Ақпарат

6.1.1: Оперонды зерттеу үшін мутанттарды пайдалану - Биология

6.1.1: Оперонды зерттеу үшін мутанттарды пайдалану - Биология


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

үйрену мақсаттары

  • Гаплоидты организмдердегі генетикалық қатынастарды зерттеу үшін ішінара диплоидтарды қалай қолдануға болатынын сипаттаңыз.
  • Болатынын болжаңыз лак Оперон гендері берілген мутациялар болған кезде экспрессияланатын болады.

Жалғыз мутанттар лак оперон

The лак Оперон және оның реттеушілері алғаш рет мутанттарды зерттеу арқылы сипатталды E. coli лактоза алмасуында әртүрлі ауытқуларды көрсетті. Кейбір мутанттар білдірді лак оперон гендері конституциялық түрде, яғни оперон ортада лактозаның бар -жоқтығын білдірді. Мұндай мутант деп аталады құрылтайшы мутанттар.

The оператордың орны (lacO) – Бір мысал Ов, онда оператор мутациясы репрессорды азайтады немесе болдырмайды lacI гендік өнім) оператор тізбегін танудан және байланыстырудан. Осылайша, в Ов мутанттар, lacZ, ләззат, және lacA лактозаның бар немесе жоқтығын көрсетеді.

The lacI локус – мутант аллелінің бір түрі lacI (шақырылған I-) не репрессорлық полипептидтің өндірілуіне кедергі жасайды, не оператордың реттілігімен байланыстыра алмайтын полипептид шығарады. Бұл сонымен қатар сөйлемнің құрылтайшы -экспрессоры лак оперон, өйткені репрессорды байланыстырудың болмауы транскрипцияға мүмкіндік береді.

Мутанттың тағы бір түрі lacI шақырды Iс репрессорлық полипептидтің лактозаны байланыстыруына жол бермейді, осылайша оператормен байланысады және индукцияланбайды. Бұл мутант конститутивтік түрде лак лактоза бар ма, жоқ па - оперон. The лак оперон экспрессияланбайды және бұл мутант суперрепрессор деп аталады.

Екі лак Бір жасушадағы оперондар ішінара диплоидтар жасайды E.coli

реттеу туралы көбірек білуге ​​болады лак бір ұяшықта екі түрлі көшірме болған кезде оперон. Мұны пайдалану арқылы жүзеге асыруға болады F-факторы бір данасын тасымалдау үшін, ал екіншісі геномдықта E. coli хромосома Бұл ішінара диплоидты тудырады E. coli.

F-фактор - бұл бос плазмида бола алатын немесе қожайын бактериалды хромосомаға біріктірілген экстра хромосомалық ДНҚ. Бұл ауысу IS элементтері арқылы жүзеге асырылады, онда тең емес кроссинг F-факторы мен іргелес ДНҚ тізбегін (гендерін) хост хромосомасындағы және одан тыс қайта біріктіруі мүмкін. Зерттеушілер бұл генетикалық құралды бір жасушадағы әртүрлі мутациялардың әртүрлі комбинациялары арқылы реттеуді тексеруге мүмкіндік беретін ішінара диплоидтарды (мерозиготаларды) жасау үшін пайдаланды. Мысалы, F-факторлық көшірмеде а болуы мүмкін IС мутация, ал геномдық көшірмеде болуы мүмкін ОC мутация. Бұл жасуша лактозаның (немесе глюкозаның) болуына/болмауына қалай жауап береді? Мұны анықтау үшін бұл ішінара диплоидты қолдануға болады IС басым болып табылады I+, бұл өз кезегінде басым I-. Оны көрсету үшін де пайдалануға болады ОC мутация тек әрекет етеді cis- кезінде lacI мутация әрекет ете алады транс- .

Мысал (PageIndex{1})

Жоғарыда қойылған сұрақты қарастырыңыз: көшірмесі бар ұяшық лак F-факторының оперонында болады IС мутация, ал геномдық көшірмеде бар ОC мутация. Бұл жасуша лактозаның (немесе глюкозаның) болуына/болмауына қалай жауап береді?

Шешім

The IС мутация аллоктозаны байланыстыра алмайтын ақуыз түрін кодтайды, сондықтан лактоза бар болса да операторды тануды жалғастырады. Дегенмен, оператордың геномдық көшірмесі ОC арқылы енді танылмайтын реттілікке мутацияланады лак репрессор. Осы себепті, lacZYA геномдық гендер лак Оперон осы ұяшықта үздіксіз экспрессияланатын болады, өйткені lacI репрессор бұл тізбекті байланыстыра алмайды.


Лак Оперон

Негізгі операторға қосымша, LacO, көрсетілген 1-сурет , ішінде екі «псевдо-оператор» тізбегі бар лак Оперон тізбегі және репрессияға ықпал етеді. Псевдо-операторлардың ДНҚ тізбегі LacO-ға өте ұқсас, бірақ бірдей емес және LacI-мен әлсіз байланысқан. LacI протеинінің тетрамерінде ДНҚ-байланыстырушы екі учаскенің болуы жалған операторлар репрессияны күшейте алатын механизмді ұсынды – бір LacI тетрамер екі бөлек операторды байланыстырып, ілмектелген ДНҚ құрылымын жасай алады. ДНҚ циклінің эксперименттік дәлелдері әртүрлі зертханалардан алынған. Соңғы дәлелдер ілмектердің пайда болуы үшін екі димер арасындағы бұрыштың ашылуы керек екенін көрсетеді. 4-сурет . Бұл ілмектік құрылымдар айтарлықтай репрессияны ескере отырып, жоғары тұрақтандырылған lacZYA экспрессия бактерия жасушаларында байқалады. Шынында да, құрамында бірнеше оператор тізбегі бар және супер орамдық тығыздық сипаттамасы бар ДНҚ E. coli кешеннің жартылай шығарылу кезеңін көрсетеді, ол 2 күннен асады. Дегенмен, тіпті бұл ілмектелген кешендер де индукторлық қанттардың болуына тез (30 секундтан аз уақыт ішінде) жауап береді, бұл өтпелі болуы мүмкін сыртқы лактоза көзіне тез бейімделуге мүмкіндік береді.

4-сурет. Ілмектелген ДНҚ құрылымы. Көк көк түсті қисық сызық бейнелейді лак оперондық ДНҚ (бақылаушыға жақындығын көрсететін көлеңкесі бар), оның құрамында үш ықтимал LacI-байланыстыру орны бар (оның екеуі, O1 және О2, LacI-ге байланысты көрсетілген). Псевдооператор тізбегі O2 ішінде орналасқан lacZ ген және біріншілік оператор тізбегі О1 үшін промоторлар тізбегін қайталайды lacZYA метаболикалық гендер ( 1-сурет ). Тетрамерикалық LacI суреттің төменгі жағында бір мезгілде О-мен әрекеттесу ретінде көрсетілген1 және О2. Бұл құрылым ДНҚ-ны айналдырады және өте жоғары тұрақтылығы бар кешен жасайды. LacI тетрамеріндегі димерлердің О арасындағы цикл кезінде олардың арасында үлкенірек бұрышты қабылдайтынын ескеріңіз.1 және О2 цикл болмаған кезде (яғни, көрсетілген құрылым 3(a) сурет ). Циклдің пайда болуы үшін димерлердің арасындағы икемділіктің қажеттілігі эксперименталды дәлелдермен расталады.


12.1 The лак оперон

The лак Оперон (лактоза опероны) — лактозаның тасымалдануы мен метаболизмі үшін қажетті оперон. ішек таяқшасы және басқа да көптеген ішек бактериялары.

Оперон - бір промотордың бақылауындағы гендердің кластерін қамтитын ДНҚ-ның жұмыс істейтін бірлігі. Гендер мРНҚ тізбегіне бірге транскрипцияланады және цитоплазмада бірге аударылады немесе бөлек аударылатын моноцистрондық мРНҚ-ларды, яғни әрқайсысы бір ген өнімін кодтайтын мРНҚ-ның бірнеше тізбегін жасау үшін сплайцинациядан өтеді. Мұның нәтижесі - оперон құрамындағы гендер не бірге, не мүлде білдірілмейді. Оперонды анықтау үшін бірнеше гендерді бірге транскрипциялау керек.

Глюкоза көптеген бактериялар үшін артықшылықты көміртегі көзі болғанымен лак Оперон бета-галактозидазаның белсенділігі арқылы глюкоза болмаған кезде лактозаның тиімді қорытылуына мүмкіндік береді. Гендік реттелу лак оперон анық түсінілген алғашқы генетикалық реттеу механизмі болды, сондықтан ол прокариоттық генді реттеудің көрнекті мысалы болды. Осы себепті бұл жерде егжей-тегжейлі талқыланады. Лактоза алмасуының бұл жүйесін Франсуа Якоб пен Жак Монод биологиялық жасуша қандай ферментті синтездейтінін қалай білетінін анықтау үшін пайдаланған. Олардың жұмысы лак Оперон оларға 1965 жылы физиология бойынша Нобель сыйлығын алды.

Бактериялық оперондар – бір мРНҚ транскриптінен бірнеше белоктар шығаруға қабілетті полицистрондық транскрипттер. Бұл жағдайда лактоза бактерия үшін қант көзі ретінде қажет болғанда, үш ген лак оперонды экспрессиялауға және олардың кейінгі белоктарын аударуға болады: lacZ, lacY және lacA. lacZ гендік өнімі β-галактозидаза болып табылады, ол лактозаны, дисахаридті глюкоза мен галактозаға бөледі. lacY лактозаның жасушаға жасушалық тасымалдануын қамтамасыз ету үшін цитоплазмалық мембранаға енетін мембраналық ақуыз болып табылатын Бета-галактозидтік пермеазаны кодтайды. Соңында, lacA галактозид ацетилтрансферазаны кодтайды.

Лактоза болмаған кезде немесе глюкоза сияқты қолайлы қуат көзі болған кезде ферменттерді өндіру ысырап болар еді. The лак Оперон жасушаның кодталған ферменттерді өндіруге энергия жұмсауын қамтамасыз ету үшін екі бөліктен тұратын басқару механизмін пайдаланады. лак Оперон қажет болғанда ғана. Лактоза болмаған жағдайда лак репрессор, lacI, кодталған ферменттердің өндірісін тоқтатады лак оперон. The лак егер коиндуктор онымен байланыспаса, репрессор әрқашан өрнектеледі. Басқаша айтқанда, ол шағын молекулалы коиндуктордың қатысуымен ғана транскрипцияланады. Глюкоза болған кезде ферменттерді өндіруге қажетті катаболит активатор ақуызы (CAP) белсенді емес болып қалады және EIIAGlc лактозаның жасушаға тасымалдануын болдырмау үшін лактоза өткізгіштігін тоқтатады. Бұл қосарлы басқару механизмі глюкоза мен лактозаның диаокси деп аталатын екі түрлі өсу фазасында дәйекті түрде пайдаланылуын тудырады.

Үш әріпті қысқартулар бактериялардағы фенотиптерді сипаттау үшін қолданылады, соның ішінде E. coli.

  • Лак (лактозаны пайдалану мүмкіндігі),
  • Оның (гистидин амин қышқылын синтездеу қабілеті)
  • Мот (жүзу моторикасы)
  • SmR (антибиотик стрептомицинге төзімділік)

Лак жағдайында жабайы типтегі жасушалар Lac+ болып табылады және лактозаны көміртегі және энергия көзі ретінде пайдалана алады, ал лак-мутантты туындылар лактозаны пайдалана алмайды. Әр түрлі ген қосымша әріппен ерекшеленетін белгілі бір фенотипке қатысатын гендерді белгілеу үшін әдетте бірдей үш әріп қолданылады (кіші әріптер, курсив). The лак ферменттерді кодтайтын гендер lacZ, lacY және lacA болып табылады. Төртінші лак ген lacI болып табылады, лактоза репрессорын кодтайды — «I» индукциялық дегенді білдіреді.

Ферменттерді кодтайтын құрылымдық гендер мен ген экспрессиясына әсер ететін белоктарды кодтайтын реттеуші гендерді ажыратуға болады. Ағымдағы қолдану белоктарға қолдану үшін фенотиптік номенклатураны кеңейтеді: осылайша, LacZ - lacZ генінің ақуыз өнімі, β-галактозидаза. Ген болып табылмайтын әртүрлі қысқа тізбектер де геннің экспрессиясына әсер етеді, соның ішінде лак промоутер, лак p, және лак оператор, лак о. Бұл қатаң стандартты қолдану болмаса да, мутациялар әсер етеді лак o деп аталады лак oc, тарихи себептерге байланысты.

The лак Оперон 3 құрылымдық геннен және промотордан, терминатордан, реттеушіден және оператордан тұрады. Үш құрылымдық гендер: lacZ, lacY және lacA.

  • lacZ дисахарид лактозаны глюкоза мен галактозаға бөлетін жасушаішілік фермент β-галактозидазаны (LacZ) кодтайды.
  • lacY бірдей бағытта протон градиенті арқылы жасушаға β-галактозидтерді қоса, лактозаны айдайтын трансмембраналық симпортер Бета-галактозидтік пермеазаны (LacY) кодтайды. Пермеаза жасушаның β-галактозидтерге өткізгіштігін арттырады.
  • lacA ацетил тобын ацетил-КоА-дан β-галактозидтерге тасымалдайтын фермент β-галактозидті трансацетилазаны (LacA) кодтайды.

Лактозаның катаболизмі үшін тек lacZ және lacY қажет сияқты.

Арнайы бақылау лак гендер лактоза субстратының бактерияға қолжетімділігіне байланысты. Лактоза көміртегі көзі ретінде қол жетімсіз болған кезде ақуыздарды бактериялар өндірмейді. The лак гендер оперонға ұйымдасқан, яғни олар хромосомаға бірден іргелес бір бағытта бағытталған және бір полицистрондық мРНҚ молекуласына бірге транскрипцияланады. Барлық гендердің транскрипциясы РНҚ-полимераза ферментінің (РНҚП) байланысуынан басталады, ол ДНҚ-байланыстырушы ақуыздың белгілі бір ДНҚ-ны байланыстыратын орынға, промоторға тікелей гендердің жоғары ағынымен байланысады. РНҚ полимеразаның промотормен байланысуына cAMP-байланысқан катаболит активатор ақуызы (CAP, cAMP рецепторларының ақуызы ретінде де белгілі) көмектеседі. Дегенмен, lacI гені (реттеуіш ген лак оперон) RNAP оперонның промоторымен байланысуын блоктайтын ақуызды шығарады. Бұл ақуызды тек аллолактоза онымен байланысып, оны инактивациялағанда ғана алып тастауға болады. lacI гені түзетін белок деп аталады лак репрессор. Реттеу түрі, ол лак Оперон теріс индукциялық деп аталады, яғни кейбір молекула (лактоза) қосылмаса, ген реттеуші фактормен (лак-репрессор) өшіріледі. болуына байланысты лак репрессорлық ақуызды алу үшін, lacZ генін басқа генмен алмастыратын гендік инженерлер лактоза бар агарда тәжірибелік бактерияларды өсіруі керек. Егер олар жоқ болса, олар экспрессиялауға тырысатын ген экспрессияланбайды, өйткені репрессорлық ақуыз әлі де RNAP промотормен байланысуына және генді транскрипциялауға кедергі жасайды. Репрессор жойылғаннан кейін RNAP барлық үш генді (lacZYA) мРНҚ-ға транскрипциялауға кіріседі. mRNA тізбегіндегі үш геннің әрқайсысының Shine-Dalgarno тізбегі бар, сондықтан гендер дербес аударылады. ДНҚ тізбегі E. coli лак оперон, lacZYA мРНҚ және lacI гендер GenBank-тен қол жетімді (көрініс).

Бірінші бақылау механизмі лактозаға реттеуші жауап болып табылады, ол лактоза болмаған кезде β-галактозидазаның өндірісін тежеу ​​үшін лактоза репрессоры деп аталатын жасушаішілік реттеуші ақуызды пайдаланады. Репрессорды кодтайтын lacI гені жақын жерде орналасқан лак оперон және әрқашан өрнектеледі (конститутивтік). Егер өсу ортасында лактоза жетіспесе, репрессор lacZ деп аталатын промотордан төмен қарай қысқа ДНҚ тізбегімен өте тығыз байланысады. лак оператор. Репрессордың оператормен байланысуы RNAP промотормен байланысуына кедергі жасайды, сондықтан LacZ және LacY кодтайтын мРНҚ өте төмен деңгейде ғана жасалады. Жасушаларды лактозаның қатысуымен өсіргенде, лактозадан lacZ генінің өнімі арқылы жасалған аллолактоза деп аталатын лактоза метаболиті репрессормен байланысып, аллостериялық ығысуды тудырады. Осылайша өзгертілген репрессор оператормен байланыса алмайды, бұл RNAP транскрипциясына мүмкіндік береді. лак гендер және осылайша кодталған ақуыздардың жоғары деңгейіне әкеледі.

Екінші бақылау механизмі глюкозаға жауап болып табылады, ол глюкозаның жоқтығында β-галактозидазаның өндірісін едәуір арттыру үшін катаболиттік активатор ақуызы (CAP) гомодимерін пайдаланады. Циклдік аденозинмонофосфаты (cAMP) – таралу деңгейі глюкозаға кері пропорционалды сигнал молекуласы. Ол CAP-мен байланысады, бұл өз кезегінде CAP-ның CAP байланыстыру орнына байланысуына мүмкіндік береді (төмендегі диаграммада сол жақтағы промотордан жоғары 16 бит ДНҚ тізбегі, транскрипцияның басталу орнынан шамамен 60 бит жоғары) РНАП ДНҚ-мен байланысады. Глюкоза болмаған жағдайда cAMP концентрациясы жоғары және САП-cAMP-ның ДНҚ-мен байланысуы β-галактозидазаның өндірісін айтарлықтай арттырады, бұл жасушаға лактозаны гидролиздеп, галактоза мен глюкозаны босатуға мүмкіндік береді.

Жақында индукторды алып тастау өрнекті блоктау үшін көрсетілді лак глюкоза болған кезде оперон. Глюкоза жасушаға PEP-тәуелді фосфотрансфераза жүйесі арқылы тасымалданады. Фосфоэнолпируваттың фосфаттық тобы жалпы PTS (фосфотрансфераза жүйесі) ақуыздары HPr және EIA және глюкозаға тән PTS ақуыздары EIIAGlc және EIIBGlc, EII glucose тасымалдаушысының цитоплазмалық доменінен тұратын фосфорлану каскады арқылы тасымалданады. Глюкозаның тасымалдануы оның EIIBGlc арқылы фосфорлануымен бірге жүреді, фосфат тобын басқа PTS ақуыздарынан, соның ішінде EIIAGlc ағызу. EIIAGlc фосфорланбаған түрі онымен байланысады лак өткізеді және лактозаның жасушаға енуіне жол бермейді. Сондықтан, егер глюкоза да, лактоза да болса, глюкозаның тасымалдануы индуктордың тасымалдануын блоктайды. лак оперон.

The лак репрессор – төрт бөліктен тұратын ақуыз, тетрамер, бірдей суббірліктер (12.2-сурет). Әрбір суббірлікте ДНҚ-мен байланысуға қабілетті бұралмалы бұралмалы (HTH) мотиві бар. Репрессор байланысатын оператор орны инверттелген қайталанатын симметриялы ДНҚ тізбегі болып табылады. Оператордың екі ДНҚ жартылай учаскелері бірге репрессордың екі бөлімшелерімен байланысады. Репрессордың басқа екі бөлімшелері бұл модельде ештеңе жасамаса да, бұл қасиет көптеген жылдар бойы түсінілмеді.

Ақырында қосымша екі оператордың қатысқаны анықталды лак реттеу. Бірі (O3) lacI генінің соңында O1 ағынының шамамен −90 бит жоғары жағында, ал екіншісі (O2)) lacZ ерте бөлігінде O1 ағынынан шамамен +410 бит төмен орналасқан. Бұл екі учаске ерте жұмыста табылмады, өйткені олардың артық функциялары бар және жеке мутациялар репрессияға қатты әсер етпейді. O2) немесе O3-ке бір ғана мутация 2-3 есе ғана әсер етеді. Дегенмен, олардың маңыздылығы екі еселенген мутантты O2) де, O3-де де ақауы күрт төмендетілгенімен (шамамен 70 есе) көрсетілген.

Қазіргі үлгіде, лак репрессор бір уақытта негізгі оператор O1 екеуіне де, O2) немесе O3-ке де байланысты. Аралық ДНҚ кешеннен шығады. Екі кіші оператордың артық табиғаты маңызды болып табылатын нақты циклдік кешен емес екенін көрсетеді. Бір идея, егер байланыстырылған репрессор O1-ден бір мезетте босатылса, жүйе байланыстыру арқылы жұмыс істейді, кіші операторға байланыстыру оны жақын жерде ұстайды, осылайша ол тез қайта қосылуы мүмкін. Бұл репрессордың O1-ге жақындығын арттырады.

12.2-сурет: арасындағы кешеннің имитациялық құрылымдық моделі лак репрессорлық протеин (LacI) және ұзындығы 107 bp ДНҚ сегменті. Екі димерлі LacI функционалдық бөлімшелері (жасыл + көк және сары + қызғылт сары) әрқайсысы ДНҚ оператор тізбегін (жоғарғы) байланыстырады. LacI денесінің тұрақты денесімен байланысқан ДНҚ-байланыстыратын бас топтарының қозғалғыштығы ДНҚ-ның ілмегі үшін күш береді (Вил және т.б.).

Репрессор аллостериялық ақуыз болып табылады, яғни ол бір-бірімен тепе-теңдікте болатын екі сәл өзгеше пішіннің біреуін қабылдай алады. Бір түрде репрессор оператор ДНҚ-мен жоғары спецификалық түрде байланысады, ал екінші түрінде ол өзінің ерекшелігін жоғалтады. Индукцияның классикалық моделі бойынша индуктордың не аллолактозаның, не IPTG-нің репрессорға қосылуы екі пішін арасындағы репрессордың таралуына әсер етеді. Осылайша, индуктормен байланысқан репрессор ДНҚ байланыстырмайтын конформацияда тұрақтанады. Дегенмен, бұл қарапайым модель бүкіл оқиға бола алмайды, өйткені репрессор ДНҚ-мен айтарлықтай тұрақты байланысады, бірақ ол индукторды қосу арқылы тез бөлінеді. Сондықтан, репрессор ДНҚ-мен байланысқан кезде индуктор репрессормен де байланыса алатыны анық сияқты. Байланыстырудың нақты механизмі қандай екені әлі толық белгісіз.

Репрессордың ДНҚ-мен спецификалық емес байланысуы Лак-оперонның репрессиясында және индукциясында шешуші рөл атқарады. Лак-репрессорлық ақуызды байланыстыратын арнайы орын оператор болып табылады. Спецификалық емес өзара әрекеттесу негізінен заряд-заряд әрекеттесуі арқылы жүзеге асады, ал оператормен байланыс гидрофобты әрекеттесу арқылы күшейтіледі. Бұған қоса, репрессор байланыстыра алатын спецификалық емес ДНҚ тізбегінің көптігі бар. Негізінде, оператор болып табылмайтын кез келген реттілік арнайы емес болып саналады. Зерттеулер көрсеткендей, спецификалық емес байланысуы болмаса, лак-оперонның индукциясы (немесе репрессиясы) индуктордың қаныққан деңгейлерінде де болуы мүмкін емес. Арнайы емес байланыссыз индукцияның базальды деңгейі әдеттегіден он мың есе аз болатыны дәлелденді. Бұл спецификалық емес ДНҚ репрессорлық белоктар үшін «шұңқыр» ретінде әрекет етіп, оларды оператордан алшақтататындығына байланысты. Арнайы емес тізбектер ұяшықтағы қолжетімді репрессордың мөлшерін азайтады. Бұл өз кезегінде жүйені басуға қажетті индуктордың мөлшерін азайтады.

Лактозамен жұмыс істеу үшін пайдалы бірқатар лактоза туындылары немесе аналогтары сипатталған лак оперон. Бұл қосылыстар негізінен алмастырылған галактозидтер болып табылады, мұнда лактозаның глюкоза бөлігі басқа химиялық топпен ауыстырылады. Изопропил-β-D-тиогалактопиранозид (IPTG) жиі индуктор ретінде қолданылады. лак физиологиялық жұмыс үшін оперон. IPTG репрессормен байланысады және оны инактивациялайды, бірақ β-галактозидаза үшін субстрат болып табылмайды. In vivo зерттеулерге арналған IPTG бір артықшылығы оның метаболизденуі мүмкін еместігі болып табылады E. coli оның концентрациясы тұрақты болып қалады және экспрессия жылдамдығы лак p/o-бақыланатын гендер экспериментте айнымалы емес. IPTG қабылдау P. fluorescens-тегі лактоза өткізгіштігінің әсеріне байланысты, бірақ ол емес. E. coli.

Франсуа Якоб пен Жак Монод қолданған тәжірибелік микроорганизм қарапайым зертханалық бактерия болды, E. coli, бірақ Джейкоб пен Монод ашқан негізгі реттеуші концепциялардың көпшілігі барлық ағзалардағы жасушалық реттеудің негізі болып табылады. Негізгі идея - ақуыздар қажет емес кезде синтезделмейді — Е. coli лактозаны метаболиздеу қажет болмаған кезде, мысалы, глюкоза сияқты басқа қанттар болған кезде, үш Lac ақуызын жасамай, жасушалық ресурстар мен энергияны сақтайды. Келесі бөлімде қалай әрекет ету қарастырылады E. coli зат алмасу қажеттіліктеріне жауап ретінде белгілі бір гендерді бақылайды.

Екінші дүниежүзілік соғыс кезінде Монод қоректік көздер ретінде қант комбинацияларының әсерін сынады E. coli және B. subtilis. Монод басқа ғалымдар бактериялар мен ашытқылармен жүргізген ұқсас зерттеулерді қадағалады. Ол екі түрлі қантпен өсірілген бактериялардың өсудің екі фазасын көрсететінін анықтады. Мысалы, глюкоза мен лактозаның екеуі де қамтамасыз етілсе, алдымен глюкоза метаболизденді (өсу фазасы I, 2-суретті қараңыз), содан кейін лактоза (өсу фазасы II). Диаксикалық өсу қисығының бірінші бөлігінде лактоза метаболизденген жоқ, өйткені ортада глюкоза да, лактоза да болған кезде β-галактозидаза жасалмаған. Монод бұл құбылысты диаукс деп атады.

Содан кейін Монод лактоза қоректік ортадағы жалғыз қант болған кезде пайда болған β-галактозидаза түзілу индукциясына назарын аударды.

Джейкоб пен Монодтың концептуалды жетістігі реттеуші заттар мен ген экспрессиясын өзгерту үшін әрекет ететін орындар арасындағы айырмашылықты тану болды. Бұрынғы сарбаз Джейкоб арнайы радиохабар немесе сигнал алғаннан кейін өлімге әкелетін жүкті жіберетін бомбалаушы ұшақтың ұқсастығын қолданды. Жұмыс жүйесі ұшақта жердегі таратқышты да, қабылдағышты да қажет етеді. Енді әдеттегі таратқыш бұзылды делік. Бұл жүйе екінші, функционалды таратқышты енгізу арқылы жұмыс істей алады. Керісінше, оның айтуынша, қабылдағышы ақаулы бомбалаушыны қарастырыңыз. Бұл бомбалаушының мінез-құлқын екінші, функционалды ұшақты енгізу арқылы өзгерту мүмкін емес.

реттеуші мутанттарды талдау лак Оперон, Джейкоб екінші көшірмесін жасайтын жүйені жасады лак гендер (промоторы бар lacI және промоторы мен операторы бар lacZYA) бір жасушаға енгізілуі мүмкін. Мұндай бактериялардың культурасы, олар үшін диплоидты болып табылады лак гендер, бірақ басқаша қалыпты болса, реттеуші фенотипке сыналады. Атап айтқанда, LacZ және LacY тіпті IPTG болмаған кезде де (мутанттық ген шығаратын лактоза репрессорының жұмыс істемейтініне байланысты) жасалғаны анықталады. Гендер немесе гендік кластерлер жұппен тексерілетін бұл тәжірибе комплементациялық сынақ деп аталады.

Бұл сынақ 12.4-суретте көрсетілген (қарапайымдылық үшін lacA көрсетілмеген). Біріншіден, белгілі бір гаплоидтық күйлер көрсетіледі (яғни жасушада тек бір ғана көшірме бар лак гендер). (a) панелі репрессияны көрсетеді, (b) IPTG арқылы индукцияны көрсетеді және (c) және (d) сәйкесінше lacI геніне немесе операторға мутацияның әсерін көрсетеді. (e) панелінде репрессорға арналған толықтыру сынағы көрсетілген. Егер бір данасы лак гендер lacI мутациясын тасымалдайды, бірақ екінші көшірме lacI үшін жабайы типті, нәтижесінде алынған фенотип қалыпты — бірақ lacZ индуктор IPTG әсер еткенде көрінеді. Репрессорға әсер ететін мутациялар жабайы түрге рецессивті (және бұл жабайы түрі басым) деп аталады және бұл репрессордың жасушада диффузиялануы мүмкін шағын ақуыз екендігімен түсіндіріледі. көшірмесі лак ақаулы lacI геніне іргелес оперон lacI екінші көшірмесінен алынған ақуыз арқылы тиімді түрде жабылады.

Егер бір тәжірибе операторлық мутация арқылы жүргізілсе, басқа нәтиже алынады (панель (f)). Бір мутантты және бір жабайы типті оператор аймағын тасымалдайтын жасушаның фенотипі LacZ және LacY тіпті IPTG индукторы болмаған кезде де өндіріледі, себебі зақымдалған оператор учаскесі құрылымдық гендердің транскрипциясын тежеу ​​үшін репрессордың байланысуына мүмкіндік бермейді. Операторлық мутация басым. Репрессорды байланыстыруға тиіс оператор учаскесі мутациямен зақымдалғанда, сол жасушада екінші функционалдық учаскенің болуы мутант учаскесі басқаратын гендердің экспрессиясына ешқандай айырмашылықты жасамайды.

Бұл эксперименттің неғұрлым күрделі нұсқасы екі көшірменің арасындағы айырмашылықты анықтау үшін белгіленген оперондарды пайдаланады. лак гендер және реттелмейтін құрылымдық гендер мутант операторының (панель (g)) жанындағы бір(лар) екенін көрсетеді. Мысалы, бір көшірме lacZ белсендірмейтін мутациямен белгіленген делік, ол тек LacY протеинін түзеді, ал екінші көшірме lacY-ге әсер ететін мутацияны алып жүреді және тек LacZ-ды шығара алады.Бұл нұсқада тек протеиннің көшірмесі ғана. лак мутант операторына іргелес жатқан оперон IPTGсіз өрнектеледі. Оператор мутациясын цис-доминантты деп айтамыз, ол жабайы түрге басым, бірақ оған тікелей іргелес жатқан оперонның көшірмесіне ғана әсер етеді.

Бұл түсініктеме маңызды мағынада жаңылыстырады, өйткені ол эксперименттің сипаттамасынан шығады, содан кейін нәтижелерді үлгі тұрғысынан түсіндіреді. Бірақ, шын мәнінде, модель бірінші орынға шығады және эксперимент модельді сынау үшін арнайы жасалады. Джейкоб пен Монод алдымен ДНҚ-да оператордың қасиеттері бар сайт болуы керек деп елестеді, содан кейін осыны көрсету үшін өздерінің комплементациялық сынақтарын жасады.

Оператор мутанттарының басым болуы оларды арнайы таңдау процедурасын ұсынады. Егер реттеуші мутанттар жоғарыда сипатталғандай фенил-Гал көмегімен жабайы түрдегі культурадан таңдалса, репрессорлық мутанттармен салыстырғанда операторлық мутациялар сирек кездеседі, себебі нысана өлшемі өте кішкентай. Бірақ оның орнына бүтіннің екі көшірмесін алып жүретін штаммнан бастасақ лак аймақ (яғни lac үшін диплоид), репрессорлық мутациялар (әлі де орын алады) қалпына келтірілмейді, өйткені екінші жабайы типті lacI генімен толықтыру жабайы типті фенотипті береді. Керісінше, оператордың бір көшірмесінің мутациясы мутант фенотипін береді, себебі ол екінші жабайы түрдегі көшірмеге басым.

Диаксияны түсіндіру оған әсер ететін қосымша мутациялардың сипаттамасына байланысты лак классикалық модельмен түсіндірілетіндерден басқа гендер. Кейіннен басқа екі ген, cya және crp анықталды, олар лактан алыс картаға түсірілген және мутацияға ұшыраған кезде IPTG қатысуымен және тіпті репрессор немесе операторы жоқ бактерия штаммдарында экспрессия деңгейінің төмендеуіне әкеледі. жылы cAMP ашылуы E. coli циа генін бұзатын мутанттар, бірақ crp гені емес, ортаға cAMP қосу арқылы толық белсенділік қалпына келтірілмейтінін көрсетуге әкелді.

Циа гені cAMP түзетін аденилатциклазаны кодтайды. Циа мутантында cAMP болмауы lacZYA гендерінің экспрессиясын қалыптыдан он есе төмен етеді. cAMP қосу циа мутанттарына тән төмен Lac экспрессиясын түзетеді. Екінші ген, crp, катаболит активатор ақуызы (CAP) немесе cAMP рецепторлық ақуызы (CRP) деп аталатын ақуызды кодтайды.

Дегенмен, лактоза алмасуының ферменттері глюкозаның да, лактозаның да қатысуымен (кейде ағып кететін экспрессия деп аталады) аз мөлшерде жасалады, өйткені LacI репрессоры ДНҚ-мен тығыз байланыспай, онымен тез байланысады/дисоциацияланады, бұл уақытты қамтамасыз етеді. RNAP lacZYA мРНҚ-ларын байланыстыру және транскрипциялау үшін. Глюкоза көзі жұмсалғаннан кейін кейбір лактозаның метаболизмін қамтамасыз ету үшін ағып кету қажет, бірақ оған дейін лак өрнек толығымен белсендірілген.

  • Лактоза болмаған кезде лак ферментінің өндірілуі өте аз болады (операторда онымен байланыстырылған лак репрессоры бар).
  • Егер лактоза болса, бірақ көміртегінің қолайлы көзі (мысалы, глюкоза) бар болса, ферменттің аз мөлшері пайда болады (Лак репрессоры операторға байланысты емес).
  • Глюкоза болмаған кезде CAP-cAMP промотордың жоғары жағындағы белгілі бір ДНҚ учаскесіне байланысады және RNAP промотормен байланысуын жеңілдететін РНАП-пен тікелей ақуыз-белок әрекеттеседі.

Өсу фазалары арасындағы кідіріс лактозаны метаболиздендіретін ферменттердің жеткілікті мөлшерін өндіруге қажетті уақытты көрсетеді. Біріншіден, CAP реттеуші ақуызы жиналуы керек лак промоутер, нәтижесінде өндірістің ұлғаюы лак мРНҚ. Қосымша қолжетімді көшірмелер лак мРНҚ нәтижесінде LacZ (β-галактозидаза, лактоза алмасуы үшін) және LacY (лактозаны жасушаға тасымалдау үшін лактоза өткізгіштігі) айтарлықтай көбірек көшірмелерін (аудармасын қараңыз) шығарады. Лактозаны метаболиздендіретін ферменттердің деңгейін жоғарылату үшін қажет кідірістен кейін бактериялар жасуша өсуінің жаңа жылдам кезеңіне өтеді.

Катаболиттік репрессияның екі басқатырғышы cAMP деңгейлері глюкозаның болуына байланысты, ал екіншіден, жасушалар неге алаңдатуы керек. Лактоза ыдырағаннан кейін ол глюкоза мен галактозаны түзеді (глюкозаға оңай айналады). Метаболизм тұрғысынан лактоза глюкоза сияқты көміртегі және энергия көзі болып табылады. cAMP деңгейі глюкозаның жасушаішілік концентрациясына емес, аденилатциклаза белсенділігіне әсер ететін глюкозаның тасымалдану жылдамдығына байланысты. (Сонымен қатар, глюкозаның тасымалдануы лактоза өткізгіштігін тікелей тежеуге әкеледі.) Неліктен E. coli осылай жұмыс істейді, тек болжам жасауға болады. Барлық ішек бактериялары глюкозаны ашытады, бұл олардың жиі кездесетінін көрсетеді. Глюкозаның лактозаға қарсы тасымалдануы немесе метаболизмінің тиімділігіндегі шамалы айырмашылық жасушалардың реттеуін тиімді етеді. лак осылайша оперон.

The лак ген және оның туындылары транскрипциялық активатордың белгілі бір промоторлар тізбегімен сәтті байланысуы анықталуы тиіс екі гибридтік талдау сияқты бірқатар бактерияға негізделген іріктеу әдістерінде репортер ген ретінде пайдалануға жарамды. Құрамында X-gal бар LB пластиналарында түстің ақ колониялардан көк реңкке дейін өзгеруі шамамен 20-100 β-галактозидаза бірліктеріне сәйкес келеді, ал тетразолий лактозасы мен МакКонки лактоза ортасының диапазоны 100-1000 бірлікке жетеді, олар ең сезімтал осы диапазонның сәйкесінше жоғары және төменгі бөліктері. MacConkey лактоза және тетразолий лактоза ортасы екеуі де лактозаның ыдырау өнімдеріне негізделгендіктен, олар lacZ және lacY гендерінің болуын талап етеді. Көпшілік лак тек lacZ генін қамтитын біріктіру әдістері осылайша X-gal пластиналарына немесе ONPG сұйық сорпаларына сай келеді. ONPG (орто-нитрофенил-β-галактозид) β-галактозидаза белсенділігін анықтауға арналған колориметриялық және спектрофотометриялық субстрат болып табылады. Бұл қосылыс әдетте түссіз. Алайда, егер β-галактозидаза болса, ол ONPG молекуласын галактозаға және орто-нитрофенолға гидролиздейді. Соңғы қосылыстың сары түсі бар, оны колориметриялық талдау (толқын ұзындығы 420 нм) арқылы ферменттердің белсенділігін тексеру үшін пайдалануға болады. β-галактозидаза лактозаны кәдеге жарату үшін қажет, сондықтан өндірілген түстің қарқындылығын ферментативті жылдамдықтың өлшемі ретінде пайдалануға болады. ONPG лактозаны еліктейді және β-галактозидазамен гидролизденеді, бірақ ол индуктор ретінде әрекет ете алмайды. лак оперон. Изопропил β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) сияқты индуктор ретінде әрекет ете алатын басқа лактозаның аналогы болмаса, β-галактозидаза транскрипцияланбайды және ONPG гидролизденбейді.


Лактоза операторының конститутивтік мутацияларының табиғаты ☆,☆☆

Көп санды талдау О c лак оперонының мутанттары мынаны көрсететін дәлелдер келтірді: (а) басым болуы О c мутациялары негізгі алмастыру түріне жатады және олардың барлығы лак ферментінің синтезі үшін ішінара ғана конститутивтілікті береді (b) іс жүзінде барлығы бір сатылы О c мутациялар конститутивтік деңгейлеріне қатысты аздаған кластардың біреуіне немесе екіншісіне жатады (в) көп О c мутациялардың қатарлас промоторлық әсерлері де бар, яғни Лак ферментінің синтезінің максималды деңгейіне әсер етеді.

Бұл жұмысқа GM13383 және GM16308 грант нөмірлері бойынша Ұлттық денсаулық сақтау институттары қолдау көрсетті, ал біздің біріміз (JRS) мансапты дамыту сыйлығының иегері, GM-28123, ал екіншісі (TS) HD 42801 Ұлттық денсаулық сақтау докторынан кейінгі стипендиясының алушысы болдық. .

Бұл үлес №. 415 Элеонора Рузвельт онкологиялық зерттеулер институты және биофизика бөлімі, Колорадо университетінің медициналық орталығы, Денвер, Колорадо.


Сыни тұрғыдан ойлауға арналған сұрақтар

Бір организмнің барлық жасушалары геномды бөліседі. Дегенмен, даму барысында кейбір жасушалар тері жасушаларына, ал басқалары бұлшықет жасушаларына айналады. Бірдей генетикалық нұсқаулар бір организмде екі түрлі жасуша түріне қалай әкелуі мүмкін? Жауабыңызды мұқият түсіндіріңіз.

Жасушалар әртүрлі жасуша түрлеріне (мысалы, тері жасушалары, бұлшықет жасушалары және т.б.) дифференцияланған кезде әртүрлі генетикалық бағдарламалар қосылады немесе өшіріледі. Нәтижесінде жасушалар өздері орналасқан тінге қажетті гендерді экспрессиялайды.

  1. Ортада лактоза мен глюкоза болған кезде лак оперонның транскрипциясы индукцияланады.
  2. Егер лактоза болса, бірақ глюкоза жоқ болса, лак опероны басылады.
  3. Lactose acts as an inducer of the lac operon when glucose is absent.
  4. Lactose acts as an inducer of the lac operon when glucose is present.
  1. Mutation in structural genes will stop transcription.
  2. Mutated lacY will prevent CAP from binding.
  3. Mutated lacA will metabolize lactose or maltodextrin.
  4. Transcription will continue but lactose will not be metabolized properly.

In some diseases, alteration to epigenetic modifications turns off genes that are normally expressed. Гипотетикалық түрде, бұл гендерді қайта қосу үшін бұл процесті қалай өзгертуге болады?

  1. In new seedlings, histone acetylations are present upon cold exposure, methylation occurs.
  2. In new seedlings, histone deacetylations are present upon cold exposure, methylation occurs.
  3. In new seedlings, histone methylations are present upon cold exposure, acetylation occurs.
  4. In new seedlings, histone methylations are present upon cold exposure, deacetylation occurs.
  1. Mutated promoters decrease the rate of transcription by altering the binding site for the transcription factor.
  2. Mutated promoters increase the rate of transcription by altering the binding site for the transcription factor.
  3. Mutated promoters alter the binding site for transcription factors to increase or decrease the rate of transcription.
  4. Mutated promoters alter the binding site for transcription factors and thereby cease transcription of the adjacent gene.
  1. The transcription rate would increase, altering cell function.
  2. The transcription rate would decrease, inhibiting cell functions.
  3. The transcription rate decreases due to clogging of the transcription factors.
  4. The transcription rate increases due to clogging of the transcription factors.

The wnt transcription pathway is responsible for key changes during animal development. Based on the transcription pathway shown below. In this diagram, arrows indicate the transformation of one substance into another. Square lines, or the lines with no arrowheads, indicate inhibition of the product below the line. Based on this, how would increased wnt gene expression affect the expression of Bar-1?

  1. RBPs can bind first to the RNA, thus preventing the binding of miRNA, which degrades RNA.
  2. RBPs bind the miRNA, thereby protecting the mRNA from degradation.
  3. RBPs methylate miRNA to inhibit its function and thus stop mRNA degradation.
  4. RBPs direct miRNA degradation with the help of a DICER protein complex.
  1. UV rays can alter methylation and acetylation of proteins.
  2. RNA binding proteins are modified through phosphorylation.
  3. External stimuli can cause deacetylation and demethylation of the transcript.
  4. UV rays can cause dimerization of the RNA binding proteins.
  1. Phosphorylation of proteins can alter translation, RNA shuttling, RNA stability or post transcriptional modification.
  2. Phosphorylation of proteins can alter DNA replication, cell division, pathogen recognition and RNA stability.
  3. Phosphorylated proteins affect only translation and can cause cancer by altering the p53 function.
  4. Phosphorylated proteins affect only RNA shuttling, RNA stability, and post-translational modifications.
  1. UV rays could cause methylation and deacetylation of the genes that could alter the accessibility and transcription of DNA.
  2. The UV rays could cause phosphorylation and acetylation of the DNA and histones which could alter the transcriptional capabilities of the DNA.
  3. UV rays could cause methylation and phosphorylation of the DNA bases which could become dimerized rendering no accessibility of DNA.
  4. The UV rays can cause methylation and acetylation of histones making the DNA more tightly packed and leading to inaccessibility.
  1. These drugs maintain the demethylated and the acetylated forms of the DNA to keep transcription of necessary genes “on”.
  2. The demethylated and the acetylated forms of the DNA are reversed when the silenced gene is expressed.
  3. The drug methylates and acetylates the silenced genes to turn them back “on”.
  4. Drugs maintain DNA methylation and acetylation to silence unimportant genes in cancer cells.
  1. Understanding gene expression patterns in cancer cells will identify the faulty genes, which is helpful in providing the relevant drug treatment.
  2. Understanding gene expression will help differentiate cancerous cells from malignant cells.
  3. Gene profiling would identify the target genes of the cancer-causing bacteria.
  4. Breast cancer patients who do not express EGFR can respond to anti-EGFR therapy.
  1. Personalized medicines would vary based on the type of mutations and the gene’s expression pattern.
  2. The medicines are given based on the type of tumor found in the body of an individual.
  3. The personalized medicines are provided based only on the symptoms of the patient.
  4. The medicines tend to vary depending on the severity and the stage of the cancer.

Amazon Associate ретінде біз талаптарға сай сатып алулардан пайда аламыз.

Осы кітапты келтіргіңіз, бөліскіңіз немесе өзгерткіңіз келе ме? Бұл кітап Creative Commons Attribution License 4.0 болып табылады және сіз OpenStax атрибуты қажет.

    Егер сіз осы кітапты толығымен немесе бір бөлігін басып шығару пішімінде қайта таратып жатсаңыз, әрбір физикалық бетте келесі атрибутты қосуыңыз керек:

  • Дәйексөз жасау үшін төмендегі ақпаратты пайдаланыңыз. Осы сияқты дәйексөз құралын пайдалануды ұсынамыз.
    • Авторлары: Джулианна Зедалис, Джон Эггебрехт
    • Баспагер/веб-сайт: OpenStax
    • Кітап атауы: AP® курстарына арналған биология
    • Жарияланған күні: 8 наурыз 2018 ж
    • Орналасқан жері: Хьюстон, Техас
    • Кітаптың URL мекенжайы: https://openstax.org/books/biology-ap-courses/pages/1-introduction
    • Section URL: https://openstax.org/books/biology-ap-courses/pages/16-critical-thinking-questions

    © 12 қаңтар, 2021 OpenStax. OpenStax шығарған оқулық мазмұны Creative Commons Attribution License 4.0 лицензиясы бойынша лицензияланған. OpenStax атауы, OpenStax логотипі, OpenStax кітап мұқабалары, OpenStax CNX атауы және OpenStax CNX логотипі Creative Commons лицензиясына жатпайды және Райс университетінің алдын ала және тікелей жазбаша келісімінсіз қайта шығаруға болмайды.


    • This document and 3 million+ documents and flashcards
    • High quality study guides, lecture notes, practice exams
    • Course Packets handpicked by editors offering a comprehensive review of your courses
    • Better Grades Guaranteed

    BIOL 3301 EXAM 3 Section 07869 GENETICS Wednesday April 2 2003 1 00 2 30 pm NOTE MAKE SURE YOU READ THE QUESTIONS CAREFULLY Name SSN True false statements write True or False in front of the statement 2 points each 1 The experiments by Griffith on Streptococcus pneumoniae were the first demonstration of bacterial transformation T 2 DNA polymerase III is the main activity during DNA replication T 3 Helicase is required for synthesis of the RNA primer during DNA replication F 4 Topoisomerase is a reverse transcriptase that maintains chromosome ends F 5 DNA ligase catalyzes the formation of hydrogen bonds F 6 The RNA polymerase core enzyme is sufficient for correct initiation of transcription F 7 Protein synthesis is terminated by a rho dependent mechanism F 8 IF2 stimulates binding of the 30S ribosome subunit to mRNA F 9 A homeodomain is a cis regulatory sequence F 10 Enhancers can only operate upstream of promoters they are enhancing F Multiple choice circle the correct answer 2 points each 1 A sample of normal double stranded DNA was found to have a thymine content of 27 What is the expected proportion of guanine a 9 b 23 c 32 d 36 e 73 2 The figure shown below depicts the structure of a dATP b dCTP c ddATP d UTP e ddTTP 3 Hershey and Chase proved that DNA is the transforming principle They observed that the isotope accumulated in the bacteria was a 31P b 35S c 32P d 15N e none of the above 4 In a DNA double helix nucleotides on complementary strands are held together by a covalent bonds b salt bridges c hydrogen bonds d phosphodiester bonds e none of the above 5 Meselsohn and Stahl demonstrated that DNA replication is a conservative b dispersive c funky d semi conservative e none of the above 6 rII mutants are grown on the restrictive host E coli K plate 1 and on the permissive host E coli B plate 2 The plaques appear as follows a Plate 1 no plaques Plate 2 large plaques b Plate 1 large plaques Plate 2 large plaques c Plate 1 small plaques Plate 2 small plaques d Plate 1 no plaques Plate 2 small plaques e Plate 1 no plaques Plate 2 no plaques 7 Mutations that do not complement are a allelic b non allelic c intergenic d null mutants e missense mutations 8 A tRNA with the anticodon 3 UGG 5 would carry a phenylalanine b tyrosine c tryptophane d serine e threonine 9 The E coli RNA polymerase holoenzyme consists of the following subunits a 2 1 1 1 b 2 2 1 c 2 1 1 d 1 2 1 1 e 2 2 1 10 The following diagram shows a fragment of transcribed DNA and the upper strand is the template strand 5 ATTGCC 3 3 TAACGG 5 The transcribed RNA can be represented by a 5 AUUGCC 3 b 5 TAACGG 3 c 5 AUUGCC 3 d 5 UAACGG 3 e 5 GGCAAU 3 11 EF Tu is required for a loading aminoacyl tRNA into the A site of the ribosome b regenerating EF Ts c translocation of the peptidylchain d translocation of the ribosome e releasing empty tRNAs from the ribosome 12 Stop codons are not recognized by tRNAs but by a ribosomes b the Shine Dalgarno sequence c release factors d EF Tu e IF3 13 A partial diploid of genotype I P O Z Y I P O Z Y will show a inducible production of beta galactosidase b inducible production of beta galactosidase and permease c constitutive production of beta galactosidase and permease d inducible production of permease e no beta galactosidase or acetylase production at all 14 Which of the following statements is true for eukaryotic RNA polymerases a RNA polymerase I synthesizes mRNA b RNA polymerase II synthesizes snRNA and rRNA c RNA polymerase I synthesizes rRNA d RNA polymerase III synthesizes mRNA e none of the above 15 Transcription termination in eukaryotes depends on a a hairpin structure b Rho termination factor c recognition of a AAUAAA sequence and endonuclease cleavage d polyadenylation e guanyltransferase Fill in 2 points each 1 Two of the bases Adenine and Guanine are similar in structure and are called purines The other two bases Thymine and Cytosine are called pyrimidines 2 B DNA is the most common form of DNA The spacing between basepairs is 3 4 A 3 Yanofsky studied the trp synthetase gene and demonstrated the colinearity of gene and protein 4 E coli DNA replication begins from a fixed origin but then proceeds bidirectionally ending at a site called the terminus 5 Translation initiation depends on recognition of the Shine Dalgarno sequence by the 3 end of 16S rRNA Homework 1 A We are studying some of the Neurospora mutants described by Beadle and Tatum These mutants numbered 1 to 7 are all involved in the same biosynthetic pathway The compounds generated in the different biosynthetic steps are A B C D F G H I Reconstruct the biosynthetic pathway starting on the left with the compound that comes first in the biosynthetic pathway 7 points Compound tested growth no growth A B C D F G H I 1 2 3 4 5 6 7 H G I A D F B C 4 7 3 2 5 6 1 B What are auxotrophic mutants 3 points Mutants that require addition of a supplement to grow on minimal medium 2 You are studying a gene in E coli that specifies a protein A part of its sequence is Phe Tyr Ser Trp Glu Ala Met ThrYou recover a series of mutants for this gene that show no enzymatic activity By isolating the mutant enzyme products you find the following sequences Mutant 1 Phe Asn Ser Trp Glu Ala Met Thr Mutant 2 Phe Tyr Ser Trp Mutant 3 Phe His Cys Leu Pro Ala Val Thr Mutant 4 Phe Tyr Met Leu Gly Ala Met Thr What is the DNA sequence that specifies this part of the protein What is the molecular nature for each mutation 10 points Wildtype TTC TAT TCN TGG GAA GCN ATG ACN C C AGT G C Mutant 1 TTC AAT TCN TGG GAA GCN ATG ACN C C AGT G C Point mutation leads to amino acid substitution Mutant 2 TTC AAT TCN TGG TAA C C AGT C Point mutation leads to stop codon Mutant 3 TTC CAT TGT CTN CCN GCN GTN ACN C C C TTA G Inversion Mutant 4 TTC TAT ATG CTN GGN GCN ATG ACN C C TTA G Insertion single underlined and deletion double underlined Open questions 20 points NOTE If you would run out of space you can also use the back of this page to continue your answer Describe and explain the lac operon and its regulation including catabolite repression LAC OPERON STRUCTURE The lac operon consists of POZYA P O are cis regulatory sequences P promoter O operator ZYA are structural genes lacZ encodes beta galactosidase lacY encodes permease lacA encodes transacetylase Beta galactosidase converts lactose into glucose and …


    Important topics of solutions for NCERT class 12 biology chapter 6 molecular basis of inheritance:

    6.1.1 Structure of Polynucleotide Chain

    6.1.2 Packaging of DNA Helix

    6.2 The Search for Genetic Material

    6.2.1 The Genetic Material is DNA

    6.2.2 Properties of Genetic Material (DNA versus RNA)

    6.4.1 The Experimental Proof

    6.4.2 The Machinery and the Enzymes

    6.5.2 Transcription Unit and the Gene

    6.5.3 Types of RNA and the process of Transcription

    6.6.1 Mutations and Genetic Code

    6.6.2 tRNA– the Adapter Molecule

    6.8 Regulation of Gene Expression

    6.9.1 Salient Features of Human Genome

    6.9.2 Applications and Future Challenges

    In CBSE NCERT solutions for class 12 biology chapter 6 molecular basis of inheritance, you will also get solutions to the questions based on the human genome project as it was a megaproject that aimed to sequence every base in the human genome. This project has yielded much new information among us. Many new areas and avenues have opened up as a consequence of the project. In NCERT solutions for class 12 biology chapter 6 molecular basis of inheritance, you will get an explanation of DNA Fingerprinting. It is a technique to find out variations in individuals of a population at the DNA level. It works on the principle of polymorphism in DNA sequences.

    In solutions for NCERT class 12 biology chapter 6 molecular basis of inheritance, you will get solutions to the questions based on two important nucleic acid which is also called as genetic materials for living organisms and these are:

    DNA and RNA are the two types of nucleic acids found in living systems whereas DNA is double-stranded and RNA is single-stranded, DNA acts as the genetic material in most of the organisms and RNA acts as genetic material in some viruses, mostly functions as a messenger. In NCERT solutions for class 12 biology chapter 6 molecular basis of inheritance, you will get solutions to the questions on Central dogma which consists of three important things that are:

    After going through solutions for NCERT class 12 biology chapter 6 molecular basis of inheritance you will be able to answer all the questions which are given at the end of this chapter.


    МАТЕРИАЛДАР МЕН ТӘСІЛДЕР

    Preparation of proteins and DNA

    Lac repressor (both wild-type and mutants) was overexpressed in BLIM cells (22) and purified according to Chen and Matthews (23). The DNA construct used in TPM experiments was synthesized by PCR similarly to the method described by Finzi and Gelles (20). Briefly, the pRW490 plasmid (19), containing two primary operators (with sequence 5′-TGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAAT-TTCACACAGG-3′) spaced 305 bp apart, was used as template in a PCR (201223, Qiagen, Germany) employing the following primers (MWG-Biotech AG, Germany): 5′-Biotin-AGATCCAGTTCGATGT-3′ 5′-Digoxigenin-ATAGTGGCTCCAAGTAGC-3′.

    The PCR product (purified using 28104, Qiagen, Germany) is a 1302 bp molecule labeled with biotin at one end and with digoxigenin at the other end (see Figure 1 ).

    A flow chamber (with a volume of � μl) was constructed between a microscope slide and a coverslip kept at a distance of � μm by double-sided tape. Strips of silicon grease were deposited on the inner side of the tape to provide lateral sealing and avoid contact of the solution with the tape itself. The microscope slides were previously cleaned in an ultrasonic bath in ethanol for 5 min. The coverslips were cleaned further by a 10 min treatment with reactive ion plasma in a radio-frequency plasma cleaner (PDC-002, Harrick Inc., NY).

    Buffers and sample preparation for TPM

    Unless otherwise specified, all chemicals and reagents were purchased from Sigma𠄺ldrich. The sample was prepared as follows. All steps were performed at room temperature long incubations were conducted in a water-saturated container to avoid evaporation of the sample. A solution containing 20 μg/ml anti-digoxigenin (1333089, Roche, IN) in phosphate-buffered saline (PBS) buffer [2.7 mM KCl, 137 mM NaCl, 5.4 mM Na2HPO4 and 1.8 mM KH2PO4 (pH 7.4)] was introduced into the flow chamber and incubated for 20 min to insure optimal surface coating. The excess antibody was then removed by washing the chamber 5𠄷 times with 80 μl of LBB buffer [10 mM Tris–HCl (pH 7.4), 200 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 5% (v/v) dimethyl sulfoxide (DMSO), 0.2 mM DTT, 0.1 mg/ml α-casein]. The DNA sample (80 μl at a concentration of � ng/ml in LBB buffer: this DNA concentration was chosen to maximize single DNA tethers as described below) was then introduced in the chamber and incubated for 1 h. Unbound DNA was removed by washing with 7 × 50 μl LBB − buffer (LBB lacking DTT and DMSO). Streptavidin-coated polystyrene microspheres (diameter 440 nm, Indicia Biotechnology, France) in LBB − buffer were then introduced in the flow chamber and incubated for 30 min. Unbound microspheres were finally removed with 5 × 50 μl washes of LBB buffer supplemented with Lac repressor at a tetramer concentration of 4, 20 or 100 pM, depending on the experiment. The flow chamber was then sealed with silicon grease to allow prolonged observation at the microscope (each slide could be observed for several hours without detectable loss in activity of LacI).

    Data collection and analysis

    The slide was mounted on an inverted microscope (Eclipse TE300, Nikon, Japan), images of a region of interest containing the microsphere chosen were acquired at a frequency of 25 Hz with a video camera (C3077-71, Hamamatsu, Japan) and digitized with an A/D converter (IMAQ PCI-1408, National Instruments, TX). The software for instrumentation control, data acquisition and data processing was written in Labview (v. 6.0, National Instruments, TX). Microspheres were chosen for recording based on the range of mobility exhibited each microsphere was normally monitored for 𢏁 h.

    The position of the microsphere in the sample plane (x-y plane) was monitored in real-time during the experiment using a centroid algorithm (24,25): each video frame was deinterlaced and calculation of the centroid was performed separately, after background subtraction, on the even and odd lines of the image, to obtain measurements of the bead's position with a frequency of 50 Hz. The average radius of mobility of the microsphere was calculated in real-time and charted, during the experiment, at the desired frequency. The x және ж coordinates of the microsphere, determined at a frequency of 50 Hz, were also stored for subsequent analysis as described below. Symmetry of the distribution of centroid positions in the x-y plane was used as diagnostic to insure that the microsphere would not be tethered by multiple DNA molecules or be perturbed in its diffusive motion by surface irregularities (25,26). Additionally, the DNA dilution adopted for all experiments had been previously optimized for a relatively high yield of tethered microspheres (density of about 1 tethered microsphere in each microscope field of 34 × 26 μm 2 ) with a negligible probability of multiple DNA molecules bound to the same microsphere.

    At the end of the experiment, data were analyzed as follows. Slow apparatus fluctuations and drift in stage position were removed from the x(т) және ж(т) recordings by filtering the data with a Butterworth high-pass filter (cutoff frequency of 0.1 Hz). From the filtered data, Р(т) was then calculated as [ x ( t ) ] 2 + [ y ( t ) ] 2 and a running average 〈Р(т)〉 was calculated by filtering the Р(т) trace with a Gaussian filter (27). For each microsphere a set of four 〈Р(т)〉 traces was calculated using Gaussian filters with cutoff frequencies of 0.133, 0.066, 0.044 and 0.033 Hz, corresponding to standard deviations of the filter's impulse response of 1, 2, 3 and 4 s, respectively. The left panels of Figures 2 and ​ and3 3 show examples of 〈Р(т)〉 traces obtained with a filter cutoff frequency of 0.066 Hz.

    Examples of TPM experimental recordings obtained with wild-type LacI. The left panels show time courses of the average radius of microsphere mobility, 〈Р(т)〉 (calculated as described in the Materials and Methods section, choosing a Gaussian filter with cutoff frequency of 0.066 Hz) obtained with LacI at a concentration of 100 pM (а), 20 pM (в), and 4 pM (e). The right panels show the distributions of 〈Р(т)〉 corresponding to each of the recordings shown on the left. The lines represent the best fit of the sum of two Gaussians (see Materials and Methods) to the histogram. The fitted parameters are shown in the insets.

    Examples of TPM experimental recordings obtained with LacI mutants Q60G and Q60 + 1. The left panels show time courses of the average radius of mobility, 〈Р(т)〉 (calculated as in Figure 2 ), obtained with Q60G (а) and Q60 + 1 (в) at a concentration of 100 pM. Histograms (shown on the right) are fitted with two Gaussians as described in Figure 2 .

    Dwell-times were extracted from each 〈Р(т)〉 recording using a half-amplitude threshold method (27): the 〈Р(т)〉 distribution (the right panels of Figures 2 and ​ and3 3 show some examples) was fitted with a double Gaussian: A 1 exp [ − ( x − x c 1 ) 2 / 2 σ 1 2 ] + A 2 exp [ − ( x − x c 2 ) 2 / 2 σ 2 2 ] . For each recording, the threshold was set half way between the peaks of the two fitted Gaussian curves.

    A first semi-quantitative analysis of dwell-times was elaborated following a method analogous to that described by Finzi and Gelles (20), which is based on the choice of a single filter: the Р(т) data were filtered with cutoff frequency of 0.033 Hz, corresponding to a filter dead time (Тг) of 5.4 s. The transitions giving raise to events shorter than Тг were ignored (20,28) and the resulting dwell-time distributions were analyzed to produce the durations histograms, reporting only the events with durations longer than 2Тг (20,27).

    Then, a full characterization of the analysis method was conducted using filters with different cutoff frequencies (0.133, 0.066, 0.044 and 0.033 Hz) as mentioned above. From the measured distributions of dwell-times, the average lifetime of the looped (τLm) and the unlooped (τUm) states were calculated for each experimental condition studied. In the results section we will show that these measured parameters strongly depend on the choice of filter operated. Thus, we developed a set of mathematical corrections aimed at obtaining, from the TPM measurements, a reliable estimate of the average duration of the looped and unlooped state in the DNA molecule, regardless of the choice of filter and the effects of residual noise in the measurements (see Supplementary Data). For this analysis, dwell-times were measured without imposing any cutoff in duration, since filter's limited time resolution (27) and false events due to noise are taken into account in our analysis method.

    The full description of the derivation of our novel method will be published elsewhere here we provide the mathematical expressions applied to the experimental results presented in this paper for wt-LacI at different concentrations and the Q60G and Q60 + 1 mutants. A description of the corrections used in this work and a demonstration of the validity of this method, based on numerical simulations, is reported in the Supplementary Data.


    Use of Escherichia coli operon-fusion strains for the study of glycerol 3-phosphate transport activity.

    Strains of Escherichia coli K-12 deleted in the native lac operon and bearing both a wild-type glpT operon encoding for sn-glycerol 3-phosphate (G3P) transport and a hybrid operon in which glpT operator and promoter regions are fused to the lacZ gene were constructed. In strains with such a hybrid operon, beta-galactosidase and beta-galactoside permease become inducible by G3P. In these mutants the function and maturation of the glpT-coded proteins should be distinguishable from the level of gene expression, since the beta-galactosidase activity can serve as an index of the latter. With the aid of such mutants, it was shown that: (i) the expressions of the two neighboring operons, glpT and glpA (encoding anaerobic G3P dehydrogenase), are not coordinate (ii) upon induction, the appearance of the cytoplasmic beta-galactosidase activity preceded that of methyl-beta-D-thiogalactoside transport activity (requiring only a cytoplasmic membrane protein) by about 4 min and that of G3P transport activity (requiring both a cytoplasmic membrane protein and a periplasmic protein) by about 9 min and (iii) when cells grown at several temperatures from 24 to 42 degrees C were measured for G3P transport activity at 30 degrees C, the activity increased with the growth temperature, indicating that, within the range studied, the rate of transport increases with the fluidity of membrane phospholipids.


    ТАЛҚАЛАУ

    Due to its versatility and simplicity, the TPM method has been used for the study of a variety of biochemical systems at the single molecule level ( 20 , 24 , 25 , 33 – 36 ). With regard to dynamic measurements, the main limitation of this experimental approach is represented by the low signal-to-noise ratios that can be accomplished. This limitation is mostly determined by the size of the microspheres used, which defines the time necessary for the diffusive motion to explore the volume available for a certain tether length (see Figure 1 ) variations in the length of the tether can be detected on timescales longer than this characteristic diffusion time. This limitation may be overcome and much higher signal-to-noise ratios (or, equivalently, higher temporal resolution in the measurements) may be accomplished substituting much faster diffusing objects (such as quantum dots) for the microspheres thus far used. When implemented using microspheres, however, TPM requires care in the quantitative interpretation of the measured lifetimes. Figure 7 , in fact, demonstrates how filtering of the experimental recordings (needed to obtain a good discrimination between the loop and unloop states) strongly influences the values of the measured lifetimes. We have elaborated a method of analysis of TPM data to overcome these problems and reliably measure the kinetic parameters of Lac repressor-induced loop formation and disruption.

    The formation of the 305 bp long loop in our DNA construct by simultaneous binding of the Lac repressor tetramer to the two operators is associated with a bending energy in the DNA molecule corresponding to about 9.5 кБТ ( 37 , 38 ), calculated simplifying the loop geometry to a circle, and with a DNA persistence length of 50 nm ( 39 , 40 ). The spacing between operators in the Lac operon is 92 and 401 bp ( 4 , 5 ), thus the bending energies involved in the formation of these loops can be significant and may play an important role in the kinetics of transcription regulation. The effects of DNA tension and torsion on the kinetics of DNA-binding proteins have recently been explored in a variety of theoretical studies ( 13 – 15 ) and in experimental measurements on Gal repressor ( 41 ).

    Single molecule approaches are providing fundamental information on the mechanical properties of a growing number of enzymatic systems in vitro ( 42 ). The measurement of forces in the pN range has indicated nucleic acid processing enzymes (such as RNA polymerase, DNA polymerase, topoisomerases) as molecular motors ( 43 – 45 ) capable of producing forces even larger than those of ‘classic’ motors, such as myosin ( 46 ) or kinesin ( 47 , 48 ). These forces may be crucial for these enzymes to overcome obstacles, unwind double-stranded structures and move along the DNA template under the conditions of compaction, tension and torsion to which it is subject in vivo . Transcription regulation systems, including the Lac operon, are sensitive to these forces to the extent by which binding and dissociation of the regulatory proteins are influenced by the bending and twisting energetics of the DNA. Measurements based on the use of magnetic tweezers have clearly demonstrated the sensitivity of the GalR system to supercoiling in the DNA target molecule ( 41 ). The persistence length of DNA in vivo is much lower than that measured in vitro ( 6 ), due to the action of accessory proteins. It is presumable that this physical property of DNA can be modulated to some extent by the quantity and quality of accessory proteins expressed in the cell. Thus, a new concept is recently emerging in gene regulation: the physical properties of DNA may play an important role in shaping the dynamics of gene regulation ( 38 , 49 ).

    We have applied the TPM technique, in combination with a new method for data analysis, to the investigation of the effects of flexibility (both in DNA and in the hinge region of the protein) on the kinetics of loop formation and disruption.

    The analysis of the kinetics of loop disruption is simplified by the fact that there is a 1:1 correspondence between the TPM state of lower microsphere mobility and the biochemical ORO state (see Figure 6 ). This correspondence is confirmed by the lack of dependence of τ Lm on LacI concentration ( Figure 4 , left panels Figure 7a , filled symbols). In fact, as an alternative interpretation, one could imagine a fast equilibrium between O-OR and ORO, characterized by rates much faster then the diffusion rate of the microsphere and shifted toward ORO, so to give raise to an apparent TPM loop state concealing fast biochemical reactions. However, if this were the case, one would expect the durations of the observed TPM loop state to depend on the concentration of LacI. In fact, the exit from the fast equilibrium would be determined by a reaction leading the system into a third, long lived, state. The most relevant long lived state in this regard depends on the concentration of LacI, and thus the entire behavior of the system is dependent on this parameter. More precisely, the ratio between the rates from O-OR toward RO-OR and O-O is given by [LacI]/ ҚD , which has a value of about 10, 2 and 0.4 for [LacI] of 100, 20 and 4 pM, respectively. At the two higher concentrations, RO-OR is, thus, prevalent: under these conditions, the rate of transition between O-OR and the other main unloop state scales linearly with [LacI]. Thus, the probability of exiting the above mentioned hypothetical equilibrium would also scale linearly with [LacI]. Since the measured duration of the TPM loop state does not depend on the concentration of LacI over a broad range of concentrations [4, 20 and 100 pM tested in this work, and 100 pM and 1 nM tested by Finzi and Gelles ( 20 )] the hypothesis of the TPM loop state underlying a fast biochemical equilibrium is not likely rather, the exit from this TPM state monitors directly the disruption of the loop in the DNA molecule. Thus, the TPM measurement provides a means for directly monitoring the effect of the loop strain on the kinetics of dissociation, as described in the results by the parameter α. Our findings indicate a weak dependence of the rate of loop disruption on the DNA bending and twisting energy, as demonstrated by the value of α between 1 and 2.

    With regard to the kinetics of loop formation, on the other hand, our measurements indicate that formation of a loop in the DNA molecule by binding of Lac repressor simultaneously to two operators is highly sensitive to the DNA bending energy. Qualitatively, this result is well-expected based both on theoretical considerations and previous ligase-catalyzed circularization experiments however, our results on LacI are somewhat surprising quantitatively. In fact, the values we have obtained for Джм (of the order of 10 −10 M) are significantly lower than those measured by ligase-catalyzed cyclization experiments [>10 −8 M for DNA segments of 300 bp ( 8 )] and calculated from physical models of the DNA molecule ( 11 ). It is fundamental to evaluate the effects of the microsphere on the values measured for Джм by TPM technique. It is expected, in fact, that the presence of the microsphere may slow down the kinetics of loop formation, due to an effective swelling force exerted entropically by the microsphere on the polymer. Below we will discuss results indicating that, in a system like the one we setup for the measurements on LacI, the effect of the microsphere on the measured kinetics of loop formation (and, therefore, on the measured Джм ) should not exceed, at most, a factor of 10.

    In their theoretical work, extensively modeling the physical properties of the TPM system, Segall т.б . provide an analytical expression [Equation 12 in Ref. ( 50 )] for the swelling force as a function of DNA contour length, persistence length and microsphere radius. In our experimental system, the swelling force estimated according to this expression is about 30 fN. Segall т.б . ( 50 ) conclude that a force of this magnitude due to the presence of the microsphere would decrease the rate of looping by about a factor of 2.

    Further, the TPM recordings of the position distributions of the microsphere in the absence of Lac repressor exhibit interesting non-Gaussian features ( 25 ) which may be exploited to estimate the magnitude of the swelling force. Using numerical simulations of the TPM system [similar to those described by Segall т.б . ( 50 )] to fit our data, we have estimated in our system an effective swelling force of 127 ± 14 fN (best estimate ± range for 95.4% confidence see Supplementary Data). Recent theoretical works ( 14 , 51 ) have described the effects of force on Джм : a force in the range between 30 and 140 fN due to the presence of the microsphere would not be expected to decrease Джм by more than a factor of 10.

    Finally, Hsieh т.б . ( 19 ) reported an estimate of the equilibrium constant Қ * for the intramolecular looping reaction: for the pRW490 construct containing the two primary operators at a distance of 305 bp from each other, they reported a value of 16 for Қ * . In our measurements, the equilibrium constant for the intramolecular looping reaction is given by Қ ′ = Джмка / (2 кг α). Using the values of Джм and α reported in Table 1 we obtain Қ ′ between 2.5 and 7. The difference between Қ * және Қ ′ is to be attributed to the microsphere, according to the following relationship: − RT ln( Қ ′) = Δ Гtpm = Δ ГDNA/LacI + Δ Гbead , мұндағы Δ ГDNA/LacI = − RT ln( K* ) is the free energy of looping in the absence of microsphere and Δ Гbead is the positive free energy contribution due to the microsphere opposing an entropic force to the formation of the loop. From these relations, based on the measurement of Қ ′ reported above, we estimate Δ Гbead between 0.8 and 1.8 кБТ . If we assume that this energetic barrier affects mostly the rate of formation of the loop, this would lead to a reduction of the looping rate by at most 55–83%, in agreement with what calculated by Segall т.б . ( 50 ). Thus, we conclude that, even accounting for an underestimation of Джм by about an order of magnitude in TPM due to the microsphere, Lac repressor looping is characterized by a Джм much (at least 10 times) lower than the ligase-catalyzed circularization of a DNA segment of the same length.

    The shape of a DNA loop can vary over a wide range of geometries determining large variations in the loop energetics and in the resulting Джм values ( 15 , 49 ), with significant deviations from those measured in cyclization experiments. Also, the effect of the protein bridging between the two extremities of the loop significantly influences the calculated values of Джм ( 52 , 53 ).

    The structure of the DNA–LacI complex in the looped configuration has not yet been determined. In addition to the original V-shaped model, proposed by Lewis т.б . ( 54 ), an extended conformation of the Lac repressor has been proposed ( 55 ). The rigidity of these conformations and the possibility for the protein to switch between these multiple structural states are fundamental in determining Джм for loop formation. Also, distance and phasing between the operators is a fundamental factor in determining the value of Джм , as already demonstrated for ligase-catalyzed circularization. The TPM method holds promise to allow a systematic characterization of the dependence of LacI regulation of the Lac operon on each of these components, providing in the near future, a complete picture of the orientation effects and of the protein and DNA mechanics involved in the process.

    Our measurements on the mutants of the hinge region Q60G and Q60 + 1 indicate that alterations in the flexibility and geometry of the hinge lead to significant changes in the kinetics measurable with TPM. The association and dissociation rate constants for these mutants have not been measured in standard biochemical assays however, the data shown in Figure 7b clearly demonstrate the large effects of these mutations on the looped lifetimes, with much smaller effects on the unlooped lifetimes. These results lead to the conclusion that the mutations studied cause changes predominantly in the value of the dissociation rate constant. As expected, the mutant characterized by the lower equilibrium dissociation constant (Q60G) displays a longer looped average lifetime, whereas the mutant with the higher ҚD (Q60 + 1) displays a shorter looped average lifetime. However, the sensitivity of the protein to DNA strain is not significantly affected by these mutations. It is likely that a role of this kind may be more appropriate for the tetramerization domain, and for the regions of interaction between monomers in the tetramer, which affect the propensity of the protein to take a V-shape, an open shape or other possible conformations responsible for a different sensitivity to strain in the DNA target.

    In conclusion, with regard to DNA bending, our work indicates that the rate of loop formation by Lac repressor depends more strongly than previously expected on the energetics of bending and twisting of DNA. Therefore, the mechanical and biochemical factors that in vivo modulate these energetics can play a crucial role in the modulation of gene expression regulation at least in the paradigmatic example of the Lac operon. With regard to the protein flexibility, on the other hand, our results show that the hinge flexibility and geometry have a determinant effect especially on the lifetime of the looped state, demonstrating the interplay of the mechanical properties of partners in this classic example of protein–DNA interacting system.

    Future steps aimed at a further characterization of the TPM system will investigate the effect of microspheres of different sizes on TPM measurements. Also, the measurement of looping and unlooping kinetics of different constructs in which the distances and phasing between operators is varied will provide important additional information.


    Бейнені қараңыз: Иллюзия Реальности (Желтоқсан 2022).