGF қатынасы (Левин) т.б, 2004 ).

Ферменттік және антиденелерге негізделген әдістерден айырмашылығы, масс-спектрометрия (MS) негізіндегі протеомика белоктардың реттілікке байланысты ас қорытуынан алынған пептидтердің жоғары дәлдіктегі массалық және фрагментация спектрлерін өлшейді. Бұл пептидтердің массасы мен реттілігі бірегей болғандықтан, протеомика өзіндік ерекше, колориметриялық ферменттік сынақтар мен иммундық талдаулармен тұрақты мәселе (Wild, 2013). Негізінде, MS негізіндегі протеомика жүйедегі барлық белоктарды - оның протеомын талдай алады және бұл мағынада бейтарап және гипотезасыз (Aebersold & Mann, 2016). Сонымен қатар, MS әдістері белоктардағы трансляциядан кейінгі модификацияларды (PTM) табу және сандық анықтау үшін өте қолайлы. Бұл PTMs сонымен қатар қант диабеті контекстінде ұзақ мерзімді глюкоза әсерінің көрсеткіші ретінде қызмет ететін HbA1c деңгейлері сияқты диагностикалық сынақтардың негізі болуы мүмкін. Соған қарамастан, плазмада жүйелі түрде жүргізілетін зертханалық сынақтардың ешқайсысы масс-спектрометриялық тәсілдермен анықталған ақуыздарға негізделмейді және күнделікті талдауда MS әлі күнге дейін тек дәрілер мен метаболиттер сияқты шағын молекулаларды өлшеу үшін қолданылады (Vogeser & Seger, 2016). ).

Соңғы жылдары MS негізіндегі протеомика технологиясы күрт жақсарды және ол қазір белоктарды қамтитын барлық биологиялық зерттеулердің негізгі тірегі болып табылады (Cox & Mann, 2011 Altelaar & Heck, 2012 Richards т.б, 2015 Чжан т.б, 2016). Атап айтқанда, оның өнімділігі сезімталдық пен динамикалық диапазонға дейін жетілді, бұл оны биомаркерді зерттеу үшін қызықты етеді. Бұл шолу қандағы ақуыздарды масс-спектрометрия арқылы анықтау перспективаларына арналады. Біз бүгін клиникалық диагностикадағы ақуыздардың рөлін эмпирикалық бағалаудан бастаймыз және MS негізіндегі протеомика арқылы плазмадағы биомаркерлерді табудың бұрынғы әрекеттері туралы әдебиеттерді толық қарастырамыз. Осы уақытқа дейін протеомика стратегиялары үлкен когорттардағы мақсатты тәсілдермен жалғасатын бірнеше үлгілерді кең көлемде зерттеуді қамтыды. Біз технологияның соңғы жетістіктері терең протеомдар көптеген уақыт нүктелері мен жаңа биомаркерлер мен биомаркер панельдерін табу перспективасы бар қатысушылар үшін өлшенетін жаңа стратегияға қалай мүмкіндік беретінін талқылаймыз. Біз протеомика келесі онжылдықта клиникалық зертханадағы аспаптық жұмыстың бір бөлігіне айналады және тіпті алыс болашақта қазіргі технологияларды жоюы мүмкін деп сенеміз.

Клиникалық протеинге негізделген диагностиканың қазіргі ауқымы

Қанның және дене сұйықтықтарының зертханалық зерттеулері ауруды диагностикалауға немесе растауға, тәуекелді болжауға, болжамды бақылауға және емдеу тиімділігін бағалауға бағытталған. Әдетте диагноздардың 70% қан анализі арқылы хабарланады деп болжанады, дегенмен бұл сан жақсы дәлелденбеген. Мюнхен университеттік ауруханасының Зертханалық медицина институтында стационарлық науқастардың басым көпшілігіне стационарға жатқызу кезінде белгілі бір уақытта зертханалық зерттеулер тағайындалады (77% сурет 1С). Аурухананың амбулаторияларының бірінде қаралған науқастарда бұл фракция әлдеқайда аз (31% 1D сурет). Бұл сандар амбулаториялық емделушілерге қарағанда, әдетте ауыратын ауруханаға жатқызылған науқастардың зертханалық зерттеулерге көбірек жүгінетінін көрсетеді. Сұралған талдаулар санына сүйене отырып, клиникалық тәртіпте белоктар (талдаулардың 42%), одан кейін шағын молекулалар (35%) және жасушалар (17%) басым болады (1E-сурет). Осылайша, қазірдің өзінде белоктар клиникалық тәжірибеде зертханалық талдаушылардың ең жиі талданатын класы болып табылады. Сондай-ақ, плазма ақуыздарын анықтауға қолайлы әдістер дүние жүзінде ең үлкен үлеске ие екенін ескереміз in vitro диагностика.

Плазма ақуыздарына арналған зертханалық талдаулар белгілі бір плазма ақуыздарының ферментативті белсенділігін пайдаланатын классикалық клиникалық химияға немесе антиденеге негізделген иммундық талдауларға негізделген. Ферменттік талдаулардың құны тек центтік диапазонда және олар сағатына 10 000 сынақ нәтижелерін беретін жоғары өнімді автоматтандырылған анализаторларда жұмыс істейді. Керісінше, иммундық талдаулар қымбатырақ (әдетте үлгі үшін бірнеше еуро/доллар) және сәйкес автоматтандырылған анализаторлардың өткізу қабілеті шамамен 1000 сынақ/сағ. Үлкен клиникалық химия, сондай-ақ иммундық талдау негізіндегі анализаторлар 100-ден астам әртүрлі аналитикалық параметрлерге арналған реагенттерді тасымалдауы мүмкін. Иммундық талдаудың негізгі артықшылықтары ферментативті белсенділігі жоқ плазма ақуыздарына қол жетімділік және айтарлықтай жоғары сезімталдықпен байланысты икемділіктің жоғары дәрежесі болып табылады. Тағы бір, клиникалық маңызды мәселе - зертханалық тексеруге қажетті уақыт. Шұғыл шешім қабылдау қажеттілігіне байланысты ферментативті талдаулардың көпшілігі мен бірнеше иммундық талдауларды талдау уақытын < 10 минутқа дейін қысқартуға тура келеді. Жалпы, иммундық талдаулар ферментативті талдауларға қарағанда ұзағырақ болады, дегенмен қазіргі автоматтандырылған иммундық талдаулардың басым көпшілігі 30 минуттан аспайды.

Биомаркерді зерттеуде MS негізіндегі плазма протеомикасына жүйелі шолу

Плазма ақуыздары 1990 жылдары екі өлшемді гельдік электрофорез арқылы зерттелді, кейде эксцизделген дақтарды MS сәйкестендірумен бірге. Дегенмен, олар әдетте бірнеше ондаған ақуыздарды анықтады және олар MS негізіндегі протеомикадан бұрын болғандықтан, олар бұл шолуда талқыланбайды. Үлгілерді шығаратын, бірақ ақуыз сәйкестендірулері жоқ плазманың өте төмен ажыратымдылықтағы MALDI спектрлеріне негізделген қатерлі ісік ауруын ерте анықтау талаптары (Петрикоин) т.б, 2002) дәлелденген жоқ (Баггерли т.б, 2004) және бұл технологиялар бүгінде негізінен бас тартқан.

Плазма биомаркерін зерттеумен айналысатын және MS негізіндегі протеомиканы пайдаланатын басылымдардың жан-жақты жинағын алу үшін біз PubMed шектеусіз іздеуін жүргіздік, онда «биомаркер», «плазма немесе сарысу», «протеом», «протеомика», және «масс-спектрометрия». Бұл 947 жарияланымның бастапқы тізімін берді, оның 103-і шолулар болды. Біз одан әрі адам зерттелмеген немесе плазманы немесе сарысуды қамтымаған зерттеулерді алып тастап, 381 түпнұсқалық жарияланымдарды қалдырдық (Dataset EV1).

Жарияланымдар 2002 жылы шыға бастады және 2005 жылы Адам протеомы ұйымы (HUPO) плазма протеомы туралы арнайы шығарылымды шығарған кезде жылына ең көбі 33-ке жетті (Omenn). т.б, 2005). Жылына 39 және 43 жарияланыммен 2011 және 2014 жылдары тағы екі максимум пайда болды, одан кейін 2013 жылы 24-ке және 2016 жылы жылына 20 басылымға дейін төмендеді (2А-сурет). Бақыланатын динамика жыл сайын мыңдаған жарияланымдарда көрінетін протеомиканы пайдаланатын зерттеушілердің үнемі кеңейіп келе жатқан қоғамдастығына қарама-қайшы келеді, бұл айқын өсу тенденциясы. Плазмалық протеомдық басылымдардың жалпы протеомдық жарияланымдарға қатынасы қазір < 1% құрайды және төмендеуін жалғастыруда. Плазма биомаркерлеріне нақты медициналық қажеттілікті және басқа салалардағы MS негізіндегі протеомиканың жетістігін ескере отырып, бұл плазма протеомикасының өрісін не ұстап тұрғаны туралы сұрақты тудырады.

Сурет 2. Әдебиетке толық шолу

381 негізгі жарияланымның жартысына жуығы плазмалық талдауда қолданылатын жұмыс үрдісінің аналитикалық сипаттамаларына қатысты, ал қалғандары физиологиялық немесе патофизиологиялық сұрақты зерттеді (2В-сурет). Соңғылардың үштен біріне жуығы онкологиялық ауруларға, одан кейін жүрек-қан тамырлары ауруларына (ЖҚА), адам биологиясы, қабыну, қант диабеті және жұқпалы аурулар тақырыптары (2В-сурет). Әлбетте, бұл тапсырыс қолжетімді технологиямен сәйкес өзгерістерді табу ықтималдығынан гөрі ауруларға деген қызығушылықты көрсетеді. Зерттеулердің тек 47% -ында бастапқы нәтижелерді растаудың кез келген түрі болды (2C-сурет). Жағдайлардың жартысында (24%) бұл клиникалық зерттеулердегі әдеттегі тәжірибедегідей тәуелсіз когортамен емес, бірдей үлгілермен орындалған үміткер белоктардың қарапайым Батыс бөртпелері немесе ИФА болды. Тек 36 құжат тәуелсіз ұсынылған әлеуетті биомаркерлерді тексеру үшін MS негізіндегі протеомиканы пайдаланды (Dataset EV1).

Плазманың өте жоғары динамикалық диапазоны LC-MS/MS арқылы ең көп таралған бірнеше жүзден астам ақуызды анықтауды әлі де қиындатады. Бұл қиындықты ішінара жеңу үшін плазма ақуыздары көбінесе жоғарғы 1-ден 20-ға дейінгі белоктарға қарсы бағытталған иммобилизацияланған антиденелері бар бағандар арқылы жиі азаяды (2D-сурет). Дегенмен, бұл антиденелер ешқашан толық спецификалық емес және байланыстырылған ақуыздар емес, мысалы, HSA сияқты, олардың өздері де бірнеше басқа ақуыздарға (Tu) жақындығы бар. т.б, 2010 Bellei т.б, 2011). Осылайша, таусылған плазма үлгісі бастапқы протеомның сандық көрінісі емес. Бұл әсіресе «өте сарқылу» (Цянь т.б, 2008 ) — тұтас плазмаға қарсы көтерілген поликлоналды антиденелердің кең қоспасы — немесе плазма протеомын спецификалық емес «қалпына келтіретін» гексамерлі пептидті қоспалары бар түйіршіктер (Туласираман) т.б, 2005).Бұдан басқа, бұл процедуралар жұмыс процесіне өзгермелілік пен қосымша шығындарды енгізеді, әдетте плазма ақуыздарының нақты санын анықтауға жол бермейді. Сондықтан оларды пайдалану қазіргі уақытта шағын ашу жобаларымен шектелген.

Динамикалық диапазон мен сезімталдық мәселесін шешудің екінші стратегиясы - ақуыз немесе пептид деңгейінде әртүрлі тәсілдермен жасалуы мүмкін кең плазмалық фракциялау. Бірнеше жүзден бірнеше мыңға дейін белоктарды (Лиу т.б, 2006 Пан т.б, 2011 Cao т.б, 2012 Коул т.б, 2013 Кешишян т.б, 2015 Ли т.б, 2015). Көптеген плазмалық протеомдық зерттеулер MS негізіндегі протеомикада стандартқа айналған 1% пептид пен ақуызды жалған табу жылдамдығына (FDR) қарағанда әлдеқайда қатаң статистикалық сәйкестендіру критерийлерін пайдалануды жалғастыратынын ескеріңіз.

Бөлшектеу кезінде жасырын өтімділіктің төмендеуін мультиплекстеу арқылы ішінара қалпына келтіруге болады. Мысалы, төрт пен он арасындағы үлгілер iTRAQ немесе TMT стратегиялары арқылы бірге талданды, онда үлгілер әртүрлі төмен массалық репортер иондарын тудыратын массалық бейтарап белгілермен таңбаланады (Kolla т.б, 2010 Чжоу т.б, 2012 Cominetti т.б, 2016). Сандық анықтауға пептидтерді бөлшектеу және репортер иондарының салыстырмалы қатынасын сандық анықтау арқылы қол жеткізіледі (Бантшефф т.б, 2008). Негізінде тартымды болғанымен, бұл әдістер, әдетте, бірдей репортер ионының үлгісіне ықпал ететін бірлесе оқшауланған пептидтік түрлер тудыратын қатынастың бұрмалануынан зардап шегеді («қатынасты қысу»). Өте төмен деңгейлі белоктардың немесе шағын, бірақ ауруға қатысты өзгерістері барлардың реттелуі толығымен жасырын болуы мүмкін. Мылтық протеомикасында элюционды пептидтер қарқындылық (деректерге тәуелді алу) ретімен бөлшектенеді, бұл LC-MS/MS жұмысында мәндердің болмауына әкелуі мүмкін жартылай стохастикалық процесс. Жақында енгізілген деректерге тәуелсіз сатып алу стратегиялары пептидтерді кезеңдерде дәлірек анықтайды (Picotti & Aebersold, 2012 Sajic т.б, 2015). Дегенмен, олар репортер-ион негізіндегі мультиплексирлеумен үйлеспейді, өйткені пептидтер топтарының орташа санын анықтауға болады.

Зерттеулердің шамамен 30%-да плазма үлгілері қол жетімді өлшеу уақытында қажетті плазмалық протеомды қамтуға жету үшін біріктірілді. Бұл тәсіл топ ішіндегі дисперсияларды құрбан етеді және жеке үлгілердегі шектен тыс немесе ластаушы ақуыздар бүкіл топты бұрмалауы мүмкін, бұл топтар арасында ерекшеленетін белоктардың жеке тұлға негізінде маңызды екенін бағалауды мүмкін емес етеді.

Ішінара құрал уақытына қойылатын талаптардың салдары ретінде, әдетте, 20-30-дан аспайтын үлгілер талданды және тек кейбіреулері 500-ден асты (Гарсиа-Байло). т.б, 2012 Cominetti т.б, 2016 Ли т.б, 2017). Үлгілердегі өлшеу нүктелерінің көптігін ескере отырып, бұл шағын үлгі сандары. Тиісінше, зерттеулердің көпшілігі жағдайлар мен бақылаулар арасында ерекшеленетін ақуыздар ретінде анықталған бірнеше «әлеуетті биомаркерлерді» ұсынды. Сонымен қатар, бұл үміткерлердің көпшілігінің қарастырылып отырған аурудың нақты көрсеткіштері болуы екіталай, өйткені олар аурумен жанама түрде байланысты биологиялық санаттарға жатады немесе үлгіні дайындаудың ықтимал артефактілері (кератиндер мен қызыл қан клеткаларының ақуыздары сияқты) . Қорытындылай келе, протеомика технологиясы мен эксперименттік дизайндағы шектеулер бүгінгі күнге дейін жарияланған әдебиеттерде шынайы биомаркерлерді анықтауға кедергі келтірді. Біздің білуімізше, жалғыз мүмкін болатын ерекшелік OVA1 сынағы болып табылады, онда бета-2 макроглобулин, аполипопротеин 1, сарысу трансферрині және пре-альбумин деңгейі жоғары аналық без обыры маркерімен CA125 біріктірілген. тар, FDA мақұлдаған көрсеткіш (Rai т.б, 2002 Чжан т.б, 2004 ).

Үшбұрышты MS негізіндегі биомаркерді табу және тексеру стратегиясы

Гипотезасыз MS негізіндегі протеомиканың басты артықшылығы - классикалық биомаркерлерді зерттеудегі бір ақуызды өлшеуге қарағанда, ықтимал биомаркерлердің ықтимал табиғаты мен санына қатысты ешқандай жорамал жасаудың қажеті жоқ. Тұжырымдама бойынша, MS негізіндегі протеомика әр ауруға арналған барлық ықтимал гипотезаға негізделген биомаркер зерттеулерін біріктіреді және сонымен бірге ықтимал биомаркерлердің бір-бірімен байланысын анықтайды. Тәжірибеде плазма протеомикасының қиындықтары үлкен когорттар бойынша терең және сандық зерттеулерге кедергі келтірді. Оның орнына, биомаркерді ашудың сатылы немесе «үшбұрышты» стратегиясы ұсынылды, онда жеке адамдар саны бірнешеден көпке дейін өседі, ал белоктар саны жүздеген немесе мыңнан бірнешеге дейін азаяды (Рифаи). т.б, 2006 3A-сурет).

Сурет 3. Плазма биомаркерін зерттеудегі қазіргі парадигмалар («үшбұрышты тәсіл»)

Плазмадағы гипотезасыз ашу протеомикасының әдеттегі жұмыс процесі төменнен жоғары протеомиканың басқа салаларында қолданылатынға ұқсас (Aebersold & Mann, 2016 Altelaar & Heck, 2012 3B сурет). Қысқаша айтқанда, ақуыздар пептидтерге ферментативті түрде сіңеді, олар электроспрей ионизациясымен біріктірілген жоғары қысымды сұйық хроматография (HPLC) арқылы бөлінеді. Пептидтік массалар мен молшылықтар толық MS сканерлеулерінде масс-спектрометрде өлшенеді, ал пептидтерді фрагментациялаудың келесі қадамы пептидтерді сәйкестендіру үшін MS/MS спектрлерін шығарады. Жақсы құрылған протеомика бағдарламалық платформалары дерекқорды іздеуде пептидтерді автоматты түрде және статистикалық түрде қатаң түрде анықтайды және олардың санын анықтайды (Cox & Mann, 2008 MacLean т.б, 2010 жыл т.б, 2014). Сонымен қатар, плазмада HPLC бағандарын оңай бітеп тастайтын липидтер сияқты қан компоненттері бар, бұл арнайы пептидтерді тазарту процедураларын қажет етеді (Гейер). т.б, 2016а).

Кандидаттарды тексеруге арналған мақсатты протеомика үшбұрышты стратегияның екінші кезеңі болып табылады (3C-сурет). Ашылу фазасында дифференциалды экспрессиясы бар ақуыздардың салыстырмалы түрде аз саны (әдетте < 10) үлкенірек және идеалды тәуелсіз когортада сыналады. Иммундық талдаулар жиі қол жетімді болмағандықтан, мақсатты MS әдістерін қолдануға болады. Олардың ең кең тарағаны «бірнеше реакциялық мониторинг» (MRM — кейде бір реттік немесе таңдалған реакция мониторингі деп те аталады — SRM) (Picotti & Aebersold, 2012 Carr) т.б, 2014 Эбхардт т.б, 2015). Әрбір ақуыз үшін сәйкес пептидтер жинағы таңдалады және MRM талдауын анықтау үшін олардың элюциясы мен фрагментация тәртібі бағаланады. Талдау кезінде масс-спектрометр тек осы пептидтерді элюциялау кезінде үздіксіз фрагменттеу үшін бағдарламаланады. Бір пептидке бірнеше фрагменттерді бақылай отырып, тіпті төмен рұқсатты масс-спектрометрлермен де сезімтал және нақты сандық анықтауға қол жеткізуге болады. Тексеру үшін шолақ мылтық протеомикасынан MRM артықшылығы оның жоғары сезімталдығы мен өткізу қабілеті болып табылады. Зертхана аралық зерттеулер жақсы репродукцияға қол жеткізді (Addona т.б, 2009 Abbatiello т.б, 2015), бірақ хабарланған сезімталдық әдетте төмен нг/мл концентрация диапазонына жетпейді және іс жүзінде қол жеткізілген мультиплекстеу мүмкіндіктері ондаған пептидтермен шектеледі (Перси). т.б, 2013 Ши т.б, 2013 Обербах т.б, 2014 Ву т.б, 2015). Соған қарамастан, соңғы екі зерттеу сәйкесінше 82 және 192 протеинге бағытталғанын хабарлады (Озжан т.б, 2017 Перси т.б, 2017). MRM сезімталдығын сарқылу немесе бөлшектеу арқылы сынаманың кеңірек алдын ала өңдеуі арқылы төмен нг/мл немесе тіпті жоғары pg/ml диапазондарына дейін жақсартуға болады (Бюргесс т.б, 2014 Ким т.б, 2015 Ние т.б, 2017 ).

Абсолютті және дәл сандық анықтау ішкі стандарттарды талап етеді - әдетте бақыланатын пептидтердің ауыр изотоптық нұсқалары. Синтезделген ауыр пептидтер ас қорытудан кейін қосылады, бұл сандық дәлсіздіктің көзін жасайды, өйткені ақуыздың қорытылуының өзгергіштігі ескерілмейді. Мұны пептидті бастапқы реттілік контекстіне енгізу арқылы шешуге болады, мысалы, SILAC-PrEST стратегиясында, онда сандық тегпен біріктірілген әрбір қызықты ақуыздың 150-ден 250-ге дейінгі аминқышқылды созылуы рекомбинантты түрде көрсетіледі. ауыр түрінде (Зейлер т.б, 2012 Edfors т.б, 2014 Гейер т.б, 2016а).

Мақсатты әдістер белоктардың немесе пептидтердің иммундық байытылуымен де біріктірілуі мүмкін. Мысалы, «тұрақты изотоптық стандарттарда және пептидке қарсы антиденелермен ұстауда» (SISCAPA) спецификалық пептидтер ауыр таңбаланған аналогтарымен бірге иммунопреципитацияланады, содан кейін MS негізіндегі жылдам оқу (Андерсон) т.б, 2004 Разави т.б, 2016). Бұл антиденелерді байыту мүмкіндіктерін MS анықтау ерекшелігімен біріктіреді, дегенмен талдауларды әзірлеу қиын және уақытты қажет етуі мүмкін - таза антиденеге негізделген әдістермен салыстырғанда артықшылығын тарылтады.

Үшбұрышты стратегияның соңғы кезеңі - ондаған жылдар бойы пісіп-жетілген өріс иммундық талдаулармен валидация. Максималды ерекшелік үшін әдетте сэндвич талдауларына артықшылық беріледі (3D-сурет). Оларды әзірлеу қымбат және еңбекқор болғанымен, олар жоғары сезімталдық пен жоғары өткізу қабілетіне қол жеткізе алады. Тіпті мыңдаған қатысушылары бар когорттарды да осы технологиямен сынауға болады, бірақ тек бір немесе бірнеше кандидат биомаркерлері үшін. Мұндай үлкен сандар тек бақылауға ғана емес, сонымен қатар басқа ауруларға қатысты ерекшелікті анықтау үшін қажет болуы мүмкін. Стандартты талаптарға сәйкес статистикалық қуатты және тәуелсіз популяциядағы репликацияны сақтандыру кіреді. Бүгінгі күні мұндай клиникалық зерттеулер жаңа биомаркерлердің аздығын ішінара түсіндіретін қымбат көпжылдық жұмыс болуы мүмкін.

Иммунологиялық талдаулар негізінен антиген-антиденені тануға қатысты кейбір тән шектеулерге ие. Оларға кросс-реактивтілік, триглицеридтер сияқты фондық молекулалардың кедергісі және сызықты емес реакция («ілмек әсері») кіреді (Hoofnagle & Wener, 2009 Wild, 2013). Сонымен қатар, барлық клиникалық маңызды ақуыз нұсқалары антиденеге негізделген талдаулар арқылы оңай танылмайды. Осы шектеулерді ескере отырып, MS негізіндегі әдістер, кем дегенде, кейбір ауқымды клиникалық сынақтарда тартымды балама болар еді, бірақ бұл үшін қазіргі кездегіге қарағанда әлдеқайда сенімді, сезімтал және жоғары өткізу қабілеттілігі технологиялары қажет.

Соңғы онжылдықта протеомика қауымдастығы сапа стандарттарын талқылайтын және нәтижелердің статистикалық маңыздылығын, сондай-ақ әлеуетті биомаркерлердің ерекшелігін және олардың әлеуетті клиникалық қолданылуын қамтамасыз ететін барабар когорттарды таңдаудың маңыздылығын көрсететін биомаркерлерді дұрыс әзірлеу бойынша нұсқаулықтарды әзірледі (Luque- Гарсия және Нойберт, 2007 Паулович т.б, 2008 Мищак т.б, 2010 Суринова т.б, 2011 Конькилер т.б, 2013 Parker & Borchers, 2014 Hoofnagle т.б, 2016 ).

Үшбұрышты стратегияның қатаң талаптарын ескере отырып, оның толық және сәтті қолданылған есептері аз болса да, таңқаларлық емес. Бұл сондай-ақ ішінара үш түрлі технологияның - шолақ мылтық протеомикасының, мақсатты протеомиканың және иммундық талдаудың дамуының қатысуына байланысты болуы мүмкін. Көптеген жарияланымдар бірінші фазаны сипаттайды немесе оны тек бір топтағы (Dataset EV1) иммундық талдаумен верификациямен біріктіреді.

Бірнеше қатысушыдан астам және кейбір растаулары бар зерттеулердің көпшілігі қызығушылық танытқан кандидаттарды таңдады және Western Blotting, ELISA немесе MRM талдауларын жасады. Өкілдік мысал - Чжанның зерттеуі т.б (2012), онда 10 колоректальды қатерлі ісікпен ауыратын науқастардың плазмасы бақылауға қарсы iTRAQ белгісімен белгіленіп, 72 ақуызды анықтауға әкелді. Бірнеше жоғары немесе төмендетілген протеиндердің арасында ORM2 419 адамда ELISA көмегімен бақыланды. Бұл ақуыз туа біткен иммундық жүйенің бөлігі болғандықтан (басқа екі жоғары реттелетін үміткерлер сияқты), оның нақты ісік маркері болуы екіталай. Басқа зерттеуде, супер-депляция, iTRAQ таңбалау және фракциялау 50 біріктірілген үлгіге дейін қысқартылған жүрек-қантамыр аурулары бар 751 пациенттің ашылған когортында және бақылауда 830 ақуызды анықтады (Юхаш т.б, 2011). Белгілі CRP және фибронектин маркерлері үміткерлер тізімінен таңдалды және бастапқы когортада осы белоктарға қарсы иммундық талдаулар арқылы айтарлықтай жоғары реттелетіні анықталды. Жүрек трансплантациясын зерттеуде операцияға дейін және одан кейінгі бес уақыт нүктесінде 26 пациенттің таусылған және iTRAQ таңбаланған плазмасын талдау жалпы саны 900-ден астам ақуызды анықтады (әр жеке Коэн үшін 273). т.б, 2013). 43 адамнан тұратын ішінара тәуелсіз бақылау когортындағы бес орташа мөлшердегі ақуызға қарсы MRM талдаулары және ELISA органнан бас тартуға арналған тәуекел маркерлері үшін есептеу құбырын әзірлеуге қызмет етті. Ықтимал клиникалық пайдалылық көзқарасында сүт безі қатерлі ісігінің тінтуір үлгісіндегі таусылған плазма 80 жануардан тұратын тәуелсіз тексеру когортында MRM талдаулары үшін 88 таңдалған 1000-нан астам плазма ақуызын анықтауға мүмкіндік берді (Уайткер). т.б, 2011 ).

Тікбұрышты биомаркер стратегиясы және плазмалық протеомды профильдеу

Соңғы бірнеше жылда қауымдастық MS негізіндегі протеомиканың жұмыс үрдісінің барлық аспектілерін айтарлықтай жақсартты. Үлгіні дайындау кезінде көп еңбекті қажет ететін, көп сатылы дайындау жұмыс үрдістері ең аз манипуляция қадамдары бар сенімді, бір құтылы өңдеуге ауыстырылды. Бұл сонымен қатар автоматтандыруға көмектеседі және өткізу қабілеттілігін арттырады. MS аспаптарының сезімталдығы мен реттілік жылдамдығы бірнеше есе жақсарды. Бүкіл LC-MS/MS жүйесі әлдеқайда берік болды, дегенмен бұл әдеттегі клиникалық қолдану үшін қажет нәрседен әлі алыс. Ақырында, нәтижелердің биоинформатикалық талдауы қазір статистикалық тұрғыдан дұрыс және қолдануға оңай және MS нәтижелерін басқа классикалық клиникалық және қосымша «омика» деректерінің кең ауқымымен корреляциялауға мүмкіндік береді. Ең озық MS негізіндегі протеомиканың күшін көрсете отырып, жасуша желілерін салыстырмалы түрде қысқа уақыт ішінде, кейде тіпті ешқандай фракциясыз 10 000-нан астам түрлі белоктардың тереңдігіне дейін жүйелі түрде анықтауға болады (Манн т.б, 2013 Ричардс т.б, 2015 Шарма т.б, 2015 Беккер-Йенсен т.б, 2017 ).

Жасуша желісі мен тін үлгілеріндегі протеомиканың осы технологиялық прогресін ескере отырып, біз көптеген үлгілерде плазма протеомының сандық мөлшерін тереңдете алатын жылдам және автоматтандырылған жұмыс процесін әзірлеуге болатынын сұрадық (Гейер т.б, 2016а). Біз бұл «тікбұрышты стратегияға» мүмкіндік береді деп ойладық, онда мүмкіндігінше көп белоктар мүмкіндігінше көп адамдар мен жағдайлар үшін өлшенеді. Үшбұрышты жұмыс үрдісінен айырмашылығы, бастапқы ашу когорты әлдеқайда үлкен болады, ең дұрысы жүздеген немесе мыңдаған қатысушыларды қамтиды, нәтижесінде зерттелетін топтарды немесе шарттарды ажырата алатын кез келген үлгілерді ашу ықтималдығы жоғары болады. Плазма протеомдарының бұл үлкен бастапқы саны статистикалық маңызды, бірақ белоктар тобымен байланысты шағын айырмашылықтар мен өзгерістерді табуға мүмкіндік береді. Ұсынылған тікбұрышты стратегияда ашу және валидация когорталарының екеуі де мылтық протеомикасы арқылы терең тереңдікте өлшенетін болады. Бұл валидацияның ашуға тәуелділігін жояды, яғни екі когортты бірге талдауға болады (4А-сурет). Сонымен қатар, бөлек когорталардың болуы зерттеуге тән шатастырып алуды ашуға мүмкіндік береді. Тікбұрышты стратегияның тағы бір артықшылығы - бұл үшбұрышты тәсілмен қол жетпейтін жалғыз биомаркер үміткерлерінен басқа, белгілі бір денсаулық немесе ауру күйлеріне тән ақуыз үлгілерін ашу және тексеру қабілеті.

Сурет 4. Тікбұрышты жұмыс процесі

Бір қызығы, тұжырымдаманың ұқсас өзгеруі бірнеше жыл бұрын геномдық қауымдастық зерттеулері (GWAS) үшін болды. Осы саладағы зерттеушілер мүмкіндігінше көп үлгілерді бірлескен талдау дәйекті құбырдан (Skol) артық екенін анықтады. т.б, 2006). Протеомикада айқын міндет - қысқа уақыт ішінде, ең дұрысы сарқылмай және сенімді жұмыс процесінде жеткілікті протеомика тереңдігіне қол жеткізу. Жазу кезінде бұл мақсатқа қол жеткізілген жоқ, бірақ технологиялық жетілдірудің қазіргі қарқыны оны жақын арада жүзеге асыруға уәде береді. Төменде біз осы пайда болған тәсілдің төрт мысалын талқылаймыз.

Олардың біріншісі плазма ақуыздарының деңгейіне генетикалық фонның әсерін анықтау үшін 36 монозиготикалық және 22 дизиготикалық егіздердің когортасын зерттеді (Лю т.б, 2015). Авторлар сарқылған, бөлшектелген және біріктірілген үлгілерді пайдалана отырып, спектрлік кітапхана құрды және олардың үлгілерін деректерден тәуелсіз алу (DIA) арқылы өлшеді. Барлығы 232 плазма үлгілері деректерге тәуелсіз режимде 35 минуттық градиенттермен өлшенді, бұл 1904 пептид пен 342 ақуыздың дәйекті мөлшерін анықтауға әкелді. Бір қызығы, ақуыз деңгейлері жеке адамдармен салыстырғанда жеке адамдарда салыстырмалы түрде тұрақты болды. Сонымен қатар, кейбір белоктардың деңгейлері генетикалық бақылауда болуының нақты белгілері болды. Мысалы, «иммундық жауапқа» және «қанның коагуляциясына» байланысты процестер тұқым қуалаушылыққа бейім болды, ал «гормондық жауаппен» байланысты емес. Пионерлік зерттеу болғанымен, зерттелетін плазма протеомдарының саны қойылған сұрақтың жалпылығын ескере отырып, салыстырмалы түрде аз болды. Жалпы, генетикалық зерттеулер клиникалық протеомикада әлдеқайда жоғары өткізу қабілетінің қажеттілігін көрсететін нәзік тұқым қуалайтын әсерлерді анықтау үшін мыңдаған қатысушыларды жүйелі түрде зерттейді.

Мальмстрем т.б (2016) инъекция арқылы тышқандарда сепсис туғызды S. pyogenes және олардың плазмалық протеомдарын сарқылмаған, фракцияланбаған үлгілерде үш уақыт нүктесі арқылы бақылаған. Деректерге тәуелсіз идентификацияларды қолдау үшін, сондай-ақ тіндердің зақымдануы ақуыздарының шығу тегін анықтау үшін әртүрлі тышқан тіндерінің кітапханасы пайдаланылды. Осылайша, 2 сағаттық жүгірулер орташа есеппен 786 тінтуір протеинін анықтады, дегенмен күрделі DIA MS/MS спектрлеріндегі пептидтердің сәйкестіктерін анықтауға арналған тиісті FDR критерийлері әлі де талқыланып жатқанын атап өткен жөн (Несвижский. т.б, 2007 Брюдерер т.б, 2017 Розенбергер т.б, 2017). Сепсис кезінде плазма ақуыздарының күтілетін бірнеше санаттары, сондай-ақ қан тамырлары жүйесінің зақымдалуымен байланысты кейбір маркерлер өсті. Кейбір өзгерістер патогенге қарсы иммундық жүйені жұмылдырумен байланысты болды, ал басқалары қатты зардап шеккен жануарлардың некрозымен байланысты болды.

«Плазма протеомының профилін жасау» деп аталатын жұмыс процесінде біз бір саусақпен (Гейер) бар болғаны 1 мкл сарқылмаған плазманы жылдам және сенімді талдауға назар аудардық. т.б, 2016а). Жалпы градиент уақыты небәрі 20 минутты құрады, бұл плазма протеомының аналитикалық, ішкі талдау, индивидуалды және индивид аралық вариациясын кеңінен зерттеуге мүмкіндік берді. 300 плазма ақуызының сандық көрсеткіштері негізінде FDA мақұлдаған 50-ге жуық биомаркер жапсырмасыз сандық анықтаумен қамтылды (CV < 20%). Үлгілердің кең ауқымын жылдам талдау сонымен қатар эритроциттердің лизисі бар үлгілерді, үлгіні дұрыс емес өңдеуге байланысты коагуляциялық каскадтың ішінара белсендірілгендерін және кератиндер сияқты экзогендік ластанулары бар үлгілерді нақты жіктейтін сапа маркерлерінің әртүрлі жиынын ашты. Бұл зерттеу плазма протеомының ақпарат мазмұнына пайдалы шолуды қамтамасыз еткенімен, қамту тереңдігі төмен деңгейлі, реттеуші плазма ақуыздарын шешу үшін әлі жеткіліксіз болды. Фракциялаудың бір қадамы 1000-ға жуық протеиннен тұратын сандық плазма протеомын берді, оның ішінде 10 нг/мл хабарланған концентрациясы бар 183 протеин, алайда әрбір үлгі үшін ұзағырақ өлшеу уақытының құнына байланысты.

Плазмалық протеомды профильдеу жұмыс процесінің жетілдірілген нұсқасы салмақ жоғалту зерттеуінде шамамен 1300 плазмалық протеом үлгілерін роботтық дайындауға және өлшеуге мүмкіндік берді (Гейер т.б, 2016b). Жеке тұлғалардың төрт еселенген талдауы салмағын жоғалтқан кезде және бір жыл бойы салмақты ұстап тұру кезінде орта есеппен 437 ақуыздың динамикасын анықтады. Салмақ жоғалтудың өзі адам плазмасының протеомына 93 айтарлықтай өзгерген белокпен кең әсер етті. Сандық айырмашылықтар көбінесе аз болды, бірақ физиологиялық тұрғыдан маңызды болды, мысалы, SERPINF1 адипоциттерден бөлінетін фактордың 16%-ға төмендеуі. Жеке адамдар 1 жыл бойы орташа салмақты 12% жоғалтқан бойлық зерттеу дизайны плазма протеомының ұзақ мерзімді динамикасын түсіруге және оны жеке адамдар арасында тұрақты белоктарға бөлуге мүмкіндік берді. Көп ақуыздық үлгілер липидті гомеостаз жүйесін (аполипопротеиндер тобы), төменгі деңгейдегі қабынуды және инсулинге төзімділікті көрсетті. Бұл үлгілер жеке адам деңгейінде салмақ жоғалтудың артықшылықтарын сандық түрде көрсетті, бұл жеке емдеуге және өмір салты бойынша ұсыныстарға мүмкіндік береді.

Бірге бұл зерттеулер сонымен қатар көлденең зерттеу конструкцияларына қарағанда бойлық артықшылықтарды көрсетеді, өйткені плазмалық протеома әр түрлі адамдар арасындағыға қарағанда, уақыт өте жеке адам ішінде әлдеқайда тұрақты болады. Сонымен қатар, олар біркелкі емес плазманы пайдалануымен ұқсас және берілген талдау уақытында көптеген ақуыздарды анықтайды (20 протеин/мин дейін).

Қанша протеинді қамту керек деген сұраққа қатысты, біз сарқылмаған плазмадағы 1500-ден астам ақуыздың протеомдық тереңдігі бауыр негізіндегі липопротеиндік рецепторлар сияқты тіндердің ағып кетуін қамтамасыз ететін ақуыздарды қамтуға мүмкіндік беретінін анықтадық және қазіргі уақытта әзірленіп жатқан технологиялық мүмкіндіктерге жетеді. дамыған. Алғашқы 300 ең көп ақуыздың ішінде әрбір төртінші ақуыз биомаркер болып табылады, ал келесі 1200 белокта ол әрбір 25-ші белок болып табылады (5-сурет). Өйткені жоқ априори биомаркерлердің қисық көптігінің таралуының себебі, бұл көптеген биомаркерлер әлі де табылуы керек дегенді білдіреді. Біз тікбұрышты стратегияны қолдана отырып, плазмалық протеомды профильдеудің нақты уәдесі оның әлі биомаркерлер ретінде қарастырылмаған ақуыздар мен ақуыз үлгілерін аша алатындығына сенеміз. Негізгі LC-MS/MS технологиясының экспоненциалды ұлғаюы бүкіл әлемдегі зертханаларда жазылған плазмалық протеом деректер жинағының санының сәйкес өсуін ынталандырады. Бұл көптеген клиникалық зерттеулер мен жеке тұлғаларды қамтитын плазма протеомдары мен олардың динамикасының кең дерекқорын жасайды. Одан кейін мұндай деректер протеомдық күйлерді ауруларды, қауіптерді, емдеу әдістерін және өмір салтын қоса алғанда, кең алуан түрлі «бұзушылықтармен» байланыстыратын білім базасын құру үшін біріктірілуі мүмкін. Кем дегенде, бұл тәсіл олар ашылған нақты контекстен басқа, берілген биомаркерлер жиынтығы қатысатын барлық әртүрлі жағдайларды ашады. Ауру жағдайлары арасындағы протеоманың қабаттасуы олардың арасындағы ортақтықтарды аша алады (4В-сурет, жоғарғы панель). Жеке адамның плазмалық протеом профилін және оның динамикасын жаһандық білім қорымен салыстыру арқылы түсіндіруге болады. Бұл қатар жүретін ауруларды жою және емдеуді басқару және тиімділікті бақылау үшін пайдаланылуы мүмкін (Cурет 4B, төменгі панель).

Сурет 5. Көпшілік диапазонында биомаркердің таралуы

Протеомдық биомаркерді ашу құбырын стандарттау

Нарыққа шығып жатқан биомаркерлердің қазіргі жетіспеуі әртүрлі техникалық, ғылыми және саяси аспектілердің, соның ішінде сәйкес келмейтін реттеу стандарттарының нәтижесінде төмен бағаланудың және аналитикалық негізділік пен клиникалық пайдалылыққа дәлелдердің болмауының нәтижесі болуы мүмкін деген болжам бар (Хейс). т.б, 2013). Осы қиындықтарды жеңу үшін биомаркерді дамытуға арналған жүйелі құбырлар ұсынылды (Павлоу т.б, 2013 Даффи т.б, 2015). Биомаркерді ашудың үшбұрыштан тікбұрышты стратегиясына көшу контекстінде келесі принциптерді ескеру ерекше маңызды болады.

(1) Аналитикалық өнімділік сипаттамалары: Аналитикалық жарамдылық биомаркерді дәл және сенімді өлшеуді қамтамасыз ететін сынақтың мүмкіндігі. Плазма протеомикасының әдістемесінің аналитикалық негізділігін орнату маңызды болады, өйткені дәл сол әдіс көбінесе ашылғаннан бастап қолдануға дейін жалғасады. Аналитикалық жарамдылықты анықтауға арналған егжей-тегжейлі стандарттарды Клиникалық және зертханалық стандарттар институты (CLSI) әзірлеген (www.clsi.org). Шолуды Grant and Hoofnagle (2014) және Дженнингстен табуға болады т.б (2009). Осы стандарттардың кейбірін АҚШ-тың Азық-түлік және дәрі-дәрмек басқармасы (FDA) мойындады және оларды әкелу үшін қабылданды. in vitro нарыққа диагностикалық тест (https://www.accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfstandards/search.cfm). FDA стандарттарына сәйкес келетін толық аналитикалық валидациядан бастау биомаркерді ашуға тыйым салуы мүмкін болса да, кем дегенде тасымалдау, дәлдік, дәлдік, аналитикалық сезімталдық, аналитикалық ерекшелік және сандық анықтау шегі сияқты негізгі критерийлердің кейбірі тексерілуі керек. ерте. Бұл тікбұрышты стратегия контекстінде біз қолдайтын нәрсеге сәйкес келеді және сонымен бірге ресурстарды үнемдеу мүддесіне сәйкес келеді, өйткені биомаркерді ашқаннан кейінгі қадам биомаркерді тексеру болып табылады, мұнда аналитикалық жарамдылық міндетті болады.

(2) Клиникалық өнімділік сипаттамалары: Клиникалық жарамдылық пациенттердің байланысты аурулары мен клиникалық жағдайларына қатысты және талдау арқылы мақсатталған талданатын заттардың дұрыс өлшеуіне бағытталған аналитикалық жарамдылықтан ерекшеленеді. Халықаралық стандарт ұйымы (ISO) 15189 және ISO 17025 сәйкес, валидация – «нақты мақсатты пайдалану немесе қолдану талаптарының орындалғанын объективті дәлелдемелерді ұсыну арқылы растау». Сондықтан клиникалық өнімділікті орнату биомаркерді валидациялау кезеңіндегі басты мақсат болып табылады. Клиникалық өнімділік сипаттамалары мыналарды қамтиды: (i) сау болып көрінетін адамдардың когорталарын өлшеу арқылы қалыпты анықтамалық диапазондарды анықтау, (ii) аурумен ауыратын және оң сынақтан өткен адамдардың үлесі ретінде анықталған клиникалық сезімталдықты анықтау және (iii) клиникалық ерекшелікті анықтау. , ол теріс сыналған, аурусыз адамдардың үлесі ретінде анықталады. Қабылдағыштың жұмыс сипаттамасы (ROC) сызбалары сияқты алынған статистика биомаркерлердің клиникалық өнімділігін бағалауда әсіресе пайдалы (Zweig & Campbell, 1993 Obuchowski т.б, 2004 ).

(3) Зерттеу дизайны және алдын ала талдау: мұқият зерттеу дизайны және жақсы бақыланатын аналитикалық алдын ала шарттар биомаркерді зерттеу кезінде кез келген уақытта негізгі талаптар болып табылады. Зерттеу дизайнына қатысты биомаркер шешуі керек клиникалық сұрақ пен медициналық қажеттілікті нақты анықтау міндетті болып табылады. Биомаркерлерді зерттеуде жиі кездесетін мәселе жағдайлар мен бақылау үлгілерінің дербес жиналуы және жас, этникалық, жыныс және басқа факторларға сәйкес келмеуі болып табылады, бұл әдейі емес бұрмалауға әкелуі мүмкін немесе әкелмеуі мүмкін (Даффи). т.б, 2015). Біржақтылыққа қарсы әдістерге дұрыс зерттеу дизайнын, сондай-ақ аурулардың халықаралық статистикалық классификациясы (http://apps.who.int/classifications/icd10/browse/2016/en) сияқты жүйелі жіктеулерді пайдалана отырып, қатысушылардың нақты және терең клиникалық фенотипін анықтау кіреді. немесе адам құбылысының онтологиясы (Колер т.б, 2017). Осылайша, егер адамда бірнеше ауру жағдайлары болса, оны дұрыс есепке алуға болады. Сынамаларды алу да маңызды және барлық үлгілерге (соның ішінде жағдайлар мен бақылаулар) қан алудан аналитикалық кезеңге дейін бірдей өңдеу қажет. Көптеген биомаркер зерттеулеріндегі тағы бір маңызды қадам биобанкинг болып табылады. ELISA қолдану кезінде біз ақуыз негізіндегі биомаркерлерді 3 ай бойы сақтау үшін -80°C немесе одан төмен температура қажет екенін анықтадық (Zander т.б, 2014). Ұзақ уақыт кезеңіндегі үлгі тұрақтылығы нашар зерттелген. Дегенмен, біздің тәжірибемізде шолақ мылтық протеомикасы үлгі тарихындағы вариацияға жоғары төзімділікке ие, өйткені сақталуы қажет ақуыз эпитоптары жоқ және кейіннен пайда болған протеолитикалық пептидтердің көпшілігі өзгермеген жағдайда, ақуыздың ішінара ыдырауына да төзімді болуы мүмкін.

Клиникалық қолдану жолы

Плазма протеомикасындағы қазіргі прогресс зерттеулер мен клиника үшін қызықты жаңа жолдарды ашады. Жоғарыда аталған барлық сақтық шараларын ескере отырып, көрсетілген тәсілдер ақуызға негізделген жаңа биомаркерлердің ашылуына әкелуі қаншалықты ықтимал? Ал болашақтың протеомдық биомаркері қандай болады? Бұл контекстегі негізгі тақырып – белгілі бір ауру күйінің немесе қауіптің болуы мен болмауын, басқаша айтқанда оның клиникалық көрсеткіштерін ажырату үшін биомаркердің дискриминациялық күші. Қазіргі уақытта жоғары спецификалық және жоғары сезімталдықпен қолданылатын биомаркерлердің мысалдары кардиомиоциттерде арнайы экспрессияланған құрылымдық ақуыздар болып табылатын жүрек тропониндері болып табылады, сондықтан миокард зақымдануы үшін жоғары спецификалық. Осы себепті жүрек тропониндері тіпті миокард инфарктісінің әмбебап анықтамасына енгізілді (Роффи т.б, 2016 ).

Протеомика тәсілдер кем дегенде белгілі бір аурулар үшін ұқсас өнімділігі бар қосымша биомаркерлерді анықтауда сәтті болуы мүмкін. Шындығында, біз бүгінгі таңда қолданылатын биомаркерлердің көпшілігі не өте мол немесе белгілі патофизиологиялық контекстен шыққанын білуіміз керек. Ойлау эксперименті ретінде біз биомаркерлер санының жоғары молшылық диапазонындағы ақуыздар санына қатысты протеиндердің төменгі мол диапазонына қатынасын экстраполяцияладық, бұл тиісті технологиямен қол жетімді болуы мүмкін бірнеше жүздеген жаңа биомаркерлердің әлеуетін көрсетеді ( 5-сурет). GWAS-қа ұқсас, онда көптеген соққылар зерттелетін аурудың бұрын белгісіз патофизиологиясымен байланысты болды (Holdt & Teupser, 2013 Manolio, 2013), жаңа маркерлер радар астында жасырылған болуы әбден мүмкін. алдыңғы стратегиялар жаңа жүйелі протеомика тәсілдерімен анықталады. Бұл биомаркерлер сонымен қатар диагностикада ғана емес, сонымен қатар терапия үшін де аурудың патофизиологиясы туралы түсінігімізді жақсартуға мүмкіндік береді. Дегенмен, анықталған биомаркерлер әрқашан аурудың патофизиологиясына тікелей қатысы жоқ, бірақ онымен ғана байланысты болуы мүмкін екенін ескеріңіз.

Адам геномы ICD коды бойынша жіктелген 14 500-ден астам ауруға қарсы 20 000-ға жуық ақуызды кодтайтын гендерді кодтайды. Бұл биомаркерлерді табудың қазіргі күш-жігерінде жиі айтылғандай, бір геннің немесе ақуыздың әрбір аурудың жағдайымен байланысты екенін елестету тұжырымдамалық тұрғыдан қиынға соғады. Керісінше, бірнеше маркерлер үшін үлкен когорттарды скринингке мүмкіндік беретін тікбұрышты стратегия белгілі бір денсаулық немесе ауру күйлеріне тән ақуыз үлгілерін ашуға және растауға үлкен уәде береді. Шынында да, көп маркерлі комбинациялар бір маркерлермен салыстырғанда жоғары ерекшелік пен сезімталдыққа қол жеткізуі мүмкін және омикс деректерінен дәл маркер комбинацияларын таңдаудың алғашқы құралдары әзірленді (Маззара). т.б, 2017). Дегенмен, жаңа биомаркерлердің бұрыннан барларымен біріктірілген жалпы проблемасы олар көбінесе классификацияның шамалы жақсартуларына әкеледі, әсіресе жақсы жұмыс істейтіндерге (Pencina) қосылғанда. т.б, 2010). Жалпы және интуитивті болжамдарға қарамастан, болжаушылардың арасындағы корреляция (әсіресе теріс корреляция) дискриминация үшін пайдалы болуы мүмкін екендігі көрсетілді (Демлер т.б, 2013). Бұл салада көбірек зерттеулерге кепілдік беріледі және жаңа протеомика технологиялары сәйкес статистикалық әдістерді тексеру үшін қажетті деректерді қамтамасыз етеді.

Ақырында, бұл маркерлер клиникалық жағдайда қалай қолданылады? Біз барлық плазма протеомын терең өлшеуді қолдаймыз, себебі бұл ең толық ақпаратты береді. Уақыт өте келе ол плазма протеомының бойлық профилін қосады, оны тіпті дені сау адамдарда да алуға болады. Жоғарыда айтылғандай, плазма ақуыздарының деңгейлері әдетте тұрақты, бірақ адамға тән, популяцияға негізделген шектік мәндердің орнына жеке-жеке түсіндіруге мүмкіндік береді. Сонымен қатар, қосарланған аурулар пациенттердің көптеген топтарында ерекшелік емес, ереже болып табылады. Олар жеке ELISA сынақтарының қатарынан емес, плазмалық протеомдық профильдеу сияқты жалпы диагностикалық сынақ арқылы әлдеқайда оңай және үнемді түрде шешіледі. Осыған қарамастан, әмбебап сынақ орынды болмайтын көптеген жағдайлар болуы мүмкін, өйткені ол байқаусызда басқа жағдайларды ашуы мүмкін. Ұқсас мәселелер геномды секвенирлеу немесе елестету әдістері сияқты басқа технологияларда туындайды, мұнда адамдар азырақ жасай алатын бейімділіктер туралы білгісі келмеуі мүмкін. Бұл жағдайларда және әдетте артық диагноз қою қаупін болдырмау үшін (Hofmann & Welch, 2017) клиницистер белгілі бір аурудың контекстіне бағытталған неғұрлым бағытталған сипаттағы плазмалық протеомика сынақтарын таңдай алады. Бұған бүкіл протеомға емес, белоктар панеліне бағытталған жоғарыда аталған MS әдістері арқылы қол жеткізуге болады.

Толық протеомды диагностикалық сынақтар немесе панельге негізделген сынақтар үшін дәрігерлер алынған көп өлшемді деректермен қалай әрекет етеді деген сұрақ туындайды. 6А суретінде клиникалық білім мен интуиция негізінде шешім қабылдауға біріктірілген ағымдағы жалғыз/олиго биомаркер диагностикасы көрсетілген. Жаңа биомаркерлер жақсырақ негізделген клиникалық шешімдерге уәде береді, бірақ сонымен бірге адамның интерпретациялаудың когнитивті мүмкіндіктерінен асатын үлгілерді құру қаупін білдіреді (6В-сурет). Бұл мәселенің шешімі клиникалық шешім қабылдауға айтарлықтай көмектесетін клиникалық метадеректермен біріктірілген сандық панельге бірнеше биомаркерлердің алгоритмдік комбинациясы болуы мүмкін (6С-сурет). «Терең оқыту» және «үлкен деректердегі» қарқынды дамуды ескере отырып, бұл комбинация күшті және бұрын-соңды болмаған бірлестіктерді қамтамасыз ете алатынын білу өте қызықты болады. Бүгінгі күні клиникалық тәжірибеде көп параметрлі баллдар бар екенін ескереміз. Мысалы, Чайлд-Пью шкаласы және Фрамингем тәуекел дәрежесі емделуші деректерімен бірнеше қан көрсеткіштерін біріктіріп, ондаған жылдар бойы тиісінше бауыр ауруын және жүрек-қан тамырларын емдеуде емделушіге шешім қабылдауға көмектесті. Бұл сонымен қатар плазма протеомикасын дәлелді медициналық тәжірибеге қалай қабылдауға болатынын көрсетеді, бұл көптеген параметрлер мен параметр комбинацияларын ескере отырып, үлкен мәселе, олардың барлығын жеке клиникалық сынақтармен растау мүмкін емес. Прагматикалық балама дәрігерлер кездейсоқ протеомдық ақпаратты және онымен байланысты шешімді қолдауды алатын сынақтарды жасау болуы мүмкін. Содан кейін пациенттердің нәтижелерінде айтарлықтай пайда бар-жоғын анықтау оңай болар еді.

Сурет 6. Клиникалық шешімдерде протеомдық деректерді енгізу

Қорытындылар

Зертханалық медицинадағы қазіргі тәжірибені жинақтау емдеу шешімдерінің көпшілігі қан анализі негізінде қабылданатынын және ақуызды өлшеу бүгінгі күні олардың арасында ең маңызды екенін көрсетеді. Жыл сайын миллиондаған адамдар сәтті жүргізіп жатқанына қарамастан, бұл талдаулар әрдайым дерлік жеке белоктарға қарсы бағытталған және жаңа ақуыз сынақтарын енгізу қарқыны күрт төмендеді.

MS негізіндегі протеомика мультиплексирленген және жоғары спецификалық өлшемдер үшін әлеуеті анық, оларда бір биомаркерлерден гөрі ақуыз үлгілері тиісті көрсеткіш болуы мүмкін. Әдебиеттерді шолуымыз бұрынғы күш-жігерді плазма протеомының үлкен аналитикалық қиындықтарымен тоқтатты, бұл қазір ғана қызықты технологиялық әзірлемелерге жол беріп отыр. Біз ашу және валидация процесінің барлық кезеңдеріндегі көптеген жағдайлар мен қатысушыларды талдаудың клиникалық құндылығы болуы мүмкін биомаркер панельдерін шығаруға әлеуеті бар екенін дәлелдейміз. Белгілі жағдайларда ақуыз үлгілерінің өзгерістері туралы үлкен білім базасымен біріктірілген кезде, плазмалық протеомды профильдеу стратегиясы негізінен осы дене сұйықтығының барлық ақпарат мазмұнын пайдалана алады.

Бұл көріністі шындыққа айналдыру үшін өткізу қабілеттілігін, протеомды қамту тереңдігін, беріктік пен негізгі жұмыс үрдісінің қолжетімділігін одан әрі жақсарту өте маңызды. Сонымен қатар, плазмалық протеомиканы трансляциядан кейінгі модификацияларды талдауға да кеңейтуге болады. Сол сияқты, плазма метаболомикасы да MS негізіндегі жұмыс процестерін пайдаланады және болашақта плазма протеомикасымен жүйелі түрде біріктірілуі мүмкін. Біз қажетті технологиялық әзірлемелерге уақыт өте келе қол жеткізілетініне және қол жеткізілетініне сенімдіміз. Кем дегенде, қиындықтардың көпшілігі тұжырымдамалық және «саяси» болады, өйткені протеомдық ақпарат тасқыны дәрігер мен денсаулық сақтау жүйесі үшін әрекет ететін деректерге айналуы керек. Бұл барлық қатысушы серіктестерден берілген және қажымас міндеттемені талап етеді. Әлдеқайда дәлірек және нақты диагностика туралы уәде мұндай күш-жігерді молынан марапаттайды деп сенеміз.


Нәтижелер

Өсімдіктердің өсуін талдау

Сәйкесінше көшет сатысындағы (20 DAS, S1), үзу сатысындағы (40 DAS, S2) және жетілген кезеңдегі (90 DAS, S3) сәбіз тамырлары жиналды (сурет 1A𠄼). 20 DAS кезінде сәбіз түбірі ақ түсті, ал жаңа піскен тамырдың салмағы өсінді салмағынан төмен болды (1D-сурет). Бөлу кезеңінде сәбіз тамыры бетінде қызғылт сары түс көрсете бастады және жаңа өскіннің салмағы айтарлықтай жақсарды. Бұл кезеңде жаңа тамырдың салмағы да, диаметрі де айтарлықтай өзгерістерді көрсетпеді (1Е-сурет). Кейінгі кезеңде тамыр тез өсіп, тамыр тамырының жаңа салмағы өркендікінен жоғары болды (1D-сурет). Сонымен қатар, сәбіз тамырының өсуі кезінде тамыр диаметрі айтарлықтай өсті (1Е сурет).

Сурет 1. Сәбіздің үш даму кезеңіндегі морфологиялық сипаттамасы. (A𠄼) Сәбіздің өсу жағдайы ‘Karodagosun’-да 20 DAS (A), 40 DAS (B), және 90 DAS (С). Әрбір суреттің төменгі оң жақ бұрышындағы қара жолақтар 5 см құрайды. (D) Үш даму кезеңіндегі сәбіз тамырларының жаңа салмағы. (E) Үш даму кезеңіндегі сәбіздің тамыр диаметрі. Әртүрлі кіші әріптер маңызды айырмашылықтарды көрсетеді П < 0,05.

Сәбіз тамырының дамуы кезіндегі анатомиялық өзгерістерді одан әрі зерттеу үшін Сафранин-О/жылдам жасыл бояу әр түрлі өсімдік ұлпаларының құрылымын көрсету үшін қолданылды (2-сурет). Боялған кезде қоңырланған жасуша қабырғалары қызылға айналуы мүмкін. 2А-суретте көрсетілгендей, көшеттерді отырғызу кезеңінде үлкен өлшемді шекаралық жасушалардың саны болды. Бұл кезеңде флоэма мен протоксилема кішкентай болды және лигнификация айқын болмады (2В-сурет). Бұл жасушалардың саны мен көлемінің ұлғаюымен сәбіз тамыры қалыңдай бастады. Екінші кезеңде тамырлы камбий үздіксіз бөлінеді. Ксилемада көптеген тамырлар тығыз орналасқан және жасуша қабырғасының лигнификациясы айтарлықтай жоғарылаған (2C,D суреттері). Бұдан әрі тамырдың дамуының кейінгі сатысында (2E–G-суреттер) ксилемадағы тамырлардың таралуы қатты өзгерді, олар тығыз орналасудың орнына кластерлерге тарай бастады. Сонымен қатар, осы кезеңде крахмал түйіршіктерінің көп мөлшері тез жиналды.

2-сурет. 1 кезеңдегі сәбіз тамырларының анатомиялық құрылысы (A,B), 2 кезең (C,D) және 3-кезең (E–G). BC, шекаралық жасушалар EP, эпидермис ДК, паренхималық жасуша Ph, феллоген РР, біріншілік флоэма Px, протоксилема SG, крахмал түйіршік VC, тамырлы камбий Ве, тамыр. Үлкейту бастапқы өлшемнен 200 есе (A𠄽) ал ұлғайту 400 есе (E–G).

Белоктарды анықтау және сандық анықтау

iTRAQ технологиясы іргелес кезеңдерде сәбіз тамырынан алынған ақуыздарды талдау үшін пайдаланылды. Жалпы 2845 белок анықталды. Сәбіз тамырының өсу кезеңінде барлығы 226 және 418 ДЭП сәйкесінше үзу сатысында (S2) және жетілген кезеңде (S3) анықталды (Қосымша материал S2). Сонымен қатар, екі кезеңде бір уақытта 118 DEP болды (3А-сурет).

3-сурет. Сәбіз тамырының дамуы кезінде ақуыз деңгейінің жалпы өзгерістері. (A) Венн диаграммасы әртүрлі даму кезеңдерінде жиі және бірегей түрде көрсетілген белоктар санын көрсетеді. Сопақшадағы сандар фазаға тән белоктарды, ал екі қиылысатын сопақшалардағы сандар қабаттасатын белоктарды білдіреді. (B) Қатарынан екі даму сатысы арасындағы дифференциалды түрде көрсетілген белоктар саны. (С) Дифференциалды түрде көрсетілген протеиннің орташа және макс/мин өзгерістері 2-қабатты екі даму кезеңінің арасындағы өзгеріс.

3B суретінде сәбіз тамырының өсуі кезінде жоғары және төмен реттелетін ақуыздардың саны көрсетілген. Әрбір фазада жоғары және төмен реттелетін белоктардың саны ұқсас болды. Дегенмен, жетілген кезеңдегі DEP саны үзіліс сатысындағыдан екі есе дерлік болды. Сонымен қатар, DEP орташа және ең төменгі/максималды мәні 3C суретте көрсетілген. Жетілу кезеңінде DEP амплитудасының өзгеруі салыстырмалы түрде айқынырақ болды.

Метаболикалық процеске тән белоктардың жіктелуі

GO деректер базасына сүйене отырып, біз екі дәйекті даму кезеңдері арасындағы барлық DEP-тің функционалдық аннотациясын жүргіздік. Үш санаттағы 20 үздік GO термині ‘биологиялық процесс, ’ ‘жасуша компоненттері,’ және ‘молекулярлық функциялар’ олардың көрсеткіштеріне сәйкес. П-мәндер S1 Қосымша суретте, S1 Қосымша материалда көрсетілген. DEP-тердің көпшілігі екі жиынтықта (S2/S1, S3/S2) «ұялы компоненттер» тобында байытылған. Сонымен қатар, бұл топтағы GO терминдерінің басым көпшілігі өте тығыз болды. Мысал ретінде, ‘ядро’ және ‘nucleolus’ S2/S1 (тиісінше 63 және 55 DEP) және S3/S2 (тиісінше 91 және 79 DEPs) ішінде ең көп ұсынылған GO терминдері болды. Дәл осындай құбылыс ‘молекулалық функция’. ‘биологиялық процесс үшін’ екі жиынтықтың GO шарттары арасында кейбір айырмашылықтар болды. Су тапшылығына ‘жауап’’ және ‘нуклеосома жинағы’ сәйкесінше S2/S1 (19 DEP) және S3/S2 (28 ДЭП) ең көп DEP-ті қамтыды.

Биологиялық жолдар KEGG деректер базасын пайдалану арқылы да талданған (4-сурет). Екі жиынтықта барлығы он екі жол сәйкес болды. Олардың, & # x2018genetic ақпаратты өңдеу, және # x2019 & # x2018cellular процесінің, & # x2019 & # x2018energy метаболизм, & # x2019 және & # арасында x2018organismal жүйелер & # x2019, 37,4 (S2 / S1 барлық жолдарының ең ірі пропорцияларын өтті 22,3, 9,7 және 7,6% сәйкесінше) және S3/S2 (тиісінше 31,6, 17,9, 10,4 және 10,2%). S3/S2-де ‘липидтер алмасу’, ‘терпеноидтар мен поликетидтер метаболизмі’ және ‘гликан биосинтезі мен метаболизмі’ жолдары арнайы табылған.

4-сурет. Дамудың әртүрлі кезеңдерінде сәбіз тамырынан анықталған DEP-тің KEGG классификациясы. (A) S1 және S2 арасында анықталған DEP-тің KEGG классификациясы. (B) S2 және S3 арасында анықталған DEP-тің KEGG классификациясы.

Сәбіз тамырының дамуы кезінде белоктардың функционалдық кластерлерінің профильдері

Сәбіз ұлпасының протеомы етті тамырдың өсуі мен дамуын анықтайды. Сәбіз тамырының дамуы кезінде әртүрлі ақуыздардың әртүрлі экспрессия деңгейлері әртүрлі фазалардағы ерекше функция мен маңыздылықты көрсетеді. 5-суретте көрсетілгендей, кейбір DEP-тер болжамды биологиялық функцияларына сәйкес топтастырылған. Сәбіз тамырының дамуы кезінде бірнеше патогенге байланысты (5В-сурет), стресске байланысты (5C-сурет), ақуыздың ыдырауына байланысты (5K-сурет) және сигналдық ақуыздардың (5L-сурет) экспрессия деңгейлері жақсара берді. Органикалық қышқыл алмасуына қатысатын ақуыздарға келетін болсақ (5D-сурет), бұл DEP-тердің көпшілігі S2-де төмендетілді. Керісінше, өрнек деңгейлері жетілу кезінде өскенін көрсетті. Нәтижелер ұзарту факторларының (5G-сурет), антиоксиданттық ферменттердің (5Н-сурет), фотосинтез және энергиямен байланысты ақуыздардың (5N-сурет) және тасымалдау ақуыздарының (5O-сурет) экспрессиясының төмендеуін көрсетті. Тұтастай алғанда, бірдей функциясы бар әртүрлі ақуыздар әртүрлі тенденцияларды білдірді.

5-сурет. Әр түрлі даму кезеңдеріндегі белок экспрессиясының иерархиялық кластерлік талдауы. Жылу карталары белоктардың салыстырмалы көптігі log2 арқылы жасалды. Әрбір ақуыз үшін қосылу нөмірі және ақуыз сипаттамасы көрсетілді. Белоктар метаболизм жолдарындағы рөліне қарай топтастырылды. (A–O) Ақуыздың әртүрлі қызметтерін көрсетеді.

Сәбіздегі экспансин белоктарын анықтау

Протеин аннотациясына сүйене отырып, әртүрлі даму кезеңдерінде сәбіз тамырларының протеомика деректерінен екі экспансин протеині алынды. Ақпарат, соның ішінде pI, ақуыз Mw және т.б. 1-кестеде келтірілген. Осы екі экспансин белоктарының экспрессия деңгейлері ұқсас болды, олар алдымен көтерілді, содан кейін төмендеді.

1-кесте. Аннотация және анықталған экспансин белоктарының экспрессиясы.

Осы екі экспансин белоктарының гендерін анықтау үшін протеин тізбегіне сәйкес клондау праймерлері құрастырылды. Екі DcEXP гендер, DcEXP20 және DcEXP22 RT-PCR арқылы клондалған және олардың ашық оқу шеңберлері (ORF) сәйкесінше 261 және 262 аминқышқылдарын кодтайтын 786 bp және 789 bp болды (Қосымша сурет S2, Қосымша материал S1).

Экспансиндердің маңыздылығын мұқият зерттеу үшін біз сәбіз геномындағы әртүрлі экспансин гендерін тексердік. Сәбіз геномының жарылыс нәтижесі бойынша барлығы 30 сәбіз экспансин гені анықталды. Бұл экспансин гендер деп аталды DcEXP1-DcEXP30 алдыңғы номенклатура аясында (Kende et al., 2004). Екі дифференциалды экспансин белоктарына сәйкес гендер ретінде аннотацияланды DcEXP20 (Қосымша №: g13058) және DcEXP22 (Қосымша №: g63815), тиісінше. Сәбіз экспансиндері арасындағы эволюциялық қатынасты зерттеу үшін көршілес біріктіру (NJ) әдісі барлық тізбектерге негізделген филогенетикалық ағашты құру үшін пайдаланылды. Арабидопсис және сәбіз экспансин белоктары (6-сурет және S3 қосымша суреті, S1 қосымша материалы). Барлық DcEXP төрт ішкі топқа біріктірілген: EXPA, EXPB, EXLA және EXLB. EXPA қосалқы отбасында 24 сәбіз экспансинінен тұратын ең үлкен өлшем болды. Дегенмен, EXLA және EXLB қосалқы отбасыларының сәйкесінше бір ғана мүшесі болды. Сонымен қатар, екеуі де EXPB отбасына жататын дифференциалды экспансин белоктарын анықтады. Сәбіздегі 30 экспансиннің ұзындығы 206 аминқышқылынан тұрады. Физико-химиялық қасиетке талдау нәтижелері Мв 22,4�,2 кДа диапазонында болғанын көрсетті. Олардың pI 5,3-тен 10,2-ге дейін ауытқиды (Қосымша кесте S2, Қосымша материал S1). Экспансиндердің көпшілігінде EXLB қосалқы отбасы алынып тасталды pI 7,0-ден жоғары мәндер.

6-сурет. Сәбіз экспансин гендерінің филогенетикалық ағаш және мотив композициялары.

Сәбіздегі экспансин аминқышқылдарының тізбегінің құрылымдық талдауы

Сәбіздегі 30 экспансиннің аминқышқылдарының тізбегі теңестірілді (қосымша S4 суреті, S1 қосымша материалы). Бір топшаға жататын белоктардың аминқышқылдарының тізбегі әлдеқайда жоғары ұқсастыққа ие болды. Екеуі де EXPB ішкі отбасына жататын DcEXP20 және DcEXP22 арасындағы теңестірілген сәйкестік 74,6% болды. Экспансин белоктарының көпшілігінде 16 аминқышқылынан тұратын сигналдық пептид болды. Дегенмен, DcEXP26, DcEXP29, DcEXP16 және DcEXP19 төрт ақуызында сигналдық пептид жоқ (Қосымша кесте S2, Қосымша материал S1). Сигнал пептидінен кейін бірнеше сақталған аминқышқылдарының қалдықтары анықталды. EXPA және EXPB ішкі отбасыларында барлық экспансиндерде HFD мотиві болды, DcEXP11 және DcEXP10 қоспағанда, оның орнына HFV және QFD мотиві бар. Әдетте, сегіз сақталған цистеин (Cys) қалдығы DcEXPA және DcEXPB екеуінде де, DcEXLA мен DcEXLB алты арасында да анықталды. Сонымен қатар, 11, 21 және 14 глицин (Gly) да сәйкесінше сақталды (қосымша S4 суреті, S1 қосымша материалы).

Ақуыздардағы мотивтер және олардың егжей-тегжейлі мотив тізбегі схемалық түрде 6-суретте көрсетілген. EXPA қосалқы отбасындағы он ақуыз барлық он мотив құрамдастарын бөлісті, ал басқаларында бір немесе екі мотив жоқ. Қалған үш топшадағы мотивтер EXPA-дағыдан айтарлықтай ерекшеленді. EXPB қосалқы жанұясының мүшелері DcEXP19-дан басқа мотив 4𠄷 болды. Дегенмен, EXLA және EXLB қосалқы тобының сәйкесінше тек бір немесе екі мотиві бар. Жалпы, 4 мотив барлық экспансиндерде болды.

Сәбіз тамырының өсуі кезіндегі экспансин гендерін транскриптом негізінде анықтау

Біздің зертханада алдын ала зерттеуден алынған транскриптомдық деректердің көмегімен (Wang және басқалар, 2015a) біз сәбіз тамырының өсуі кезінде экспансин гендерінің транскрипт деңгейлерін зерттедік. Транскриптом деректері арқылы барлығы 26 экспансин гені тексерілді. Біз олардың өрнек профильдерін көрсету үшін миллионға килобаза (RPKM) мәндері негізінде жылу картасын сыздық (7-сурет). Экспансин гендерінің жартысына жуығы екінші кезеңде ең жоғары экспрессияға ие болды. Алайда, біз бар екенін таппадық DcEXP17 және DcEXP24 S2 ішінде. Қайта, DcEXP25 S1 және S3 орнына тек S2-де болған.

7-сурет. Сәбіз экспансин гендерінің экспрессиялық профильдері.

Сәбіз тамырының дамуы кезіндегі экспансин гендерінің экспрессиялық профильді талдауы

Сәбіз тамырының дамуын реттейтін молекулалық механизмді зерттеу үшін он түрлі экспансин гендері, соның ішінде DcEXP20 және DcEXP22 өрнекті талдау үшін әрбір экспансин қосалқы отбасынан кездейсоқ таңдалды (8-сурет). Әрбір геннің салыстырмалы экспрессия деңгейі өрнек негізінде есептелді DcEXP24 ең төменгі өрнек деңгейіне ие S1. Басқа жағдайларды қоспағанда DcEXP9, барлық экспансин гендері S2-де ең жоғары экспрессия деңгейлерін көрсетті. Осы гендердің ішінде экспрессия деңгейі DcEXP29 S2-де S1-дегіден 30 есе көп болды. Жетілу кезеңінде экспансин гендерінің экспрессиялық профильдері әдетте төмендеді, кейбіреулері бірінші кезеңнен де төмен болды. Әртүрлі экспансин гендер арасындағы салыстыру нәтижелері мұны көрсетті DcEXP20, DcEXP30, DcEXP13, және DcEXP22 жоғары өрнек деңгейлерін көрсетті. iTRAQ нәтижелерімен салыстырғанда, екі дифференциалды экспансиндер, DcEXP20 және DcEXP22, mRNA экспрессиясының тенденциялары мен ақуыздың көптігі арасындағы тұрақты қатынасты көрсетті. өрнек деңгейі арасындағы корреляция коэффициенті DcEXP20, DcEXP22 және басқа экспансин гендері Пирсон талдауы арқылы талданды (2-кесте). өрнек профильдері DcEXP20 және DcEXP22 сәйкесінше сегіз және алты экспансин гендерімен оң корреляцияға ие болды.

8-сурет. 10 сәбіз экспансин генінің салыстырмалы экспрессиялық деңгейлері. Әртүрлі кіші әріптер маңызды айырмашылықтарды көрсетеді П < 0,05.

2-кесте. өрнек деңгейлері арасындағы корреляция DcEXP20, DcEXP22, және басқа экспансин гендер.


Протеинді қалай анықтауға болады?

Сандық LC-MS үшін қолжетімді әдістер негізінен екі санатқа бөлінеді: (i) салыстырмалы сандық анықтау және (ii) синтетикалық тұрақты изотоппен таңбаланған стандартқа дейін калибрлеу арқылы пептидтердің көптігін анықтау (1-сурет). Қазіргі уақытта ғылыми қоғамдастықтың көпшілігі зерттеу сұрақтарына бұрынғы тәсілді қолданады. Дегенмен, соңғысы, әсіресе клиникалық қолданбаларда барған сайын маңызды рөл атқара бастады.

LC-MS арқылы ашуға негізделген салыстырмалы сандық анықтау зерттеушілерге бірнеше үлгілердегі ақуыз көптігінің өзгерістерін бір уақытта анықтауға мүмкіндік берді. Бернхард Кустер айтқандай, «LC-MS өте күшті, өйткені ол көптеген ақуыздарды параллельді түрде және білудің қажеті жоқ санай алады. априори қандай белоктарды талдауға болады ». Күрделі биологиялық жүйе контекстінде жеке белоктың функциясын және ақуыздың басқалармен қарым-қатынасын нақты түсіну үшін бастапқы немесе стандартты жүйеге қатысты ақуыз көптігінің өзгеруін өлшеу керек. Атауынан көрініп тұрғандай, салыстырмалы сандық анықтау белгілі бір жағдайға қарсы белоктар мөлшерін салыстыруды қамтиды, яғни, В, С, D күйінде қанша пептид (және экстраполяция бойынша ақуыз) бар т.б. А. Кустер күйдегі сол пептидтің санымен салыстырғанда, «LC-MS антиденелері жоқ немесе сапасыз белоктар үшін сандық талдаулар жасалуы мүмкін деген мағынада да күшті» деп атап көрсетеді.

Кеңірек айтқанда, LC-MS арқылы ақуыздардың салыстырмалы мөлшерін анықтаудың негізінен екі тәсілі бар. Олар: (i) таңбаланған және (ii) жапсырмасыз. Бұрынғы категория протеомдағы пептидтерді/белоктарды таңбалаудың екі құралына бөлінеді. Атап айтқанда, бастапқыда 1999 жылы пайда болған метаболикалық таңбалау арқылы 3 және кейінірек SILAC түрінде зерттеу қауымдастығы кеңірек қабылдаған (сүстел менсотоп lшыдамдылық ақұрамындағы миноқышқылдар вбарлық мәдениет) 4 . Ақуыздарды химиялық деривация арқылы да өзгертуге болады және мұндай тәсілдер қамтылды менсотоп -вода ажақындық тags (ICAT) 5 , 18 O таңбалау 6 , диметил таңбалау 7 , және изобарлық массалық тегтер, яғни, тandem масс тag (TMT) және менсобарикалық тag for rтаңдаулы және аабсолютті quantitation (iTRAQ) 8,9 .

SILAC көмегімен биологиялық үлгілер таңбаланады in vitro мақсатты амин қышқылының ауыр изотоптық нұсқасымен. Ақуыз синтезі кезінде табиғи түрде кездесетін амин қышқылы ауырырақ таңбаланған нұсқамен ауыстырылады. Әртүрлі эксперименттік жағдайларға (жеңіл, орташа немесе ауыр орталарда өсірілген) әсер еткен жасушаларды араластыруға және біріктірілген үлгіде барлық өңдеу қадамдарын орындауға болады (1-сурет, метаболикалық таңбалау). Бұл стратегия үлгіні дайындау кезінде орын алуы мүмкін кез келген өзгермелілікті айтарлықтай азайтады және дәлірек мөлшерлеудің айрықша артықшылығына ие. бірге мысалы, TMT реагенттері 8 , жоғары өнімді мультиплексирленген протеин мөлшерін анықтауға қол жеткізуге болады. LC-MS және протеомдық деректер бағдарламалық құралымен біріктірілген кезде, қазіргі уақытта жасушалардан, ұлпалардан немесе биологиялық сұйықтықтардан алынған 16-ға дейін әртүрлі үлгілерді бір уақытта талдауға, пептидтерді/белоктарды анықтауға және пептидтердің/белоктардың салыстырмалы мөлшерін есептеуге болады (1-сурет) , химиялық таңбалау).

LC-MS арқылы жапсырмасыз мөлшерлеу танымалдылықтың жақында қайта жанданғанын байқады. Қауымдастықтың бұл жаңарған қызығушылығы, ең алдымен, ағымдағы масс-спектрометрлердің массалық ажыратымдылығының жақсаруы, жаңа HPLC жүйелерімен сақтау уақытының тұрақтылығының жақсаруы және көптеген хроматографиялық іздерді туралап қана қоймай, сонымен қатар іздерден көптеген мүмкіндіктерді шығара алатын жақсартылған деректерді талдау алгоритмдерінің салдары ретінде дамыды. . Сонымен қатар, деректерге тәуелсіз жинақтау (DIA) сонымен қатар бүкіл протеом бойынша терең, таңбасыз салыстырмалы ақуыз мөлшерін анықтаудың қуатты тәсілі ретінде пайда болды. Тұтастай алғанда, жапсырмасыз сандық тәсіл SILAC және TMT екеуіне де өте үнемді балама болып табылады және изотоптық белгілерді қолданбай-ақ көптеген үлгілердегі ақуыз көптігінің өзгерістерін салыстырудың басты артықшылығы бар. Үлгілерді LC-MS арқылы жеке талдайды, бұл жүздеген және тіпті мыңдаған пациент үлгілерінен тұратын когорттарды талдауда өте тиімді.Күрделі бағдарламалық қамтамасыз ету алгоритмдерімен бүкіл LC уақыт шкаласы бойынша бірегей пептидтік иондарға сәйкес келетін сигналдарды біріктіру енді әлдеқайда оңай. Деректерді LC-MS алғаннан кейін, жеке талдауларды салыстыруға және барлық үлгілерге ортақ хроматографиялық белгілерді туралауға болады (1-сурет, жапсырмасыз). Белгісіз LC-MS арқылы протеомды сандық анықтаудың негізгі артықшылықтары үлгілердің шексіз санын салыстыру мүмкіндігі және қымбат таңбалау стратегияларының ескіруі болып табылады. Дегенмен, негізгі кемшілігі LC-MS алу уақытының ұлғаюы болып табылады (әрбір үлгі ретімен орындалатындықтан). Дегенмен, мыңдаған клиникалық үлгілерді талдауға қажетті уақытты азайту үшін өте жылдам және қысқа LC градиенттерін қамтамасыз ете алатын жаңа жүйелер нарықта пайда болуда.

Тұрақты изотопты синтезделген пептидтерді LC-MS арқылы белоктарды сандық анықтаудың ішкі стандарттары ретінде пайдалану тұжырымдамасын алғаш рет Desiderio және Kai 10 енгізді (1-сурет, стандартты стандарттар). Бұл табиғи түрде кездесетін пептидтер сияқты аминқышқылдарының реттілігі бірдей синтетикалық триптикалық пептидтер. Алайда синтезделген пептидтердің құрамында молекулалық массаның шамалы өсуіне (6-10 Да) әкелетін кем дегенде бір тұрақты изотоппен белгіленген амин қышқылы бар. Синтетикалық пептид эквивалентінің «белгілі» саны протеомдық дайджестке енгізіледі және бүкіл үлгі LC-MS арқылы талданады. Нәтижелі пептид пен тік пептид стандарты хроматографиялық жолмен бірге элюцияланады және масс-спектрометрде иондалады. The м/з дегенмен екі пептидті оңай ажыратуға болады. Алынған иондық хроматограммалардан және екі пептид үшін де қисық астындағы ауданды есептеуден, нативті пептидтің мөлшерін ең жоғары арақатынастарды салыстыру арқылы есептеуге болады. Жалпы қабылданған ұсыныс бір ақуызға кемінде үш триптикалық пептидті синтездеу болып табылады. Егер эксперимент үшін бірнеше ақуыздың мөлшерін анықтау қажет болса, баға тез арада көтеріледі. Сонымен қатар, пептидтік стандарттарды жоғарылату өте қарапайым тәсіл болса да, ақуыз деңгейін көрсету үшін пептидтердің көптігін калибрлеу қиын болып қала береді 11 . Осы қиындықтарды шешу үшін балама калибрлеу әдістері ұсынылды және мыналарды қамтиды: мысалы, бір нүктелік жалпы анықтамалық пулды пайдалану 12,13 .


3. КЕЗДЕСТІ ЕМЕС ЖОҚ ЖОҚ

Луо және т.б. [17] ANOVA үлгілерінің шектеулерін iTRAQ деректер жинақтарында кездейсоқ емес жоғалтуларды қамтитын Байес құрылымы арқылы еңсереді. Олардың моделі өлшенген пептид интенсивтілігіне белок экспрессия деңгейлері де, пептидтерге тән әсерлер де әсер етеді деп болжайды. Бірнеше эксперименттегі осы екі әсердің мәндері кездейсоқ әсерлер ретінде модельденеді. Үлгі бір тәжірибеде бірнеше тегтермен белгіленген кезде, әртүрлі изобарлық тегтердегі вариациялар да кездейсоқ әсерлер ретінде модельденеді. Пептидтік деректердің кездейсоқ жетіспеуі пептидтің жетіспеу ықтималдығын осы пептидті шығаратын ақуыздың экспрессиялық деңгейімен байланыстыратын логистикалық регрессиямен модельденеді. Осы үлгіге арналған Марков тізбегі Монте-Карло әдісі әртүрлі үлгілер бойынша салыстырмалы өрнек деңгейлерін шығару үшін әзірленді.

3.1 Үлгі

Біз көптеген тәжірибелерден алынған iTRAQ деректерінің үлгісін сипаттауға және ақуыздардың салыстырмалы экспрессиялық деңгейлерін бағалауға назар аударамыз. iTRAQ деректері бірнеше эксперименттерден алынған кезде [17] Байес иерархиялық үлгісін модельде бақыланатын пептидтердің қарқындылығын кездейсоқ әсерлер ретінде модельдейтін бақылау компоненті бар деген мағынада пайдаланады, олардың шартты таралуы күтілетін протеин экспрессиясының деңгейлеріне және пептидтік әсерлерге байланысты. , және осы күтілетін мәндердің үлестірімдерін анықтайтын екінші (иерархиялық) құрамдас.

Luo және т.б. [17], таңбалау әсерлері квантильді қалыпқа келтіру сияқты қалыпқа келтіру әдістерімен жойылады деп болжанады. Бар деп есептейік С (𢙒) зерттелген биологиялық үлгілер Қ (𢙒) эксперименттер. Бірнеше изобарлық тегтер бір тәжірибеде бірдей үлгіні белгілей алатындықтан, рұқсат етіңіз Лс ≥ 1 белгілейтін тегтер санын білдіреді с- ші үлгі. Содан кейін ∑с Лс = М - бір тәжірибеде қолданылатын изобарлық тегтердің саны, ол 4-плексті изобарлық реагенттерді пайдаланған кезде 4-ке және 8-плексті нұсқада 8-ге тең. Бар деп есептейік I үлгідегі белоктар және Джмен үшін пептидтер менбелок. үшін lбелгісі сші үлгі кэксперимент, рұқсат етіңіз жкижслн үшін өлшенген бақыланатын қарқындылықтың журнал түрлендірілген мәнін белгілеңіз jші пептид мен-дан алынған ақуыз nші спектр. Ескертіп қой j деп неғұрлым орынды белгілеу керек j(мен) пептидтердің белоктардың ішінде орналасқанын анық көрсету үшін және l деп белгілеу керек l(с) көрсету үшін lтаңбаланған тегі сші үлгі. Белгілеуді жеңілдету үшін жақшаларды алып тастаймыз. Пептидтің өлшенген қарқындылығы ақуыздың экспрессия деңгейіне және пептидтік әсерге байланысты. Болсын xкисл журналының түрлендірілген өрнек деңгейін белгілеңіз менақуызы сүлгісімен бірге lішіндегі таңбалау тегі кші эксперимент. Болсын zкиж үшін лог түрленетін пептидтік әсерді белгілеңіз jші пептид менқұрамындағы белок кші эксперимент. Луо және т.б. [17] үшін аддитивтік модель қарастырылды жкижслн (к = 1, …, Қ мен = 1, …, I j = 1, …, Джмен с = 1, …, С l = 1, …, Лс n = 1, …, Нкижсл):

бастапқы шкаладағы мультипликативті модельге сәйкес келеді. (3), εкижслн орташа 0 және дисперсиямен тәуелсіз қалыпты үлестіріледі деп есептеледі

3.1.1 Деректер механизмінің жоқтығы

[17]-дағы пептидтердің жетіспеушілігінің статистикалық моделі босанғаннан кейінгі жүрек-қан тамырлары қызметі үшін кавеолалардың рөлдерін зерттеу нәтижесінде алынған деректер жиынтығын зерттеуге негізделген. Бұл зерттеуде үш эксперимент жүргізілді, онда екі жабайы типтегі тышқандар мен екі нокаут Cav-1 тышқандарының ақуыз профильдері iTRAQ арқылы әр экспериментте төрт изобарлық тегпен талданды. Луо және т.б. [17] бір тәжірибеде байқалған, бірақ басқа тәжірибеде жоқ пептидтердің үлесін зерттеп, жетіспейтін ықтималдық пен пептидтің қарқындылығы арасында теріс корреляция бар екенін анықтады. Басқаша айтқанда, аз мөлшерде пептидтердің болмауы ықтималдығы жоғары, өйткені талдау процесінің деректерге байланысты алынуына байланысты оларды анықтау қиынырақ. Пептидтің жоғалу ықтималдығы мен логит шкаласында байқалатын қарқындылық арасында шамамен сызықтық байланыс бар екенін байқап, Луо және т.б. [17] қарапайым логистикалық регрессия үлгісі арқылы жетіспейтін ықтималдықты модельдеді:

қайда Iкижслн = 1 екенін көрсетеді jші пептид менth белокпен өлшенеді кші эксперимент, lші көшірмесі сші үлгі және nші спектр. Формула (4) пептидтердің жоғалу ықтималдығының логиті оның қарқындылығына сызықтық тәуелді екенін білдіреді. Бұл күтілуде б > 0, өйткені интенсивтілігі төмен пептидтердің болмауы ықтимал.

3.1.2 Алдыңғылар

Байес иерархиялық құрылымы [17] эксперименттер мен үлгілер арасындағы өзгермеліліктерді ескереді және xкисл және zкиж әртүрлі эксперименттер бойынша тәуелсіз қалыпты түрде бөлінеді, яғни:

қайда xарал және zij сәйкесінше бірнеше эксперименттер бойынша орташа алынған ақуыз және пептидтік әсерлерді белгілеңіз. Бір үлгінің әртүрлі көшірмелеріндегі (әртүрлі тегтермен белгіленген) ақуыз экспрессия деңгейлері де қалыпты түрде таралған деп есептеледі:

қайда xболып табылады өрнек деңгейін білдіреді менқұрамындағы белок сші үлгі. (5)–(7) жорамалдары (3) эквивалентті түріне әкеледі:

N ( 0 , σ x 2 ) және e k i j z

N ( 0 , σ z 2 ) эксперименттер арасындағы кездейсоқ әсерлерді білдіреді және e i s l t

N ( 0 , σ δ 2 ) бір үлгінің бірнеше көшірмелері арасындағы вариацияны білдіреді. Үлгі экспериментте бірегей изобарлық тегпен белгіленсе, үлгіде қайталанатын вариация құрамдас бөлігі болмайды. Формула (8) аралас әсерлі модель болып табылады. Үлгінің сәйкестендірілуін қамтамасыз ету үшін шектеу xмен1 = 0 қосылады. Содан кейін xболып табылады өрнек деңгейін білдіреді менқұрамындағы белок сбірінші үлгіге қатысты үлгі.

Приориттердің екінші деңгейі қалыпты таралулар болып табылады xболып табылады және zij:

Иерархиялық модель дисперсияның гиперпараметрлері үшін априорлар ретінде кері гамма үлестірімдерін қабылдау арқылы аяқталады: σ x − 2

Гамма (γ 7, γ 8), мұндағы γ1 және γ2 тиісінше гамма таралудың пішіні мен масштабының параметрлерін белгілеу және қабылдау а

Н(0, ν 2 ). Сәйкес параметрлердің артқы таралулары MCMC модельдеулері арқылы имитацияланады және дифференциалды түрде экспрессияланған белоктар кейінгі таралуын талдау арқылы анықталады. xболып табылады.

3.2 ANOVA талдауымен салыстыру

[17]-дағы осы Байес үлгісі мен Хилл және т.б. ұсынған ANOVA моделінің арасындағы ең маңызды айырмашылық. [7] және Oberg және т.б. [19] бұл [17] iTRAQ деректеріндегі ескерілмейтін жетіспеушіліктерді анық үлгілеген. Оберг және т.б. [19] өз мақаласының соңында үлгіге сәйкес келу үшін цензура механизмін пайдалану келесі табиғи қадам болатынын атап өтті. Белгісіз шекті мәндегі деректерді цензуралаудың орнына [17] пептидтердің төмен қарқындылығы үшін пептидтердің болмауының жоғары ықтималдығын модельдеді. Бұл екі әдіс модельге енгізілген вариациялар тұрғысынан да ерекшеленеді. Эксперименттік әсер және репликативті әсер (бірнеше тегтер үлгіні белгілегенде) ANOVA үлгісіндегі барлық ақуыздар үшін тұрақты мәндер болып саналады. Керісінше, [17] оларды пептидтерге және (немесе) ақуыздарға тән кездейсоқ әсерлер ретінде модельдеді. Сонымен қатар, ANOVA талдауы таңбалау әсері және таңбалау мен эксперименттік әсер арасындағы өзара әрекеттесу сияқты қосымша әсерлерді қамтиды. gj(мен),с, [17] үлгіде жасалмаған. Таңбалау әсерін қосу эксперимент дизайнымен анықталады. Бірнеше эксперименттерде бірдей үлгілерді белгілеу үшін бірдей тегтер пайдаланылған кезде, таңбалау әсері анықталмайды, себебі ол сынама алу әсерімен шатастырылады. Бірнеше эксперименттерде бірдей үлгілерді белгілеу үшін әртүрлі тегтер пайдаланылған кезде ғана таңбалау әсерін қосу маңызды. Таңбалау мен эксперименттік әсер арасындағы өзара әрекеттесу үшін gj(мен),с, оны модельде алу теориялық тұрғыдан орынды болса да, бағалауда үлкен белгісіздік бар. gj(мен),с әрбір үлгі үшін қайталанулар санының аздығына (немесе қайталанбауына) байланысты.

Байес әдісінде де, ANOVA талдауында да жалпы болжам - пептидтерге негізделген бақылаулардың барлығы бұзылмаған ақуыздарды дәл көрсетеді. Біз бірдей және біркелкі емес пептидтерді бөлісетін екі немесе одан да көп ақуызды тудыратын гомологиялық гендердің мүмкіндігін, сондай-ақ транскрипциядан кейінгі модификациялар мүмкіндігін елемейміз. (1) пептидтік әсерлер мен емдеу арасындағы өзара әрекеттесуді қамтиды (gj(мен),с), ол [19] талдауында жойылады. Бұл термин де [17] құрамына кірмейді. Сонымен, [17] және [19] екеуі де белгілі бір белоктар әртүрлі өңдеулер кезінде үлгілер бойынша дифференциалды өрнектерге ие болады, бірақ ақуыз экспрессиясының кез келген өзгерісі осы ақуыздың барлық пептидтеріне бірдей әсер етеді деп болжайды.

3.3 Масс-спектрометрия деректеріндегі кездейсоқ емес жетіспеушілік

Масс-спектрометриялық деректерге бағытталған, осы бөлімде сипатталған модель (Wang және т.б. [31] ұсынған) iTRAQ деректеріне арналмаған. Бірақ iTRAQ деректері оқшауланған пептидтерді MS/MS арқылы іске қосу арқылы алынғандықтан, бұл ықтималдық моделі iTRAQ ішіндегі жетіспеушілікті зерттеудің баламалы әдісін ұсынады. Ванг және т.б. [31] алдымен жаһандық қалыпқа келтіру арқылы MS профильдері арасындағы жүйелік вариация көздерін жоюды, содан кейін қарқындылыққа тәуелді жетіспеушіліктерді зерттеуді және өткізіп алынған пептидтердің интенсивтілігін есептеуді ұсынды.

3.3.1 Жаһандық қалыпқа келтіру

Жаһандық нормалауда [31] үлгі қарқындылығының барлығы таңдалатын тұрақты фактормен байланысты деп есептеді. Масс-спектрометрия деректеріндегі кездейсоқ болмауына байланысты ықтимал ауытқуларды болдырмау үшін Ванг және т.б. жоғарғы жағын пайдалануды ұсынды Л масштабтау үшін әрбір үлгідегі пептид қарқындылығының реттелген статистикасы (мысалы, медианалар), мұнда Л пайдаланушы белгілеген параметр болып табылады. Болсын Қ (Қ > 2) MS профильдерінің саны болуы керек. -ның байқалған қарқындылығын белгілеңіз к-ші профиль ретінде Y ( k ) = ( y 1 ( k ) , y 2 ( k ) , … , y n k ( k ) ), мұндағы nк ішінде анықталған пептидтер саны к-ші профиль. Берілген сан үшін Л ( L < min ( < n k >k = 1 K ) ), популяциялық медиана келесідей анықталады

және нормалау үшін масштабтау коэффициенті к--ші профиль

3.3.2 Кездейсоқ емес жетіспеушілік және импутация

Кездейсоқ емес жоғалтуды есепке алу үшін Ванг және т.б. [31] бір үлгідегі өткізіп алынған пептид қарқындылығын басқа үлгідегі байқалған қарқындылықтың қатынасы екі үлгіде де байқалған басқа пептидтердің қарқындылығынан есептелген шкала коэффициентіне бөлуді ұсынды. Құралдың ең аз анықталатын деңгейі делік г. x j ( k ) -ның шын көптігі болсын j- ші пептид кy j ( k ) байқалатын мәнге сәйкес келетін -ші профиль. Профильде пептид болуы немесе болмауы мүмкін. z j ( k ) бар екенін көрсететін жасырын айнымалы болсын j- ші пептид к-ші профиль, z j ( k ) = 1 болса j- ші пептид құрамында болады к-ші профиль, ал әйтпесе z j ( k ) = 0. Сонда x j ( k ) = 0, егер z j ( k ) = 0 . z i ( k ) = 1 болғанда f j ( k ) x i ( k ) тығыздық функциясы болсын, бізде

I 0 (·) P (z j (k) = 0) + f j (k) (·) P (z j (k) = 1),

қайда I0(·) нөлдегі нүктелік массаны көрсетеді. (12), Ван және т.б. [31] пептидтің шынайы көптігі қоспаның таралуына ие деп есептеді. P ( z j ( k ) = 0 ) ықтималдығымен пептид құрамында жоқ. к-ші профиль, ал молдығы нөлге тең. P ( z j ( k ) = 1 ) ықтималдығымен пептид бар және молшылықтың таралуы f j ( k ) арқылы сипатталады.

Қарқындылық деңгейінің жіберіп алған мәні j- ші пептид құрамында болады к-ші профиль күтілетін мәнмен есептеледі E ( x j ( k ) | y j ( k ) = 0 ), ол келесідей есептеледі

мұндағы бірінші теңдік E ( x j ( k ) | y j ( k ) = 0 , z j ( k ) = 0 ) = 0 болуына байланысты, ал екінші теңдік мынаған байланысты болады: j- ші пептид құрамында болады к-ші профиль ( z j ( k ) = 1 ), сигналды анықтау жоқ ( y j ( k ) = 0 ) төмен қарқындылыққа ( x j ( k ) < d) баламалы. (13) ішіндегі E ( x j ( k ) | x j ( k ) < d , z j ( k ) = 1 ) терминін f j ( k ) және болғанда анықтауға болады. г көрсетілген және P d ( z j ( k ) = 1 | y j ( k ) = 0 ) , ықтималдығы j- ші пептид құрамында болады кСигнал анықталмаған кезде -ші профиль ретінде есептеуге болады

мұнда үшінші теңдік орындалады, себебі P d ( yj ( k ) = 0 | zj ( k ) = 1 ) = P d ( xj ( k ) < d | zj ( k ) = 1 ) және P d ( yj ( k ) ) = 0 | zj ( k ) = 0 ) = 1 . (14) тармағындағы P d ( x j ( k ) < d | z j ( k ) = 1 ) терминін соңғы көрсетілген кезде f j ( k ) тығыздық функциясынан алуға болады, және

Сондықтан шартты тығыздық f j ( k ) болғанда және г көрсетілген болса, өткізіп алған пептидтің қарқындылығын (13)–(15) арқылы есептеуге болады.

Ең төменгі аспаптың анықталатын деңгей параметрі г бір құралдан алынған барлық MS шикі профильдеріндегі фондық шу деңгейімен бағаланады, келесідей белгіленеді d ̂ . Содан кейін анықталатын деңгейі к--ші профиль d ̃ (к) = d ̂ /λ (к), мұндағы λ (к) (11) нормалау шкаласының коэффициенті болып табылады. Ванг және т.б. [31] деп болжаңыз

үшін тәуелсіз к = 1, 2, …, Қ. Бұл z j ( k ) = 1 , f j ( k ) болған кезде x j ( k ) тығыздық функциясы деген болжамға баламалы. Н(λ (к) μj, (λ (к) σj) 2). Ерекше жағдайда бұл σj ≪ | d ̃ (к) − μj| және биологиялық репликациялар қол жетімді, Ванг және т.б. [31] төменде келтірілген P d ( z j ( k ) = 1 | y j ( k ) = 0 ) және есептелген E ( X j ( k ) | y j ( k ) = 0 ) ықтималдығының бағалаушыларын қамтамасыз етті:

Есептелген деректер белоктарды бағалау, кластерлеу және ақуызды дифференциалды идентификациялау сияқты әрі қарай талдау үшін пайдаланылады.

Ванг және т.б. ұсынған модель. [31] Луо және т.б. ұсынған Байес моделінен ерекшеленеді. [17] келесі үш жолмен. Біріншіден, [31]-де белгілі бір деңгейден төмен қарқындылық цензураланады және цензура параметрі [17]-дағы фондық шу деңгейлері негізінде бағаланады, жетіспейтін ықтималдықты әлеуетті шынайы қарқындылықпен байланыстыру үшін логистикалық регрессия үлгісі құрастырылады. Аз мөлшерде пептидтердің жетіспеу ықтималдығы жоғары екенін байқаған кезде, [17]-дағы модельге негізделген жетіспеушілік механизмі [31] цензура механизміне қарағанда жоғалу ықтималдығын пептидтің қарқындылығымен байланыстырады. Екіншіден, [31] бір мәнді есептеуді жүргізеді және қабылданбаған қарқындылықтарды күтілетін мәндермен есептейді, ал [17] бірнеше рет есептеуді жүргізеді және өткізіп алынған мәндердің кейінгі үлестірімдерін имитациялайды. Үшіншіден, [31] iTRAQ талдауына арналмаған және [31] ішіндегі идеяны iTRAQ деректеріне қолданған кезде вариация көздері жойылуы керек. [31] күші азырақ есептеу жүктемесінде жатыр. f j ( k ) тығыздығы көрсетілгенде, өткізіп алынған пептидтің қарқындылығын (13) формуладан алынған күтілетін мәнмен оңай есептеуге болады.


2. Протеомика

Әртүрлі протеомдық стратегияларды қорытындыламас бұрын (1-сурет), бірнеше тармақты атап өту керек 4:

Қазіргі уақытта ешқандай протеомдық технология сүтқоректілер протеомының барлық күрделілігін шеше алмайды.

Кез келген протеомдық техникада көбірек ақуыздарға бейімділік бар.

Тұтастай алғанда, қанша ақуызды анықтауға болатынын және олардың қаншалықты дәл сандық мөлшерін анықтауға болатыны арасында келіссөздер бар.

Сандық пептидтік ақпараттың протеин өзгерістеріне таралуы арқылы ақпарат сөзсіз жоғалады.

Протеомика әдістерін салыстыру

Аббревиатура. Толық аты-жөні және түсіндірмесі. Артықшылықтары. Кемшіліктері.
DIGE Гель электрофорезінің айырмашылығы Протеин деңгейінде мөлшерлеу Төмен сезімталдық
Посттрансляциялық модификацияларды және белок изоформаларын визуализациялау Тек дифференциалды түрде экспрессияланған ақуыздарды MS/MS анықтауға бейім
Жақсы сандық дәлдік Өте жоғары немесе төмен pI немесе Mw ақуыздар гельде шешілмейді
Гель-LC-MS/MS LC-MS/MS талдау алдында SDS–PAGE арқылы бөлу Қолданудың қарапайымдылығы Префракциялау MS/MS талдауына уақыт талаптарын арттырады
LC-MS/MS талдау алдында префракциялау сезімталдықты арттырады Пептидтік таңбалаусыз күрделі қоспалардағы төмен сандық дәлдік
«Баспалдақ» протеолитикалық ыдырау көрсеткіші ретінде Мв өте жоғары немесе төмен белоктар гельде шешілмейді
СИЛАК Жасуша дақылында аминқышқылдары бар тұрақты изотопты таңбалау Минималды эксперименттік вариация Пептидтік деңгейде мөлшерлеу
Өте жақсы сандық дәлдік Культурада көбеймейтін жасушаларға, яғни кардиомиоциттерге жарамайды
Сүзілген сарысу қоспаларына көбейетін және шыдайтын мәдениеттегі жасушалар үшін пайдаланудың қарапайымдылығы Жануарларды метаболикалық таңбалау қымбатқа түседі
iTRAQ, TMT-тегтері Пептидтердің изотоптық таңбалануы Жақсы сандық дәлдік Пептидтік деңгейде мөлшерлеу
Тіндермен, сондай-ақ жасуша дақылдарымен бірге қолдануға болады Аралас MS/MS спектрлерінде әртүрлі пептидтердің репортер иондары болады
Аббревиатура. Толық аты-жөні және түсіндірмесі. Артықшылықтары. Кемшіліктері.
DIGE Гель электрофорезінің айырмашылығы Протеин деңгейінде мөлшерлеу Төмен сезімталдық
Посттрансляциялық модификацияларды және белок изоформаларын визуализациялау Тек дифференциалды түрде экспрессияланған ақуыздарды MS/MS анықтауға бейім
Жақсы сандық дәлдік Өте жоғары немесе төмен pI немесе Mw ақуыздар гельде шешілмейді
Гель-LC-MS/MS LC-MS/MS талдау алдында SDS–PAGE арқылы бөлу Қолданудың қарапайымдылығы Префракциялау MS/MS талдауына уақыт талаптарын арттырады
LC-MS/MS талдау алдында префракциялау сезімталдықты арттырады Пептидтік таңбалаусыз күрделі қоспалардағы төмен сандық дәлдік
«Баспалдақ» протеолитикалық ыдырау көрсеткіші ретінде Мв өте жоғары немесе төмен белоктар гельде шешілмейді
СИЛАК Жасуша дақылында аминқышқылдары бар тұрақты изотопты таңбалау Минималды эксперименттік вариация Пептидтік деңгейде мөлшерлеу
Өте жақсы сандық дәлдік Культурада көбеймейтін жасушаларға, яғни кардиомиоциттерге жарамайды
Сүзілген сарысу қоспаларына көбейетін және шыдайтын мәдениеттегі жасушалар үшін пайдаланудың қарапайымдылығы Жануарларды метаболикалық таңбалау қымбатқа түседі
iTRAQ, TMT-тегтері Пептидтердің изотоптық таңбалануы Жақсы сандық дәлдік Пептидтік деңгейде мөлшерлеу
Тіндермен, сондай-ақ жасуша дақылдарымен бірге қолдануға болады Аралас MS/MS спектрлерінде әртүрлі пептидтердің репортер иондары болады

Протеомика әдістерін салыстыру

Аббревиатура. Толық аты-жөні және түсіндірмесі. Артықшылықтары. Кемшіліктері.
DIGE Гель электрофорезінің айырмашылығы Протеин деңгейінде мөлшерлеу Төмен сезімталдық
Посттрансляциялық модификацияларды және белок изоформаларын визуализациялау Тек дифференциалды түрде экспрессияланған ақуыздарды MS/MS анықтауға бейім
Жақсы сандық дәлдік Өте жоғары немесе төмен pI немесе Mw ақуыздар гельде шешілмейді
Гель-LC-MS/MS LC-MS/MS талдау алдында SDS–PAGE арқылы бөлу Қолданудың қарапайымдылығы Префракциялау MS/MS талдауына уақыт талаптарын арттырады
LC-MS/MS талдау алдында префракциялау сезімталдықты арттырады Пептидтік таңбалаусыз күрделі қоспалардағы төмен сандық дәлдік
«Баспалдақ» протеолитикалық ыдырау көрсеткіші ретінде Мв өте жоғары немесе төмен белоктар гельде шешілмейді
СИЛАК Жасуша дақылында аминқышқылдары бар тұрақты изотопты таңбалау Минималды эксперименттік вариация Пептидтік деңгейде мөлшерлеу
Өте жақсы сандық дәлдік Культурада көбеймейтін жасушаларға, яғни кардиомиоциттерге жарамайды
Сүзілген сарысу қоспаларын көбейтетін және шыдайтын мәдениеттегі жасушалар үшін пайдаланудың қарапайымдылығы Жануарларды метаболикалық таңбалау қымбатқа түседі
iTRAQ, TMT-тегтері Пептидтердің изотоптық таңбалануы Жақсы сандық дәлдік Пептидтік деңгейде мөлшерлеу
Тіндермен де, жасуша дақылдарымен де қолдануға болады Аралас MS/MS спектрлерінде әртүрлі пептидтердің репортер иондары болады
Аббревиатура. Толық аты-жөні және түсіндірмесі. Артықшылықтары. Кемшіліктері.
DIGE Гель электрофорезінің айырмашылығы Протеин деңгейінде мөлшерлеу Төмен сезімталдық
Посттрансляциялық модификацияларды және белок изоформаларын визуализациялау Тек дифференциалды түрде экспрессияланған ақуыздарды MS/MS анықтауға бейім
Жақсы сандық дәлдік Өте жоғары немесе төмен pI немесе Mw ақуыздар гельде шешілмейді
Гель-LC-MS/MS LC-MS/MS талдау алдында SDS–PAGE арқылы бөлу Қолданудың қарапайымдылығы Префракциялау MS/MS талдауына уақыт талаптарын арттырады
LC-MS/MS талдау алдында префракциялау сезімталдықты арттырады Пептидтік таңбалаусыз күрделі қоспалардағы төмен сандық дәлдік
«Баспалдақ» протеолитикалық ыдырау көрсеткіші ретінде Мв өте жоғары немесе төмен белоктар гельде шешілмейді
СИЛАК Жасуша дақылында аминқышқылдары бар тұрақты изотопты таңбалау Минималды эксперименттік вариация Пептидтік деңгейде мөлшерлеу
Өте жақсы сандық дәлдік Культурада көбеймейтін жасушаларға, яғни кардиомиоциттерге жарамайды
Сүзілген сарысу қоспаларын көбейтетін және шыдайтын мәдениеттегі жасушалар үшін пайдаланудың қарапайымдылығы Жануарларды метаболикалық таңбалау қымбатқа түседі
iTRAQ, TMT-тегтері Пептидтердің изотоптық таңбалануы Жақсы сандық дәлдік Пептидтік деңгейде мөлшерлеу
Тіндермен де, жасуша дақылдарымен де қолдануға болады Аралас MS/MS спектрлерінде әртүрлі пептидтердің репортер иондары болады

Протеомдық тәсілдер. Протеин сығындыларын ас қорытуға дейін ақуыз деңгейінде немесе пептид деңгейінде ақуызды қорытудан кейін бөлуге болады. DIGE-де ақуыз сығындылары 2-DE арқылы бөлінбес бұрын әртүрлі флуоресцентті бояғыштармен белгіленеді. SILAC үшін жасушалар ауыр немесе жеңіл аминқышқылдарының қосылуы арқылы культурада метаболикалық түрде белгіленеді. Немесе таңбалау iTRAQ немесе TMT изобарлық тегтерін пайдаланып, пептидтік деңгейде орындалады. Содан кейін пептидтер MS/MS арқылы талданады. 2-DE, екі өлшемді гельдік электрофорез DIGE, айырмашылық гель электрофорезі 1-DE, бір өлшемді гель электрофорезі SILAC, жасуша культурасындағы AA аминқышқылдарымен тұрақты изотопты таңбалау, амин қышқылы iTRAQ, салыстырмалы және абсолютті сандық өлшеуге арналған изобарлық белгі TMT, тандем жаппай тег.

Протеомдық тәсілдер. Протеин сығындыларын ас қорытуға дейін ақуыз деңгейінде немесе пептид деңгейінде ақуызды қорытудан кейін бөлуге болады. DIGE-де ақуыз сығындылары 2-DE арқылы бөлінбес бұрын әртүрлі флуоресцентті бояғыштармен белгіленеді. SILAC үшін жасушалар ауыр немесе жеңіл аминқышқылдарының қосылуы арқылы культурада метаболикалық түрде белгіленеді. Немесе таңбалау iTRAQ немесе TMT изобарлық тегтерін пайдаланып, пептидтік деңгейде орындалады. Содан кейін пептидтер MS/MS арқылы талданады. 2-DE, екі өлшемді гельдік электрофорез DIGE, айырмашылық гель электрофорезі 1-DE, бір өлшемді гель электрофорезі SILAC, жасуша культурасындағы AA аминқышқылдарымен тұрақты изотопты таңбалау, амин қышқылы iTRAQ, салыстырмалы және абсолютті сандық өлшеуге арналған изобарлық белгі TMT, тандем жаппай тег.

2.1 Екі өлшемді гельдік электрофорез

Екі өлшемді гельдік электрофорез (2-DE) белоктарды изоэлектрлік нүктесі (pI) және молекулалық массасы (Mw) негізінде бөлуге мүмкіндік береді. 5 Бірінші өлшем белоктарды pI-ге сәйкес бөлуді қамтиды. Белок қоспасы иммобилизацияланған рН градиенті бар жолаққа жүктеледі. Электр өрісі қолданылғаннан кейін белоктар өздерінің pI-ге ауысады, онда олар цвиттерионды болады, яғни олар таза зарядын жоғалтады және миграцияны тоқтатады (изоэлектрлік фокустау). Изоэлектрлік фокустау аяқталғаннан кейін иммобилизацияланған рН градиент жолақтары екінші өлшемде бөлу үшін үлкен форматты гельдерге тасымалданады, мұнда ақуыздар SDS–PAGE арқылы молекулалық массасына сәйкес шешіледі.

SDS–PAGE-ден айырмашылығы, 2-DE гельдері протеомалардың күрделі карталарын жасайды, олар протеиннің дискретті «дақтары» ретінде бейнеленеді. pI және Mw тәуелсіз қасиеттер болғандықтан, 2-DE гельдері SDS–PAGE-ге қарағанда әлдеқайда көп ақуыздарды шеше алады. Маңыздысы, бір ақуыз гельдегі бірнеше нүктелерде болуы мүмкін. pI немесе Mw ауысуы трансляциядан кейінгі модификациялардың, ақуыздың деградациясының немесе ақуыз изоформаларының болуын көрсетеді. 6, 7 Протеин ерекшеліктері Coomassie немесе күміс бояумен бейнеленеді және үлгілер арасындағы дифференциалды өрнек салыстырмалы денситометриялық сандық анықтау арқылы анықталады. Дегенмен, гель-гель өзгермелілігі сандық дәлдікті шектей алады және өрнектегі шамалы айырмашылықтарды анықтауға тыйым салады.

Неғұрлым күрделі 2-DE әдісі - айырмашылық гельдік электрофорез (DIGE, 2А-сурет). 8 DIGE ақуыз экспрессиясындағы салыстырмалы айырмашылықтарды анықтау үшін Cy-бояғыштары бар ақуыз қоспаларының флуоресцентті таңбалауын қамтиды. Біріктірілген эксперименттік үлгілерден тұратын ішкі стандарт қамтылған, ол барлық үлгілерді көрсетеді. DIGE анықтау сезімталдығы күміс бояуының сезімталдығымен 9 салыстырылады және бояғыштар pI және Mw үшін сәйкес келеді. Кәдімгі 2-DE гельдерінен DIGE негізгі артықшылығы үлгілерді бір гельде мультиплекстеуге болады, осылайша қажетті гельдер санын азайтады және тәжірибелік вариацияны шектейді. Ішкі стандартпен қолданылатын DIGE протеин экспрессиясындағы 10%-ға дейінгі айырмашылықтарды сенімді түрде анықтайды. 10 Гельдер әрбір Cy-бояғыштың сәуле шығару толқын ұзындығын арнайы өлшейтін флуоресцентті сканер арқылы сканерленеді. Коммерциялық бағдарламалық құрал пакеттері ақуыз мүмкіндіктеріне сәйкес келеді және сканерленген гель кескіндерінен дифференциалды өрнекті есептейді. Гельдер бойынша ақуыз деңгейін қалыпқа келтіру белок қатынасын әрбір гельде бірге анықталған ішкі стандартпен салыстыру арқылы орындалады.

Гель негізіндегі протеомика. Түрлі иммобилизацияланған рН градиенттерінде DIGE көмегімен тышқанның жүрек протеомын бөлу: pH 3–10 NL (А) және рН 4–7 (Б). Ақ жолақ тар рН градиентінде сол аймақтың жақсырақ ажыратымдылығын көрсетеді. (C) SDS–PAGE бойынша алты жасушадан тыс гликопротеидтердің Mw таралуы. Қалыпты қолқа тінімен (КОН) салыстырғанда абдоминальды аорталық аневризмалардағы (ААА) тән «баспалдақ» протеолизді көрсетеді. Спектрлік сандардағы айырмашылықтар түспен кодталған (қызыл жоғары, көк төмен). (D) Сау аорта тіндерін матрицалық металлопротеиназа-12 (MMP-12) көмегімен инкубациялау AAA-да байқалғандай фибронектиннің ұқсас фрагментация үлгісін индукциялады. Салыстырмалы түрде металлопротеиназалар-9 (MMP-9) матрицалық ыдырауы азырақ болды (Дидангелостың рұқсатымен шығарылған) т.б. 15 ).

Гель негізіндегі протеомика. Түрлі иммобилизацияланған рН градиенттерінде DIGE көмегімен тышқанның жүрек протеомын бөлу: pH 3–10 NL (А) және рН 4–7 (Б). Ақ жолақ тар рН градиентінде сол аймақтың жақсырақ ажыратымдылығын көрсетеді. (C) SDS–PAGE бойынша алты жасушадан тыс гликопротеидтердің Mw таралуы. Қалыпты қолқа тінімен (КОН) салыстырғанда абдоминальды аорталық аневризмалардағы (ААА) тән «баспалдақ» протеолизді көрсетеді. Спектрлік санаулардағы айырмашылықтар түспен кодталған (қызыл жоғары, көк төмен). (D) Сау қолқа тіндерін матрицалық металлопротеиназа-12 (MMP-12) көмегімен инкубациялау AAA-да байқалғандай фибронектиннің ұқсас фрагментация үлгісін индукциялады. Салыстырмалы түрде металлопротеиназалар-9 (MMP-9) матрицалық ыдырауы азырақ болды (Дидангелостың рұқсатымен шығарылған) т.б. 15 ).

Басқа протеомдық әдістерден айырмашылығы, 2-DE арқылы сандық анықтау пептидтік деңгейде емес, ақуыз деңгейінде орындалады және сандық анықтау масс-спектрометриямен (MS) сәйкестендіруден ажыратылады. Күміс бояуды MS үшін тиісті дақтарды кесуді жеңілдету үшін гельдегі ақуыз ерекшеліктерін визуализациялау үшін пайдалануға болады. Немесе, дақтар роботтық нүкте таңдау құралы арқылы флуоресцентті гельдерден тікелей таңдалады. Содан кейін дақтар ақуызды анықтау алдында гель ішіндегі триптикалық ас қорытуға ұшырайды.

2-DE әдісінің негізгі ескертулерінің бірі - көп ақуыздар аз ақуыздарды бүркемелейді. Бұл тар рН диапазоны бар градиенттерді пайдалану арқылы ішінара шешуге болады (2В-сурет). Дегенмен, бірінші өлшемдегі бөлу, атап айтқанда бірінші өлшемнен екінші өлшемге өту шығынсыз болмайды және өте үлкен, кіші және гидрофобты ақуыздарды шешу қиын болып қалады.

2.2 Сұйықтық-хроматографиялық тандемдік масс-спектрометрия

Сұйықтық-хроматографиялық тандемдік масс-спектрометрия (LC-MS/MS) протеомикадағы қазіргі алтын стандарт болып табылады. MS негізгі принципі масса-заряд қатынасын өлшеуді қамтиды (м/z) иондалған пептид және оның фрагментация өнімдері. Ақуыздар бастапқыда кері фазалық LC арқылы шешілетін және электроспрей MS арқылы иондалатын пептидтік фрагменттерді шығару үшін трипсин сияқты ферменттермен қорытылады. 11 Гидрофобтылығына байланысты пептидтер кері фаза бағанынан әртүрлі уақыт нүктелерінде элюцияланады (ұстау уақыты). LC-MS/MS қолданатын әдеттегі жұмыс процесі элютті пептидтердің массалары мен қарқындылығын жазу үшін тұрақты зерттеу сканерлеуін қамтиды. Фрагментация (MS/MS) үшін колоннадан шығарылатын ең көп прекурсор иондары таңдалады. MS/MS деректерінен алынған аминқышқылдарының реті туралы ақпарат ақуызды анықтауға мүмкіндік береді. Спектрлік санау, ион қарқындылығы және хроматографиялық шыңның ауданы сияқты пептидтік параметрлер белок көптігінің сандық көрсеткішін қамтамасыз ете алады (белгісіз мөлшерлеу). 12 Масс-спектрометриялық технологияның әмбебаптығы көптеген әртүрлі масс-спектрометрлерді тудырды, MALDI-TOF-TOF, Q-TOF және Orbitrap масс-анализаторлары 13 қазіргі уақытта протеомиканы ашу үшін қолданылатын кең таралғандардың қатарында.

2.3 Gel-LC-MS/MS талдауы

MS алдында SDS–PAGE арқылы алдын ала фракциялау 2-DE арқылы бөлуге жарамсыз үлгілерді сипаттауда пайдалы болды. Ол сондай-ақ аз мөлшердегі ақуыздарға қарсы ауытқудың жалғыз ең үлкен себебін жеңуге көмектеседі - көп пептидтер масс-спектрометрдің жұмыс циклінде басым болғандықтан пайда болатын аз мөлшердегі пептидтердің сынамалары кезіндегі стохастикалық. Гель-LC-MS/MS талдауы үшін ақуыздар SDS–PAGE арқылы бөлінеді, бүкіл гель жолағы бірқатар жолақтарға бөлінеді, жолақтар бос гель бөліктерін қалдырмай кесіледі, трипсинмен қорытылады және LC-MS/ Әрбір жолақ бойынша MS талдауы жүргізіледі. 14, 15 Гель жолақтары белоктардың қоспасы болғандықтан, LC бөлу ақуызды анықтау және сандық анықтау үшін маңызды, яғни спектрлік санау арқылы. 16 Спектрлік санау ақуыздың салыстырмалы көптігін анықтаудың танымал стратегиясы болды, бірақ күрделі қоспалар үшін сенімді емес. Жалпы, ақуыз неғұрлым көп болса, оны MS/MS анықтау ықтималдығы соғұрлым жоғары болады. Спектрлік сандар белгілі бір ақуызға сәйкес келетін MS/MS спектрлерінің санынан алынады.

Гель-LC-MS/MS әдісінде белоктың табиғи Mw туралы ақпарат сақталады. Егер ақуыздың ыдырауы трипттік ас қорытуға дейін орын алса, пептидтер жергілікті ақуыздардың күтілетін Mw мәнінен төмен гель сегменттерінде MS арқылы анықталады (2С суреті). Осылайша, дифференциалды түрде экспрессияланған ақуыздардың бірдей гельдік жолақтармен шектелгенін тексеру маңызды. Әйтпесе, бұзылған ақуыз SDS–PAGE бетінде (2D суреті). Сонымен қатар, ақуыз фрагменттері тым кішкентай болуы мүмкін және анықтаудан қашып кетуі мүмкін, себебі олар буферлік фронттың алдында көшкен. Екінші жағынан, протеолитикалық ыдырау өнімдері туралы ақпарат маңызды және протеин деңгейінде алдын ала бөлінбестен триптикалық пептидтерді талдайтын кәдімгі шолақ мылтық протеомикасында жоғалады.

2.4 Аңшылық мылтық протеомикасы

Гель негізіндегі тәсілдерден басқа, пептидтердің көптігіне негізделген ақуыз экспрессиясындағы айырмашылықтарды сандық анықтаудың гельсіз әдістері бар. Бұл атыс қаруының протеомдық әдістері протеомды тереңірек зерттей алатынымен, үлгілер тым күрделі болса, сандық анықтауда мәселелер туындайды. МС иондану тиімділігінің айырмашылығына байланысты сандық емес. Ең көп иондар электроспрей ионизациясы кезінде ең көп зарядтарды тартады, бұл төмен деңгейлі пептидтердің иондалу ықтималдығын азайтады. Көп мөлшердегі пептидтердің бірігіп кетуіне байланысты жалған-оң протеин өзгерістерін болдырмау үшін сенімді мөлшерлеу үшін таңбалау әдістерін пайдалану керек. Танымал таңбалау әдістеріне салыстырмалы және абсолютті сандық анықтау үшін изобарлық тегтеу (iTRAQ), тандемдік массалық тегтер (TMT) және жасуша мәдениетіндегі амин қышқылдары бойынша тұрақты изотопты таңбалау (SILAC) жатады. 17 iTRAQ қазіргі уақытта сегіз үлгіге дейін салыстырмалы сандық анықтауға мүмкіндік беретін төрт және сегіз плекс ретінде қол жетімді, ал TMT және SILAC таңбалауы тиісінше алты және үш үлгіде қолданылуы мүмкін. 18 Дегенмен, пептидтер жай ғана суррогат өлшем болып табылады және ақуыздың мөлшерін анықтау үшін әрқашан сенімді бола бермейді, яғни олар трансляциядан кейінгі модификацияларға немесе протеолизге ұшыраса.

2.4.1 Жасуша дақылында аминқышқылдары бойынша тұрақты изотопты таңбалау

SILAC белоктарды жеңіл (мысалы, 12 C) және ауыр изотоптармен (мысалы, 13 C) таңбалау үшін радиоактивті емес изотоптық белгілерді пайдаланады. 18 Үлгілерді бір MS іске қосу кезінде мультиплексирлеуге және талдауға болады, осылайша эксперименттік қатені азайтады. 19 SILAC жұптары хроматография кезінде коэлюцияланады, бірақ ауыр және жеңіл изоформаның сәйкес пептидтері тән массалық ығысумен пайда болады. Әрбір ақуыздың салыстырмалы мөлшерін SILAC таңбаланған пептидтердің ең жоғары қарқындылығының айырмашылығы арқылы есептеуге болады. Белоктардың дифференциалды деңгейлерін сандық анықтау үшін SILAC қолдану культурадағы жасушаларды пайдаланудан асып түседі. SILAC таңбаланған тышқандар барлық ақуыздардың толық дерлік таңбалануымен сипатталған, бірақ SILAC диетасы қымбат. 20 Метаболикалық таңбалау сонымен қатар аминқышқылдарының синтезі мен көзі, ақуызды жинақтау және айналым кинетикасы туралы ақпаратты енгізеді.

2.4.2 Салыстырмалы және абсолютті сандық/тандем массалық тегтері үшін изобарлық тегтеу

Адам тінін пайдаланатын жағдайларда, iTRAQ немесе TMT LC-MS/MS арқылы дифференциалды экспрессиялық зерттеулерге арналған клиникалық үлгілерді мультиплексирлеуге арналған опция болып табылады, 21, бірақ бұл әдістерде ескертулер жоқ. 22 (i) iTRAQ және TMT жүйесінің SILAC-қа қарағанда бір кемшілігі таңбалаудың пептидтік деңгейде орындалу фактісі және эксперименттік процесте кеш орын алуы болып табылады.Белгілеу алдында белоктар алдымен жасушалардан немесе тіндерден экстракцияланады және пептидтерге дейін қорытылады. Бұл өзгерудің ықтимал көзі. (ii) SILAC-тан айырмашылығы, сандық анықтау MS деңгейінде емес, MS/MS деңгейінде орындалады. Әртүрлі үлгідегі пептидтер өздерінің бірдейлігін сақтайды м/z таңбалаудан кейінгі арақатынастар (MS). Тек фрагментациядан кейін (MS/MS) изобарлық массалық тегтер әр тегке бір изотоптық алмастыру арқылы әртүрлі репортер иондарын шығарады және әрбір жеке үлгі үшін сандық ақпаратты береді. iTRAQ эксперименттерінде жиі байқалатын мәселе күрделі фон ақуыз қатпарларының өзгерістерін жете бағаламауға әкелуі мүмкін. Прекурсор иондарын таңдау кезінде фрагментация үшін таңдалған массалық терезеде бір пептидтен көп болуы мүмкін. Осындай аралас MS/MS спектрлерінде сандық анықтау үшін әртүрлі белоктардың пептидтерінен шыққан репортер иондары қате біріктірілген.

2.5 Белоктарды анықтау

«-омика» өрістерінің әрқайсысы үшін дәл және қолжетімді деректер базалары қажет болғанымен, протеомика осы ресурстарға ең тәуелді болуы мүмкін. Ақуыздарды анықтау және сандық анықтау технологиялары белоктарды идентификациялау және пептидтерді сандық анықтау үшін жан-жақты дерекқорларға сүйенеді. Бұл дерекқорлар жүйелік биология саласына тікелей жатпайды, бірақ олар соңғы талдаулар үшін негіз болып табылады, өйткені бұл дерекқорларды өңдеу және қолдау зерттелген ақуыздарды дұрыс анықтау және сандық анықтау үшін өте маңызды.

Функционалды және реттілікке негізделген дерекқорлар үшін UniProt ең жан-жақтылардың бірі болып табылады. UniProt бірнеше жіктеулерден тұрады: Swiss-Prot және TrEMBL белоктар туралы реттілік пен функционалдық ақпаратты қамтиды, UniRef және UniParc реттілік пен мұрағатталған реттілік жазбаларын және қол жетімді болса, әдебиет сілтемелері және сілтеме жасалған дерекқорлар сияқты қолдаушы деректерді қамтиды. 23 Mascot, SEQUEST немесе X!Tandem сияқты бағдарламалар UniProt сияқты жалпыға қолжетімді дерекқорлардан алынған FASTA ақуыз тізбектерін іздейді. ' орындағаннан кейінкремнийде белгілі фермент спецификасы бар фрагментацияда, қарқындылығы бар ең жоғары масса тізімдері (тәжірибелік деректер) кремнийде- фрагменттелген мәліметтер базасы. Бастапқы иондық массалар дерекқор тізбектерінен алынған массаларға қарсы сканерленеді. Белгілі бір массалық төзімділік шегінде сәйкестік болса, бақыланатын MS/MS спектрлері содан кейін теориялық реттіліктен алынған иондық қатарлармен салыстырылады. Мұнда нақты қарастырылмағанымен, Noble және MacCoss 24 шолуы мен түсіндірмесі осы әдістемелер мен әдістер туралы түсінік береді. Бағалау алгоритмдері әртүрлі нәтижелер бере алады және үлкен ауқымды деректер жиынындағы бір пептидті идентификацияларға тәуелділік жалған идентификацияның ықтимал себебі болып табылады. Протеомдық зерттеулердің көпшілігі кем дегенде екі бірегей пептидтері бар идентификацияларды ғана хабарлайды немесе бір пептидті идентификацияға арналған MS/MS спектрлерін қамтиды.


Әдістері

Өсімдік материалы және үлгі алу

Бұл зерттеуде Denghai 661 (DH351/DH372) қытай жүгерінің элиталық сорты қолданылды. Тұқым Shandong Denghai Seeds Co., Ltd. (Лайчжоу, Қытай) компаниясынан алынды. Өсімдіктер жүгері өсіру маусымында Шаньдун ауылшаруашылық университетінің тәжірибелік фермасында өсірілді, Тайан (36°10′E, 117°04′N), Қытай. Сол күні гүлдеген өсімдіктер тегтеліп, жасанды түрде өздігінен тозаңданды. 3, 5, 10, 15, 20, 30, 40 және 50 DAP әр сатысында тоғыз құлақ жиналды. Материалдың біркелкілігін арттыру үшін әр масақтың ортаңғы бөлігінен ұрықтанған дәндерден сынама алынды. Әрбір кезең үшін үш сынама тең мөлшердегі дәндерді араластыру арқылы дайындалды, үлгілер протеин экстракциясына дейін бірден -80 °C температурада сақталды. Дәннің әрбір сатысында жаңа салмақ пен құрғақ салмақ өлшенді. 10–50 DAP және 3–30 DAP дәндері, сәйкесінше, жоғарыда сипатталғандай, жалпы крахмал мазмұнын және эндосперм жасушаларының санын анықтау үшін жиналды [83].

Протеинді экстракциялау

Астық сынамалары сұйық азотта ұсақ ұнтаққа айналдырылды, ұнтақ ерітінді мен пестильді пайдалана отырып, құрамында 10 % (көлем/көлем) үшхлорсірке қышқылы (TCA) бар алдын ала салқындатылған ацетонның (−20 °C) 10 есе көлемінде суспензияланды. Содан кейін гомогенат мұқият араластырылғаннан кейін -20 ° C температурада 2 сағат бойы тұндырылды. Содан кейін гомогенат 20 000 температурада 30 минут центрифугаланған g 4 °C температурада және үстіңгі қабат мұқият жойылды, түйіршік үш рет суық ацетонмен шайылды, -20 °C температурада 30 минутқа қалдырылды, содан кейін 20 000 температурада центрифугаланады. g 4 °C температурада 30 мин. Алынған түйіршіктер құрамында 8 М мочевина, 30 мм HEPES, 1 мМ поливинилполипирролидон (PMSF), 2 мМ ЭДТА және 10 мм дитиотреитол (DTT) бар лизис буферінде ерітілді, содан кейін 5 минут бойы ультрадыбыстық күйге келтірілді. Ерітілген ақуыз сығындысы 20 000 градуста центрифугаланған g 4 °C температурада 30 мин, үстіңгі зат жиналды және 1 сағат бойы 56 °C температурада 10 мм DTT-мен тотықсыздандырылды, содан кейін қараңғы жерде 1 сағат бойы 55 мМ йодоацетамидпен (IAM) алкилирленді. Қоспа суық ацетонның 5 есе көлемін -20 °C температурада 3 сағат бойы тұндырды, содан кейін 20 000 температурада центрифугалау жүргізілді. g 30 мин. Алынған түйіршік 0,1% SDS бар 0,5 М триэтиламмоний бикарбонатында (TEAB) буферде ерітілді, 5 минут бойы ультрадыбыспен өңделді және 20 000 температурада центрифугаланады. g 30 мин. Супернатант сұйық қорыту үшін пайдаланылды, ал ақуыз концентрациясы стандарт ретінде BSA бар Брэдфорд талдауы (Bio-Rad, Hercules, CA, АҚШ) арқылы анықталды.

Ерітінді қорытуда және iTRAQ таңбалауында

Әрбір үлгі үшін TEAB буферіндегі 100 мкг ақуызға 3,3 мкл трипсин (1 мкг/мкл) (Promega, Madison, WI, АҚШ) қосылды және ақуыздар 37 °C температурада 24 сағат бойы қорытылды. Трипсиннің жаңа аликвоты (1 мкл) қосылды және үлгі 12 сағат бойы қайтадан қорытылды. Тұнба 30 мкл 0,5 М TEAB ішінде ерітілді және 70 мкл изопропанолмен араластырылды. Содан кейін қорытылған пептидтер өндірушінің нұсқауларына сәйкес iTRAQ реагенттерімен (AB SCIEX, Framingham, MA, АҚШ) таңбаланды. 3, 5, 10, 15, 20, 30, 40 және 50 DAP алынған астық үлгілері сәйкесінше 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119 және 121 iTRAQ реагенттерімен таңбаланған. Үш тәуелсіз биологиялық эксперимент жүргізілді.

SCX және LC-MS/MS

Біріктірілген пептидтер күшті катион алмасу (SCX) буферінде (10 мМ калий фосфаты бір негізді (KH)) ерітілді.2PO4) 25 % ацетонитрилде, рН 2,8). Қоспа фосфор қышқылын пайдалана отырып, рН 3-ке теңестірілді, содан кейін кремний диоксиді негізіндегі SCX бағанымен (250 × 4,6 мм, 5 мкм, 100) жабдықталған жоғары өнімді сұйық хроматография (HPLC) жүйесін (Симадзу, Киото, Жапония) пайдаланып фракцияларға бөлді. Å, Phenomenex, Torrance, CA, АҚШ). Барлығы 36 фракция B буферімен (10 мМ KH) 1 мл/мин ағын жылдамдығында жиналды.2PO4 және 25% ацетонитрилдегі 2 М калий хлориді (KCl), рН 2,8) келесі градиентпен: 45 мин ішінде 0 %, 1 мин ішінде 0–5 %, 20 мин ішінде 5–30 %, 5 мин ішінде 30–50 % және 5 минут бойы және 50-100 % 5 минут бойы және 10 минут бойы ұсталды. Фракциялар өндірушінің нұсқауларына сәйкес қабат-X 33 мкм PolyRevStage SPE (Phenomenex) көмегімен тұзсыздандырылды және центрифугалық жылдамдықтағы вакуумдық концентраторда лиофилизацияланды. Содан кейін әрбір кептірілген фракция түтігіне 30 мкл 0,1% құмырсқа қышқылы қосылды және MALDI-TOF сынағы үшін Анкерлік чип тақтасының мақсатты ұңғымасында 0,1 мкл қайта ерітілген ерітінді табылды. MALDI-TOF (Bruker Daltonics, Германия) сынағынан кейін 36 фракция шыңдық аймаққа сәйкес 16 соңғы фракцияға біріктірілді.

Масс-спектрометриялық талдау Q-Exactive масс-спектрометріне (Thermo Fisher Scientific, MA, АҚШ) қосылған Dionex Ultimate 3000 Nano LC жүйесінде орындалды. Пептидтік қоспалар Acclaim PePmap C18 кері фазалық бағанға (75 мкм × 2 см, 3 мкм, 100 Å, Thermo Scientific) жүктелді және кері фазалық C18 бағанымен (75 мкм × 10 см, 5 мкм, Å30) бөлінді. , Agela Technologies) 300 нЛ/мин ағын жылдамдығында 45 минут ішінде 0,1 % құмырсқа қышқылында 5–80 % (көлем/көлем) ацетонитрил градиентін пайдалану. А еріткіші судағы 0,1 % құмырсқа қышқылы болды. Толық масс-спектрометрия (MS) сканерлеуі (350–2000 м/ц) оң ион режимінде 70 000 (200 м/ц) ажыратымдылықта, AGC мақсатты мәні 3–6, иондардың максималды жинақталу уақытында алынды. 50 мс, сканерлеу ауқымдарының саны 1 және динамикалық алып тастау 15 с. Пептидтер мен пептид фрагменттері m/z туралы ақпарат келесі шарттарды қолдану арқылы алынды: әрбір толық сканерлеуден кейін 20 фрагменттік файл жиналды (MS2 сканерлеу), жоғарырақ соқтығыс энергиясының диссоциациясының (HCD) фрагментациясы, 2 м/z оқшаулау терезесі, толық сканерлеу 17500 (200 м/ц) ажыратымдылықта, микроскандар 1, иондардың максималды жинақталу уақыты 100 мс, нормаланған соқтығыс энергиясы 28 эВ және толып кету коэффициенті 1 %.

Мәліметтерді талдау

Протеинді анықтау үшін MS шикізат файлдары Proteome Discoverer 1.3 (Thermo Fisher Scientific) бағдарламасымен өңделді және MASCOT 2.3.01 (Matrix Science, Лондон, Ұлыбритания) бағдарламалық құралымен ізделді. Алынған MS/MS спектрлері автоматты түрде UniProt-ге қарсы іздестірілді.Zeamays ақуыз деректер базасы (2014 жылғы желтоқсанда 86 922 реттілік). Іздеу параметрлері келесідей болды: бір өткізіп алған ыдырауы бар фермент ретінде трипсин таңдалды, цистеин қалдықтарының карбамидометилденуінің фиксирленген модификацияларына рұқсат етілді iTRAQ N терминалының 8-плексті модификациясы, K және Y, Gln → N терминалының Pyro-Glu және тотығу. метиониннің мөлшері айнымалы модификациялар ретінде орнатылды пептидтерге төзімділік 15 ppm деңгейінде және MS/MS төзімділігі 20 мму деңгейінде орнатылды. Ақуызды сәйкестендіру және сандық деректерді талдау үшін жалған табу жылдамдығы (FDR) ≤1 % кем дегенде бір бірегей пептид қажет болды.